مقالة منهجية

تحريض المستعمرات الصغيرة في المبيضات عن طريق العلاج الضوئي الديناميكي بوساطة روز البنغال

1.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66549

⸱

مارس 29, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Dermatology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Ophthalmology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4National Institute of Infectious Diseases and Vaccinology, National Health Research Institutes, 5Department of Internal Medicine, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 6Insititute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 8Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

لم يتم استكشاف أهمية المستعمرات الصغيرة في المبيضات spp. مقاومة الأدوية بشكل كامل. يقدم العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDT) استراتيجية واعدة ضد الالتهابات الفطرية المقاومة للأدوية. توضح هذه الدراسة أن aPDT بوساطة البنغال الوردية يعطل بشكل فعال المبيضات glabrata ويحفز المستعمرات الصغيرة ، مما يقدم إجراء فريدا.

الملخص

في مواجهة معدل وفيات بنسبة 40٪ في مرضى المبيضات ، لا تزال المبيضات المقاومة للأدوية ومحورها الصغير تمثل تحديا علاجيا كبيرا. يستهدف العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDT) هياكل فطرية متعددة ، على عكس المضادات الحيوية / مضادات الفطريات ، مما قد يحبط المقاومة. تعتمد الطرق التقليدية لتحفيز المستعمرات الصغيرة على بروميد الإيثيديوم أو الفلوكونازول ، مما قد يؤثر على قابلية الدواء واستجابات الإجهاد. بحثت هذه الدراسة في تطبيق الضوء الأخضر (ذروة 520 نانومتر) وحساس ضوئي لورد البنغال (RB) لمكافحة عزل المبيضات غلابراتا المقاوم للأدوية. كشفت النتائج أن علاج aPDT يثبط بشكل كبير نمو الخلايا (انخفاض بنسبة ≥ 99.9٪) ويحفز بشكل فعال تكوين مستعمرة صغيرة ، كما يتضح من انخفاض حجم وفقدان تلطيخ مؤشر الأكسدة والاختزال في الميتوكوندريا. تقدم هذه الدراسة دليلا أوليا على أن aPDT يمكن أن يحفز المستعمرات الصغيرة في سلالة C. glabrata المقاومة للأدوية المتعددة في المختبر ، مما يوفر نهجا تحويليا محتملا لمكافحة الالتهابات الفطرية المقاومة.

المقدمة

تشكل الالتهابات الفطرية ، خاصة تلك التي تسببها المبيضات البيض والمبيضات جلابراتا المقاومة للأدوية بشكل متزايد ، تهديدا عالميا خطيرا1. يمكن أن تكون هذه العدوى مميتة ، خاصة بالنسبة للمرضى في المستشفى وأولئك الذين يعانون من ضعف في جهاز المناعة. يهدد ارتفاع المقاومة المضادة للفطريات السيطرة على داء المبيضات الغازي ، وهو عدوى فطرية شديدة مع ارتفاع معدل الوفيات ، وخاصة من المبيضات البيض2. تعيق السلالات المقاومة العلاج الفعال ، مما قد يزيد من التعقيد ومعدلات الوفيات. في مقاطعة ألاميدا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، أصبحت C. glabrata أكثر الأنواع الغازية انتشارا3. قد يتأثر هذا التحول في انتشار وتوزيع أنواع المبيضات بممارسات الرعاية الصحية المحلية ، والتركيبة السكانية للمرضى ، واستخدام العوامل المضادة للفطريات ، وانتشار عوامل الخطر لعدوى المبيضات.

تكشف الطفرات الصغيرة في المبيضات ، التي تفتقر إلى الميتوكوندريا الوظيفية ، كيف تؤثر هذه العضية على الاستجابة للأدوية ، والفوعة ، ومقاومة الإجهاد 4,5. تشكل C. glabrata هذه المستعمرات بسهولة ، وتكتسب حساسية تجاه polyenes بينما تفقدها إلى الأزول6. ترتبط حساسية الآزول ووظيفة الجهاز التنفسي ارتباطا وثيقا ، مع انخفاض التنفس مما يؤدي إلى المقاومة عن طريق فقدان الحمض النووي للميتوكوندريا7. تم عزل المستعمرات الصغيرة من C. glabrata مع مقاومة الآزول من عينات البراز البشري من متلقي زرع نخاع العظم الذي يخضع لعلاج الفلوكونازول8 ومن زجاجات مزرعة الدم للمرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم9. إن آثارها المحتملة في مقاومة الأدوية والفوعة والاستجابة للإجهاد تسلط الضوء على أهميتها السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن خصائصها المميزة تجعلها أدوات قيمة للتحقيق في الأسئلة الأساسية في بيولوجيا الميتوكوندريا5. مع استمرار البحث في الطفرات الصغيرة ، من المرجح أن تتوسع تطبيقاتها في كل من البحوث السريرية والأساسية.

