مقالة منهجية

تحضير عينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ

DOI:

10.3791/66590

⸱

يونيو 7, 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول إجراء تحضيرا محسنا ومتقنا لعينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ. وهي مناسبة للتطبيقات التي تنطوي على تحليل نقاط الاشتباك العصبي في عضويات الشبكية الناضجة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عضويات الشبكية (ROs) هي نظام زراعة ثلاثي الأبعاد يحاكي سمات الشبكية البشرية التي تميزت عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) في ظل ظروف محددة. تمت دراسة تطور المشبك العصبي ونضجه في ROs من الناحية المناعية والكيميائية والوظيفية. ومع ذلك ، فإن الدليل المباشر على البنية التحتية الملامسة المشبكية محدود ، حيث يحتوي على كل من نقاط الاشتباك العصبي الشريطية الخاصة والمشابك الكيميائية التقليدية. يتميز المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) بدقة عالية وتاريخ محترم يوضح تطور الشبكية ونضج المشبك العصبي في البشر والأنواع المختلفة. إنها أداة قوية لاستكشاف البنية المشبكية في ROs وتستخدم على نطاق واسع في مجال البحث في ROs. لذلك ، لاستكشاف بنية جهات الاتصال المشبكية RO بشكل أفضل على المستوى النانوي والحصول على أدلة مجهرية عالية الجودة ، قمنا بتطوير طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لإعداد عينة RO TEM. تصف هذه الورقة البروتوكول والكواشف المستخدمة والخطوات التفصيلية ، بما في ذلك إعداد تثبيت RO ، وما بعد التثبيت ، والتضمين ، والتصور.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر شبكية العين ، وهي عضو حسي بصري حيوي في البشر والثدييات ، بنية مغلفة مميزة تتميز بثلاث طبقات نووية تضم الخلايا العصبية السومة وطبقتين شبكيتين تشكلهما الوصلات المشبكية1 ، بما في ذلك المشابك التقليدية والمشبك الشريطيالمتخصص 2,3. يلعب المشبك الشريطي دورا مهما في نقل نبضات الحويصلة بطريقة متدرجة 2,3. تتضمن عملية الرؤية نقل الإشارات الكهروضوئية عبر مستويات مختلفة من الخلايا العصبية والمشابك العصبية ، لتصل في النهاية إلى القشرة البصرية 4,5.

تمثل عضويات الشبكية (ROs) نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد (3D) مشتق من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، تحاكي الحالات الفسيولوجية لأنسجة الشبكية في المختبر1،6،7. هذا النهج واعد لدراسة أمراض الشبكية8 ، وفحص الأدوية9 ، والعمل كعلاج محتمل للحالات التنكسية الشبكية التي لا رجعة فيها مثل التهاب الشبكية الصباغي10 والزرق11. كنظام توصيل بصري قوي في المختبر ، فإن المشبك داخل ROs هو هيكل حاسم يسهل تحويل الإشارة الفعالة ونقلها5.

يمكن تقسيم تطور RO تقريبا إلى ثلاث مراحل وفقا لسماتها المورفولوجية وملامح التعبير الجزيئي 6,12. تتكون التناضحيات العكسية في المرحلة 1 (حوالي D21-D60) من الخلايا السلفية العصبية للشبكية ، والعديد من خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، وعدد قليل من خلايا الأمكرين النجمية (SACs) ، المقابلة للحقبة الأولى من تطور الجنين البشري. في المرحلة 2 (حوالي D50-D150) ، تعبر ROs عن بعض سلائف المستقبلات الضوئية ، والخلايا العصبية البينية ، والجينات المرتبطة بتكوين المشابك ، والتي تمثل مرحلة انتقالية. تطور المستقبلات الضوئية النضج في المرحلة 3 ROs (حوالي بعد D100-D150) ، المقابلة للمرحلة الثالثة من نمو الجنين البشري6،12،13. والجدير بالذكر أنه بالمقارنة مع ROs في المرحلة 1 والمرحلة 2 ، فإن ROs في المرحلة 3 لها بنية رقائقية مميزة نضجت نقاط الاشتباك العصبي الخاصة بها12 ، بما في ذلك وجود نقاط الاشتباك العصبي الشريطية14. علاوة على ذلك ، أكدت دراسة حديثة أن نقاط الاشتباك العصبي الناضجة موجودة في نقل الإشارات الضوئية ، مما يشير إلى أنها وظيفية13. وبالتالي ، غالبا ما يتم اختيار ROs في المرحلة 3 للتحقيق في البنية المشبكية.

