يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا التائية الأولية للفأر والفحص المجهري بفاصل زمني لهجرة الخلايا التائية في ظل ظروف بيئية محددة مع التحليل الكمي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مقايسة الهجرة في الوقت الحقيقي في المختبر لخلايا الفئران الأولية CD8 + T
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعتمد الاستجابة المناعية التكيفية على قدرة الخلية التائية على الانتقال عبر الدم والليمفاوية والأنسجة استجابة لمسببات الأمراض والأجسام الغريبة. هجرة الخلايا التائية هي عملية معقدة تتطلب تنسيق العديد من مدخلات الإشارة من البيئة والخلايا المناعية المحلية ، بما في ذلك الكيموكينات ومستقبلات الكيموكين وجزيئات الالتصاق. علاوة على ذلك ، تتأثر حركة الخلايا التائية بالإشارات البيئية المحيطة الديناميكية ، والتي يمكن أن تغير حالة التنشيط ، والمناظر الطبيعية للنسخ ، وتعبير جزيء الالتصاق ، والمزيد. في الجسم الحي ، يجعل تعقيد هذه العوامل المتشابكة على ما يبدو من الصعب التمييز بين الإشارات الفردية التي تساهم في هجرة الخلايا التائية. يوفر هذا البروتوكول سلسلة من الطرق من عزل الخلايا التائية إلى التحليل بمساعدة الكمبيوتر لتقييم هجرة الخلايا التائية في الوقت الفعلي في ظل ظروف بيئية محددة للغاية. قد تساعد هذه الظروف في توضيح الآليات التي تنظم الهجرة ، وتحسين فهمنا لحركية الخلايا التائية وتوفير أدلة ميكانيكية قوية يصعب تحقيقها من خلال التجارب على. إن الفهم الأعمق للتفاعلات الجزيئية التي تؤثر على هجرة الخلايا أمر مهم لتطوير علاجات محسنة.
المقدمة
الخلايا التائية هي المستجيبات الرئيسية للاستجابة المناعية التكيفية المتخصصة لمولد الضد. على مستوى المجتمع الإحصائي، الخلايا التائية غير متجانسة، وتتكون من مجموعات فرعية خلوية ذات وظائف متخصصة متميزة. الأهم من ذلك ، أن الخلايا التائية CD8 + هي المستجيبات الخلوية الرئيسية للجهاز المناعي ، والتي تقضي بشكل مباشر على الخلايا المصابة أو المختلةوظيفيا 1.
تتواجد الخلايا التائية CD8+ الناضجة في الأنسجة وتنتشر عبر الدم والليمفاوية بحثا عن المستضدات. أثناء العدوى، تقدم الخلايا التائية مولدات ضد في الدم أو الأنسجة، وتصرف بسرعة إلى الطحال أو أقرب عقدة ليمفاوية مصاصة لبدء استجابة مناعية مثمرة. في كلتا الحالتين، تنشط الخلايا التائية، وتخضع للتوسع النسيلي، وتترك الجهاز الليمفاوي ليدخل الدم، إن لم يكن موجودا بالفعل. خلال هذه العملية ، تمنح الإشارات داخل الخلايا خفض تنظيم مستقبلات التوجيه اللمفاوية وتنظيم العديد من مستقبلات الانتغرين والكيموكين الضرورية للهجرة الخاصةبالأنسجة 2. في نهاية المطاف ، فإن الهجرة الموجهة للخلايا التائية إلى مواقع العدوى مدفوعة بإشارات بيئية متقاربة تشمل إشارات الانتغرين والكيموكين.
يمكن تصنيف الكيموكينات على نطاق واسع إلى فئتين رئيسيتين: (1) إشارات الاستتباب ، والتي تعتبر ضرورية للتمايز والبقاء والوظيفة القاعدية ، و (2) الإشارات الالتهابية ، مثل CXCL9 و CXCL10 و CCL3 ، وهي مطلوبة للانجذاب الكيميائي. بشكل عام ، تخلق chemokines تدرج إشارة يدفع الهجرة الاتجاهية ، والمعروفة باسم الانجذاب الكيميائي ، بالإضافة إلى تنشيط تعبير integrin1. الانجذاب الكيميائي منظم بدقة وحساس للغاية ، مع الخلايا التائية القادرة على الاستجابة للتغيرات الصغيرة في التدرج التي يمكن أن تقودها نحو اتجاه أو موقع معين.
بالإضافة إلى هذه العوامل المرتبطة بالخلايا التائية ، تتأثر الهجرة أيضا بتكوين وكثافة المصفوفة خارج الخلية (ECM). يتكون ECM من شبكة كثيفة من البروتينات ، بما في ذلك الكولاجين والبروتيوغليكان ، والتي توفر سقالة لمستقبلات الأنتغرين اللاصقة على الخلايا التائية. Integrins هي عائلة متنوعة من البروتينات عبر الغشاء ، ولكل منها مجالات ربط عالية التخصص وتأثيرات إشارات المصب. يتيح التعبير الديناميكي لمستقبلات الأنتغرين على سطح الخلية التائية التكيف السريع مع بيئاتها المتغيرة3. الأهم من ذلك ، يربط الأنتغرين ECM وشبكات الأكتين الهيكلية الخلوية داخل الخلايا التي تعمل معا لتوليد القوة الدافعة المطلوبة لحركة الخلايا التائية.
باختصار ، تختلف أنماط الهجرة بناء على النمط الظاهري للخلايا المناعية أو الإشارات البيئية. يتم تنظيم هذه العمليات الحيوية المعقدة بإحكام عن طريق التعبير عن السيتوكينات والكيموكينات والأنتغرينات على سطح الخلية التائية والخلايا المحيطة والأنسجة المحلية المصابة. في الجسم الحي ، يمكن أن تكون آليات الهجرة هذه معقدة وقد تنتج عن عدة إشارات مضافة4. بسبب هذا التعقيد ، قد يكون من المستحيل إقامة علاقة سببية بين المتغيرات المتشابكة على ما يبدو. للتغلب على هذا ، هناك العديد من الأساليب في المختبر لدراسة جوانب محددة من هجرة الخلايا التائية مثل الاستجابة لإشارات كيموكين محددة والتفاعل بين إنتغرينات الخلايا التائية وبروتينات ربط ECM. يتناول هذا البروتوكول طرقا لعزل وتنشيط خلايا الفئران CD8 + T ، مع مقايسات الهجرة في المختبر في الفضاء ثنائي الأبعاد وأدوات التحليل الحسابي لتحليل هجرة الخلايا التائية المحددة. هذه الطرق مفيدة للمستخدم لأنها لا تتطلب مواد أو أجهزة متطورة ، كما هو الحال مع بعض فحوصات هجرة الخلايا الأخرى الموضحة في الأدبيات. يمكن أن توفر بيانات هجرة الخلايا التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الطرق دليلا على الاستجابات المناعية بطريقة مبسطة تتيح مزيدا من التحقيق المستنير في الجسم الحي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على بروتوكولات من قبل لجنة الجامعة للموارد الحيوانية في جامعة روتشستر. تم الحفاظ على الفئران في هذه الدراسة في الفضاء الخالي من مسببات الأمراض في منشأة بجامعة روتشستر. تم استخدام ذكور / إناث الفئران C57BL / 6 ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6-12 أسبوعا (15-30 جم) ، في هذه الدراسة. يمكن إجراء عزل أنسجة الفئران على سطح الطاولة مع قفازات لتغطية اليدين وقناع للوجه لتغطية الأنف والفم ، أو داخل خزانة السلامة البيولوجية. يجب إجراء جميع عمليات زراعة الخلايا وإعداد الألواح في خزانة السلامة البيولوجية. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.
1. تنقية الخلايا التائية CD8 + وتنشيطها
- تحضير المواد
- بالنسبة للاختيار السلبي للخلايا التائية CD8 + : قم بإعداد وسط اختيار سلبي من طاف خطوط خلايا الورم الهجين GK1.5 والأجسام المضادة M5 / 114 ، والتي تنتج مضادات CD4 ومضادة MHCII ، على التوالي. امزج المادة الطافية بنسبة 1: 1 ، وقم بترشيحها ، وتخزينها عند 4 درجات مئوية للاستخدام المستقبلي (>0.5 ميكروغرام من كل جسم مضاد / مليون خلية إجمالية). بدلا من ذلك ، تتوفر مجموعات عزل الخلايا التائية CD8 + التجارية.
- لتنشيط الخلايا التائية: أضف 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD3 (10 ميكروغرام / مل) و CD28 (16 ميكروغرام / مل) في 1x DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) إلى مزرعة غير الأنسجة (TC) معالجة 24 صفيحة جيدا وتخزينها طوال الليل عند 4 درجات مئوية لضمان ربط اللوحة.
ملاحظة: تغطي الأجسام المضادة والبروتينات أطباق / أطباق الثقافة غير المعالجة ب TC بشكل أفضل من الأطباق العادية المعالجة ب TC ، لذلك يتم استخدام لوحات الثقافة غير المعالجة ب TC لتوليد الخلايا التائية.
- قم بإعداد طبق استزراع 10 سم (أو ما يعادله) عن طريق وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر في الطبق وتوزيع 2 مل من وسط R9 في المرشح (وسط R9: RPMI 1640x مكمل ب 10٪ FBS ، 1٪ مضاد حيوي مضاد حيوي ، 20 مللي متر HEPES عازلة ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية MEM ، 50 ميكرومتر β-ميركابتوإيثانول).
- احصل على فأر يتمتع بخلفية وراثية مناسبة والجنس والعمر والوزن على النحو الذي يحدده التصميم التجريبي.
- القتل الرحيم للفأر باستخدام CO2 متبوعا بخلع عنق الرحم ، أو استراتيجيات القتل الرحيم المناسبة على النحو المحدد في بروتوكولات رعاية واستخدامها المحلية والمعتمدة من قبل المؤسسة.
- ضع الماوس في وضع ضعيف ، وقم بتمديد جميع الأطراف الأربعة بشكل عمودي على الجسم ، وقم بتثبيت وسادات القدم على لوحة تشريح باستخدام دبابيس تشريح الماوس T ، أو ما يعادلها. قم بعمل شق سطحي مركزي من خلال الطبقة الجلدية في أسفل البطن البطني باستخدام مقص تشريح جراحي للفأر وقطعه مباشرة حتى الذقن (~ 8 سم). افصل الجلد عن البطانة البريتونية لكشف العقد الليمفاوية. قم بتمديد الجلد بشكل عمودي بعيدا عن الجذع وتثبيتهلأسفل 5.
- قم باستئصال الغدد الليمفاوية العنقية والمحورية والعضدية والأربية برفق بشكل ثنائي باستخدام ملقط غير حاد (أو النوع المفضل من مجموعة تشريح جراحية قياسية للفئران). نقل إلى مصفاة الخلية المعدة في الخطوة 1.2.
- افتح الصفاق وأزل الطحال. نقل إلى مصفاة الخلية المعدة في الخطوة 1.2.
- تخلص من جثة الفأر في وعاء الخطر البيولوجي المناسب.
- قم بإعداد معلق أحادي الخلية للأنسجة اللمفاوية الثانوية عن طريق الاضطراب الميكانيكي فوق مصفاة الخلايا 70 ميكرومتر مع 2 مل من وسط R9 من الخطوة 1.2 عن طريق لف أداة تعطيل الأنسجة نصف دورة في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة بشكل متكرر.
ملاحظة: تعمل نهاية المكبس لحقنة قفل luer ، إما 3 مل أو 10 مل ، بشكل جيد لسحق الأنسجة وتجانسها. يمكن استخدام مواد بديلة وفقا لتقدير المستخدم. - اغسل الخلايا وطرف المحقنة والمصفاة وطبق الاستزراع ب 7 مل من الوسط ، مع التأكد من بقاء المصفاة في وضع مستقيم لمنع نقل قطع أكبر من الأنسجة أو الركام الخلوي الذي قد يكون موجودا في التعليق أحادي الخلية.
- انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
- قم بتجميع الخلايا عند 270 × جم في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق وصب المادة الطافية.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل لمدة 1 دقيقة لإزالة خلايا الدم الحمراء. خفف ب 9.5 مل من وسط R9 وقم بتدويره عند 270 × جم (20 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق. صب الطاف.
- أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسط الاختيار السلبي المعد مسبقا الذي يحتوي على مضاد MHCII ومضاد CD4 (الخطوة 1.1.1). صخرة في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
- بيليه الخلايا في 270 × غرام لمدة 5 دقائق وصب طاف . اغسل 3x ب 10 مل من وسط R9.
- في نفس الوقت ، في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، اغسل 200 ميكرولتر من حبات IgG المضادة للفئران في 7 مل من الوسط. ضع الأنبوب على مغناطيس ، وأزل الوسط ، وكرر خطوة الغسيل مرتين. أعد تعليق الخرز في 7 مل من وسط R9.
- قم بإذابة الخلايا عند 270 × جم (20 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق ، وقم بصب المادة الطافية ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 7 مل من تعليق الخرزة من الخطوة 1.13. صخرة في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية) لمدة 45 دقيقة.
- إثراء خلايا CD8 + T عن طريق نضوب حبة مغناطيسية. ضع الأنبوب المخروطي مباشرة على المغناطيس بدون غطاء لمدة 3 دقائق لإزالة الأجسام المضادة / الخلايا المرتبطة بالخرزة. يجب الاحتفاظ بخلايا CD8+ . مع بقاء الأنبوب في المغناطيس ، اجمع تعليق الخلية باستخدام ماصة مصلية أو ما يعادلها وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 270 × جم (20 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق ويغسل 3 مرات في المتوسط.
- اغسل لوحة التنشيط المطلية مسبقا (الخطوة 1.1.2) باستخدام 1x DPBS مرتين دون سحب السحب مباشرة على السطح السفلي للوحة.
- اختياري: قم بإجراء فصل الخلايا الليمفاوية الحية / الميتة لإزالة الخلايا الميتة.
- نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 mL. أضف 2 مل من وسائط فصل الخلايا الليمفاوية برفق إلى الجزء السفلي من تعليق الخلية. أجهزة الطرد المركزي عند 900 × جم لمدة 10 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) عند التسارع والتباطؤ المنخفضين.
ملاحظة: ستنفصل الخلايا الحية عند واجهة الوسائط المتوسطة والفصل (الطبقة البيضاء الوسطى). سوف الخلايا الميتة حبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب ويمكن التخلص منها في النهاية. - انقل الطبقة الوسطى التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية الحية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي عند 270 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب الطاف.
- نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 mL. أضف 2 مل من وسائط فصل الخلايا الليمفاوية برفق إلى الجزء السفلي من تعليق الخلية. أجهزة الطرد المركزي عند 900 × جم لمدة 10 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) عند التسارع والتباطؤ المنخفضين.
- أعد تعليق الحبيبات في 12 مل من الوسط باستخدام 10 U / mL من الماوس المؤتلف IL-2. لوحة 1 مل لكل بئر في لوحة 24 بئر غير معالجة TC ونقلها إلى 37 درجة مئوية طوال الليل.
2. رفع الخلايا التائية CD8 + المنشطة
- تصور الخلايا باستخدام مجهر ضوء قياسي على الطاولة ، باستخدام هدف 4x أو 10x.
ملاحظة: ستظهر الخلايا التائية المنشطة أكبر حجما ومستديرة أو ممدودة مقارنة بالخلايا التائية المعطلة ويجب أن تحتوي على مجموعات كثيفة من الخلايا في جميع أنحاء البئر. - لرفع الخلايا المنشطة ، قم بتعطيل الخلايا باستخدام ماصة 1 مل ، مع التأكد من خلطها جيدا عند حواف اللوحة. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
ملاحظة: الخلايا المنشطة أكثر لزوجة وتتطلب ماصة أكثر قوة. - اغسل الآبار ب 1 مل من وسط R9 لإزالة أي خلايا متبقية. كرر مرة أخرى إذا لزم الأمر. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 270 × جم (20 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
- قم بإجراء فصل الخلايا الليمفاوية الحية / الميتة لإزالة الخلايا الميتة كما في الخطوات 1.17-1.18.
- الحفاظ على الخلايا التائية عن طريق إزالة الخلايا الحية / الميتة كل 3-4 أيام في وسط R9 مع IL-2 في لوحة غير TC 6 آبار.
ملاحظة: تتكاثر الخلايا التائية بشكل أفضل في الآبار ذات الأبعاد الصغيرة أثناء التنشيط المبكر ، ربما بسبب ملامسة الخلايا التائية للخلايا التائية أو العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الخلايا التائية التي تساعد على تنشيطها. يؤدي الانتشار السريع للخلايا التائية إلى تحول وسط المزرعة إلى اللون الأصفر خلال 24-48 ساعة بعد الثقافة. في هذه المرحلة ، ارفع الخلايا وانقلها إلى بئر أكبر (لوحة غير مطلية وغير TC ذات 6 آبار) مع وسط استزراع طازج كاف لتغذية الخلايا (عادة 5 مل لكل بئر). استبدل الوسط المستنفد بوسط طازج كلما أشار إلى ذلك بتغيير لون الوسط الأصفر ، أو كل 3-4 أيام.
3. إعداد طبق زجاجي
- قم بإعداد غرف أو ألواح هجرة الخلايا الزجاجية عن طريق الطلاء ب 300 ميكرولتر / سم2 بروتين أ (0.1 مجم / مل) طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، واغسلها مرتين باستخدام 1x DPBS عن طريق الاستغناء عن الطبق والصب قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- قم بتغطية غرفة أو صفيحة الهجرة بفأر مؤتلف 300 ميكرولتر / سم2 ICAM-1 أو VCAM-1 Fc chimera (0.1-2.75 مجم / مل) مع كيموكين فأر مؤتلف (0.1-10 ميكروغرام / مل) لمدة 2-3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. يتم تقديم روابط إنتغرين أخرى مثل الفبرونيكتين والكولاجين الوريدي للفأر والفأر E-cadherin لتغطية الحجرة مباشرة عند 2.5-10 ميكروغرام / مل بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الحجرات مرتين باستخدام 1x DPBS عن طريق الاستغناء عن الطبق والصب مباشرة بعد ذلك قبل إضافة الخلايا.
ملاحظة: يمكن أن تهاجر الخلايا التائية بشكل مختلف بتركيزات مختلفة من روابط الانتغرين والكيموكينات اعتمادا على حالة التنشيط والتمايز والتحسس والتحضير. يقترح بشدة فحص هجرة الخلايا بتركيزات مختلفة متعددة.
- اغسل الحجرات مرتين باستخدام 1x DPBS عن طريق الاستغناء عن الطبق والصب مباشرة بعد ذلك قبل إضافة الخلايا.
- ضع الخلايا الملتصقة على ألواح مغلفة بالزجاج قبل 24 ساعة من بدء التصوير في حالة زراعة الخلايا التائية مع خلايا أخرى ، مثل الخلايا السرطانية ، لقياس قتل الخلايا التائية للخلايا السرطانية بطريقة في الوقت الفعلي.
4. تحضير الخلايا
- اختياري: تلطيخ الخلايا التائية والخلايا الملتصقة بصبغة تعقب الخلايا المفضلة عند 1 ميكروغرام / مل لكل 1 × 107 خلايا في 1x DPBS لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، أو وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو ما يعادله.
- لوحة 1 × 105 خلايا CD8 + T (أو الكمية المطلوبة) في وسط L-15 من Leibovitz تستكمل ب 1-5 جم / لتر جلوكوز في غرفة 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تم تصميم وسيط L-15 للاستخدام بدون نظام بيكربونات الصوديوم CO2. يتم تخزينه مؤقتا باستخدام الأحماض الأمينية الأساسية الحرة ، ومخازن الفوسفات ، والجالاكتوز للحفاظ على مستويات الأس الهيدروجيني. - اختياري: إجراء حظر إنتغرين.
- احتضان الخلايا التائية مسبقا بجسم مضاد مانع للإنتغرين (1-10 ميكروغرام / مل ، CD11a المضاد للفأر (M17 / 4) ، CD18 المضاد للفأر (M18 / 2) ، مضاد للفأر VLA-4 (9C10) لمدة 10 دقائق والسماح بالزحف في وجود نفس الجسم المضاد.
5. الفحص المجهري بفاصل زمني
- إجراء المجهر الفيديو.
- بالنسبة للخلايا التائية ، احصل على صور ساطعة وفلورية كل 10-60 ثانية لمدة 10-60 دقيقة ، أو إعدادات الاكتساب المطلوبة.
ملاحظة: هجرة الخلايا التائية حساسة لدرجة الحرارة ، ودرجة الحرارة المثلى لترحيل الخلايا التائية للماوس هي 37 درجة مئوية. يتكون نظام التحكم في درجة الحرارة الذي يستخدمه هذا البروتوكول من سطح مجهر مغلق ومعزول مع نظام تدفئة مرفق. تقع غرفة التصوير على سطح التصوير. يحتوي محيط هذه الغرفة على بئر مملوء بالماء المقطر الذي يسمح بحرارة ورطوبة ثابتة أثناء التصوير. يتم وضع microwell في وسط غرفة التصوير.
6. التحليل بمساعدة البرامج لهجرة الخلايا التائية
- استخدم برنامج Volocity لتقييم هجرة الخلايا التائية.
- افتح Volocity وقم بإنشاء تسلسل صور جديد.
- حدد ونقل جميع أفلام مجهر الفيديو ذات الفاصل الزمني إلى المنطقة الزرقاء في Volocity.
- اضبط السطوع والتباين باستخدام أداة تحسين التباين وفقا للإعدادات التي يريدها الباحث.
- تحقق من أحجام الصور: 0.325 ميكرومتر ل 20x ، 0.65 ميكرومتر ل 10x.
- التسلسل: اضبط النقاط الزمنية (على سبيل المثال: 81 صورة في حالة التقاط صورة كل 15 ثانية لمدة 20 دقيقة ، 4 في الدقيقة).
- ألغ تحديد جميع النقاط الزمنية في علامة التبويب القياس.
- ابحث عن الكائنات باستخدام الشدة - حرك الشريط بحيث يكون على يمين الذروة.
- استبعاد الكائنات حسب الحجم: جميع الخلايا التي يقل قطرها عن 10 ميكرومتر وأكبر من 100 ميكرومتر لاستبعاد حطام الخلية أو الجسيمات غير الخلوية. استبعاد الخلايا التائية التي يتم ترحيلها لأقل من 20٪ من وقت التسجيل (والتي يمكن أن تختلف اعتمادا على التعريف من قبل كل محقق).
- تجاهل الكائنات الثابتة (خانة الاختيار).
- الانضمام تلقائيا إلى المساحات المكسورة (خانة الاختيار).
- اضبط أقصر مسار على ما لا يزيد عن 20 ميكرومتر.
- مسار ترحيل الخلية هو الخط الذي يربط موقع الخلية نفسها بمرور الوقت. تأكد من أن خوارزمية التتبع تقوم بالتتبع عن طريق اكتشاف مكان اكتشاف الكائنات الفردية عن طريق التجزئة في كل إطار، ومطابقة الكائنات عبر الإطارات.
- احفظ بروتوكولا جديدا عن طريق اختيار القياسات > حفظ البروتوكول > اسم بروتوكول جديد.
- انقر فوق قياس جميع النقاط الزمنية في علامة تبويب القياس.
- فرز المسارات حسب الفترة الزمنية ، من الأعلى إلى الأدنى.
- سجل أرقام معرف المسار لجميع الخلايا ذات المسارات الجيدة كما هو محدد من قبل المحقق. بعد التتبع التلقائي للخلايا، يكون التقييم اليدوي لكل مسار خلية ضروريا لاستبعاد المسارات المحددة أو المقطوعة بشكل خاطئ. استبعاد الخلايا ذات المسارات السيئة.
- قم بتصدير الملف كنص مفصول بفواصل ونقل البيانات إلى برنامج التحليل المطلوب.
ملاحظة: المعلمات الأساسية: السرعة (ميكرومتر / دقيقة) ، الإزاحة (الحركة الصافية ، ميكرومتر) ، طول المسار (إجمالي طول المسار ، ميكرومتر) ، ومؤشر التعرج (MI ؛ صافي الإزاحة / طول المسار. MI = 1 يشير إلى مسار خطي مستقيم تماما).
- قم بإجراء التتبع اليدوي باستخدام Image J.
- افتح المكونات الإضافية وحدد التتبع والتتبع اليدوي. اضبط المعلمات - الفواصل الزمنية ومعايرة x / y (حجم البكسل) ومعايرة z (في وضع التتبع اليدوي). ابدأ تتبع الخلية الفردية بالنقر فوق إضافة مسار ، وتحديد خلية واحدة في النقطة الزمنية الأولى ، ومتابعتها خلال جميع النقاط الزمنية. بعد ذلك ، انقر فوق إنهاء المسار. كرر ذلك لجميع الخلايا ذات الاهتمام.
ملاحظة: Trackmate ، أداة أخرى لتتبع الخلايا ، هي برنامج تتبع تلقائي متاح عبر المكون الإضافي ImageJ.
- افتح المكونات الإضافية وحدد التتبع والتتبع اليدوي. اضبط المعلمات - الفواصل الزمنية ومعايرة x / y (حجم البكسل) ومعايرة z (في وضع التتبع اليدوي). ابدأ تتبع الخلية الفردية بالنقر فوق إضافة مسار ، وتحديد خلية واحدة في النقطة الزمنية الأولى ، ومتابعتها خلال جميع النقاط الزمنية. بعد ذلك ، انقر فوق إنهاء المسار. كرر ذلك لجميع الخلايا ذات الاهتمام.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن تأكيد تنشيط الخلايا التائية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، والبحث عن زيادة التعبير عن CD69 و CD44 ، وهما علامتان أساسيتان للتنشيط في الخلايا التائيةالفئران 6. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحديد نقاء مجموعة الخلايا التائية عن طريق قياس التدفق الخلوي لخلايا CD3 + CD8 + T. تنتج هذه الطريقة >90٪ من خلايا CD8 + T.
يمكن تقييم هجرة الخلايا التائية من خلال برامج تتبع الخلايا بمساعدة البرامج والتي يمكن استنساخها وضبطها لتناسب احتياجات الباحث. تت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إن فهم التأثير البيولوجي للإشارات المتقاربة في الجسم الحي أمر صعب وليس من السهل تفسيره. توفر البروتوكولات المقدمة هنا طريقة معقولة لفهم هجرة الخلايا التائية في ظروف محددة للغاية وذات صلة بيولوجية. يمكن تحديد هذه الشروط بناء على تقدير الباحث ، ويمكن تعديل البروتوكولات لتناسب احتياجات مجموعات الخلايا التائية المختلفة ، وحالة التنشيط ، والنمط الظاهري للخلية. علاوة على ذلك ، يمكن استجواب العديد من الروابط والمستقبلات من خلال هذه الإجراءات المحددة لحجب الأجسام المضادة 7,8
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أن جميع الأبحاث وإعداد المخطوطات قد أجريت في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر كيم الذين ساهموا في تطوير هذه البروتوكولات بمرور الوقت. تم توفير البيانات التمثيلية بواسطة P01 AI102851/الذكاء الاصطناعي/NIAID NIH HHS/الولايات المتحدة و P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/الولايات المتحدة. أصبح هذا المنشور ممكنا جزئيا بفضل المنحة رقم T32 GM135134 من جائزة روث إل كيرششتاين المؤسسية لخدمة البحوث الوطنية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طبق 10 سم | 353003 Corning | أو ما يعادله | |
| 15 مل أنبوب مخروطي | ThermoFisher | 339650 | أو ما يعادله |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | بدون كالسيوم وبدون مغنيسيوم |
| 6 لوحة بئر غير TC معالجة | Corning | 3736 | أو ما يعادلها |
| 70 & micro ؛ مصفاة الخلايا m | FisherScientific | 352350 | أو ما يعادلها |
| عازلة التحلل ACK | ThermoFisher | A1049201 | أو ما يعادلها |
| أجهزة الطرد المركزي Allegra 6KR | ThermoScientific | sorvall 16R مع دوار tx400 3655 ودلو | أو ما يعادله |
| من Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | أو ما يعادله |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | أو ما يعادلها |
| من أجهزة الطرد المركزي | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | أو ما يعادلها |
| من الكولاجين (IV) | Corning | 354233 أو ما يعادله | |
| من طبق ثقافة DeltaT .17 مم زجاج سميك شفاف | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads الأغنام المضادة للفئران IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 | Magnet ThermoFisher Scientific | 12301D | أو ما يعادلها |
| Easy sep Fluid Cell | 19851 | ||
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | أو ما يعادلها |
| من Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | أو ما يعادلها |
| من Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| مكعبات تصفية | نيكون أو أوليمبوس | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | أو ما يعادلها |
| من كاميرا HQ CCD | CoolSNAP | أو ما يعادلها | |
| من ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| قابس التتبع التلقائي ImageJ في | http://imagej.net/TrackMate | رابط ويب | |
| ImageJ التتبع اليدوي قم بتوصيل | رابط الويب | ||
| https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html L-15 | مختلف | انظر المواد | وصفة متوسطة: Leibovitz ' s L-15 متوسط بدون فينول أحمر (Gibco) مكمل ب 1-5 جم / لتر جلوكوز |
| L-15 من Liebovitz ، بدون فينول أحمر | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok حقنة يمكن التخلص منها | Fisher Scientific | 14-955-459 | أو ما يعادلها |
| من وسط فصل الخلايا الليمفاوية | Corning | 25-072-CI | أو ما يعادلها |
| M5 / 114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية | ThermoFisher | 11140050 | أو ما يعادلها |
| نظام تسخين المجهر | Okolab | okolab.com | تصاميم مخصصة متاحة |
| Millicell EZ الشريحة | Millipore | C86024 | |
| Mojosort ماوس CD8 + Na & iuml. طقم عزل الخلايا التائية | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R & أنظمة D | 8875-EC-050 | أو ما يعادلها |
| من مجموعة التشريح الجراحي للفأر | فيشر ساينتفيك | 13-820-096 | أو ما يعادلها |
| من عناصر NIS | نيكون | برنامج | |
| غير TC 24wp | Corning | 353047 | أو ما يعادله |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | أو ما يعادله |
| البروتين A | ThermoFisher Scientific | أو ما يعادله | |
| R9 | مختلف | انظر المواد | وصفة متوسطة: RPMI 1640x مكمل بنسبة 10٪ FBS ، 1٪ مضاد حيوي ومضاد للفطريات (Gibco) ، 20 ملي مولار عازلة HEPES (Gibco) ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية MEM (Gibco) ، 50 & mu ؛ M & beta ؛ ميركابتو إيثانول (سيجما ألدريتش) الفأر |
| المؤتلف ICAM-1 Fc الوهم | R & أنظمة D | 796-IC-050 | أو ما يعادلها |
| من الماوس المؤتلف IL2 | Biolegend | 575410 | أو ما يعادله |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 أو ما يعادله | |
| من دبابيس T | Fisher Scientific | S99385 | أو ما يعادلها |
| من مجهر TE2000-U | نيكون | أو ما يعادله | |
| ماوس مؤتلف مختلف | R& أنظمة | D أو ما يعادلها | |
| VCAM-1 Fc chimera | R & أنظمة D | 643-VM-050 | أو ما يعادلها |
| Volocity | PerkinElmer |
المراجع
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).
- Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
- Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850(2023).
- Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352(2015).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
- Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
- Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231(2021).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
- Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
- Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
- Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239(2013).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
- Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
- Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963(2014).
- Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
