مقالة منهجية

دور الخلايا التائية CD4 في التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي الانتكاسي والهطول

DOI:

10.3791/66553

⸱

يناير 19, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Institute of Neurological Diseases, First People's Hospital of Shizuishan, 4Department of Neurology, Xianyang Hospital of Yan’an University, 5Department of Pharmacy, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, 6Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام نموذج تجريبي لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (EAE) في الفئران للتحقيق في دور خلايا CD4 T في الانتكاس الأولي والانتكاسة ل EAE من منظور مرحلة التنشيط ووظيفة التأثير المناعي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي يتميز بتسلل الخلايا المناعية وإزالة الميالين في الجهاز العصبي المركزي (CNS). يعمل التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) كنموذج حيواني نموذجي لدراسة مرض التصلب العصبي المتعدد. في هذه الدراسة ، هدفنا إلى التحقيق في دور خلايا CD4 T في بدء وانتكاس EAE ، مع التركيز على مرحلة التنشيط والاستجابة المناعية. لإنشاء نموذج الفئران EAE ، تم تحصين إناث الفئران ببروتين سكري قليل التغصن المايلين (MOG) 35-55 مستحلب بمساعد فرويند الكامل (CFA). تم تقييم الدرجات السريرية يوميا ، وأظهرت النتائج أن الفئران في مجموعة EAE أظهرت نمطا كلاسيكيا للانتكاس. كشف تحليل تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H & E) واللوكسول الأزرق السريع (LFB) عن تسلل كبير للخلايا الالتهابية في الجهاز العصبي المركزي وإزالة الميالين في الفئران EAE. فيما يتعلق بمرحلة التنشيط ، قد تساهم كل من خلايا المستجيب CD4 + CD69 + T (Teff) وخلايا CD4 + CD44 + CD62L في بدء EAE ، ومع ذلك ، ربما كانت مرحلة الانتكاس تهيمن عليها خلايا CD4 + CD44 + CD62L- Tem. بالإضافة إلى ذلك ، من حيث وظيفة المناعة ، تشارك الخلايا التائية (Th) 1 المساعدة بشكل أساسي في بدء EAE. ومع ذلك ، تساهم كل من خلايا Th1 و Th17 في مرحلة الانتكاس ، وتم تثبيط الوظيفة المثبطة للمناعة للخلايا التائية التنظيمية (Treg) أثناء العملية المرضية EAE.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي يتميز بتسلل الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع الخلايا المناعية وإزالة الميالين1،2. أظهرت دراسة حديثة أنه أكثر أمراض الإعاقة شيوعا التي تصيب الشباب ، مع زيادة معدل حدوثه باستمرار في جميع أنحاءالعالم 3. التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج حيواني نموذجي لمرض التصلب العصبي المتعدد يحاكي العديد من جوانب المرحلة الالتهابية لمرض التصلب العصبي المتعددالبشري 4. من منظور الوظائف المناعية ، يشار إلى خلايا CD4 T الأولية التي لم تصادف المستضدات بعد باسم الخلايا T (Th) 0 المساعدة. تخضع هذه الخلايا لعمليات النضج والتنشيط لإظهار وظائف مختلفة. يمكن تصنيف خلايا CD4 T إلى عدة مجموعات فرعية وفقا لوظائفها المحددة ، والتي تشمل خلايا Th1 و Th2 و T التنظيمية (Treg) و مساعد البصيلات T (Tfh) و Th17 و Th9 و Th225. من الإجماع الشائع أن الأنواع الفرعية للخلايا Th1 و Th17 هي عوامل التسبب في المرض الحاسمة ل EAE6. يمكن أن تفرز خلايا Th1 γ الإنترفيرون (IFN-γ) ، وتفرز خلايا Th17 الإنترلوكين (IL) -17 وعوامل التهابية أخرى ، والتي يمكن أن تنشط الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا الدبقية الدقيقة والخلايا النجمية. تنتج هذه الخلايا السيتوكينات الالتهابية7 ، مثل IL-18 و IL-12 و IL-23 و IL-1β ، والتي يمكن أن تحفز الاستجابة المناعية لخلايا Th1 / Th17 ، مما يؤدي إلى إزالة الميالين التدريجي والتلف المحوري. من منظور مرحلة التنشيط ، تمتلك خلايا CD4 T مصيرا محددا مسبقا لتتطور إلى مجموعات فرعية مميزة للخلايا وحالات متمايزة ، بما في ذلك الخلايا التائية الساذجة والمستجيب والذاكرة8. تتكاثر خلايا CD4 T الأولية وتتمايز إلى مجموعة متنوعة من مجموعات فرعية من المستجيب بوظائف مختلفة في بيئاتمختلفة 9. معظم الخلايا المستجيبة قصيرة العمر ، حيث تتطور مجموعة صغيرة من الخلايا التائية إلى خلايا ذاكرة تائية تظهر وظائف مستجيب سريعة عند مواجهة نفس المستضدات مرة أخرى وتزود المضيف بحماية قوية للغاية وطويلة الأمد10،11.

على الرغم من أن الأبحاث الحالية تشير إلى أن خلايا CD4 T تلعب دورا مهما في تطور EAE ، إلا أنه لا يزال من غير الواضح كيف تساهم مجموعات الخلايا التائية المختلفة CD4 ، المصنفة بناء على مرحلة التنشيط ووظيفة التأثير المناعي ، في بدء وانتكاس EAE. في هذه الدراسة ، أنشأنا نموذج EAE في الفئران C57BL6 / J عن طريق تحصين البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) 35-55 وحققنا في بدء وانتكاس EAE ، مع التركيز على مرحلة التنشيط والوظيفة المناعية لخلايا CD4 T.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقسيم ما مجموعه 18 فأرة من أنثى C57BL / 6J تتراوح أعمارهم بين ستة إلى ثمانية أسابيع بشكل عشوائي إلى مجموعة تحكم (ن = 6) ومجموعة EAE (ن = 12) لهذه الدراسة. تم شراء الفئران من مركز التجربة بجامعة نينغشيا الطبية. تم إيواء الفئران في غرفة يتم التحكم فيها في درجة الحرارة والرطوبة مع دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة ، وحرية الوصول إلى المياه العذبة والغذاء. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية من لجنة أخلاقيات التجريبية بجامعة نينغشيا الطبية قبل بدء الدراسة.