يتم تطبيق الكيمياء الهيستولوجية المناعية على نطاق واسع لدراسة التعبير عن البروتينات الجزيئية المختلفة. ومع ذلك ، فإن الحد من المجهر الضوئي يكمن في قدرته على مراقبة عدد محدود فقط من الخلايا والجزيئات المحددة في وقت واحد ، مما يؤدي إلى عدم وجود تحليل شامل للعلاقات بين الخلايا والبيئة المحيطة بها. يتميز المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) بدقة عالية ، بدقة محدودة تبلغ 0.1-0.2 نانومتر ، متجاوزا المجهر الضوئي بمقدار ~ 10-20 مرة15. يعوض عن عيوب الفحص المجهري الضوئي ويستخدم لتوضيح تطور الشبكية ونضج المشبك العصبي في البشر16،17 والأنواع المختلفة18،19،20،21. يتيح TEM التمييز المباشر للمكونات قبل المشبكية وما بعد المشبكية18,20 ، ويسمح أيضا بالمراقبة الشاملة للهياكل تحت الخلوية مثل الشرائط 2,3 والحويصلات22 والميتوكوندريا23. لذلك ، يعد TEM أداة أساسية لتحديد أنواع نقاط الاشتباك العصبي واستكشاف البنية التحتية لجهات الاتصال المشبكية في ROs على المستوى النانوي.

من الأهمية بمكان ملاحظة أن تحضير العينة له أهمية كبيرة للحصول على صور مجهرية إلكترونية عالية الجودة. على الرغم من أن بعض الدراسات قد أجرت EM على ROs12،13،24 ، إلا أن الإجراءات التفصيلية غير واضحة. نظرا لأن جودة صورة المجهر الإلكتروني تعتمد على تأثير تثبيت RO وتخلل الكاشف إلى حد كبير ، يجب مراعاة العديد من العوامل المهمة أثناء التحضير. وبالتالي ، من أجل التحقيق بشكل أفضل في جهات الاتصال المشبكية في ROs ، نقدم طريقة ذات قابلية استنساخ جيدة توضح نقاط تشغيل تثبيت RO وتضمينه وتحديد مواقع المراقبة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الحصول على مكاتب تسلم الطلبات من iPSCs25

ملاحظة: تم اشتقاق ROs من iPSCs عن طريق تعديل الإجراء المبلغ عنه سابقا.

  1. فصل iPSCs عند التقاء ~ 90٪ باستخدام البروتياز البكتيري (انظر جدول المواد). تقطيع المستعمرات إلى قطع وكشطها مع رافع الخلية.
  2. بعد التجميع ، أعد تعليق مجموعات الخلايا في 0.25 مل من Matrigel المثلج البارد. بعد 20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، يتم تشتيت الجل المتصلب بوسط DMEM/F12 (مكمل N2 0.5٪، مكمل B27 1٪، 0.1 ملليمتر β-ميركابتوإيثانول، 0.2 ملليمتر بديل ل-جلوتامين، 100 وحدة / مل من البنسلين و100 ملغ/مل من الستربتومايسين). حدد هذا الوقت على أنه اليوم 0 من التمايز.
  3. بعد 5 أيام من الثقافة العائمة ، تتجمع الخلايا لتشكيل أكياس الخلايا. انقل هذه الخراجات الخلوية إلى طبق بتري 100 مم حيث ستلتصق الآن وتنمو.
  4. في اليوم 15 ، استخدم البروتياز البكتيري لفصل الخلايا الملتصقة واستزراعتها في وسط DMEM / F12 (مكمل 2٪ B27 ، 0.1 mM من الأحماض الأمينية غير الأساسية).
  5. في اليوم 21 ، قم بتغيير الوسط ب 20 مل من الوسط المحتوي على المصل (وسط DMEM / F12 ، 8٪ FBS ، 2٪ مكمل B27 ، 100 mM Taurine ، و 2 mM L-glutamine بديل) ، واستبدل الوسط كل أسبوع.