اكتشفت هذه الدراسة أن العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) يمكن أن يحفز المستعمرات الصغيرة في C. glabrata ، مما يوسع نطاق الطرق إلى ما وراء التقنيات التقليدية لتعريض C. glabrata لبروميد الإيثيديوم أو الفلوكونازول.

البروتوكول

1. زراعة C. glabrata

ملاحظة: يتم استخدام C. glabrata المقاوم للأدوية المتعددة (C2-1000907) المقاوم لمعظم العوامل المضادة للفطريات ، بما في ذلك الفلوكونازول ، في التجارب. قد تحتاج الظروف التجريبية إلى التكيف مع سلالة معينة ، حيث قد توجد اختلافات بين سلالات مختلفة. استخدمت جميع التجارب المبيضات اللوغاريتمية التي نمت عند 25 درجة مئوية (تحاكي العدوى الطبيعية) من أجل الاتساق. إن افتقار C. glabrata إلى الخيوط يبسط القياس الكمي مقارنة ب C. albicans ، التي تشكل خيوط عند 37 درجة مئوية10.

  1. لتحضير استزراع لوغاريتمي الطور ل C. glabrata ، اختر مستعمرة واحدة من صفيحة أجار وانقلها إلى أنبوب اختبار زجاجي يحتوي على 3 مل من وسط خميرة البيبتون المعقمة (YPD) (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 14-16 ساعة عند 25 درجة مئوية مع اهتزاز (155 دورة في الدقيقة ، زاوية 45 درجة لزيادة انتقال الهواء إلى الوسط).
  2. بعد الحضانة ، قم بتخفيف الثقافة باستخدام YPD الطازج إلى OD600 من 0.1 باستخدام تقنية معقمة. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 6 ساعات مع الاهتزاز عند 155 دورة في الدقيقة. تحقق من مرحلة السجل ل C. glabrata عن طريق قياس OD600. الهدف ل 0.65-1.00 ، وهو ما يتوافق مع 1 × 10 7-1.5 × 107 خلايا / مل.

2. تحريض المستعمرات الصغيرة عن طريق بروميد الإيثيديوم والفلوكونازول والعلاج الضوئي الديناميكي

  1. تحريض مستعمرة بروميد الإيثيديوم الصغير
    1. اضبط معلق الخميرة إلىOD 600 من 0.1 (5 × 106 خلايا / مل) مع YPD إلى حجم نهائي قدره 3 مل ، ثم أضف 30 ميكرولتر من مخزون بروميد الإيثيديوم (10 ملغم / مل) (انظر جدول المواد) لتركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل.
    2. احتضان تعليق الخميرة بين عشية وضحاها (16-18 ساعة) عند 25 درجة مئوية ، 155 دورة في الدقيقة ، زاوية 45 درجة. اضبط على OD600 من 0.65 (1 × 107 خلايا / مل). قم بإجراء سلسلة تخفيف 10 أضعاف في لوحة 96 بئرا عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من تعليق الخميرة المعدل إلى 180 ميكرولتر من PBS لكل بئر. هذا يخلق ستة تخفيفات تتراوح من 10-1 إلى 10-5.
    3. حدد 4 عوامل تخفيف (على سبيل المثال ، 100 و 101 و 102 و 103) ولوحة 3 قطرات (20 ميكرولتر) لكل منها على 4 أرباع من ألواح أجار YPD (ثلاث نسخ).
    4. احتضان الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية. حدد الأرباع التي تحتوي على 5-80 مستعمرة من التخفيفات المختارة مسبقا لتلطيخ كلوريد ثلاثي فينيل تترازوليوم (TTC)11 (انظر الخطوة 3). امسح اللوحات ضوئيا بدقة 1200 نقطة في البوصة باستخدام ماسح ضوئي بالألوان الكاملة 48 بت.
  2. تحريض مستعمرة الفلوكونازول الصغيرة
    ملاحظة: لتسريع العملية ، استخدم خلايا T3 (خليط من الخلايا الطبيعية والصغيرة التي تم الحصول عليها بعد 3 علاجات RB-PDT ؛ انظر الخطوة 2.3) لتشكيل مستعمرة صغيرة مستحثة بالفلوكونازول. وذلك لأن العلاج القياسي يؤدي عادة إلى تكوين أبطأ.
    1. تحضير وضبط معلق خلية الخميرة كما هو موضح في الخطوة 2.1.1.
    2. احتضان بين عشية وضحاها (16-18 ساعة) عند 25 درجة مئوية. اضبط OD600 إلى 0.1 مرة أخرى.
    3. انقل 1 مل من التعليق المعدل إلى أنبوب معقم سعة 5 مل.
    4. اغمس قطعة قطن معقمة (بطول 15 سم ، بطرف 0.9 سم × 2.6 سم ، انظر جدول المواد) في تعليق الخميرة ، مع ضمان ملامسة قاع الأنبوب والالتواء لإزالة السائل الزائد من جدار الأنبوب.
    5. قم بإعداد الألواح في غطاء المحرك باستخدام أجار مولر-هينتون (انظر جدول المواد).
    6. امسح القطن ذهابا وإيابا على الأجار ، وقم بتدويره 60 درجة مرتين ، ثم امسح المحيط لتغطية متساوية.
    7. تعقيم ملقط على اللهب لمدة 1-2 ثانية ، والسماح لهم بالتبريد لفترة وجيزة ، ثم استخدامها لالتقاط الأقراص الفارغة.
    8. قسم اللوحة إلى ثلاثة قطاعات متساوية باستخدام علامة. ضع قرصا فارغا واحدا في وسط كل قطاع.
    9. أضف 12.5 ميكرولتر من مخزون الفلوكونازول (2 مجم / مل ، انظر جدول المواد) إلى كل قرص (25 ميكروغرام / قرص) ، واخلطه جيدا لتجنب الفقاعات ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 20-24 ساعة.
    10. قم بإجراء تلطيخ TTC (انظر الخطوة 3). امسح اللوحات ضوئيا بدقة 1200 نقطة في البوصة باستخدام ماسح ضوئي بالألوان الكاملة 48 بت.
  3. PDT الحث مستعمرة صغيرة
    ملاحظة: قد تنتج الفطريات المختلفة أعدادا مختلفة من المستعمرات الصغيرة بعد PDT. بعض السلالات قد لا تنتج أي شيء على الإطلاق.
    1. إعداد نظام aPDT.
      ملاحظة: يتبع إجراء الإعداد لجهاز نظام aPDT الطريقة التي أبلغ عنها Hung etal 12. باختصار ، يتكون نظام aPDT من مجموعة LED خضراء مع ذروة عند 520 نانومتر (انظر جدول المواد) ، يضيء الضوء من الأسفل مع محاذاة جيدة مع كل بئر من لوحة 96 بئرا.
    2. اضبط تعليق خلية الخميرة في وسط YPD إلىOD 600 من 0.65 (حوالي 1 × 107 خلايا / مل).
    3. امزج 1 مل من معلق الخميرة مع 111 ميكرولتر من البنغال الوردي 2٪ (RB ، الشكل 1) (انظر جدول المواد) في أنبوب دائري لإعطاء تركيز RB نهائي بنسبة 0.2٪. احتضان الخليط على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، مع تدويره بزاوية 45 درجة عند 155 دورة في الدقيقة.
    4. انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 16100 × جم لمدة 2.5 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة).
    5. تخلص من المادة الطافية وكشط الأنبوب برفق خمس مرات على أرضية غطاء المحرك لإعادة تعليق الحبيبة.
    6. اغسل التعليق باستخدام 1x PBS أربع مرات لإزالة كل RB. يتبع كل غسلة إعادة تعليق الحبيبات مع دوامة قصيرة أو ماصة للتعليق الشامل.
      1. بعد الغسيل النهائي ، أضف 1000 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. الحل وردي فاتح اللون. انقل 200 ميكرولتر من معلق الخميرة المغسول المحمل ب RB إلى كل من الآبار الثلاثة في صفيحة 96 بئرا (ثلاث نسخ).
    7. ضع لوحة 96 بئرا على نظام الإضاءة الديناميكية الضوئية مع مصابيح LED التي تسلط الضوء الأخضر من الأسفل. أطفئ أضواء الغرفة لضمان إضاءة موحدة ومنع التداخل. تنشيط نظام إضاءة LED لتوصيل جرعة PDT البالغة 4.38 جول / سم2 على مدى دقيقتين ؛ تأكد من محاذاة النظام بشكل صحيح مع الآبار.
    8. بعد التشعيع ، قم بتخفيف تعليق الخميرة في لوحة 96 بئرا. أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخميرة إلى بئر يحتوي على 180 ميكرولتر PBS ، مما يؤدي إلى تخفيف 10 أضعاف. كرر التخفيفات المتبقية لتحقيق نطاق من 10-1 إلى 10-5.
    9. اختر أربعة عوامل تخفيف (على سبيل المثال ، 10-2 إلى 10-5) بناء على تعديل تركيز خلية الخميرة.
    10. لكل عامل تخفيف ، لوحة 3 قطرات (20 ميكرولتر لكل منهما) لكل ربع على ألواح أجار YPD.
    11. بعد امتصاص معلق الخميرة بالكامل ، حوالي 10 دقائق بواسطة ألواح الآجار ، اقلب واحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    12. حدد T0 على أنه عنصر التحكم الأبوي C. glabrata بدون علاج PDT. تحضير الفطريات T0 في مرحلة نمو السجل كما هو موضح أعلاه وتعريضها لضوء أخضر 4.38 جول / سم2 في وجود 0.2٪ RB. تمنع حالة PDT هذه باستمرار 3 إلى 3.5 سجلات من نمو الفطريات.
      1. تشير إلى الفطريات الناجية على أنها T1 وتعريضها لنفس جرعة PDT مرة أخرى بعد توسيعها في المختبر إلى مرحلة نمو السجل. يشار إلى الفطريات الباقية بعد PDT الثاني باسم T2 وهكذا دواليك.
    13. في اليوم التالي ، اختر الأرباع التي يتراوح عدد المستعمرات فيها بين 5 و 80. احسب عدد المستعمرات في كل ربع واحسب العيار بالصيغة التالية: وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) / مل = عدد المستعمرات (متوسط ثلاث نسخ) × عامل التخفيف × 50.
    14. قم بإجراء تلطيخ TTC (انظر الخطوة 3). امسح اللوحة ضوئيا كما هو موضح سابقا (الخطوة 2.2).

3. تحليل وظيفة الميتوكوندريا (اختبار تلطيخ TCC)

ملاحظة: TTC هو مؤشر الأكسدة والاختزال ومستقبل الإلكترون. يتحول إلى اللون الأحمر عندما يتم كسر المركبات البيضاء بواسطة الإلكترونات11. لاحظ أنه ليس بالضرورة أن تشكل جميع الخلايا مستعمرات مرئية في غضون 24 ساعة بعد الزراعة على صفيحة أجار. تتحول المستعمرات ذات الميتوكوندريا الوظيفية إلى اللون الأحمر ، بينما تظل المستعمرات التي تحتوي على ميتوكوندريا غير وظيفية بيضاء. هذا يسمح بالتمايز بين المستعمرات ذات وظائف الميتوكوندريا المختلفة.

  1. بعد العلاج ، قم بتخفيف معلقات المبيضات على ألواح أجار YPD وفقا لكثافة الخلايا المطلوبة للحصول على مستعمرات مميزة لسهولة التصور والتلطيخ.
  2. بعد 24 ساعة من النمو عند 37 درجة مئوية ، تتشكل المستعمرات المرئية من خلية واحدة. ماصة 20 ميكرولتر من 20٪ TTC مباشرة على وسط كل مستعمرة.
  3. بعد الامتصاص الكامل ، حوالي 10 دقائق من TTC من قبل المستعمرات ، احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة.

4. حركية النمو العادية والصغيرة C. glabrata

ملاحظة: تمت مقارنة ثلاث سلالات من الخميرة: C. glabrata C2-1000907 T0 (عزل سريري بدون علاج PDT) ، T3n (C. glabrata C2-1000907 بعد 3 مستعمرات RB-PDT متتالية تظهر مستعمرات يبلغ متوسط قطرها 1.5 ± 0.8 مم مماثلة للخلايا الأبوية) ، و T3p (مستعمرات صغيرة من C. glabrata C2-1000907 بعد 3 RB-PDT متتالية).

  1. اضبط تعليق خلية الخميرة في وسط YPD إلىOD 600 من 0.1 (5 × 106 خلايا / مل) في أنبوب 3 مل.
  2. قم تلقائيا بقياس OD600 للثقافة الساكنة كل 20 دقيقة باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الأوضاع (انظر جدول المواد) لمدة 24 ساعة.

النتائج

تم تقديم البيانات كمتوسط مع ± الخطأ المعياري وتم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة ، مع ثلاث نسخ على الأقل في كل مجموعة. تم رسم البيانات التجريبية ، بما في ذلك عدد المستعمرات ، وقياسات OD600 ، ونتائج تلطيخ TTC ، وتحليلها إحصائيا باستخدام الرسوم البيانية والبرامج الإحصائية (انظر جدول المواد). تم استخدام اختبار ANOVA أو t أحادي الاتجاه لتحليل البيانات ، واعتبرت القيمة p <0.05 مهمة. تم إجراء المسح باستخدام ماسح ضوئي بالألوان الكاملة 48 بت بدقة 1200 نقطة في البوصة ، وتم إجراء قياسات لاحقة لأقطار المستعمرة باستخدام برنامج ImageJ.

كما هو موضح في منحنيات النمو في الشكل 2 ، أظهرت الطفرات الصغيرة ل C. glabrata C2-1000907 (T3p) نموا أبطأ مقارنة بالفطريات الأبوية غير المعالجة ذات الحجم العادي (T0). عندما تم خلط C. glabrata مع 0.2٪ RB لمدة 15 دقيقة وتعريضه ل 4.38 J / cm2 ضوء أخضر (علاج PDT) ، انخفض عيار الفطريات من 107.5 CFU / mL إلى 104.5 CFU / mL (على الأقل 3 سجلات ، الشكل 3) مقارنة بالمجموعة الضابطة (RB فقط) ، والتي كانت كثافة خلاياها حوالي 107 CFU / mL. بالإضافة إلى ذلك ، بعد aPDTs ، لوحظت مستعمرات صغيرة. كان متوسط حجم هذه المستعمرات الصغيرة 0.4 مم ± 0.25 مم بدلا من الحجم المعتاد البالغ 1.5 مم ± 0.8 مم (الشكل 4 أ). يمكن التعرف على المستعمرات الصغيرة الحجم التي تعاني من خلل في الميتوكوندريا من خلال حجمها ولونها بعد تلطيخها بنسبة 20٪ TTC. أظهرت المستعمرات الصغيرة التي حافظت على اللون الأبيض (الشكل 3 ب ، الأسهم البيضاء) خللا في الميتوكوندريا ، بينما احتفظت بعض المستعمرات الأصغر ذات اللون الأحمر والمستعمرات ذات الحجم الطبيعي بوظيفة الميتوكوندريا الطبيعية (الشكل 4 ب). يمكن لعامل إقحام الحمض النووي التقليدي بروميد الإيثيديوم (الشكل 4C) والفلوكونازول (الشكل 4D) أن يحفز بشكل فعال طفرات صغيرة من المبيضات. انتشار القرص هو طريقة بسيطة لتحديد حساسية الدواء في الفطريات. في الشكل 4D ، أحاطت منطقة دائرية واضحة بدون نمو بقرص الفلوكونازول الذي يحتوي على 25 ميكروغرام من الفلوكونازول في مزرعة T0 (بدون PDT) ، مما يشير إلى مقاومة أقل للأدوية في هذه الفطريات الأبوية. ومع ذلك ، لا يزال يتم تعريف C. glabrata C2-1000907 على أنه سلالة مقاومة من خلال الحد الأدنى من تركيز التثبيط تجاه الفلوكونازول (البيانات غير معروضة) وقطر المنطقة الصافية. في ثقافة T3 ، تشكلت العديد من المستعمرات الصغيرة بالقرب من القرص (سهم ، لوحة سفلية) ، مما يشير إلى مقاومة الأدوية بعد ثلاثة علاجات PDT متكررة.

figure-results-1
الشكل 1: التركيب الجزيئي لورد البنغال (RB). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: منحنيات نمو C. glabrata C2-1000907 24 ساعة بعد RB-PDT المتكرر. تمت مقارنة منحنيات النمو لثلاث سلالات: C. glabrata C2-1000907 T0 (الخلايا الأبوية الساذجة) ، T3n (مستعمرات ذات حجم طبيعي بعد 3 علاجات متكررة) ، و T3p (مستعمرات صغيرة بعد 3 علاجات متكررة). بالمقارنة مع T0 و T3n ، أظهرت مستعمرات T3p معدل نمو أبطأ بكثير (n = 3 ، p < 0.05). تزرع جميع الخلايا في وسط YPD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تثبيط نمو C. glabrata C2-1000907 بعد aPDT. أدى علاج aPDT واحد بجرعة خفيفة 4.38 J / cm² و 0.2٪ RB إلى تثبيط نمو C. glabrata C2-1000907 بشكل كبير بمقدار 3 سجلات مقارنة بالتحكم الساذج (p < 0.0001 ، اختبار t غير المزاوج). تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± التسويق عبر محرك البحث ، ويتم تجميع البيانات من 3 تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل الخلل الوظيفي للميتوكوندريا باستخدام تلطيخ كلوريد ثلاثي فينيل تترازوليوم (TCC). (أ) C. glabrata C2-1000907 ، 24 ساعة بعد علاج aPDT (0.2٪ RB ، 4.38 J / cm² ضوء أخضر) ، أظهر توزيعا لحجم مستعمرة ثنائية النمط ، مع مستعمرات كبيرة (1.5 مم ± 0.8 مم) ومستعمرات صغيرة (صغيرة) (0.4 مم ± 0.25 مم). (ب) كشف تلطيخ TCC أن المستعمرات الكبيرة كانت تعمل ، حيث تحولت إلى اللون الأحمر ، بينما كانت المستعمرات الصغيرة غير وظيفية ، لأنها ظلت بيضاء. (ج) كما تم تحفيز المستعمرات الصغيرة بواسطة بروميد الإيثيديوم (100 ميكروغرام / مل لمدة 30-40 دقيقة) و (د) علاج فلوكونازول (25 ميكروغرام / مل). أحاطت منطقة دائرية واضحة بدون نمو بقرص الفلوكونازول الذي يحتوي على 25 ميكروغرام من الفلوكونازول في ثقافة T0 (بدون PDT) ، مما يشير إلى الحساسية. في ثقافة T3 ، تشكلت العديد من المستعمرات الصغيرة بالقرب من القرص (سهم ، لوحة سفلية) ، مما يشير إلى مقاومة الأدوية بعد ثلاثة علاجات PDT متكررة. قضبان المقياس: 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

تكشف هذه الدراسة النقاب عن PDT كأول طريقة تم الإبلاغ عنها للحث على تكوين مستعمرة صغيرة في المبيضات ، متجاوزة التأثيرات الثابتة لبروميد الإيثيديوم والفلوكونازول. تتطلب هذه الملاحظة الجديدة مزيدا من الاستكشاف لكشف آثارها على كل من القضاء على الفطريات عن طريق تقليل الفوعة وظهور آليات المقاومة.

يمنع PDT بوساطة RB بشكل فعال نمو C. glabrata ، مما يشير إلى نهج علاج بديل محتمل لعدوى المبيضات. كحساس ضوئي منشط بالضوء ، ينتج RB الأكسجين الفردي وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) عند تعرضه لطول موجي معين. يتسبب هذا الإجهاد التأكسدي في تلف المكونات الخلوية الأساسية مثل الدهون والبروتينات والأحماض النووية13 ، مما يؤدي إلى خلل في الميتوكوندريا ، كما هو موضح في هذه الدراسة. هذا يجعل من الصعب على المبيضات تطوير المقاومة من خلال الآليات التقليدية التي لوحظت مع الأدوية المضادة للفطريات القياسية.

تظهر سلالات الخميرة الثلاث المستخدمة في هذه الدراسة ، T0 و T3n و T3p ، أنماط نمو متميزة. يبقى T0 دون علاج ، بينما يخضع T3n و T3p ل RB-PDT ثلاث مرات. يعرض T3n مستعمرات عادية الحجم ، بينما يعرض T3p مستعمرات صغيرة. قد يشير النمو البطيء للمستعمرات الصغيرة إلى تغيرات في الطاقة الخلوية والتمثيل الغذائي. يمكن أن يؤدي النمط الظاهري الصغير ، الذي يرتبط غالبا بخلل الميتوكوندريا4 ، إلى ضعف التنفس الهوائي ، وبالتالي التأثير على حركية النمو الكلي. قد يؤثر ضعف التنفس الهوائي في المستعمرات الصغيرة على ضراوتها أو قابليتها للأدوية أو قدرتها على الاستمرار في بيئات مختلفة. يحمل هذا الاتصال آثارا سريرية محتملة ويوفر سبلا لاتجاهات البحث المستقبلية.

بروميد الإيثيديوم ، وهو عامل إقحام الحمض النووي ، يمنع تخليق الحمض النووي للميتوكوندريا ويحلل الحمض النووي للميتوكوندريا الموجود ، ويحول المبيضات إلى مستعمرات صغيرة مع خلل في الميتوكوندريا14. يمكن أن يؤدي الفلوكونازول ، الذي يشيع استخدامه لعلاج عدوى المبيضات ، إلى مقاومة الأدوية وتطور المستعمرة الصغيرة في C. glabrata6. قد تظهر الطفرات الصغيرة مقاومة للأدوية الآزولية من خلال تنشيط عامل النسخ PDR1 وتنظيمه للجينات CDR1 و CDR215. علاوة على ذلك ، بسبب الفقدان الجزئي أو الكامل للحمض النووي للميتوكوندريا ، تتعرض وظيفة الميتوكوندريا للخطر16.

أثبت PDT فعاليته في تقليل الفوعة البكتيرية17 ، وتحفيز الحساسية للمضادات الحيوية18 ، وتقليل تكوين الأغشية الحيوية19 في البكتيريا. الدراسات على PDT ضد الالتهابات الفطرية محدودة20. يثير هذا الاكتشاف أسئلة مثيرة للاهتمام حول كيفية تأثير RB-PDT على الميتوكوندريا في C. glabrata. لفهم كيفية تأثير RB-PDT على خلايا الخميرة بشكل كامل ، فإن فهم الآليات الجزيئية التي تسبب تغيرات النمو أمر بالغ الأهمية. ومع ذلك ، فإن الطفرات الصغيرة التي يسببها PDT قيد الدراسة حاليا ، ولا تزال أسسها الآلية التفصيلية غير واضحة. هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لتحديد ما إذا كانت هناك أي اختلافات بين المستعمرات الصغيرة التي تم إنشاؤها بطرق مختلفة. إن فهم كيفية تشكل البيتيت في أنواع المبيضات أمر مهم لدراسة العلاقة بين وظيفة الميتوكوندريا والإمراضية. علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون الطفرات الصغيرة بمثابة نموذج لاستكشاف آليات مقاومة الأدوية المضادة للفطريات.

الدراسة الحالية ، بينما تقدم رؤى قيمة حول آثار PDT بوساطة RB على C. glabrata وظهور مستعمرات صغيرة ، لها بعض القيود التي يجب مراعاتها. أولا ، ركزت الدراسة بشكل أساسي على التجارب في المختبر ، وترجمة هذه النتائج إلى إعدادات سريرية تستدعي مزيدا من التحقيق. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب الآليات الجزيئية المحددة الكامنة وراء تكوين المستعمرات الصغيرة بعد RB-PDT وآثارها المحتملة على مقاومة الأدوية المضادة للفطريات مزيدا من الاستكشاف المتعمق. علاوة على ذلك ، بينما قارنت الدراسة أنماط نمو سلالات الخميرة المختلفة ، يمكن أن توفر التحليلات الجزيئية والجينية الإضافية فهما أعمق للتغيرات الأيضية والجينية المرتبطة بتكوين مستعمرة صغيرة.

علاوة على ذلك ، لم يتم تناول التباين المحتمل في الاستجابة ل RB-PDT بين العزلات السريرية المختلفة ل C. glabrata في هذه الدراسة ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى تحقيقات أوسع خاصة بالسلالة. ستكون الدراسات المستقبلية التي تتناول هذه القيود حاسمة لفهم أكثر شمولا للآثار المترتبة على PDT بوساطة RB وظهور مستعمرات صغيرة في سياق استراتيجيات العلاج المضادة للفطريات.

باختصار ، يكشف هذا التحقيق أن aPDT يحفز C. glabrata (C2-1000907) طفرات صغيرة مع ضعف وظيفة الميتوكوندريا. قد تقدم هذه الآلية الفريدة طريقة جديدة للدراسات المضادة للفطريات. لا يزال يتعين توضيح آلية العمل الدقيقة الكامنة وراء المستعمرات الصغيرة التي يسببها PDT ، وسيكون استكشاف الاختلافات المحتملة عن الطرق الأخرى أمرا حاسما لتحسين الاستراتيجيات العلاجية.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تلقى هذا العمل تمويلا من وزارة العلوم والتكنولوجيا ، تايوان [MOST 110-2314-B-006-086-MY3] ، جامعة تشنغ كونغ الوطنية [K111-B094] ، [K111-B095] ، مستشفى جامعة تشنغ كونغ الوطني ، تايوان [NCKUH-11204031] ، [NCKUMCS2022057].

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 & مرشح mMerck ، تايبيه ، تايوانMillex ، SLGVR33RS
1.5 مل أنبوب ميكرونبتون ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية# 3745
20٪ كلوريد ثلاثي فينيلترازوليوم (TTC)سيجما ألدريتش ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةT8877
5 مل أنبوب دائري من البولي بروبيلينكورنينج ، أريزونا ، الولايات المتحدة الأمريكية352059
5 مل أنبوب دائري القاع مع غطاء مصفاة الخليةكورنينج ، أريزونا ، الولايات المتحدة الأمريكيةفالكون ، # 352235
لوحة 96 بئرAlpha plus ، Taoyuan Hsien ، تايوان# 16196
AgarBRS ، تاينان ، تايوانAG012
قرص فارغAdvantec ، طوكيو ، اليابان49005040
جهاز طرد مركزيEppendorf ، المملكة المتحدة5415R
محلول بروميد الإيثيديومSigma-Aldrich ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكيةE1510
فلوكونازول ، 2 مجم / ملفايزر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكيةBC18790248
برنامج GraphPad PrismGraphPadالإصدار 7.0
الصمام الثنائي الباعث للضوء الأخضر (LED)Nanyi للإلكترونيات المحدودة ، تاينان ، تايوان5050موجة الإثارة: 500 ~ 550 نانومتر
درجة حرارة منخفضة. حاضنات اهتزازYihder ، تايبيه ، تايوانLM-570D (R)
مسحاتقطنية للعناية بالفمGood Verita Enterprise ، تايبيه ، تايوان161357
مولر هينتون الثاني أجارBD للعلوم الحيوية ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية211438
قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاعالأجهزة الجزيئيةSpectraMax i3x
OD600< / sub> مقياس الطيف الضوئيBiochrom ، لندن ، المملكة المتحدةUltrospec 10
روز البنغالسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية330000تركيز المخزون 40 مجم / مل = 4٪ ، تحضير في PBS ، مخزن عند 4 درجات ؛ ج
أنبوب زجاجي معقمSunmei ، تاينان ، تايوانAK45048-16100
مستخلص الخميرة ببتون سكر العنب متوسطHIMEDIA ، الهندM1363
فيوج شريط

المراجع

  1. Soriano, A., et al. Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations. J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).
  2. Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4, 18026(2018).
  3. Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis. BMC Infect Dis. 22 (1), 843(2022).
  4. Whittaker, P. A. The petite mutation in yeast. Subcell Biochem. 6, 175-232 (1979).
  5. Hatab, M. A., Whittaker, P. A. Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).
  6. Defontaine, A., et al. In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata. J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).
  7. Brun, S., et al. Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).
  8. Bouchara, J. P., et al. In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata. J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).
  9. Badrane, H., et al. Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures. Nat Commun. 14 (1), 5918(2023).
  10. Shantal, C. -J. N., Juan, C. -C., Lizbeth, B. -U. S., Carlos, H. -G. J., Estela, G. -P. B. Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response. Microbiol Res. 260, 127038(2022).
  11. Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar. Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).
  12. Hung, J. H., et al. Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans. J Vis Exp. (181), e63558(2022).
  13. Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).
  14. Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide. Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).
  15. Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. The petite mutation in yeasts: 50 years on. Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).
  16. Piskur, J. Inheritance of the yeast mitochondrial genome. Plasmid. 31 (3), 229-241 (1994).
  17. Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).
  18. Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance. J Clin Med. 8 (3), 411(2019).
  19. Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. Photodynamic therapy to control microbial biofilms. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090(2021).
  20. Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

كانديدا جlabrataالعلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروباتكانديدا المقاومة للأدويةالعلاج بالضوء الأخضرمؤشر الأكسدة والاختزال في الميتوكوندرياعلاج العدوى الفطريةالفطريات المقاومة للأدوية المتعددة
تحريض المستعمرات الصغيرة في المبيضات عن طريق العلاج الضوئي الديناميكي بوساطة روز البنغال
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.