1. تطوير EAE الانتكاسي في الفئران C57BL / 6

  1. إذابة الكاشف
    1. قم بإذابة 5.4 مجم MOG35-55 (جدول المواد) في 1.8 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). يزن 12.6 مجم من المتفطرة السلية H37RA (جدول المواد) وأضفه إلى 1.8 مل من محلول Freund المساعد الكامل (CFA) (جدول المواد). قم بإذابة 360 ميكرولتر من سم السعال الديكي (PTX; جدول المواد) إلى 7.2 مل من PBS باستخدام ماصة (جدول المواد).
  2. تحضير مستحلب MOG35-55 و CFA
    1. محلول الماصة MOG35-55 ومحلول CFA باستخدام حقنتين سعة 5 مل محضرتين في الخطوة 1.1 وتوصيلها بصمام نقطة الإنطلاق. تخلط باستمرار على الثلج لمدة 1 ساعة حتى يتم الحصول على مستحلب حليب من الماء في الزيت.
      ملاحظة: يتم تحضير المستحلب بنجاح عندما يطفو على سطح الماء دون تشتت بعد إسقاطه في الماء.
  3. تخدير الفأر
    1. قم بفك غطاء مانع التسرب في الطرف الأمامي لمبخر آلة التخدير. صب ببطء 20 مل من الأيزوفلوران على طول برغي الختم في المنتصف وقفل غطاء ختم التعبئة. قم بتبديل مفتاح صمام الإنطلاق للتأكد من توصيل تدفق الهواء من مبخر آلة التخدير بصندوق تحريض التخدير (جدول المواد).
    2. قم بتوصيل مصدر طاقة مضخة الهواء ، وقم بتشغيل مفتاح مضخة الهواء ، وقم بتدوير وضبط صمام مصدر الهواء في الطرف الأمامي لمقياس تدفق الأكسجين بحيث يكون تدفق الغاز الناتج 400 مل / دقيقة. افتح المبخر ، واضبط تركيز الحث على 3٪ ، وانتظر حتى يملأ المخدر صندوق الحث.
    3. بعد حوالي 1 دقيقة ، ضع الفئران في صندوق الحث ، ثم أغلق صندوق الحث ، وانتظر حتى تكون الفئران في نوم عميق ، واسترخاء العضلات ، وتنفس ثابت ؛ بعد ذلك ، يمكن تحديد الفئران على أنها الحالة المثالية للتخدير (جدول المواد).
      ملاحظة: قم بتبديل مفتاح صمام الإنطلاق لضمان توصيل تدفق الهواء من مبخر آلة التخدير بقناع التخدير حتى يتم تخدير الفئران بالكامل.
  4. تحصين الفئران
    1. قم بحقن 200 ميكرولتر من المستحلب المحضر في الخطوة 1.2 تحت الجلد باستخدام حقنة سعة 1 مل مع الإبرة في أربعة مواقع على ظهر الفأر ، حوالي 0.5 سم على جانبي العمود الفقري في الإبط ومستوى الفخذ12 في فئران مجموعة EAE. استخدم 50 ميكرولتر من المستحلب في كل موقع (جدول المواد).
  5. حقن PTX
    1. أخرج الفئران من القفص عن طريق اصطياد الذيل ووضعه على سلك القفص. أمسك ذيل الفئران بالأصابع 4 و 5 واسحبه برفق للحفاظ على اتجاه الجسم والأطراف للأمام. أمسك رأس الفئران والتقط الجلد الموجود على ظهر الفئران باستخدام الأصابع الوسطى والبنصر
    2. في 0 ساعة و 48 ساعة بعد التحصين في الخطوة 1.4 ، يتم حقن 200 ميكرولتر من PTX داخل الصفاق في موضع 0.5 سم على طول جانبي خط منتصف البطن بعمق اختراق 1-2 سم باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة (جدول المواد).
      ملاحظة: قبل حقن PTX بعد 48 ساعة من تحصين MOG35-55 ، من الضروري تخدير الفئران باستخدام الإجراءات الموضحة في الخطوة 1.3. يجب الاهتمام بالفئران حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على التكسير القصي.
    3. بالنسبة للفئران في المجموعة الضابطة ، عالج بالمحلول الملحي باستخدام نفس الطريقة وقم بتقييم النتيجة السريرية يوميا.
      ملاحظة: تم تقييم الفئران بحثا عن علامات EAE وفقا للمقياس التالي13: 0 = لا توجد أعراض مرضية ، 1 = شلل كامل في الذيل ، 2 = شلل / ضعف جزئي في الخلف ، 3 = شلل كامل في الأطراف الخلفية ، 4 = شلل الأطراف الأمامية والخلفية ، و 5 = حالة محتضرة.