2. التثبيت الأمامي ل ROs

  1. انقل برفق أحد ROs المستزرعة (~ D180 ، حجم قطره حوالي 1 ~ 2 مم هو الأمثل) من طبق بتري إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل مع ماصة ووضع علامة على المعلومات ذات الصلة حول ROs.
    ملاحظة: قطع ROs إلى النصف أو قطع الأنسجة سيئة التنظيم باستخدام ماكينة حلاقة تحت المجهر في الطبق الذي يحتوي على مثبت إذا كانت ROs كبيرة جدا.
  2. قم بإزالة وسط الاستزراع من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل باستخدام ماصة. أضف 1.5 مل من 2٪ بارافورمالدهيد -2٪ غلوتارالدهيد المثبت المخفف في 0.1 M فوسفات عازلة (PB) ، درجة الحموضة 7.4 ، وثبت في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 4 ساعات. قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: يمكن إيقاف هذه الخطوة مؤقتا لمدة 1 أسبوع ولكن يوصى بإعادة التشغيل في أقرب وقت ممكن. إذا تركت ROs لفترة أطول ، فقد يتسبب ذلك في التحلل الذاتي للخلايا مما يؤدي إلى تدمير البنية التحتية ل ROs. نظرا لهشاشة ROs ، تجنب العمليات الدورية أو المتذبذبة أو التقليب أو العمليات القاسية.

3. التثبيت اللاحق لمكاتب تسلم الطلبات

  1. قم بإزالة مثبت 2٪ بارافورمالدهايد -2٪ جلوتارالدهيد واغسله ب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.01 م (PBS) عند درجة حموضة 7.4 لمدة 3 × 10 دقائق. قم بتعليق ROs برفق في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل أثناء عملية الغسيل للشطف الكامل. لكل يوم إضافي من التثبيت ، قم بزيادة عدد الغسلات بمقدار اثنين لإزالة المثبت المتبقي قدر الإمكان.
  2. قم بإزالة أي PBS متبقي باستخدام ماصة واستبدلها ب ~ 150 ميكرولتر من حمض الأوسميك 1٪ (OsO4) حتى يتم غمر كتل الأنسجة. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في صندوق مظلم لحمايتها من الضوء والتسلل في RT لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: OsO4 هو مؤكسد قوي ويجب التعامل معه في غطاء الدخان.

4. تلطيخ والجفاف

ملاحظة: يجب تشغيل مزيل الرطوبة لتجفيف البيئة من هذه الخطوة.

  1. قم بإزالة OsO4 باستخدام ماصة ، واغسلها ب 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) 3 × 10 دقائق ، ثم اغسل 3 × 10 دقائق بالماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: لضمان الشطف الكامل ل ROs ، نوصي بتعليق ROs. نضح OsO4 في زجاجة مخصصة للتخلص منها.
  2. قم بإزالة آخر غسل بالماء منزوع الأيونات واستبدله ب ~ 150 ميكرولتر لكل أنبوب (ضمان التسلل الكامل لكتل الأنسجة) من أسيتات اليورانيوم والبقع لمدة 1-2 ساعة في RT. حماية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من الضوء.
  3. قم بإزالة أسيتات اليورانيوم واستبدلها ب 1 مل من الأسيتون بنسبة 50٪ في غطاء الدخان ، مع تجفيفها لمدة 10 دقائق. ثم ، استخدم 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ و 100٪ أسيتون للجفاف المتدرج لل ROs على التوالي. يستمر كل جفاف لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: اترك بعض السوائل لامتصاص ROs لكل تبادل لمنع التعرض للهواء والرطوبة. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل بسرعة في أسرع وقت ممكن لأن الأسيتون متقلب. نضح أسيتات اليورانيوم في زجاجة مخصصة للتخلص منها.

5. التسلل

  1. تخلص من الأسيتون وأضف ~ 150 ميكرولتر من الخليط المكون من الأسيتون وراتنج Epon-812 بنسبة 1: 1. ضعه في فرن 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. قم بإزالة الخليط أعلاه واستبدله بخليط يتكون من الأسيتون وراتنج Epon-812 بنسبة 1: 4. ضعه في فرن على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
  3. انقل ROs إلى الأنابيب الجديدة التي تحتوي على ~ 500 ميكرولتر من راتنجات الايبوكسي النقية بعناية وضعها في فرن 45 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.

6. التضمين

  1. قم بإعداد 30-50 مل من راتنجات الايبوكسي النقية في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل عن طريق خلط مجموعة الكاشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مسبقا. قم بتدوير راتنجات الايبوكسي النقية رأسا على عقب ببطء لمدة 30 دقيقة لتقليل فقاعات الهواء التي يدخلها الخلاط. ثم اتركيه في فرن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. أضف 2/3 حجم راتنجات الايبوكسي النقية إلى أخدود قالب التضمين.
  2. استخدم عود أسنان لاختيار ROs في قالب التضمين المجهز براتنجات الايبوكسي النقية.
  3. املأ الأخدود براتنجات الايبوكسي النقية حتى يبرز قليلا أو ينتفخ.
  4. اضبط موضع ROs على طرفي قالب التضمين للتضمين الاتجاهي. ضع قالب التضمين في فرن 45 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة ثم ضعه في فرن 65 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة.

7. تحديد المواقع شبه رقيقة

  1. صنفر راتنجات الايبوكسي الزائدة حول الأنسجة من نهايات الجوانب الأربعة الأطول من كتلة التضمين لتشكيل وجه شبه منحرف. قم بتثبيت كتلة التضمين في حامل تثبيت العينة وقم بربط البرغي باستخدام مفك البراغي L. ثم قم بتثبيت سكاكين زجاجية على حامل السكين وشد الجوز يدويا.
  2. قم بقص الراتنج الزائد حتى تتعرض المنطقة المرغوبة.
  3. املأ حوض السكين الزجاجي بالماء. قطع شرائح شبه رقيقة بسمك 1 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم شبه رقيقة ووضعها على شريحة مجهر بإبرة.
  4. أضف 50 ميكرولتر من 1٪ تولويدين أزرق لصبغ شرائح شبه رقيقة واحتضانها لمدة دقيقة واحدة عند 95 درجة مئوية على لوح التسخين. شطف بالماء المقطر لمدة 2 دقيقة. استخدم مجهرا بصريا عاديا 20x لمراقبة بنية الأقسام.

8. تقسيم رقيقة جدا

  1. قم بتثبيت كتل التضمين والسكاكين الزجاجية كما هو موضح في الخطوة 7.1. اضبط المسافة بين السكين وكتلة الأنسجة ومستوى السائل في الحوض وسرعة التقطيع. قطع المقاطع فائقة النحافة بسمك ~ 70-100 نانومتر باستخدام ميكروتوم فائق النحافة واغرف الشرائح على شبكة نحاسية (200 شبكة) مع الفيلم الداعم.
  2. قم بتلطيخ المقاطع فائقة الرقة باستخدام سترات الرصاص بنسبة 3٪ لمدة 15 دقيقة لتعزيز التباين في إجراء التلوين المزدوج.

9. تصوير ROs بواسطة TEM

  1. قم بتشغيل البرنامج (انظر جدول المواد).
  2. انقر فوق الزر "وضع الذاكرة " وقم بتمييز كل قسم فائق النحافة تقريبا.
  3. البحث عن الهياكل متشابك.
    1. يميز الهيكل الرقائقي لل ROs عند التكبير المنخفض.
    2. حدد موقع الطبقة النووية الخارجية (ONL) ، والتي توضح بنية نووية ذات كثافة إلكترون أعمق. بعد ذلك ، انتقل إلى محطة المستقبلات الضوئية حيث تتراكم العديد من الحويصلات. ابحث عن أطراف القضيب بشريط متشابك واحد والأطراف المخروطية ذات الأشرطة المشبكية المتعددة.
    3. انتقل إلى طبقة الضفيرة الداخلية (IPL) وابحث عن بنية مماثلة بشريط صغير.
  4. التقط الصورة المجهرية.
    1. انقر فوق ابدأ وأدخل طاقة التكبير المقابلة.
    2. احفظ الصور.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر إنشاء 3D ROs من خلال تمايز iPSC أداة قوية لدراسة آليات أمراض الشبكية والعلاج باستبدال الخلايا الجذعية. على الرغم من أن آخرين قد أظهروا الروابط المشبكية في ROs وظيفيا وكيميائيا مناعيا ، إلا أن الأدلة المباشرة على نقاط الاشتباك العصبي التقليدية والشريطية محدودة للغاية. نقدم هنا طريقة للتحقيق في البنية التحتية لنوعين من نقاط الاشتباك العصبي في ROs بواسطة TEM. بعد 180 يوما من الثقافة ، تم إصلاح ROs وتلوينها وتضمينها وشرائح رفيعة جدا. كشفت مراقبة TEM عن نقاط اشتباك عصبي شريطية في النهايات المحورية للمستقبلات الضوئية (الشكل 1 والشكل 2) ، والتي يتم توزيعها في OPL. تحت TEM ، شرائط من قضبان كروية حول الغزو المشبكي ، وتشكيل ملف تعريف على شكل حدوة حصان مع خلايا أفقية (الشكل 1). تحتوي القضبان عادة على شريط واحد فقط ، لكن المخاريط لها شرائط متعددة (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت نقاط الاشتباك العصبي الكيميائية الكلاسيكية بين خلايا الأمكرين في IPL (الشكل 3). تحت TEM ، يتكون المشبك الكيميائي من ثلاثة أجزاء: ما قبل المشبكي ، والشق المشبكي ، وما بعد المشبكي. الأغشية الخلوية المقابلة للأجزاء قبل المشبكية وما بعد المشبكية أكثر سمكا قليلا من بقية الأجزاء ، وتسمى الفجوة الضيقة بين الغشاءين الشق التشابكي. هناك العديد من الحويصلات المشبكية في السيتوبلازم في موقع الغشاء قبل المشبكي. تؤكد هذه الدراسة وجود اتصالات متشابكة كاملة في 3D ROs المشتقة من iPSC. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الشطف غير الكامل بين الخطوات سيؤدي إلى ترسيب الجسيمات السوداء أثناء عملية تحضير العينة (الشكل 4).

figure-results-1
الشكل 1: صور TEM لنقاط الاشتباك العصبي لشريط القضيب في ROs. (أ ، ب) تشكل الخلايا الأفقية والقضيب مظهرا جانبيا على شكل حدوة حصان. لوحظ شريط واحد (رؤوس سهام) في كل كروية قضيب في OPL of ROs ، محاطا بالعديد من الحويصلات. قضبان المقياس = 0.2 ميكرومتر. الاختصارات: ROs = عضويات شبكية العين. HC = خلية أفقية ؛ OPL = طبقة الضفيرة الخارجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صور TEM لنقاط الاشتباك العصبي الشريطية المخروطية في ROs. كانت ثلاثة نقاط اشتباك عصبي شريطية (رؤوس سهام) واضحة في عنيق مخروطي في OPL of ROs. شريط المقياس = 0.2 ميكرومتر. الاختصارات: TEM = المجهر الإلكتروني النافذ ؛ ROs = عضويات الشبكية. OPL = طبقة الضفيرة الخارجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: صورة TEM للمشابك الكيميائية في RHO. لوحظ وجود مشبك كيميائي تقليدي بين خلايا الأمكرين في طبقة IPL من ROs. يتكون المشبك الكيميائي من ثلاثة أجزاء: ما قبل المشبكي ، والشق المشبكي ، وما بعد المشبكي. هناك العديد من الحويصلات المشبكية في السيتوبلازم في موقع الغشاء قبل المشبكي. يشير السهم إلى اتجاه الإرسال المشبكي ، مما يشير إلى نقل العديد من الحويصلات من عملية AC1 إلى ملف تعريف AC2 آخر. شريط المقياس = 0.2 ميكرومتر. الاختصارات: TEM = المجهر الإلكتروني النافذ ؛ ROs = عضويات الشبكية. IPL = طبقة الضفيرة الداخلية ؛ ACs = خلايا أماكرين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مثال على مشكلة يمكن أن تحدث أثناء عملية تحضير العينة. هناك الكثير من الجسيمات السوداء (الدوائر) في عنيق المخروط بسبب الشطف غير الكامل بين الخطوات. السهام: مشبك الشريط. شريط المقياس = 0.2 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة ، قدمنا بروتوكولا مفصلا لمراقبة البنية التحتية المشبكية التقليدية والشريطية في ROs بواسطة TEM. يعتمد هذا البروتوكول على طرق تحضير الشبكية الموصوفة سابقا مع بعض التعديلات20. لتحسين معدل نجاح معالجة العينات وجودة الصور المجهرية TEM ، ضع في اعتبارك النقاط الرئيسية التالية. أولا ، من المهم الاعتراف بأن ROs تتطور من iPSCs ، وتشكل كتلة خلية تفتقر إلى الأوعية الدموية 6,26 والخلايا الدبقية26. قد يؤدي هذا الغياب إلى تنظيم أقل إحكاما مقارنة بالشبكية في الجسم الحي. وبالتالي ، من الأهمية بمكان التعامل مع Ros بلطف للحفاظ على هيكلها وسلامتها. أضف السوائل على طول جدار الأنبوب لتقليل الإزعاج.

الأهم من ذلك ، تأكد من الجفاف الشامل للأنسجة في البروتوكول الخطوة 4 وقم بتشغيل مزيل الرطوبة لتقليل رطوبة الغرفة قبل البدء في خطوة الجفاف. عند استبدال الأسيتون ، تعمل بسرعة واترك بعض السائل لغمر الأنسجة ، مما يمنع التدمير الشديد لبنية أنسجة RO. تنقبض الأنسجة غير المجففة بشكل حاد على ارتفاعات EM العالية ، ويعيق الماء في الأنسجة تغلغل عامل التضمين.

نظرا لأن ROs موجودة ككرات شفافة ، تأكد من الاتجاه الصحيح عند قطع شرائح شبه رقيقة للحصول على هياكل رقائقية سليمة. وأخيرا، تعتبر التناضح العكسي في المرحلة 3 (حوالي بعد D100-D150) ناضجة وتمتلك نقاط اشتباك عصبي متكاملة12، ونتيجة لذلك، يوصى بإجراء تحري الاتصالات المشبكية، بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي الشريطية والمشابك الكيميائية في تلك المكاتب.

على الرغم من تقديم دليل محدود على البنية التحتية لنقاط الاشتباك العصبي RO في الدراسات السابقة ، لا توجد تفاصيل حول الإجراء الكامل لإعداد عينة RO بالإضافة إلى تحديد أنواع مختلفة من الهياكل المشبكية12،13،24. استخدم Capowski et al. تقنيات مختلفة للتحقيق في خصائص ROs التي تسببها خطوط hPSC المختلفة في مراحل مختلفة ، بما في ذلك الصور المجهرية الإلكترونية التي تظهر وجود نقاط الاشتباك العصبي الشريطية المحملة بالحويصلة في عنيق المخروط ، والتي كشفت أن ROs في المرحلة 3 التي تسببها خطوط hPSC المختلفة ناضجة ووظيفية12. باستخدام TEM والتصوير ثنائي الفوتون ، أكد Cowan et al. تكوين هياكل متشابكة شريطية وظيفية في ROsالناضجة 13 ، ولكن لم يتم الإشارة إلى نوع المشبك (نقاط الاشتباك العصبي المخروطية أو القضيبية). ومع ذلك ، أظهرت دفعاتنا العديدة من نتائج الصور المجهرية بنية الغشاء لنقاط الاشتباك العصبي الشريطية بوضوح وتباين مثاليين ، مما يوضح أن طريقتنا مجدية وقابلة للتكرار. بالإضافة إلى ذلك ، حددنا أنواعا مختلفة من نقاط الاشتباك العصبي وفقا لخصائصها المورفولوجية المختلفة: عادة ما تكون نقاط الاشتباك العصبي المخروطية أكبر ولها عدة شرائط بينما تكون نقاط الاشتباك العصبي المخروطية أصغر عادة ، وتظهر شريطا واحدا فقط. في المشابك الكيميائية ، تتراكم الحويصلات في الهياكل قبل المشبكية ، ويتم تعزيز كثافة الإلكترون للشق المشبكي.

تعد السلامة الهيكلية للجهات اتصال متشابكة في ROs أمرا حيويا لوظيفتها. يوفر استخدام TEM للتحقيق في هذه الاتصالات مزايا واسعة ومهمة في مختلف المجالات ، مثل دراسة التسبب في شبكية العين في المختبر ، وإجراء فحص الأدوية في ROs ، وتقييم تقنيات التمايز من ROs ، من بين تطبيقات أخرى. محدودة بالتصوير 2D TEM ، يمكن ملاحظة جانب معين فقط من البنية التحتية ROs ، مما يجعل من الصعب تحليل بنية المشبك بالكامل بشكل مجسم. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم حدود التمايز في وضع الخلايا في غير محلها 13,26 ، مما يزيد من تعقيد عملية المراقبة. وبالتالي ، فإن الجمع بين حجم EM مع إعادة الإعمار 3D قد يتغلب على أوجه القصور هذه في المستقبل.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA1105503) ، ومختبر الدولة الرئيسي لعلم الأعصاب (SKLN-202103) ، ومؤسسة تشجيانغ للعلوم الطبيعية في الصين (Y21H120019) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (82070981).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 مم طبق بتريكورنينج430167
المجهر الإلكترونيالأسيتون10000
B27 ملحقجيبكورافع الخلية A3582801
سانتا كروزsc-395251
شبكات النحاسبكين Zhongjingkeyi التكنولوجيا المحدودةAZH400HH
DigitalMicrographGatan، Inc.البرمجيات
DispaseStemCell Technologies# 07913البروتياز البكتيري
DMEM / F12 متوسطGibco# 11320033
تضمين القالبBeijing Zhongjingkeyi Technology Co.، Ltd.GZ10592
Epon-812 علم المجهر الإلكتروني الراتنج# 14900
مصل الأبقار الجنيني (FBS) الصناعاتالبيولوجية# 04-0021A
المجهر الإلكترونيالجلوتارالديهايد16020
hiPSCشركة التكنولوجيا الحيوية المعروض المحدودةRC01001-A
الرصاص سيتراتبكين Zhongjingkeyi التكنولوجيا المحدودةGZ02618
L-GlutaMaxLife Technologies# 35050061بديل L-glutamine
MatrigelCorning356234
المجهر الشريحةCITOTEST80312-3161
N2 الملحقGibco17502048
Na 2< / sub>HPO4< / sub> middot ؛ 12H 2 < / sub >Oسيجما71650مكون من PB / PBS
NaH 2< / sub >PO 4 < / sub > & middot ؛ H2< / sub>OSigma71507مكون من الأحماض الأمينية غير الأساسية PB / PBS
سيجما#M7145
المجهرمجهر بيولوجيمجهر Xsz-107bnii
OsO4< / sub>TED PELLA4008-160501
فرنBluepardBPG9040A
علم المجهر الإلكتروني157-8
البنسلين الستربتومايسينجيبكو# 15140-122
شبه / رقيقة جدا ميكروتومReichert-Jung396649
التورينسيجما#T0625
تولويدين الأزرقسانجون للتكنولوجيا الحيويةE670105-0100
مجاهرإلكترونية للنقلهيتاشيH-7500
أسيتات اليورانيلتيد بيلاCA96049
بيتا ميركابتو إيثانولسيجما444203
علم برنامج علم مختبر البصري بارافورمالديهايد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489(2021).
  2. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  3. Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. Ribbon synapses of the retina. Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).
  4. Webvision: The organization of the retina and visual. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. , University of Utah Health Sciences Center, Webvision. Salt Lake City (UT). (1995).
  5. Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2. Elife. 7, e30388(2018).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), dev189746 (2020).
  8. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).
  9. Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. Human-on-chip for therapy development and fundamental science. Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).
  10. Chahine Karam, F., et al. Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability. J Pers Med. 12 (3), 502(2022).
  11. Lo, J., et al. Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies. Mol Aspects Med. 94, 101219(2023).
  12. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  13. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), e1634 1623-1640 (2020).
  14. Cora, V., et al. A cleared view on retinal organoids. Cells. 8 (5), 391(2019).
  15. Żak, A. M. Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives. Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).
  16. Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. The anatomy of the foveola reinvestigated. PeerJ. 6, e4482(2018).
  17. Syrbe, S., et al. Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study. Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).
  18. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  19. Liu, X., et al. Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish. Front Cell Dev Biol. 11, 1169941(2023).
  20. Yang, Q., et al. Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  21. Zhang, J., et al. Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background. Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).
  22. De Robertis, E., Franchi, C. M. Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones. J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).
  23. Frey, T. G., Mannella, C. A. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).
  24. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  25. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Front Cell Dev Biol. 8, 128(2020).
  26. Afanasyeva, T. aV., et al. A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications. Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة