يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تجميع النيوكليوسوم في الموقع للقوة الترابطية أحادية الجزيء والفحص المجهري الفلوري

2.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66579

⸱

سبتمبر 6, 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة إجراء تجريبيا مفصلا لإعادة تكوين حبال الحمض النووي المحتوية على النيوكليوسوم للقوة المترابطة أحادية الجزيء والفحص المجهري الفلوري. كما يصف العديد من التجارب النهائية التي يمكن إجراؤها لتصور سلوك الربط للبروتينات المتفاعلة مع الكروماتين وتحليل التغيرات في الخصائص الفيزيائية للنيوكليوسومات.

الملخص

تشكل النيوكليوسومات الوحدة الأساسية للكروماتين حقيقيات النواة وكانت محور العديد من التحقيقات الإعلامية أحادية الجزيء فيما يتعلق بخصائصها الفيزيائية الحيوية وتفاعلاتها مع البروتينات المرتبطة بالكروماتين. عادة ما تتضمن إعادة تكوين النيوكليوسوم على الحمض النووي لهذه الدراسات إجراء غسيل الكلى بالملح الذي يوفر تحكما دقيقا في وضع وعدد النيوكليوسومات المتكونة على طول حبل الحمض النووي. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول يستغرق وقتا طويلا ويتطلب كمية كبيرة من الحمض النووي وأوكتامير الهيستون كمدخلات. لتقديم استراتيجية بديلة ، تم وصف طريقة إعادة تكوين النواة في الموقع لقوة الجزيء الواحد والفحص المجهري الفلوري الذي يستخدم مرافق هيستون Nap1. تمكن هذه الطريقة المستخدمين من تجميع النيوكليوسومات على أي قالب DNA دون الحاجة إلى تسلسلات قوية لتحديد مواقع النيوكليوسوم ، وضبط كثافة النيوكليوسوم عند الطلب ، واستخدام عدد أقل من الكواشف. يحدث تكوين النيوكليوسوم في الموقع في غضون ثوان ، مما يوفر سير عمل تجريبيا أبسط وانتقالا مناسبا إلى قياسات الجزيء الفردي. يتم وصف أمثلة على فحصين نهائيين لاستكشاف ميكانيكا النيوكليوسوم وتصور سلوك البروتينات الفردية على الكروماتين.

المقدمة

وحدة التعبئة الأساسية للكروماتين حقيقيات النواة هي النيوكليوسوم ، حيث يتم لف ~ 147 زوجا أساسيا (bps) من الحمض النووي حول أوكتامر من بروتينات الهستونات الأساسية1،2. بالإضافة إلى تغليف الجينوم ، تعمل بنية النيوكليوسوم كطبقة غنية أخرى من التنظيم الفيزيائي الحيوي الذي يمكن تسخيره بواسطة البروتينات المرتبطة بالكروماتين عند أداء وظائفها المختلفة3،4. كان الوصول التجريبي إلى الخصائص الفيزيائية للنيوكليوسومات وقياسها أمرا صعبا من الناحية الفنية لأن هذه الوحدات تعمل بمقاييس ضئيلة (على سبيل المثال ، أطوال النانومتر ، وقوى البيكونوتون) ، وبالتالي ، فإن استكشافها يتطلب حساسية ودقة كافية لإبلاغ الوظيفة بشكل هادف. علاوة على ذلك ، غالبا ما تتفاعل البروتينات المرتبطة بالكروماتين مع ركائزها بشكل عابر ، وتفتقر معظم مناهج المجموعة إلى الدقة الزمنية المناسبة لإبلاغ حركية هذهالتفاعلات 5. لحسن الحظ ، أتاح ظهور تقنيات الجزيء الفردي تصور البروتينات الفردية وتفاعلاتها ومعالجتها في الوقت الفعلي ، والكشف عن معلومات ميكانيكية حول هذه الأحداث الجزيئية التي تحدث على المقياسالنانوي 6. على وجه الخصوص ، تسخر القوة المترابطة أحادية الجزيء والفحص المجهري الفلوري (smCFFM) كلا من أدوات الكشف عن التألق عالي الدقة ومعالجة القوة لحل آليات وتكوين وتنسيق مجمعات الكروماتين وبروتينالكروماتين 7،8 في وقت واحد.

في smCFFM التي تستخدم على وجه التحديد "ملاقط بصرية" كطريقة للتلاعب بالقوة ، يتم استخدام ليزر مركز بإحكام لاحتجاز جسم عازل ، عادة ما يكون حبة بلاستيكية بحجم ميكرون ، في ثلاثة أبعاد9. يمكن اقتران البوليمر الحيوي مثل قطعة من الحمض النووي مع الخرزة (عن طريق ، على سبيل المثال ، الستربتافيدين البيوتين ، ديجوكسيجينين - ديجوكسيجينين - المضاد للديجوكسيجينين) ، ويمكن للمستخدم تطبيق قوة معايرة وقياس القوة / الإزاحة الناتجة عن النظام10. تتيح وحدة التألق المضافة التصوير الفلوري متعدد الألوان المتزامن لتتبع تكوين البروتين وسلوكه.

تتضمن الطريقة السائدة لإعادة تشكيل قوالب النيوكليوسوم ل smCFFM تجميع النيوكليوسومات على قوالب الحمض النووي المخصصة عن طريق غسيل الكلىبالملح 11،12،13. في هذا الإجراء ، يتم تحضين أوكتامير الهيستون المنقاة بقوالب الحمض النووي في مخزن مؤقت عالي الملح (~ 1 M كلوريد الصوديوم) ، وعندما يتم تحويل الملح ببطء بعيدا ، تتجمع النيوكليوسومات تلقائيا على الحمض النووي بطريقة موضعية تعتمد علىالتسلسل 14،15. على هذا النحو ، من المعتاد أن يتم دمج تسلسلات تحديد المواقع القوية للنيوكليوسوم (على سبيل المثال ، Widom 60116 ، X. laevis 5S rDNA17) في قوالب الحمض النووي لإنشاء مصفوفات نيوكليوسوم مخصصة. على الرغم من أن هذه الطريقة الراسخة توفر تحكما دقيقا في وضع وعدد النيوكليوسومات عبر الحمض النووي ، إلا أنها تعاني من العديد من العيوب: (1) قد يؤدي دمج تسلسل الحمض النووي القوي لتحديد مواقع النيوكليوسوم إلى توليد نيوكليوسومات مستقرة بشكل مصطنع تحيز نشاط البروتينات المرتبطة بالكروماتين ، (2) تتطلب عملية غسيل الكلى بالملح لتكوين النيوكليوسوم كميات كبيرة من الحمض النووي والأوكتامر ، و (3) يستغرق الإجراء من يوم إلى عدة أيام من العمل بالإضافة إلى جهد كبير لمعايرة نسبة الحمض النووي إلى الأوكتامير الصحيحة للحصول على كثافة مصفوفة النيوكليوسومات المثلى.

في هذه المخطوطة ، نصف طريقة بديلة لتشكيل النيوكليوسومات على طول الحمض النووي في الموقع داخل قوة ترابطية أحادية الجزيء ومجهر مضان باستخدام مرافق هيستون المؤتلف Nap1 ، والذي يشبه المسار الفسيولوجي لتكوين النيوكليوسوم في الجسم الحي18،19،20،21،22. تسمح هذه الطريقة للمستخدمين بتجميع النيوكليوسومات على تسلسلات DNA غير محددة ، وضبط كثافة النيوكليوسوم بسهولة ، واستخدام كميات أقل بكثير من الكواشف ، كل ذلك في غضون دقائق. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تكوين حبال الحمض النووي النووي في الموقع يتيح سير عمل تجريبي أبسط وراحة التصور والمعالجة المدمجة لجزيء واحد. وبالتالي ، عندما لا يكون تحديد موضع النيوكليوسوم المنتظم والمحدد ضروريا ، فإن هذا البروتوكول يوفر خيارا مفيدا للتحقيق في ميكانيكا النيوكليوسوم أو سلوك البروتين على الكروماتين ، والذي نصف أيضا أمثلة على الفحوصات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الحمض النووي البيوتينيل

  1. قم بإعداد تفاعل حجمي 120 ميكرولتر يحتوي على 20 ميكروغرام من λ DNA ، و 33 ميكرومتر من البيوتين-dCTP ، و 33 ميكرومتر من البيوتين-dUTP ، و 33 ميكرومتر من البيوتين-dATP ، و 33 ميكرومتر من dGTP ، و 10 وحدات من إنزيم Klenow ، و 1x NEB Buffer 2.
    ملاحظة: يستخدم هذا الإجراء على وجه التحديد الحمض النووي الجيني الخطي مزدوج الشريطة (ds) الخالي من المثيلة (ds) λ الحمض النووي الجيني (48،502 نقطة في الثانية) ، والذي يحتوي على 12 نيوكليوتيدات (nt) 5 'أحادي الشريطة (ss) DNAمتدلي 23. ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول للاستفادة من أي طول أو تسلسل من dsDNA الخطي بشرط أن يحتوي على ما لا يقل عن عدة nts من ss 5 'المتدلية ، والطول والتسلسل nt الذي يملي عدد nts البيوتينيل المثبت على كل طرف للربط النهائي بين المصائد البصرية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقليص التفاعل. على سبيل المثال ، يمكن استخدام 5 ميكروغرام من الحمض النووي في تفاعل حجمي 30 ميكرولتر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ركائز الحمض النووي المتولدة بهذه الطريقة ليست مقيدة بشكل التوائي للحصول على بروتوكولات لإنشاء حمض نووي مقيد الالتواء ، يرجى الرجوع إلى التقارير المنشورةسابقا 24،25.
  2. احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  3. أضف 10 ملي متر من EDTA واحتضنه عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. قم بإجراء ترسيب الإيثانول للحصول على منتج الحمض النووي الحيوي.
    1. أضف 0.1x حجم 3 M من أسيتات الصوديوم و 3x حجم من المثلج البارد 100٪ الإيثانول. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل حتى ليلة واحدة. جهاز طرد مركزي عند 13,500 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    2. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وأضف 1 مل من 75٪ من الإيثانول. جهاز طرد مركزي عند 13,500 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية.
    3. كرر إزالة المواد الطافية وإضافة الإيثانول وخطوات الطرد المركزي.
    4. قم بإزالة كل المادة الطافية بعناية واترك الحبيبات تجف في الهواء لمدة 10 دقائق. قم بإذابة الحبيبات في 100-200 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE أو ddH2O (يمكن أن تحتضن عند 37 درجة مئوية لتسهيل الذوبان). قم بقياس التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي Nanodrop.

2. تحضير القنوات في خلية التدفق

ملاحظة: يعتمد هذا الإجراء على شريحة موائع دقيقة متوفرة تجاريا (انظر جدول المواد) ولكن يمكن تكييفها مع أي أداة smCFFM مع خلية تدفق متعددة القنوات.

  1. القنوات التخميلة (الفصل) 4 و 5 (أو أي فصل يحتوي على بروتينات) (انظر تخطيطي القنوات في الشكل 1 أ). أضف 500 ميكرولتر من 0.1٪ BSA إلى كل قناة وتتدفق عند 0.8 بار (~ 0.45 ميكرولتر / ثانية للأنابيب بقطر داخلي 0.010 بوصة) لمدة 8 دقائق.
  2. أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ Pluronic-F127 إلى كل قناة وتدفقها عند 0.8 بار لمدة 8 دقائق. قم بإزالة المحلول واشطف المحاقن باستخدام 1x PBS. أضف 2 مل من 1x PBS إلى كل قناة وتتدفق عند 0.8 بار لمدة 27 دقيقة.
  3. دوامة محلول مخزون الخرز المطلي بالستربتافيدين (يستخدم هذا الإجراء حبات بحجم 3.13 ميكرومتر) وأضف 2.15 ميكرولتر من محلول الخرزة إلى 1 مل من 1x PBS. أضف إلى الفصل 1.
    ملاحظة: يمكن تعديل حجم وتركيز الخرز المطلي بالستربتافيدين وفقا لتفضيلات المستخدم.
  4. أضف 30-80 نانوغرام من الحمض النووي λ البيوتينيل إلى 1 مل من 1x PBS. أضف إلى الفصل 2.
    ملاحظة: يمكن تعديل تركيز الحمض النووي الحيوي حسب تفضيل المستخدم. ستزيد الكميات الأكبر من الحمض النووي من وتيرة تكوين حبال الحمض النووي ولكنها تزيد أيضا من وتيرة ربط جزيئات متعددة من الحمض النووي في وقت واحد ، مما قد يزيد من صعوبة التجربة.

3. تكوين النيوكليوسوم بوساطة Nap1 في الموقع

  1. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصور الخالي من البروتين إلى الفصل 3.
    ملاحظة: تركيبة المخزن المؤقت في الفصل 3 مرنة ويجب أن تكون مناسبة لكل من النيوكليوسومات والبروتين (البروتينات) المحددة ذات الأهمية. اختياريا ، يمكن للمستخدمين اختيار إضافة أنظمة كسح الأكسجين لتقليل التبييض الضوئي للفلوروفورات و / أو الحمض النووي المنافس لإزالة أوكتاميرات الهيستون غير الملفوفة بشكل صحيح في النيوكليوسومات.
  2. أضف 2 نانومتر S. cerevisiae Nap1 و 2-5 نانومتر H4 أوكتامر هيستون (HO) المسمى LD655 إلى 500 ميكرولتر من 1x HR buffer18. أضف إلى الفصل 4.
    ملاحظة: يمكن شراء أوكتامات هيستون و Nap1 تجاريا أو تحضيرها داخليا (انظر جدول المواد). يعتمد عدد النيوكليوسومات التي سيتم تشكيلها على طول كل حمض نووي مربوط على تركيز الأوكتامر بالإضافة إلى الوقت الذي يقضيه في هذه القناة. يمكن تعديل كثافة النيوكليوسوم المرغوبة والتقريبية للمستخدم على طول كل جزيء من جزيئات الحمض النووي عن طريق ضبط أي من هاتين المعلمتين أو كليهما. بالإضافة إلى ذلك ، قد يختار المستخدم تسمية أوكتامير هيستون بالفلوروفور المفضل لديه.
  3. اختياري: أضف بروتين مرتبط بالكروماتين أو أي بروتين آخر ذي أهمية إلى الفصل 5 في مخزن مؤقت مناسب.
  4. قم بتدفق جميع القنوات عند 1.0 بار (~0.55 ميكرولتر / ثانية في الإعداد التجريبي الحالي) لمدة 30 ثانية لمسح قنوات خلايا التدفق بالعينات.
  5. اضبط التدفق على 0.2 بار (~0.16 ميكرولتر / ثانية في الإعداد التجريبي الحالي). انقل المصائد البصرية (OTs) إلى الفصل 1 وامسك بزوج مناسب من الخرز المطلي بالستربتافيدين.
  6. انقل OTs إلى الفصل 3 ، وقم بإجراء معايرة القوة لزوج الخرزة ، وقم بتشغيل الليزر أحمر متحد البؤر (أو خط ليزر آخر مفضل) ، وقم بمعايرة منطقة التصوير.
  7. اضبط التدفق على 0.2 بار وانقل OTs إلى الفصل 2. التقاط الحمض النووي البيوتينيل.
  8. حرك OTs إلى الفصل 3 وأوقف التدفق. قم بزيادة المسافة بين OTs لتمديد الحمض النووي ومراقبة منحنى مسافة القوة (FD) المرتبط لتأكيد وجود حبل DNA واحد (على عكس الحبال المتعددة). يجب أن يتبع المنحنى نموذج السلسلة الشبيهة بالدودة ل dsDNA بطول الكنتورالمحدد 26.
  9. اضبط المسافة بين OTs بحيث يقرأ توتر الحمض النووي حوالي 1 pN.
    ملاحظة: 1 pN من التوتر منخفض بما يكفي للسماح للنيوكليوسومات بالبقاء ملفوفة بواسطة الحمض النووي27 ولكنه مرتفع بما يكفي لوضع جزيء الحمض النووي بأكمله داخل محور تصوير مسح الخط.
  10. قم بتشغيل المسح الخطي لبدء جمع جهاز التصوير الاحترازي مع تشغيل الليزر الأحمر.
    ملاحظة: يمكن الحصول على التصوير الدائري أو المسح الضوئي ثنائي الأبعاد للحمض النووي المربوط ، حسب تفضيل المستخدم.
  11. انقل OTs إلى الفصل 4 مع إيقاف تشغيل التدفق. بتسهيل من Nap1 ، يتم تحميل HOs على الحمض النووي ولفها لتشكيل النيوكليوسومات في الوقت الفعلي. يتم تصور تحميل النيوكليوسوم على أنه مسارات فلورية تظهر على الحمض النووي داخل التصوير الحركي. في الوقت نفسه ، يمكن مراقبة تكوين النيوكليوسوم على الحمض النووي من خلال زيادة القوة حيث يتم تحميل المزيد من HOs عندما تظل مواضع OTs ثابتة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف تشغيل ليزر الإثارة الفلورية أثناء خطوات تكوين النيوكليوسوم لتجنب التبييض الضوئي للفلوروفورات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يحدث ارتباط غير محدد لأوكتامر الهيستون بالحمض النووي حيث لا يتم لف الأوكتاميرات في النيوكليوسومات باستخدام هذا البروتوكول. لن تولد أحداث الربط هذه "تمزقا" عندما يتم شد الحمض النووي ، كما هو موضح في بروتوكول Unwrapping Nucleosomes (الخطوة 4) أدناه ، ويمكن في بعض الأحيان غسلها بواسطة تدفق عازل لطيف ، خاصة إذا كان المخزن المؤقت يحتوي على حمض نووي منافس حر.
  12. عندما يتم تكوين العدد التقريبي المطلوب من النيوكليوسومات ، ابدأ في جمع البيانات.

4. فك النيوكليوسومات

  1. أكمل الخطوة 2 والخطوة 3.
  2. بعد تكوين حبل الحمض النووي الذي يحتوي على نيوكليوسومات ، انقل OTs إلى الفصل 3.
  3. استعد لتجارب فك تغليف النيوكليوسوم عن طريق تقليل المسافة بين OTs حتى تصل القوة إلى الصفر تقريبا. صفر القوة.
  4. ابدأ في تحريك OT 1 بعيدا عن OT 2 بسرعة ثابتة تبلغ 0.1 ميكرومتر / ثانية. على الكيموغراف ، ستتحرك الخرزة في OT 1 بصريا بعيدا عن الخرزة في OT 2. على منحنى FD ، سترتفع القوة مع زيادة المسافة. عندما تفكك النيوكليوسومات ، ستظهر "تمزقات" أو انتقالات في القوة (~ 8-37 pN) تدل على تفكك الغلاف الداخلي للنيوكليوسومات الفردية27،28،29.
    ملاحظة: تعتمد القوة التي يحدث بها فك التغليف على معدل السحب ، وهو أمر متوقع للعمليات غير التوازنية. في بعض الأحيان ، يتم فك النيوكليوسومات المتعددة في وقت واحد ، مما ينتج عنه تغيير أكبر في المسافة في الانتقال على منحنى FD. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تفكيك الغلاف الخارجي للنيوكليوسوم غير مرئي بسهولة في هذا الإعداد التجريبي (انظر قسم المناقشة).

5. تصور ارتباط البروتين بالكروماتين

  1. أكمل الخطوة 2 والخطوة 3.
  2. أضف 10 نانومتر من الرابط المسمى Cy3 هيستون H1.4 إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصورة في الفصل 5.
    ملاحظة: يمكن إضافة أي بروتين ذي أهمية إلى الفصل 5 بتركيز مفضل (عادة أقل من 100 نانومتر لتصور الجزيء الفردي).
  3. بعد تكوين حبل الحمض النووي الذي يحتوي على نيوكليوسومات ، قم بتشغيل الليزر الأخضر بالإضافة إلى الليزر الأحمر وانقل OTs إلى الفصل 5 للتصوير في الوقت الفعلي لارتباط H1 بالكروماتين.
  4. استمر في جمع التصوير الحركي أو المسح حتى يتم تحقيق إحصائيات كافية (على الأقل ~ 10-20 تصوير حركي اعتمادا على تكرار الأحداث والصعوبة التجريبية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام الإعداد الموضح في الخطوة 3 (الشكل 1 أ) ، تم تصور تكوين النيوكليوسوم على طول حبل الحمض النووي على أنه ظهور بؤر فلورية حمراء في مسح ثنائي الأبعاد (الأشكال 1 ب ، على اليسار) أو المسارات بمرور الوقت على جهاز التصوير الحربي (الشكل 1 ب ، يمين). أسفرت النيوكليوسومات الملفوفة بشكل صحيح عن مسارات مضان كانت ثابتة بمرور الوقت ضمن حد الحيود للكشف متحد البؤر (~ 300 نانومتر). والجدير بالذكر أن النيوكليوسومات المتعددة المتكونة بالقرب من ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر البروتوكول الموصوف العديد من المزايا لإعادة تكوين النيوكليوسوم بما في ذلك تقليل الكواشف والوقت بالإضافة إلى تمكين تكوين النيوكليوسوم المعتمد على المرافق على طول أي تسلسل DNA (يحتمل أن يكون أصليا). علاوة على ذلك ، تسمح الطريقة في الموقع بسير عمل تجريبي أبسط وانتقال مريح إلى فحوصات الجزيء الفردي لميكانيكا النيوكليوسوم وتفاعل البروتين والكروماتين. من ناحية أخرى ، تشمل قيود هذا النهج عدم القدرة على توجيه وضع النيوكليوسوم على طول الحمض النووي (حتى مع دمج تسلسلات قوية لتحديد مواق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

يقر G.N.L.C. بالدعم المقدم من المعهد الوطني للصحة العقلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) بموجب الجائزة رقم F31MH132306. يتم دعم S.L. من قبل مؤسسة روبرتسون ، والمؤسسة الدولية لمتلازمة ريت ، والمعاهد الوطنية للصحة (رقم الجائزة R01GM149862).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x HR bufferN / AN / A30 mM & nbsp ؛ تريس  أسيتات درجة الحموضة 7.5 ، 20 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم ، 50 ملي كلوريد البوتاسيوم ، 0.1 مجم / مل BSA   ؛
1x PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)N / AN / A137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد البوتاسيوم ، 10 ملي فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة ، 1.8 ملي فوفات البوتاسيوم أحادي القاعدة   ؛
حمض الخليك ،Millipore SigmaAX0074-6استخدم لصنع خلات تريس
بيوتين - 11-dUTPجينا بيوساينسNU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATPجينا بيوساينسNU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTPجينا بيوساينسNU-956-BIO14-S
مصل الأبقار الألبومينMillipore SigmaA9418-50Gتذوب في H2O وتشغيله من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر
Cy3 Maleimide صبغة أحادية التفاعلCytivaPA23031Maleimide الوظيفية Cy3 fluorophore
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf الطرد المركزي 5425 RFisher Scientific05-414-051جهاز طرد مركزي على مقاعد الطاولة مع
تبريد الكحول الإيثيلي ، نقيMilliporeSigma 459844
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)Millipore SigmaE9884يذوب في H2O إلى 0.5 M
أوكتامر هيستون بشري (H4 ، L50C ؛ H2A, K119C) تمتنقية بروتينات الهيستون المؤتلفة غير المؤتلفة وتلك التي تؤوي طفرات الملصقات داخليا كما هو موضح سابقا (انظر المراجع 33 ، 34 ، 35 ، 36). باختصار ، تم التعبير عن الهستونات المؤتلفة في خلايا BL21 (De3) pLySS (Promega). تم عزل أجسام التضمين بعد صوتنة ، وتم استخراج الهستونات في ظل ظروف تغيير الطبيعة. تم تحليل الهستونات في المخزن المؤقت A (7 M اليوريا ، 10 ملي مولار تريس هيدروكلوريد الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ، و 5 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول) ، وأضيف المحلول إلى عمود جاذبية محمل ب Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). ثم تمت إضافة التدفق من خلال عمود الجاذبية المحمل SP Sepharose Fast Flow (Cytiva) ، وتم تصفية الهستونات من العمود عن طريق إضافة المخزن المؤقت A المكمل ب 600 ملي مولار كلوريد الصوديوم. هيستونات تؤوي طفرات وضع العلامات (H4 ، L50C ؛ H2A ، K119C) تم تنقيتها ثم اقترانها بالفلوروفور المطلوب عبر الأصباغ الوظيفية (Cytiva ، Lumidyne) باستخدام نسبة مولار من الصبغة إلى البروتين 20: 1 (انظر المراجع 33 ، 34). تم تجميع أوكتامير هيستون عن طريق إضافة نسبة مولية متساوية لكل هيستون من النوع البري أو المسمى بالفلوروفور في ظل ظروف تغيير الطبيعة ، وتحويلها إلى مخزن مؤقت عالي الملح يحتوي على 2 M كلوريد الصوديوم ، ثم يتم تنقيتها بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم كما هو موضح سابقا (انظر المراجع 36 ، 37). بدلا من ذلك ، يمكن شراء بروتينات الهيستون الفردية وأوكتامر الهيستون الجاهزة تجاريا (على سبيل المثال ، Epicypher).
المخزن المؤقت للصورةN / AN / A20 ملي مولار تريس هيدروكلوريد الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم
Klenow Fragment (3 'to 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam- ، dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021خالية من المثيلة & lambda; DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleimide الوظيفية LD655 fluorophore
Linker هيستون H1.4 (A4C)N / AN / Aبروتين مؤتلف منقى مصنوع داخليا (انظر المرجع 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN / Aتكوين المصيدة المزدوجة ؛ المواد القياسية للأداة المقدمة من الشركة المصنعة
محلول أسيتات المغنيسيومMillipore Sigma63052-100MLاستخدم لصنع عازلة HR
NEBuffer 2New England BiolabsB7002Sمرفقة مع مجموعة شظية Klenow
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250Gتذوب في H2O وتعمل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر
كلوريد البوتاسيومMillipore SigmaP3911استخدم لصنع PBS و HR عازلة
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةMillipore SigmaP0662استخدم لصنع PBS
S. cerevisiae< / em> تم تنقية Nap1N / A/ ANap1 داخليا كما هو موضح سابقا (انظر المراجع 33 ، 34). بدلا من ذلك ، يمكن شراء Nap1 تجاريا (على سبيل المثال ، Active Motif).
أسيتات الصوديومMillipore Sigma241245تذوب في H2O إلى 3 M
كلوريد الصوديومMillipore SigmaS9888استخدم لصنع PBS ومخزن الصورة
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةMillipore SigmaS9763استخدم لصنع
جزيئات PBS SPHERO المغلفة بالبيوتين (3.0-3.4 & micro ؛ م)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000 / 2000c مقياس الطيف الضوئيفيشر ScientificND2000مقياس الطيف الضوئي النانوي
تريس قاعدةفيشر العلميةBP152-500تذوب في H2O وتضبط على درجة الحموضة المناسبة ؛ استخدم لجعل المخزن المؤقت للصورة وخلات تريس
N

المراجع

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. Nucleosome structure and dynamics are coming of age. Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).
  4. McGinty, R. K., Tan, S. Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes. Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).
  5. Fierz, B., Poirier, M. G. Biophysics of chromatin dynamics. Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).
  6. Single-molecule techniques: A laboratory manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  7. Chua, G. N. L., Liu, S. When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions. Annu Rev Biophys. , (2024).
  8. Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy. Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).
  9. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11, 288(1986).
  10. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  11. Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence. J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).
  12. Salt Peterson, C. L. gradient dialysis reconstitution of nucleosomes. CSH Protoc. 2008, 5113(2008).
  13. Leicher, R., Liu, S. Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers. Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).
  14. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, 772-778 (2006).
  15. Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. Nucleosome positions predicted through comparative genomics. Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).
  16. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).
  17. Chipev, C. C., Wolffe, A. P. Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo. Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).
  18. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181, 1380-1394 (2020).
  19. Vlijm, R., et al. Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes. PLoS One. 10, e0141267(2015).
  20. Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1. J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).
  21. Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor. J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).
  22. Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions. Mol Cell. 37, 834-842 (2010).
  23. Wu, R., Taylor, E. Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).
  24. King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint. Nat Commun. 7, 11810(2016).
  25. Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method. Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).
  26. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  27. Diaz-Celis, C., et al. Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).
  28. Leicher, R., et al. Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).
  29. Chua, G. N. L., et al. Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes. bioRxiv. , (2023).
  30. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).
  31. McCauley, M. J., et al. Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes. Cell Rep. 41, 111858(2022).
  32. Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. Effect of force on mononucleosomal dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).
  33. Li, S., et al. Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence. Nat Commun. 13, 4947(2022).
  34. Li, S., et al. Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).
  35. Harada, B. T., et al. Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes. Elife. 5, e10051(2016).
  36. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).
  37. Rogge, R. A., et al. Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA. J Vis Exp. (79), e50354(2013).
  38. Leicher, R., et al. Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1. Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

إعادة التشكيل في الموقعمجهر الجزيء الواحدمجهر القوةميكانيكا الكروماتينالمرافق الهستوني Nap1رباط DNAفك التفاف النيوكليوسومارتباط الهستون الرابط
تجميع النيوكليوسوم في الموقع للقوة الترابطية أحادية الجزيء والفحص المجهري الفلوري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.