2. تحليل التلوين النسيجي

  1. جمع الدماغ
    1. تخدير الفئران باتباع الخطوة 1.3. قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم وافتح الصدر لكشف القلب بالكامل. اقطع الأذن الزائدة وقم بتقطيعها ببطء باستخدام محلول ملحي مبرد مسبقا باستخدام حقنة سعة 20 مل بإبرة في البطين الأيسر حتى يصبح الكبد رماديا وأبيض.
    2. قم بتقطيع 4٪ بارافورمالدهايد حتى يظهر طرف الذيل ، ويصبح الجسم متيبسا ، ويصبح الكبد قاسيا. قطع رأس الرأس ، وقطع الجمجمة ، وجمع الدماغ باستخدام الملقط ، وإصلاحه في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة (جدول المواد).
  2. تحضير أقسام البارافين
    1. الجفاف المتدرج: اغمر أنسجة المخ من الخطوة 2.1 على التوالي في 70٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، 80٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، 95٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، إيثانول لامائي لمدة ساعة واحدة ، استبدل بالإيثانول اللامائي الطازج ، استمر في الغمر لمدة ساعة واحدة (جدول المواد).
    2. الشفافية: اغمر أنسجة المخ من الخطوة 2.2.1 في الزيلين لمدة 30 دقيقة ، واستبدلها بالزيلين الطازج ، واستمر في الغمر حتى تصبح الأنسجة شفافة (جدول المواد).
    3. التضمين: قم بتضمين أنسجة المخ من الخطوة 2.2.2 في البارافين لمدة ساعة واحدة ، واستبدلها بالبارافين الطازج ، واستمر في التضمين لمدة ساعة واحدة ، وتقطيعها إلى شرائح 6 ميكرومتر بعد تحرير القالب ، ووضع الشريحة في الماء الساخن ، وجففها عند 37 درجة مئوية ، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (جدول المواد).
    4. إزالة الشمع: اغمر أنسجة المخ من الخطوة 2.2.3 في الزيلين لمدة 20 دقيقة ، واستبدلها بالزيلين الطازج ، واستمر في الغمر لمدة 20 دقيقة ، وضعها في الإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج ، واغمرها لمدة 5 دقائق ، 75٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها بماء الصنبور (جدول المواد).
    5. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H & E): تلطيخ الأنسجة من الخطوة 2.2.4 بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 3-5 دقائق ثم اشطفه بماء الصنبور. عالج الأنسجة بمحلول تمايز الهيماتوكسيلين ، لفترة وجيزة واشطفها جيدا بماء الصنبور. عالج الأنسجة بمحلول الهيماتوكسيلين سكوت المزرق ، واشطفه بماء الصنبور. اغمر في 85٪ إيثانول لمدة 5 دقائق و 95٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، وقم بتلطيخ خطوات بصبغة اليوزين لمدة 5 دقائق (جدول المواد).
    6. التجفيف: اغمر الأنسجة من الخطوة 2.2.5 على التوالي في الإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج ، واستمر في الغمر لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج ، واغمرها لمدة 5 دقائق ، والزيلين لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالزيلين الطازج ، واغمرها لمدة 5 دقائق ، ثم أختمت باللثة المحايدة (جدول المواد).
    7. مراقبة أنسجة المخ باستخدام المجهر وإجراء الحصول على الصور وتحليلها (جدول المواد).

3. تحليل تلطيخ LFB

  1. مجموعة غمد المايلين: قم بقص العمود الفقري للفئران من طرف الرأس لأعلى 2 أجزاء إلى طرف الذيل لأسفل 2 أجزاء ، وقم بتفجير الحبل الشوكي إلى طرف الذيل ، وقم بإصلاح الحبل الشوكي في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: تم حصاد غمد المايلين من نفس الفئران في الخطوة 2.1 ، وخطوات نضح القلب هي نفسها كما في 2.1.
  2. أقسام البارافين إزالة البارافين وإعادة الجفاف: ضع الشرائح من الخطوة 3.1 على التوالي في الزيلين لمدة 20 دقيقة ، واستبدلها بالزيلين الطازج ، واستمر في الغمر لمدة 20 دقيقة ، والإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج ، واغمرها لمدة 5 دقائق ، 75٪ كحول لمدة 5 دقائق ، واغسلها بماء الصنبور.
  3. تلطيخ أزرق سريع: ضع محلول تلطيخ أزرق سريع أ في فرن 60 درجة مئوية وقم بالتسخين المسبق لمدة 30 دقيقة. ضع الشرائح من الخطوة 3.2 في المحلول أ وقم بتغطيتها بغشاء بلاستيكي لمدة ساعة واحدة لمنع الشرائح من الجفاف ، ثم أخرج الشرائح واغسلها بسرعة بماء الصنبور.
  4. تمايز الخلفية: ضع الشرائح من الخطوة 3.3 في محلول تلطيخ أزرق سريع Luxol B لمدة 2 ثانية (بينما تكون الصبغة ساخنة) ، واغمر مباشرة في محلول تلطيخ أزرق سريع Luxol C للتمايز لمدة 15 ثانية ، واغسلها بالماء حتى يصبح غمد المايلين أزرق والخلفية عديمة اللون تقريبا.
  5. تلطيخ عداد الإيوسين: ضع الشرائح من الخطوة 3.4 في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية للتجفيف. بمجرد الانتهاء من ذلك ، أخرجيها من الفرن واتركيها لتبرد. ضع الشرائح في 95٪ من الإيثانول واليوزين لمدة 1 دقيقة.
  6. الجفاف والختم: ضع الشرائح من الخطوة 3.5 على التوالي في الإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج ، واستمر في الغمر لمدة 5 دقائق ، واستبدلها بالإيثانول اللامائي الطازج مرة أخرى ، واستمر في الغمر لمدة 5 دقائق ، والزيلين 5 دقائق ، واستبدلها بالزيلين الطازج ، واغمرها لمدة 5 دقائق. اغسل وجفف العينات وأغلقها بالعلكة المحايدة.
  7. فحص المجهر: جمع الصور وتحليلها باستخدام مجهر بصري عمودي (جدول المواد).

4. تحليل قياس التدفق الخلوي

  1. افتح تجويف البطن للفئران. استخرج الطحال باستخدام الملقط وفرم إلى قطع صغيرة من 1.5-2.5 سم في PBS على الجليد باستخدام المقص. طحن الطحال في 10 مل من RPMI-1640 الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري للجنين (FBS) باستخدام مكبس حقنة سعة 2.5 مل وادفعه عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر للحصول على معلق أحادي الخلية (جدول المواد).
    ملاحظة: تم حصاد الطحال من نفس الفئران في الخطوة 2.1.
  2. انقل المعلق الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.1 إلى أنابيب سعة 15 مل وقم بالتحلل باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء على الجليد لمدة 10 دقائق. يغسل باستخدام RPMI-1640 الذي يحتوي على 2٪ FBS ، وجهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا باستخدام RPMI-1640 الذي يحتوي على 2٪ FBS.
  3. عد الخلايا بعداد الخلايا التلقائي (جدول المواد) واضبط التركيز على 1 × 106 خلايا / مل.
  4. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنابيب سعة 1.5 مل وتحتضن ب 1 ميكرولتر من الجسم المضاد CD16 / 32 المضادللفأر 14 (0.5 مجم / مل) لمدة 30 دقيقة لمنع التلوين غير المحدد. اغسل باستخدام RPMI-1640 وجهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من RPMI-1640 التي تحتوي على 2٪ FBS.
  5. وصمة عار بالأجسام المضادة الخاصة ب CD45 (Alexa Fluor 700) و CD3 (FITC) و CD4 (APC) و CD69 (BV674) لخلايا Teff15 لمدة 30 دقيقة ، 2 ميكرولتر لكل جسم مضاد. وصمة عار مع الأجسام المضادة الخاصة ب CD45 (Alexa Fluor 700) و CD3 (FITC) و CD4 (APC) و CD44 (BV421) و CD62L (PE) لخلايا Tem16 لمدة 30 دقيقة ، 2 ميكرولتر لكل جسم مضاد. يغسل باستخدام RPMI-1640 وجهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 350 ميكرولتر من PBS. تحليل نسبة الخلية باستخدام مقياس التدفق الخلوي والبرنامج المرتبط به (جدول المواد).

5. تحليل السيتوكينات بواسطة مصفوفة حبة القياس الخلوي

  1. استخدم مجموعة حبة القياس الخلوي (جدول المواد) لقياس IL-2 و IL-4 و IL-6 و IL-10 و IL-17A وعامل نخر الورم (TNF) -α و IFN-γ في أدمغة الفئران ، والطرق كما هو موضح أدناه.
  2. اجمع دماغ الفأر كما هو موضح في الخطوة 2.1.
  3. استخراج البروتين الكلي: قطع ووزن 50 مجم من أنسجة المخ (ثلاثة أدمغة في المجموعة الضابطة ، ومجموعة EAE في مرحلة الذروة ، ومرحلة RR). ضع الأدمغة في أنابيب سعة 1.5 مل وأضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل الذي يحتوي على PMSF ومثبطات البروتياز ومثبطات الفوسفاتيز.
  4. قطع الأدمغة إلى قطع صغيرة حوالي 1 مم3 ، واستخراجها بواسطة الخالط بالموجات فوق الصوتية عند 400 واط ، و 5 ثوان تشغيل و 5 ثوان ؛ كرر لمدة 5 أضعاف. ضع الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق ، وجهاز الطرد المركزي على حرارة 12000 × جم لمدة 5 دقائق ، واجمع المادة الطافية (جدول المواد).
  5. قم بإعداد معايير السيتوكين Th1 / Th2 / Th17 للفأر كما هو موضح أدناه.
    1. افتح قارورة من معايير الماوس المجفف بالتجميد Th1 / Th2 / Th17. انقل المعايير إلى أنبوب بولي بروبلين مخروطي سعة 15 مل. قم بتسمية الجزء العلوي من الأنبوب كمعيار.
    2. أعد تشكيل المعايير في 2.0 مل من مخفف الفحص. اسمح للمعيار المعاد تشكيله بالتوازن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. امزج البروتين المعاد تكوينه برفق عن طريق سحب العينات.
    3. قم بتسمية أنابيب 12 مم × 75 مم ورتبها بترتيب التخفيف التالي: 1: 2 ، 1: 4 ، 1: 8 ، 1:16 ، 1:32 ، 1:64 ، 1: 128 ، و 1: 256. الماصة 300 ميكرولتر من مخفف الفحص في كل أنبوب مسمى.
    4. إجراء التخفيفات التسلسلية: انقل 300 ميكرولتر من أعلى مستوى إلى أنبوب التخفيف 1:2 واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات. استمر في التخفيفات التسلسلية عن طريق نقل 300 ميكرولتر من الأنبوب 1: 2 إلى الأنبوب 1: 4 وهكذا حتى الأنبوب 1: 256. قم بإعداد أنبوب 12 مم × 75 مم يحتوي فقط على مخفف الفحص ليكون بمثابة تحكم سلبي 0 بيكوغرام / مل.
      ملاحظة: امزج جيدا عن طريق سحب العينات. لا تقم بالدوامة لمنع اقتران الأجسام المضادة على الميكروبيدات من السقوط.
    5. لخلط حبات التقاط السيتوكين Th1 / Th2 / Th17 للفأر ، قم بإعداد 19 أنبوبا ، بما في ذلك المعايير التي تحتوي على 3 عينات في كل مجموعة (المجموعة الضابطة ، ومجموعة EAE في مرحلة الذروة ، ومرحلة RR) للتجربة. دوامة تعليق حبة الالتقاط بقوة لمدة 5 ثوان قبل الخلط. أضف 190 ميكرولتر من كل حبة التقاط في أنبوب واحد وقم بتسميتها بخرز التقاط مختلط. دوامة خليط الخرز جيدا.
      ملاحظة: ستستقر الخرزات المترافقة بالأجسام المضادة من التعليق بمرور الوقت. من الضروري دوامة القارورة قبل أخذ حصة معلقة من الخرز.
    6. لإجراء الفحص ، قم بتدوير الخرز الكهربائي للمزيج. أضف 50 ميكرولتر من الخرز إلى جميع أنابيب الفحص. أضف 50 ميكرولتر من التخفيفات القياسية للسيتوكين Th1 / Th2 / Th17 إلى أنابيب التحكم كما في الجدول 1.
    7. أضف 50 ميكرولتر من كاشف الكشف عن الماوس Th1 / Th2 / Th17 PE إلى جميع أنابيب الفحص. احتضان أنابيب الفحص لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة وحمايتها من الضوء. أضف 1 مل من مخزن الغسيل المؤقت إلى كل أنبوب فحص وجهاز طرد مركزي بمعدل 200 × جم لمدة 5 دقائق. استنشق وتخلص من المادة الطافية من كل أنبوب فحص بعناية.
    8. أضف 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى كل أنبوب فحص لإعادة تعليق حبيبات الخرزة. قم بتحليل بيانات السيتوكين Th1 / Th2 / Th17 بالماوس باستخدام برنامج FCAP Array (جدول المواد).

  

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم الدرجات السريرية
كما هو موضح في الشكل 1 ، لم تظهر على الفئران في المجموعة الضابطة أي أعراض سريرية. أظهرت الفئران في مجموعة EAE ، التي تم تحصينها ب MOG35-55 ، شلل الذيل بعد حوالي 12 يوما من التحصين. بحلول اليوم 16 ، وصلت الأعراض إلى شلل كامل في الأطراف الخلفية (تعرف بمرحلة الذروة ، الذروة). بعد ذلك ، تم تخفيف الأعراض تدريجيا. تفاقمت الأعراض السريرية للفئران في حوالي اليوم 25 ووصلت إلى شلل كامل في الأطراف الخلفية في اليوم 30 تقريبا (تعرف بمرحلة الانتكاسية ، RR). والجدير بالذكر أن الأعراض استمرت لفترة أطول من المرة السابقة ، والتي طورت ميزة الانتكاسية الكلاسيكية. يتعرض المظهر الرئيسي لفئران EAE الانتكاسية والانتكاسية لمراحل مختلفة من التفشي والمغفرة والانتكاس أثناء تطور المرض ، والتي لها دورية وتذبذب معينين.

التحليل النسيجي
أظهرت فئران المجموعة الضابطة بنية أنسجة المخ سليمة مع أوعية دموية موزعة بالتساوي ومحددة بوضوح ، دون أي تسلل التهابي للخلايا. (الشكل 2 أ). في مرحلة الذروة لفئران مجموعة EAE ، لوحظ تسلل كبير للخلايا الالتهابية في الدماغ (الشكل 2 ب) ، مما أدى إلى تغيرات تشبه الكفة حول الأوعية الدموية (يشار إليها بالسهم الأحمر). وبالمثل ، في فئران مجموعة EAE في مرحلة RR ، كان هناك تسلل واضح للخلايا الالتهابية (الشكل 2C) ، مع تراكم سائد حول الأوعية الدموية (يشار إليه بالسهم الأحمر).

تحليل تلطيخ LFB
في المجموعة الضابطة ، ظهر غمد المايلين للمادة البيضاء الشوكية باللون الأزرق ، مما يشير إلى أن هيكله كان سليما ومعبأا بإحكام (الشكل 3 أ). في مرحلة الذروة من مجموعة EAE ، أظهرت المادة البيضاء الشوكية لونا أزرق فاتحا أو أبيض. بدا الهيكل فضفاضا ومقطعا ، مع وجود كبير للتنكس الفراغي المشار إليه بسهم أحمر (الشكل 3 ب). في مرحلة RR لمجموعة نموذج EAE ، لوحظ فقدان كبير لمايلين المادة البيضاء في النخاع الشوكي. بدا الهيكل فضفاضا ، ويمكن ملاحظة عدد كبير من التنكس الفراغي (يشار إليه بالسهام الحمراء ؛ الشكل 3 ج).

مقايسة قياس التدفق الخلوي
أظهرت النتائج الموضحة في الشكل 4 أ ، ب زيادة كبيرة في نسبة خلايا CD4 + CD69 + Teff في فئران EAE في مرحلة الذروة عند مقارنتها بالمجموعة الضابطة (P < 0.0001). بالإضافة إلى ذلك، زادت نسبة هذه الخلايا أيضا خلال مرحلة الاختطار النسبي، على الرغم من أن الفرق لم يكن يعتد به إحصائيا (P > 0.05). كشف الشكل 4C ، D عن ارتفاع ملحوظ في نسبة خلايا CD4 + CD44 + CD62L- Tem في الفئران EAE في كل من مرحلتي الذروة والRR ، مقارنة بالمجموعة الضابطة (P < 0.0001).

قياس السيتوكين بواسطة مصفوفة حبة القياس الخلوي
توضح النتائج الموضحة في الشكل 5 أنه عند مقارنتها بالمجموعة الضابطة ، كانت مستويات IL-4 (P < 0.0001) و IL-6 (P < 0.001) و IFN-γ (P < 0.0001) و TNF-α (P < 0.0001) مرتفعة بشكل ملحوظ في مجموعة EAE في مرحلة الذروة. في حين زاد التعبير عن IL-17A أيضا ، لم يكن الفرق يعتد به إحصائيا (P > 0.05). وعلاوة على ذلك، لم يظهر مستوى IL-2 أي تغيير خلال مرحلة الذروة لفئران EAE (P > 0.05). ومع ذلك، فقد ارتفع بشكل ملحوظ خلال مرحلة التراجعي (P < 0.01). علاوة على ذلك، كانت تعبيرات كل من TNF-α (P < 0.001) وIL-17A (P < 0.01) في مرحلة الRR أعلى بشكل ملحوظ من تلك التي لوحظت في المجموعة الشاهدة. وعلى العكس من ذلك، كان التعبير عن IL-10 في مجموعة EAE أقل بكثير من ذلك في المجموعة المرجعية، سواء في مرحلتي الذروة أو الاختطار النسبي (P < 0.0001).

figure-results-1
الشكل 1: تقييم الدرجات السريرية. تم تقييم النتيجة السريرية يوميا وتظهر أن الفئران طورت EAE كلاسيكيا انتكاسيا محصنا بواسطة MOG35-55. (أ) الرسم البياني لتطور أعراض الفئران EAE. (ب) تقييم الفئران EAE من خلال متوسط الدرجات السريرية. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM ، ن = 6. تم تحليل المعطيات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات لاحقة لتقييم الفروق ذات الدلالة الإحصائية. * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001 ، **** P < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: خريطة مجهرية لتلوين H & E في الدماغ. (أ) دماغ الفئران في المجموعة الضابطة. (ب) دماغ الفئران EAE في مرحلة الذروة. تم تسلل الخلايا الالتهابية إلى الدماغ في مرحلة الذروة في فئران مجموعة EAE وتوزيعها حول الأوعية الدموية لتشكيل تغيير يشبه الكفة (السهم الأحمر). (ج) دماغ الفئران EAE في مرحلة RR. تجمعت الخلايا الالتهابية في فئران مجموعة EAE في مرحلة RR حول الأوعية الدموية (السهم الأحمر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: خريطة مجهرية لتلوين غمد المايلين LFB. (أ) غمد المايلين الفئران في المجموعة الضابطة. (ب) غمد المايلين للفئران EAE في مرحلة الذروة. كانت المادة البيضاء الشوكية زرقاء فاتحة أو بيضاء ، وكان الهيكل فضفاضا ومقطعا ، وظهر عدد كبير من التنكس الفراغي (السهم الأحمر). (ج) غمد المايلين للفئران EAE في مرحلة RR. فقد مايلين المادة البيضاء في الحبل الشوكي على نطاق واسع ، وكان الهيكل فضفاضا ، وظهر عدد كبير من التنكس الفراغي (السهم الأحمر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: أدى التحصين بواسطة MOG35-55 إلى زيادة التنظيم لنسبة خلايا CD4 Teff و Tem في كل من مرحلة الذروة وRR في فئران EAE. (أ) مخطط تدفق توضيحي يعرض التلوين المناعي لخلايا CD4 + CD69 + . (ب) النسبة المئوية لخلايا CD4 + CD69 + Teff. (ج) مخطط تدفق توضيحي يعرض التلوين المناعي لخلايا CD44 + CD62L + (بوابة على خلايا CD4 T). (د) النسبة المئوية لخلايا CD44 + CD62L + Tm. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM ، ن = 5. تم تحليل المعطيات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات لاحقة لتقييم الفروق ذات الدلالة الإحصائية. * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001 ، **** P < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: مستوى السيتوكينات في دماغ الفئران تم تحليله بواسطة مجموعة حبة قياس الخلوي. يتم التعبير عن البيانات بمتوسط ± SEM ، n = 3. تم تحليل المعطيات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات لاحقة لتقييم الفروق ذات الدلالة الإحصائية. * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001 ، **** P < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تسمية الأنبوبالتركيز (pg / مل)التخفيف القياسي للسيتوكين
10 (تحكم سلبي)لا يوجد تخفيف قياسي (مخفف الفحص فقط)
2201:256
3401:128
4801:64
51561:32
6312.61:16
76251:8
812501:4
925001:2
105000أعلى مستوى

الجدول 1: قائمة التخفيفات القياسية للسيتوكين لأنابيب التحكم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض التصلب العصبي المتعدد هو أكثر أمراض إزالة الميالين المناعي الذاتي انتشارا في الجهاز العصبي المركزي ، والذي يصيب ملايين الأشخاص في جميع أنحاءالعالم 17. EAE هو النموذج الحيواني النموذجي لمحاكاة السمات المرضية السريرية ل MS18. أظهرت الدراسات أن الأفراد المصابين بالتصلب العصبي المتعدد يعانون من ضعف إدراكي وإعاقات أخرى بسبب تنكس المحاور والخلايا العصبية في الجهاز العصبيالمركزي 19،20،21. في مرحلة الذروة وRR من نموذج EAE ، أظهرت الفئران شلل في ذيولها وأطرافها الخلفية. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أن الخلايا الالتهابية تتسلل إلى الجهاز العصبي المركزي ، مما يؤدي إلى درجات متفاوتة من فقدان غمد المايلين. أشارت هذه النتائج إلى التأسيس الناجح لنموذج EAE في هذه التجربة.

يجب إجراء عملية الاستحلاب ل MOG35-55 و CFA على الجليد لمنع تدهور MOG35-55 الناجم عن توليد الحرارة أثناء عملية التجانس. يتم إعطاء PTX داخل الصفاق لتعزيز نفاذية الأوعية الدموية ، مما يسمح للخلايا التائية بعبور الحاجز الدموي الدماغي بسهولة والوصول إلى غمد المايلين المحيط بالخلايا العصبية22. ما يستدعي اهتماما خاصا هو أنه في الحالات التي تصاب فيها الفئران بالشلل ولا تستطيع تحمل الأكل أو الشرب بمفردها ، من المهم توفير صواني الطعام والماء في قفصها أو إطعامها يدويا لمنع العطش المفرط والجوع.

تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل نسبة خلايا التيف CD4 + CD69 + وخلايا CD4 + CD44 + CD62L- Tem. تم تنظيم نسبة خلايا التيف CD4 + CD69 + في طحال الفئران EAE بشكل ملحوظ في مرحلة الذروة. بالإضافة إلى ذلك ، كان أعلى من المجموعة الضابطة في مرحلة الانتكاس ، على الرغم من أن هذا الاختلاف لم يصل إلى دلالة إحصائية. من ناحية أخرى ، كانت نسبة خلايا CD4 + CD44 + CD62L- Tem أعلى بشكل ملحوظ في فئران EAE مقارنة بالمجموعة الضابطة في كل من مرحلة الذروة ومرحلة RR. يشير هذا إلى أن بدء EAE قد يشمل كلا من خلايا CD4 + CD69 + Teff و CD4 + CD44 + CD62L- Tem في مرحلة الذروة ، في حين أن مرحلة RR ربما تهيمن عليها خلايا CD4 + CD44 + CD62L- Tem في مرحلة RR. CD69 هو أقدم جزيء سطح الغشاء يتم التعبير عنه أثناء تنشيط الخلايا الليمفاوية. يلعب دورا مهما في تعديل التصاق وهجرة الخلايا التائية ، وبالتالي مساعدة الخلايا المناعية في تحديد مواقع العدوى أو الالتهابات داخل الجسموتوطينها 23. لا تعبر الخلايا التائية المريحة عن CD69 ، ولكن عندما يتم تحفيزها وتنشيطها بواسطة منشطات مضادة ل CD3 / TCR يمكن التعبير عنها بشكل حثي24. بعد مرحلة المستجيب ، يخضع جزء كبير من الخلايا التائية لموت الخلايا المبرمج لأنها غير قادرة على التمايز أكثر من ذلك. يحدث هذا الانخفاض في الأعداد بشكل أساسي بسبب عدم وجود السيتوكينات المؤيدة للبقاء على قيد الحياة ، بما في ذلك IL-2 ، والتي يتم إنتاجها أثناء تحفيز المستضد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تقليل تنظيم مستقبلات هذه السيتوكينات يساهم بشكل أكبر في ظاهرة الانكماش النسيلي25. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي إزالة العامل المعدي من خلال استجابة مناعية تكيفية إلى تقلص نسيلي للخلايا التائية ، مما يترك في النهاية عددا أقل من خلايا الذاكرة طويلة العمر لتوفير استجابة مناعية للمضيف في حالة الإصابة مرة أخرى بالعامل الممرض26. في الدراسة الحالية ، ارتفعت نسبة الخلايا التائية CD4 + CD69 + بشكل ملحوظ في مرحلة الذروة ولكنها انخفضت في مرحلة RR ، مما يشير إلى أن خلايا CD4 Teff غير قادرة على البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة وتخضع في النهاية لموت الخلايا المبرمج ، فقط جزء صغير من الخلايا التائية الخاصة بالمستضد يتطور إلى خلايا ذاكرة تائية طويلة العمر. تحتوي خلايا Tem على تعبير منخفض عن CD62L. ومع ذلك ، فهي قادرة على التعبير عن بعض مستقبلات الكيموكين وجزيئات الالتصاق التي تسهل هجرتها إلى الأنسجة الملتهبة. بعد إعادة تنشيط المستضد ، يكون معدل الانتشار بطيئا نسبيا ، ولكن يتم إطلاق السيتوكينات بسرعة لبدء وظيفة المستجيب27. في هذه الدراسة ، المستضدات في الفئران المنبعثة من المستحلب وهاجمت الجهاز المناعي مرة أخرى ، يمكن إعادة تنشيط خلايا Tem وإطلاق عدد كبير من السيتوكينات ، مثل IL-6 و IFN-γ ، مما قد يؤدي إلى انتكاسة فئران EAE.

مجموعات الخلايا التائية CD4 الأولية المؤيدة للالتهابات المرتبطة بأمراض المناعة الذاتية (بما في ذلك مرض التصلب العصبي المتعدد) هي خلايا Th1 التي تفرز خلايا IL-2 و IL-6 و IFN-γ و TNF-α و Th17 التي تفرز IL-17. لقد ثبت أن IFN-γ المرتبط بخلية Th1 يمكن أن يكون له تأثير ضار مباشر على الخلايا قليلة التغصن ، مما يؤدي إلى تلف الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزيللمريض 28. تلعب خلايا Th17 أيضا دورا مهما في العديد من أمراض المناعة الذاتية ، بما في ذلك مرض التصلب العصبي المتعدد. لاحظت الأبحاث مستويات مرتفعة من خلايا Th17 و IL-17 mRNA في آفات الدماغ لمرضى التصلب العصبي المتعدد عند مقارنتها بالأفراد غير المصابين بالمرض29. خلايا Treg ، التي تتميز بإنتاج IL-10 و TGF-β30 ، لها تأثير مثبط للمناعة وتلعب دورا مهما في الحفاظ على تحمل الجهاز المناعي للمكونات الذاتية ، وبالتالي تمكين الجسم من الحفاظ على التوازن المناعي. لاحظنا هنا تنظيما متزايدا كبيرا لتعبير IL-4 و IL-6 و IFN-γ و TNF-α في مجموعة EAE في مرحلة الذروة. بالإضافة إلى ذلك ، تم أيضا زيادة التعبير عن IL-17A ، على الرغم من عدم وجود أهمية. في المقابل، كانت مستويات التعبير عن TNF-α و IL-17A في مرحلة الRR أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بالمجموعة الشاهدة. يشير هذا إلى أن مرحلة الذروة من EAE مدفوعة بشكل أساسي بخلايا Th1 بدلا من خلايا Th17 ، في حين أن مرحلة RR من EAE بدأت بواسطة كل من خلايا Th1 و Th17. تجدر الإشارة إلى أن التعبير عن IL-10 في مجموعة EAE في كل من فترة الذروة والRR كان أقل بشكل ملحوظ من ذلك في المجموعة الضابطة ، مما يشير إلى أن الوظيفة المثبطة للمناعة لخلايا Treg قد أعاقت أثناء الموكب المرضي ل EAE.

في الختام ، تشير دراساتنا إلى الإنشاء الناجح لنموذج EAE الانتكاسي للفئران من خلال التحصين باستخدام الببتيد MOG35-55. من منظور المرحلة النشطة ، ربما بدأت مرحلة الذروة من EAE بواسطة خلايا CD4 + CD69 + Teff و CD4 + CD44 + CD62L- Tem ، في حين أن انتكاس مرحلة EAE RR قد تهيمن عليه بشكل أساسي خلايا CD4 + CD44 + CD62L- Tem. من منظور وظيفة التأثير المناعي ، بدأت مرحلة الذروة من EAE بشكل أساسي ليس بواسطة خلايا Th17 ولكن بواسطة خلايا Th1. ومع ذلك ، بدأت مرحلة RR من EAE بواسطة خلايا Th1 و Th17. تم تثبيط الوظيفة المثبطة للمناعة لخلايا Treg أثناء العملية المرضية EAE. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء تنشيط خلايا Th1 / Th17 وقمع خلايا Treg تتطلب مزيدا من التحقيق.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في نينغشيا (2022AAC03601 و 2023AAC02087) ومؤسسة الأبحاث بجامعة نينغشيا الطبية (XM2019052). شكرا لدعم مركز أبحاث العلوم والتكنولوجيا الطبية بجامعة نينغشيا الطبية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مبخر آلة التخديرNorvap20-17368
  ؛ Co.Ltd تداول IsofluraneSigma-Aldrich (شنغهاي).792632
70 مو ؛ م خلية مصفاةXIYAN المحدودة15-1070
Alexa Fluor 700 المضاد للفأر CD45 الأجسام المضادةBiolegend103128
APC المضادة للفأر CD4 الأجسام المضادةBiolegend100616
عداد الخلايا الأوتوماتيكيJiangsu JIMBIO Technology Co.، LTDJIMBIO iCyta S2
BD * مصفوفة حبة القياس الخلوي (CBA) ماوس Th1 / Th2 / Th17 CBA KitBD Biosciences560485
Biotin مضاد للفأر CD16 / 32 الأجسام المضادةBiolegend101303
Brilliant Violet 510 المضاد للفأر CD69 الأجسام المضادةBiolegend104532
BV786 الفئران المضادة للفأر CD62L (MEL-14)BD Pharmingen563109
عمود الأنسجة & طقم استخراج البروتين الخلويشنغهاي Epizyme Biomedical Technology Co.، LtdPC201Plus
Complete Co.Ltd تداول سيجما ألدريتش (شنغهاي) المساعد لفرويند.  مجفف SLCH4887
DIAPATHDonatello
حقنة معقمة يمكن التخلص منها (1 مل)Yikang Group210820
حقنة معقمة يمكن التخلص منها (2.5 مل)Yikang Group210820
حقنة معقمة يمكن التخلص منها (5 مل)Yikang Group210820
آلة الصباغةDIAPATHGiotto
آلة التضمينووهان Junjie Electronics Co.، LtdJB-P5
الإيثانولSCRC100092683
مصل الأبقارالجنيني Procell Life Science & التكنولوجيا المحدودةFSP500
FITC هامستر مضاد للفأر CD3e (145-2C11)BD Pharmingen553062
مقياس التدفق الخلويبيكتون وديكنسون وشركاهFACSمقياس
التدفق الخلويBecton و Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo softwareBD Biosciences10.8.1
منصة مجمدةووهان جونجي للإلكترونيات المحدودة ، Ltd JB-L5
زجاج الشريحةServicebioG6004
HE مجموعة حلول الصبغةServicebioG1003
حل الهيماتوكسيلين EosinServicebioG1002
جهاز طرد مركزي مبرد عالي السرعةنظام التصوير Thermo Fisher ScientificMogafugo8R
نيكوننيكون DS-U3
Luxol طقم تلطيخ أزرق سريعServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
المتفطرة السلية H37RABD Pharmingen231141
البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
الصمغ المحايدSCRC10004160
منظمKEDEEKD-P
فرنLaboteryGFL-230
قطاعة علم الأمراضLeicaRM2016
السعال الديكي من Bordetella السعال الديكيSigma-Aldrich (شنغهاي) Trading Co.Ltd.P7208
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتServicebioG4202
ماصة 0.5-10 & LDLAB 7010101004
الماصة العلمية 100-1000 & LDLAB ماصة 7010101014
20-200 مو ؛ LDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640Procell Life Science & التكنولوجيا المحدودةPM150110
صمام المحملةقوانغدونغ Kanghua الطبية المحدودةA06
الأنسجة الموزعةZhejiang Kehua Instrument Co.، LtdKD-P
مجهر بصري مستقيمنيكون نيكونكسوف E100
XyleneSCRC10023418
السم العلمية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swanberg, K., et al. Multiple sclerosis diagnosis and phenotype identification by multivariate classification of in vivo frontal cortex metabolite profiles. Sci Rep. 12 (1), 13888(2022).
  2. Zahoor, I., et al. An emerging potential of metabolomics in multiple sclerosis: a comprehensive overview. Cell Mol Life Sci. 78 (7), 3181-3203 (2021).
  3. Vitturi, B., et al. Spatial and temporal distribution of the prevalence of unemployment and early retirement in people with multiple sclerosis: A systematic review with meta-analysis. PloS one. 17 (7), 0272156(2022).
  4. Brambilla, R. The contribution of astrocytes to the neuroinflammatory response in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Acta neuropathologica. 137 (5), 757-783 (2019).
  5. Niedźwiedzka-Rystwej, P., Tokarz-Deptuła, B., Deptuła, W. Characteristics of T lymphocyte subpopulations. Postepy Hig Med Dosw. 67, 371-379 (2013).
  6. Loos, J., et al. Functional characteristics of Th1, Th17, and ex-Th17 cells in EAE revealed by intravital two-photon microscopy. J neuroinflammation. 17 (1), 357(2020).
  7. Prajeeth, C., et al. Effectors of Th1 and Th17 cells act on astrocytes and augment their neuroinflammatory properties. J neuroinflammation. 14 (1), 204(2017).
  8. Nielsen Birgitte, R., et al. Characterization of naïve, memory and effector T cells in progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 310, 17-25 (2017).
  9. Xie, L., et al. The role of CD4+ T cells in tumor and chronic viral immune responses. Med Comm. 4 (5), e390(2023).
  10. Sun, L., et al. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  11. Kawabe, T., et al. Memory-phenotype CD4+ T cells spontaneously generated under steady-state conditions exert innate TH1-like effector function. Sci Immunol. 2 (12), (2017).
  12. Moon, J., et al. A study of experimental autoimmune encephalomyelitis in dogs as a disease model for canine necrotizing encephalitis. J Vet Sci. 16 (2), 203-211 (2015).
  13. Pérez-Nievas, B., et al. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J neuroinflammation. 7, 60(2010).
  14. Zheng, J., et al. Prostaglandin D2 signaling in dendritic cells is critical for the development of EAE. J Autoimmun. 114, 102508(2020).
  15. Adamczyk, M., et al. The expression of activation markers CD25 and CD69 increases during biologic treatment of Psoriasis. J Clin Med. 12 (20), 6573(2023).
  16. Meng, R., et al. Echinococcus multilocularisIndoleamine 2,3-dioxygenase 1 signaling orchestrates immune tolerance in -infected mice. Front Immunol. 13, 1032280(2022).
  17. Sheinin, M., et al. Suppression of experimental autoimmune Encephalomyelitis in mice by β-Hydroxy β-Methylbutyrate, a body-building supplement in humans. J Immunol. 211 (2), 187-198 (2023).
  18. Ghareghani, M., et al. Hormones in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) animal models. Transl Neurosci. 12 (1), 164-189 (2021).
  19. Pérez-Miralles, F., et al. Clinical impact of early brain atrophy in clinically isolated syndromes. Mult Scler. 19 (14), 1878-1886 (2013).
  20. Nygaard, G., et al. Cortical thickness and surface area relate to specific symptoms in early relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (4), 402-414 (2015).
  21. Biberacher, V., et al. Atrophy and structural variability of the upper cervical cord in early multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (7), 875-884 (2015).
  22. Ma, Y., et al. Epsilon toxin-producing Clostridium perfringens colonize the multiple sclerosis gut microbiome overcoming CNS immune privilege. J Clin Invest. 133 (9), e163239(2023).
  23. Cibrián, D., Sánchez, M. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur J Immunol. 47 (6), 946-953 (2017).
  24. Clarkson Benjamin, D., et al. Preservation of antigen-specific responses in cryopreserved CD4 and CD8 T cells expanded with IL-2 and IL-7. J Transl Autoimmun. 5, 100173(2022).
  25. Raeber Miro, E., et al. The role of cytokines in T-cell memory in health and disease. Immunol Rev. 283 (1), 176-193 (2018).
  26. Ville, S., et al. Co-stimulatory blockade of the CD28/CD80-86/CTLA-4 balance in transplantation: Impact on memory T cells. Front Immunol. 6, 411(2015).
  27. Natalini, A., et al. OMIP-079: Cell cycle of CD4+ and CD8+ naïve/memory T cell subsets, and of Treg cells from mouse spleen. Cytometry A. 99 (12), 1171-1175 (2021).
  28. Joffre, O., et al. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  29. Montes, M., et al. Oligoclonal myelin-reactive T-cell infiltrates derived from multiple sclerosis lesions are enriched in Th17 cells. Clin Immunol. 130 (2), 133-144 (2009).
  30. Feruglio, S., Kvale, D., Dyrhol, R. T. Cell responses and regulation and the impact of in vitro IL-10 and TGF-β modulation during treatment of active tuberculosis. Scand J Immunol. 85 (2), 138-146 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

T CD4 T Th1 Th17
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة