مقالة منهجية

نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا لبناء الخلايا الاصطناعية

4.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66626

⸱

أبريل 19, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) المستخدم في بناء الخلايا الاصطناعية. يحدد المراحل الرئيسية مع النتائج التمثيلية في مقصورات صغيرة مختلفة. يهدف البروتوكول إلى إنشاء أفضل الممارسات للمختبرات المتنوعة في مجتمع الخلايا الاصطناعية ، مما يعزز التقدم في تطوير الخلايا الاصطناعية.

الملخص

تم استخدام نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) على نطاق واسع لتسهيل التجميع من أسفل إلى أعلى للخلايا الاصطناعية. إنه بمثابة المضيف للآلية الأساسية ل Central Dogma ، حيث يقف كهيكل مثالي لدمج وتجميع أنظمة التقليد الخلوية الاصطناعية المتنوعة. على الرغم من استخدامه المتكرر في تصنيع الخلايا الاصطناعية ، فإن إنشاء نظام CFPS مصمم وقوي لتطبيق معين لا يزال يمثل تحديا غير بسيط. في ورقة الطرق هذه ، نقدم بروتوكولا شاملا لنظام CFPS ، يستخدم بشكل روتيني في بناء الخلايا الاصطناعية. يشمل هذا البروتوكول المراحل الرئيسية في إعداد نظام CFPS ، بما في ذلك مستخلص الخلية ، وإعداد القالب ، وتحسين التعبير الروتيني باستخدام بروتين مراسل الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض نتائج تمثيلية من خلال تغليف نظام CFPS داخل مقصورات دقيقة مختلفة ، مثل قطرات أحادية الطبقة ، وحويصلات مستحلب مزدوج ، وغرف تقع فوق طبقات الدهون المزدوجة المدعومة. أخيرا ، نوضح الخطوات والشروط الحاسمة اللازمة للتجميع الناجح لأنظمة CFPS هذه في بيئات متميزة. نتوقع أن يسهل نهجنا إنشاء ممارسات عمل جيدة بين مختلف المختبرات داخل مجتمع الخلايا الاصطناعية المتوسع باستمرار ، وبالتالي تسريع التقدم في مجال تطوير الخلايا الاصطناعية.

المقدمة

برز تخليق الخلايا الاصطناعية أو الاصطناعية كمجال بارز للغاية للبحوث متعددة التخصصات ، وجذب اهتماما كبيرا من العلماء عبر مجالات البيولوجيا التركيبية والكيمياء والفيزياء الحيوية. يتحد هؤلاء العلماء من خلال الهدف المشترك المتمثل في بناء الحد الأدنى من الخلايا الحية1،2،3. كان النمو السريع لهذا المجال متماشيا مع التطورات الكبيرة في التقنيات الحيوية ، مثل معالجة الحمض النووي المؤتلف4 ، ومواد المحاكاة الحيوية5 ، وتقنيات التصنيع الدقيق للتجزئة6 ، بما في ذلك طريقة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS)7. تشمل أنظمة CFPS الآلية الخلوية الأساسية للنسخ والترجمة ، مما يوفر الإطار الأساسي لتطوير وتكامل الخلايا الاصطناعية متعددة الوظائف.

على الرغم من أن تقنيات CFPS تستخدم بشكل متكرر في تجميع الخلايا الاصطناعية ، إلا أن تطوير نظام CFPS قوي ومصمم خصيصا لتجميع أنظمة الخلايا الاصطناعية المختلفة لا يزال يمثل تحديا معقدا. حاليا ، تتوفر العديد من أنظمة CFPS ، مشتقة من كل من بدائيات النوى والكائنات الحيةالنموذجية 8 ، كل منها متخصص لتطبيقات معينة في تخليق الخلايا الاصطناعية. بالإضافة إلى أدوارها المركزية في النسخ والترجمة ، تختلف أنظمة CFPS في مكوناتها الرئيسية وإجراءات الإعداد المرتبطة بها. هذه الاختلافات ، التي تشمل الاختلافات في مستخلصات الخلايا ، وبوليميراز الحمض النووي الريبي ، وطرق تحضير القوالب ، والتركيبات العازلة ، ترجع إلى حد كبير إلى مسارات التطوير المتميزة التي تتبعها مجموعات البحث التي حسنت أنظمتها بشكل مكثف لتحقيق أقصى إنتاجية من البروتين.

من بين المكونات المختلفة لنظام CFPS ، يعد مستخلص الخلية مجموعة إنزيمية مهمة للنسخ والترجمة ، وبالتالي فهو محدد رئيسي لأداء CFPS9. يعد نظام CFPS القائم على الإشريكية القولونية (E. coli) هو النظام الأكثر استخداما نظرا لوضعه كأفضل كائن بدائي النواة مفهوما. علاوة على ذلك ، تم تطوير نظام CFPS المعاد تشكيله بالكامل والذي يتألف من البروتينات والريبوسومات المنقاة بشكل فردي ، والمعروفة باسم PURE10 ، من قبل مجموعة أبحاث Ueda ، وهو مناسب بشكل خاص للتطبيقات التي تتطلب خلفية واضحة. اليوم ، حتى أنظمة CFPS القائمة على الإشريكية القولونية قد تنوعت ، خاصة من حيث سلالات المصدر للإكستراك11 وطرق التحضير12,13 ، بوليميراز الحمض النووي الريبي14,15 ، مصادر الطاقة16,17 ، والأنظمة العازلة18,19. تشمل السلالات الأكثر استخداما مشتقات سلالة K12 و B ، مثل A1920 و JM10921 و BL21 (DE3) 22 و Rossetta223 ، إلى جانب نظيراتها المعدلة وراثيا.

في البداية ، تم اختيار سلالات الإشريكية القولونية ذات أنشطة RNase والبروتياز المنخفضة لتعزيز استقرار mRNA واستقرار البروتينات المؤتلفة المركبة حديثا ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاجية البروتين النهائية24. بعد ذلك ، تم تصميم مستخلصات الإشريكية القولونية لتسهيل تعديلات محددة بعد الترجمة ، بما في ذلك الجليكوزيل25 والفسفرة26 والدهون27 ، لتحقيق تعديلات ما بعد الترجمة المذكورة أعلاه. بالإضافة إلى ذلك ، تم دمج مجموعة من المواد المضافة مثل المرافقات الجزيئية28 والمثبتات الكيميائية للمساعدة في طي البروتينات المستهدفة ، مما يساهم في تنويع أنظمة CFPS. يتم استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 البكتيري ، المعروف بعمليته العالية ، في الغالب للنسخ ، على الرغم من استخدام بوليميراز آخر مثل SP629 . تم تكييف بوليميراز الحمض النووي الريبي الداخلي الإشريكية القولونية للنماذج الأولية للدوائر الجينية التي تستفيد من عوامل سيجما30. أخيرا ، تم تحسين مجموعة متنوعة من سلائف الطاقة31،32،33 والأملاح المختلفة والمكونات العازلة19،34،35 بشكل منهجي لتعزيز الإنتاجية.

إلى جانب نظام CFPS نفسه ، فإن طرق التغليف وكذلك مواد التقسيم ضرورية أيضا لتجميع الخلايا الاصطناعية الناجح. تشمل الأنظمة المختلفة التي تم تطويرها لتغليف تفاعل CFPS بنجاح قطرات الماء / الزيت المستقرة بالسطحي ، والدهون / البوليمر ، وحويصلاتها الهجينة أحادية الصفيحة (بأقطار تتراوح من 50 نانومتر إلى عدة ميكرومتر) ، بالإضافة إلى طبقات ثنائية دهنية مدعومة بشكل مستو. ومع ذلك ، نظرا لمحتوى الجزيء المعقد لنظام CFPS ، يعتمد معدل نجاح التغليف على حالات محددة ، خاصة لتشكيل الحويصلات. لتحسين معدل نجاح وكفاءة تغليف CFPS ، تم تطوير العديد من رقائق الموائع الدقيقة لتسهيل تكوين كل من القطرات والحويصلات36. ومع ذلك ، يجب إنشاء رقائق وأجهزة إضافية.

يحدد هذا البروتوكول نظام E. coli CFPS باستخدام سلالة BL21 (DE3) ، وهي مضيف شائع الاستخدام لإنتاج البروتين المؤتلف. يشمل البروتوكول سردا مفصلا لإعداد مستخلص الخلية ، وإعداد القالب ، وتحسين التعبير القياسي باستخدام بروتين مراسل الفلورسنت. علاوة على ذلك ، نقدم نتائج مثالية تم تحقيقها من خلال تغليف نظام CFPS داخل مقصورات دقيقة متنوعة ، بما في ذلك قطرات أحادية الطبقة ، وحويصلات مستحلب مزدوجة ، وغرف تقع فوق طبقات الدهون المزدوجة المدعومة. وأخيرا، نوضح العناصر الإجرائية المحورية والشروط اللازمة التي لا غنى عنها للنجاح في إنشاء أنظمة CFPS هذه في سياقات بيئية متميزة.

البروتوكول

1. استخراج التحضير

  1. قم بخط سلالة E. coli BL21 (DE3) من مخزون الجلسرين على صفيحة أجار Luria Bertani (LB) واحتضانها لمدة 15 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد مزرعة مسبقة بين عشية وضحاها عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة من صفيحة LB المحضرة حديثا في قارورة سعة 50 مل من وسط Luria Bertani (LB).
  3. قم بتلقيح 5 مل من الزراعة المسبقة في 500 مل من وسط 2xYTPG في دورق Erlenmeyer محير سعة 3 لتر. قم بزراعته عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي (بين 220 دورة في الدقيقة و 250 دورة في الدقيقة) واحصد الخلايا عندما تصل إلى مرحلة منتصف السجل (OD600 ~ 3). بعد ذلك ، ضع مزارع الخلايا في ماء جليدي بارد لمدة 10 دقائق وأجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، يمكن حذف الجلوكوز في وسط 2xYTPG لتطبيقات محددة 9,12.
  4. أعد تعليق كريات الخلايا الناتجة في 35 مل من المخزن المؤقت S30 A المبرد مسبقا ، متبوعا بالطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
  5. كرر الخطوة 1.4 مرتين.
    ملاحظة: يمكن تخزين كريات الخلايا عند -80 درجة مئوية إذا لم يتم استخدامها على الفور.
  6. أعد تعليق الكريات النهائية في المخزن المؤقت S30 B (على سبيل المثال ، استخدم 1.1 مل من المخزن المؤقت S30 B لكل 1 جم من حبيبات الخلية) وقم بتعطيل الخلايا بتمريرة واحدة عبر French Press عند 17000 رطل / بوصة مربعة.
    1. لاستخدام المطبعة الفرنسية ، اتبع دليل المستخدم وانقل تعليق الخلية إلى غرفة تعطيل المعدن الفرنسية ، مما يضمن تجميع جميع المكونات وإغلاق الصمام السفلي لغرفة التعطيل.
    2. انقل حجرة التعطيل المجمعة إلى المنصة الهيدروليكية وقم بتأمين قفل الأمان.
    3. قم بتشغيل المضخة الهيدروليكية وابدأ الاضطراب.
    4. تحكم في صمام المخرج لتمكين تعليق الخلية من التدفق من أنبوب المخرج إلى أنبوب جديد سعة 50 مل. اضبط سرعة التدفق لضمان التعطيل الفعال ، من الناحية المثالية قطرة واحدة في كل مرة. حافظ على الضغط فوق الحد الأدنى البالغ 15000 رطل / بوصة مربعة.
  7. أجهزة الطرد المركزي المحللة الناتجة عند 30000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية وجمع المادة الطافية. كرر الطرد المركزي مرة واحدة وجمع طاف. أضف 0.3 حجم من المخزن المؤقت قبل الحضانة إلى المادة الطافية المجمعة واحتضانها مع رج لطيف عند 37 درجة مئوية لمدة 80 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي استخدام المخزن المؤقت قبل الحضانة إلى زيادة العائد النهائي على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن أن الجريان السطحي الفارغ (بدون مخزن مؤقت قبل الحضانة) يمكن أن يحسن أيضا الكفاءة 37,38 ، والتي تعتمد على سلالة المصدر المقابلة.
  8. قم بغسيل خليط الجريان السطحي الناتج لمدة ساعتين مقابل 2 لتر من المخزن المؤقت S30 C ، واستبدل المخزن المؤقت لغسيل الكلى مرة واحدة ب 2 لتر من المخزن المؤقت S30 الطازج C ، وقم بغسيل الكلى طوال الليل عند 4 درجات مئوية39.
    ملاحظة: يمكن تقصير الخطوة الثانية من غسيل الكلى طوال الليل إلى حوالي 3 ساعات.
  9. اجمع العينة التي تم تحليلها وأجهزة الطرد المركزي عند 30000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية والقسمة في أحجام مناسبة وقم بتجميدها على الفور في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينة المجمدة في -80 °C على الأقل لمدة 6 أشهر إلى 1 سنة دون فقدان الكفاءة.

2. بوليميراز الحمض النووي الريبي T7

  1. تحويل بلازميد pAR1219 إلى BL21 (DE3) نجم E. coli الخلايا المختصة40.
  2. تلقيح 10 مل من مزرعة ليلية في 1 لتر من وسط رطل (يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين). تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى يصل OD600 إلى 0.6-0.8.
  3. ابدأ الحث بإضافة تركيز نهائي قدره 1 mM IPTG. حث الخلايا لمدة 5 ساعات إضافية والحصاد عن طريق الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بتخزين كريات الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أسابيع.
  4. أعد تعليق كريات الخلية في 30 مل من المخزن المؤقت T7 A وتعطيل الخلايا بتمريرة واحدة عبر الصحافة الفرنسية عند 15000 رطل / بوصة مربعة. قم بإزالة بقايا الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. أضف كبريتات الستربتومايسين قطرة قطرة إلى المادة الطافية من الخطوة السابقة ، لتصل إلى تركيز نهائي قدره 4٪ (وزن / حجم). بعد حضانة قصيرة على الجليد ، جهاز طرد مركزي عند 20000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. قم بتصفية المادة الطافية من خلال غشاء مرشح 0.45 ميكرومتر وقم بتحميل العينة المفلترة على عمود تبادل أنيون قوي (حجم العمود 40 مل) ، والذي تم ضبطه مسبقا بأحجام 10 أعمدة من المخزن المؤقت T7 B ، عبر نظام كروماتوجراف سائل آلي.
  7. اغسل العمود المحمل ب 50 مجلدا من المخزن المؤقت T7 B وقم بإزالة العينة بأحجام 10 أعمدة من مخاليط Cالعازلة منخفضة الملح (50 mM NaCl) والملح العالي (500 mM) T7 ، مما أدى إلى إنشاء تدرج تركيز خطي لكلوريد الصوديوم من 50 إلى 500 mM بمعدل تدفق ~ 3 مل / دقيقة41.
  8. جمع كسور الذروة وتحليلها بواسطة SDS-PAGE.
    ملاحظة: يظهر بوليميراز T7 نطاقا سائدا عند ~ 100 كيلو دالتون ، بينما لا تزال تظهر كميات كبيرة من الشوائب على هلام SDS-PAGE.
  9. قم بتجميع الكسور التي تحتوي على بوليميراز T7 والدياليز مقابل 2 لتر من T7 buffer C طوال الليل.
  10. أضف الجلسرين للوصول إلى تركيز نهائي بنسبة 10٪ وتركيز الخليط الناتج إلى تركيز نهائي قدره 3-4 مجم / مل عن طريق الترشيح الفائق42.
    ملاحظة: إذا ظهر هطول الأمطار أثناء عملية التركيز ، فتوقف فورا وقم بإزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي.
  11. اضبط تركيز الجلسرين على 50٪. القسمة وفلاش تجميد العينة مع النيتروجين السائل. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية لفترة أطول.
    ملاحظة: يمكن أيضا تخزين حصة صغيرة في -20 درجة مئوية لمدة 1 شهر على الأقل دون فقدان الكفاءة.

3. إعداد العازلة

  1. قم بإعداد المخازن المؤقتة كما هو موضح في الجدول 1 قبل يوم من الاستخدام.

4. تصميم القالب وإعداده

  1. استنساخ الجين محل الاهتمام في ناقل قائم على المروج T7 أو إنشاء منتج PCR خطي يحتوي على الجين محل الاهتمام.
    ملاحظة: راجع قسم المناقشة للاطلاع على مبادئ التصميم.
  2. تحضير البلازميد من ثقافة بين عشية وضحاها باستخدام مجموعة استخراج البلازميد.
    ملاحظة: نوصي باختيار مجموعة البلازميد التي تتضمن خطوة ترسيب الأيزوبروبانول متبوعة بإجراء غسيل يحتوي على 70٪ من الإيثانول.
  3. قم بإذابة الحمض النووي المجفف في كمية صغيرة من الماء عالي النقاء إلى تركيز يتراوح بين 200 ميكروغرام / مل و 500 ميكروغرام / مل ، على النحو الذي يحدده مقياس الطيف الضوئي الحجمي الصغير.
  4. اختياري: التعبير مباشرة عن البروتينات من منتجات PCR الخطية.
    ملاحظة: في هذه الحالة ، هناك حاجة إلى خطوة تنقية PCR.

5. تحسين Mg2+ و K +

  1. قم بإعداد مزيج رئيسي لفحص تركيز المغنيسيوم2+ كما هو موضح في الجدول 2 ، أو لفحص تركيز K + كما هو موضح في الجدول 3.
  2. انقل المزيج الرئيسي إلى أنابيب ميكروفوج فردية أو صفيحة 96 بئرا على شكل حرف V.
  3. ماصة الحجم الدقيق لمحاليل مخزون Mg2+ أو K+ في أنابيب الميكروفوج الفردية أو لوحة 96 بئرا على شكل حرف V واستكمال تفاعلات CFPS بماء عالي النقاء. احتضان ردود الفعل لمدة 2 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: في حالة استخدام لوحة 96 بئر على شكل حرف V ، أغلق اللوحة بغطاء بلاستيكي لمنع التبخر.
  4. أخرج 2 ميكرولتر من خليط التفاعل وانقله إلى صفيحة سوداء ذات 96 بئرا لقياسات التألق بواسطة قارئ اللوحة.
    ملاحظة: نستخدم قارئ لوحة الفلورسنت مع الإعداد التالي: الإثارة/الانبعاث: 485/528، الكسب: 50، ارتفاع القراءة: 7.00 ملم. ومع ذلك ، سيحتاج المرء إلى ضبط قارئ الألواح الخاص به لإنشاء منحنى معايرة محدد باستخدام بروتينات الفلورسنت النقية.

6. التغليف

  1. قطره
    1. تحضير زيت مفلور يحتوي على خافض للتوتر السطحي (2٪ PFPE-PEG في HFE7500) أو محلول زيت معدني دهني عن طريق إذابة الدهون في الزيت المعدني (راجع الخطوة 6.2.1)
    2. تحضير حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر من تفاعل CFPS من خلال الجمع بين الكواشف المقابلة 2-18 من الجدول 4. أضف تفاعل CFPS إلى 500 ميكرولتر من الزيت المحضر مسبقا في أنبوب سعة 1.5 مل ، ثم افرك الأنبوب بقوة على رف الأنبوب 50x لتشكيل قطرات دقيقة (ماء في زيت). احتضان الأنبوب عند 30 درجة مئوية لإجراء التفاعل.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام رقائق الموائع الدقيقة البسيطة لتوليد قطرات متجانسة أيضا43.
  2. الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة (GUVs)
    1. تحضير محلول الزيت الدهني المعدني
      1. أضف 57 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى قنينة زجاجية سعة 4 مل ثم أضف 18 ميكرولتر من 25 مجم / مل 1-بالميتويل-2-أوليويل-جلسرين-3-فوسفوكولين (POPC) لتشكيل محلول دهون الكلوروفورم ، وتحقيق تركيز نهائي قدره 8 مللي مول (استخدم دهون أخرى بتركيزات نهائية مماثلة).
        ملاحظة: كانت خطوة الخلط هذه لضمان الخلط المتجانس للدهون المختلفة.
      2. تبخر الكلوروفورم تحت تدفق الأرجون لمدة 15 دقيقة ، ثم تتبخر تحت فراغ لمدة 1 ساعة.
      3. قم بإذابة الدهون الجافة الناتجة في 1500 ميكرولتر من الزيت المعدني ، لتصل إلى تركيز نهائي يبلغ 400 ميكرومتر. احتضان الخليط بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    2. تشكيل طبقة دهنية بينية
      1. أضف 500 ميكرولتر من المحلول الخارجي (انظر الجدول 5) إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، وقم ببطء بوضع 250 ميكرولتر من محلول الزيت المعدني الدهني فوق المحلول الخارجي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتشكيل طبقة دهنية بينية مستقرة.
    3. تحضير الحل الداخلي
      1. امزج جميع الكواشف في الجدول 6 لتشكيل المحلول الأولي واحتفظ به على الجليد حتى الاستخدام. أكمل المحلول الداخلي بإضافة T7RNAP ومستخلص S30 وقالب DNA إلى المحلول السابق للداخل ككواشف 16-18 مدرجة في الجدول 4.
        ملاحظة: زيادة تركيز السكروز المغلف فوق 250 mM قد يمنع الترجمة الخالية من الخلايا44.
    4. تشكيل GUVs
      1. أضف 50 ميكرولتر من المحلول الداخلي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من الزيت المعدني الدهني ، والماصة لأعلى ولأسفل بسرعة ، والدوامة بقوة.
      2. اترك الأنبوب على الثلج لمدة 10 دقائق وأضف ببطء 20 ميكرولتر من خليط المستحلب إلى الجزء العلوي من طور الزيت في الأنبوب سعة 1.5 مل من الخطوة 6.2.2.
      3. أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم (استخدم سرعة طرد مركزي تتراوح من 100 × جم إلى 1000 × جم) لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ومراقبة تكوين GUVs في قاع الأنبوب.
        ملاحظة: يمكن استخدام سرعة طرد مركزي محددة أعلى ؛ ومع ذلك ، قد يعتبر المرء أن سرعة الطرد المركزي يمكن أن تؤثر على حجم GUVs45 المشكلة.
      4. قم بإزالة مرحلة الزيت العلوية.
      5. نضح 30 ميكرولتر من GUVs في الجزء السفلي من الأنبوب بعناية. احتضان GUVs التي تم جمعها عند 30 درجة مئوية.
        ملاحظة: تختلف درجة حرارة الحضانة المثلى باختلاف البروتينات.
      6. استخدم مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (LSM) لمراقبة التعبير عن البروتينات الفلورية.
  3. طبقة الدهون المزدوجة المدعومة (SLB)
    1. إعداد غرف SLB
      1. سمكة البيرانا النظيفة 24 × 24 مم # 1.5 تغطي عن طريق إضافة سبع قطرات من حمض الكبريتيك وقطرتين من 50٪ بيروكسيد الهيدروجين إلى وسط كل شريحة غطاء. احتضان المواد المتفاعلة على أغطية الغطاء لمدة 45 دقيقة على الأقل ؛ شطف جيدا بالماء عالي النقاء.
      2. قم بتجميع حجرة إعادة التكوين عن طريق توصيل أنبوب ميكروفوج مقطوع سعة 0.5 مل على أغطية الغطاء النظيفة باستخدام غراء بصري معالج تحت مصباح فوق بنفسجي (365 نانومتر) لمدة 10 دقائق لتشكيل غرفة تفاعل.
    2. تشكيل SLB
      1. قم بإذابة 80٪ 1،2-ديوليويل-سن-جلسرين-3-فوسفوكولين (DOPC) ، 19.95 مول٪ 1،2-ديولويل-سن-جلسرين-3-فوسفو-إل-سيرين (DOPS) ، و 0.05٪ Atto488-DOPE (1،2-ديولويل-سن-جليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين = DOPE) ، اخلطيها في الكلوروفورم ، جفف تحت تدفق النيتروجين المعتدل والفراغ لمدة 1 ساعة لإزالة المذيب تماما.
      2. أعد ترطيب طبقة الدهون المجففة في المخزن المؤقت SLB A ، مما ينتج عنه تركيز دهون نهائي يبلغ 4 مجم / مل.
      3. دوامة وصوتنة العينات الناتجة حتى تصبح واضحة.
      4. قم بتخفيف 4 مجم / مل من سيارات الدفع الرباعي مع 130 ميكرولتر من المخزن المؤقت SLB A ، وانقل 75 ميكرولتر من التعليق إلى غرف التفاعل المشكلة مسبقا ، واحتضانها على كتلة حرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت SLB A إلى غرفة التفاعل لمزيد من الحضانة لمدة 2 دقيقة.
      5. اغسل الحجرة ب 2 مل من المخزن المؤقت SLB B (المخزن المؤقت SLB A بدون MgCl2) قبل تبادل المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت S30 C مع 0.4٪ (وزن / حجم) BSA لتفاعلات CFPS ، وترك 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت داخل الغرفة لمنع SLB المشكل من الجفاف.
      6. قم بإزالة المخزن المؤقت S30 المتبقي C وأضف خليط تفاعل CFPS إلى غرفة SLB بعناية. احتضان الغرفة عند 30 درجة مئوية ومراقبة التعبير تحت مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.

النتائج

لكل دفعة جديدة من مستخلص الخلايا وبوليميراز T7 RNA ، يوصى بإجراء فحص أساسي لكل من تركيزات Mg2+ و K + لضمان الأداء الأمثل لنظام CFPS. يمكن أن يكون مضان GFP للمجلد الفائق بمثابة مؤشر للعائد الإجمالي لنظام CFPS في ظل ظروف مختلفة ، كما هو موضح في الشكل 1A ، B. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر مقارنة متوازية للعائد لنظام CFPS عبر مقصورات مختلفة في الشكل 1C ، مما يدل على الأداء المتسق في أنظمة CFPS المغلفة ، وإن كان ذلك مع انخفاض طفيف في GUVs ، ربما بسبب تأثير السكروز46. علاوة على ذلك ، تم تغليف تفاعلات CFPS بنجاح في قطرات (الشكل 2) ، GUVs (الشكل 3) ، وفوق SLBs (الشكل 4).

يوضح الشكل 2 أ تكوين قطرات المستحلب ، وهو ما يتضح عندما يصبح محلول الزيت مضطربا. تم التقاط تعبير البروتينات الفلورية الخضراء / الحمراء (GFP و mCherry) باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر. أظهر الشكل 3 نجاح تغليف تفاعل CFPS داخل GUVs من خلال عملية نقل المستحلب البسيطة. أشارت القناة الحمراء إلى الدهون الموصوفة. أظهرت القناة الخضراء تعبير المجلد الفائق GFP ؛ وتمثل القناة الصفراء صبغة فلورية خاملة. يوضح الشكل 4A غرفة SLB حيث يمكن ترسيب تفاعل CFPS. داخل هذه الغرفة ، تم تشكيل SLB أعلى الغطاء الزجاجي ، مع وضع خليط تفاعل CFPS فوق SLB المشكل مسبقا ، مما يتيح التصوير عبر مجهر المسح بالليزر متحد البؤر. كما هو موضح في الشكل 4B ، تم تصور SLB بواسطة الدهون الموسومة ، الموضحة باللون الأخضر ، بينما تم عرض GTPase Cdc42 الصغير المعبر عنه المنصهر مع mCherry باللون الأرجواني. كان التعبير في الموقع ل mCherry-Cdc42 قابلا للملاحظة ، جنبا إلى جنب مع عملية استهداف الغشاء القابل للانعكاس ، تحت المجهر. ومع ذلك ، تم استكمال نظام CFPS المستخدم بآلية prenylation ، على النحو المفصل في منشور حديث47.

figure-results-1
الشكل 1: تحسين ومقارنة نظام CFPS. فحص تركيز (A) Mg2+ وتركيزات (B) K + لنظام CFPS بكميات كبيرة. (ج) مخطط شريطي يوضح نواتج تعبير البروتين في أجزاء مختلفة. تم استخدام مضان GFP superfolder لتحديد عائد نظام CFPS ، الذي تم قياسه بواسطة قارئ لوحة أو مجهر مسح ليزر متحد البؤر. الاختصارات: CFPS = تخليق البروتين الخالي من الخلايا. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ sfGFP = المجلد الفائق GFP ؛ GUV = حويصلة أحادية الصفيحة عملاقة ؛ SLB = طبقة الدهون المزدوجة المدعومة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تخليق البروتين الخالي من الخلايا في قطرات. (أ) صورة لتفاعلات CFPS المغلفة في قطرات الماء في الزيت المستقرة بخافض للتوتر السطحي. (B) صور Brightfield و (C ، D) مضان ل CFPS من (C) mCherry و (D) المجلد الفائق GFP مغلفة في قطرات مرئية بواسطة مجهر المسح بالليزر متحد البؤر. يشار إلى المجلد الفائق GFP باللون الأخضر ؛ يشار إلى mCherry باللون الأرجواني. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: CFPS = تخليق البروتين الخالي من الخلايا. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تخليق البروتين الخالي من الخلايا في GUVs. (أ) صورة لتفاعلات CFPS المغلفة في GUVs. (ب-د) صورة مضان ل CFPS مغلفة داخل POPC GUVs ، معبرة عن المجلد الفائق GFP. (ب) تم تمييز الطبقة المزدوجة الليبيدة بنسبة 0.05٪ من الدهون Atto647N-DOPE ، الموضحة باللون الأحمر ، (ج) صبغة خاملة موضحة باللون الأصفر ، و (د) يشار إلى المجلد الفائق GFP باللون الأخضر. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: CFPS = تخليق البروتين الخالي من الخلايا. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ GUV = حويصلة أحادية الصفيحة عملاقة ؛ POPC = 1-بالميتويل-2-أوليويل-الجلسرين-3-فوسفوكولين; DOPE = 1،2-ديوليويل-سن-جليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تخليق البروتين الخالي من الخلايا لبروتين GTPase-Cdc42 الصغير أعلى SLBs. (أ) رسم تخطيطي لإعادة تكوين استهداف غشاء Cdc42 واستخراج الغشاء المعتمد على RhoGDI على SLBs ، كما هو موضح بواسطة مجهر المسح بالليزر متحد البؤر. تم تنفيذ آلية prenylation عن طريق مستخلص غني ب prenlytransferase ، والذي تم وصفه بالتفصيل في مكان آخر. 47. (ب) عرض متعامد لما قبل وبعد تحضير خليط التفاعل أعلى SLB. (ج، د) السلاسل الزمنية لشدة mCherry-Cdc42 على الغشاء (الوردي) وفي المحلول (الأسود) أثناء استهداف الغشاء (C) و (D) استخراج الغشاء. تم تكييف أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (A-D) من Kai et al.47. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة. ملاحظة: أضف β-ميركابتوإيثانول و DTT قبل الاستخدام مباشرة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مخطط السحب لفحص تركيز المغنيسيوم2+ . الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: مخطط السحب لفحص تركيز K + . الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: تكوين المحلول الداخلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: تكوين المحلول الخارجي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 6: تكوين محلول Preinner . الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

تحدد هذه المخطوطة نظاما معدلا لتخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) مصمما للاستخدام في العديد من المقصورات الدقيقة عبر منصات الخلايا الاصطناعية ، بما في ذلك قطرات الماء في الزيت ، و GUVs ، و SLBs. استخدمنا سلالة مضيف تعبير البروتين المؤتلف E. coli القياسية ، BL21 (DE3) ، كمستخلص مصدر لبناء أنظمة الخلايا الاصطناعية المرتكزة على البروتين. أنتج هذا النهج حوالي 0.5 مجم / مل من البروتين عبر مقصورات مختلفة. في حين يمكن استخدام سلالات مصدر استخراج مخصصة أخرى ، فقد تم تحسين هذه الأنظمة بشكل أساسي لنوع معين من البروتين أو النشاط الأيضي ، والذي قد يكون دون المستوى الأمثل للتعبير العام عن البروتين. سهلت التطورات الحديثة في تحليل قياس الطيف الكتلي الكمي الدراسات التجريبية حول التحليل البروتيني لخلية المحللة48,49 ، لا سيما في ظل ظروف التحضير المختلفة.

على الرغم من اكتساب رؤى من هذه الدراسات ، فإن إنشاء علاقة كمية بين عوامل البروتين المحددة هذه والأداء العام لأنظمة CFPS لا يزال يمثل تحديا. تركت هذه الفجوة أسئلة دون إجابة حول كيفية التقييم الكمي لأداء دفعة معينة من المستخلص. وبالإضافة إلى ذلك، لم تجر مقارنة منهجية ومتوازية لمختلف سلالات المصادر المبلغ عنها. في هذه الدراسة ، استخدمنا وسط 2xYPTG لتعزيز إنتاج الكتلة الحيوية ، وهي استراتيجية موصى بها للانتقال إلى 2xYPT عند استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي الداخلي للنسخ. على الرغم من الاقتراحات القائلة بأنه يمكن دمج بوليميراز T7 في إجراء تحضيرالمستخلص 45 ، فقد اخترنا بروتوكول تحضير منفصل لمستخلص S30 وبوليميراز T7 RNA لتقليل الاختلافات العالية من دفعة إلى أخرى.

يرتبط إنتاج البروتين المستهدف ارتباطا جوهريا بعملية النسخ / الترجمة المركزية. يعد التصميم المناسب للقالب والنقاء أمرا بالغ الأهمية لنجاح التعبير الخالي من الخلايا. بالإضافة إلى قالب البلازميد ، يمكن أيضا استخدام الحمض النووي الخطي المزدوج الذي تقطعت به السبل الناتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يوفر ملاءمة للفحص والتطبيقات عالية الإنتاجية. على عكس تصميم القالب التقليدي للتعبير في الجسم الحي في الإشريكية القولونية ، يتم تبسيط تصميم القالب في نظام E. coli الخالي من الخلايا دون الحاجة إلى اعتبارات تحريض التعبير. العنصر الأساسي الوحيد في قالب التعبير الخالي من الخلايا هو التسلسل التنظيمي T7. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، يمكن أن يؤثر تسلسل 5 'للجين المستهدف على بدء الترجمة ، اعتمادا على البنية الثانوية التي يشكلها mRNA المكتوب المقابل. إذا كان موقع ربط الريبوسوم يقع داخل حلقة جذعية مستقرة من mRNA المنسوخة ، فقد يتم إعاقة بدء الترجمة بشكل كبير ، مما يؤدي إلى ضعف التعبير العام. وبالمثل ، يمكن للكودونات النادرة المتتالية أن تعيق التعبير ويجب تحسينها ، على غرار الدراسات في الجسم الحي . يمكن تحقيق ذلك من خلال خوادم مفتوحة المصدر مخصصة لتحسين الكودون50 والتنبؤ بالبنية الثانوية mRNA51.

فيما يتعلق بنظام العازلة ، استخدمنا مخزن خلات مكمل بفوسفات الكرياتين وكيناز الكرياتين كمصادر لتجديد الطاقة في إعدادنا التجريبي. أسفر هذا الإعداد عن مستوى تعبير معتدل وحركية سريعة نسبيا ، ويعزى ذلك إلى تفاعل تجديد الطاقة أحادي الخطوة الذي يحفزه الكرياتين كيناز باستخدام فوسفات الكرياتين. في حين أن بعض الباحثين قد تحولوا إلى نظام عازلة الغلوتامات ، مشيرين إلى تشابهه الأقرب مع البيئة الخلوية52 ، لاحظنا عدم وجود اختلافات كبيرة في إنتاجية تعبير البروتين مع بروتوكولاتنا الحالية. ومع ذلك ، أشار التحليل البروتيني الأخير إلى أن أنظمة العازلة المختلفة بالاقتران مع طرق معالجة المستخلص يمكن أن تؤثر على ناتج التعبير النهائي19. فيما يتعلق بسلائف الطاقة ، تم التحقيق في ركائز متنوعة من قبل العديد من مجموعات البحث لتحقيق فعالية التكلفة وزيادة إنتاجيةالتعبير 53,54. في سياق نظام CFPS المقدم ، تم اختيار فوسفات الكرياتين وكيناز الكرياتين عمدا. كان الدافع وراء هذا الاختيار هو كفاءة تجديد الطاقة التي يمكن تحقيقها من خلال تفاعل أحادي الخطوة وعدم وجود تداخل مع الإنزيمات الداخلية الموروثة من المستخلص. وبالتالي ، فإن هذا التكوين يؤسس نظاما مباشرا وقويا مناسبا تماما لمختلف بيئات المقصورة الدقيقة.

كما هو موضح في النتائج الممثلة ، أظهرنا تعبيرا ناجحا للبروتين في ثلاث حجرات دقيقة متميزة: قطرات الماء في الزيت المثبتة بواسطة الزيت شبه المفلور ، GUVs التي تشكلت من خلال نقل المستحلب ، وفوق طبقة ثنائية دهنية مدعومة. يسلط تنوع تعبير البروتين عبر المقصورات الدقيقة المختلفة الضوء على متانة نظام CFPS الخاص بنا لبناء الخلايا الاصطناعية. من بين طرق التغليف هذه ، كانت تقنية قطرات المستحلب نهجا مباشرا بشكل ملحوظ لتغليف نظام CFPS ، ولا يتطلب سوى التحريض أو الدوامة. ومع ذلك ، تميل هذه القطرات إلى أن تكون غير مستقرة بسبب واجهة المياه غير المستقرة ، وهو قيد يمكن معالجته عن طريق إضافة الدهون أو المواد الخافضة للتوتر السطحي إلى مرحلة الزيت. على الرغم من التطبيق العملي لقطرات الماء في الزيت المستقرة ، إلا أنها لا تكرر بشكل كامل بيئة الخلية الطبيعية ، والتي تتكون من مقصورتين مائيتين مفصولتين بغشاء خلوي. بدلا من القطرات ، تم إنشاء حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) بأحجام تتجاوز 1 ميكرون لتقليد الخلايا عن كثب. تم تغليف نظام CFPS داخل طبقة الدهون المزدوجة لهذه الحويصلات ، مما يوفر آلات النسخ والترجمة لأنظمة الخلايا الاصطناعية المتنوعة55.

يبرز نقل المستحلب ، المعروف أيضا باسم المستحلب المزدوج ، كتقنية نموذجية لتغليف تفاعلات CFPS ، نظرا لعملية التحضير المعتدلة وكفاءة التغليف العالية نسبيا مقارنة بالطرق الخالية من المذيبات. ومع ذلك ، يمكن أن يتراوح توليد حويصلات المستحلب المزدوج من خطوات الطرد المركزي البسيطة إلى استخدام نقل المستحلب بمساعدة الموائع الدقيقة ، ولكل طريقة مزاياها وعيوبها المرتبطة بها ، كما تم تلخيصها في مكان آخر36. يعتمد التغليف الناجح لنظام CFPS داخل GUVs على ضبط الأسمولية وتطبيق القوة المناسبة لاجتياز واجهة الزيت والماء. على الرغم من أن طريقة نقل المستحلب الموصوفة هنا هي الأكثر وضوحا ولا تتطلب معدات معملية محددة ، إلا أن كفاءة وتجانس GUVs المولدة يمكن أن تختلف بين الدفعات المختلفة. علاوة على ذلك ، يجب أن تتعامل جميع طرق نقل المستحلب مع الزيت المتبقي في تجويف السطح البيني ثنائي الطبقة المشكل ، مما يستلزم خطوة إضافية لإزالة الزيت56 ، والتي قد تشكل تحديات في المشاريع الحركية.

أخيرا ، أظهرنا التعبير الناجح ل CFPS فوق طبقة الدهون المزدوجة المدعومة (SLB) ، مما يوفر نهجا قيما للمشاريع التي تتطلب تخليق البروتين بالقرب من بيئة الغشاء الحيوي الدهني. من خلال استخدام نظام CFPS المقدم ، أثبتنا تطبيقه الناجح في توصيف عملية استهداف الغشاء القابل للانعكاس ل Cdc4247 ، وهو جزيء بروتين مركزي ضروري للقطبية الخلوية. باختصار ، فإن إنتاجية التعبير المتوسط المتسق والمتانة المتأصلة التي لوحظت في مختلف المقصورات الدقيقة تسلط الضوء على إمكانات نظام CFPS هذا في بناء أنظمة الخلايا الاصطناعية المتنوعة. يمكن توسيع هذه القدرة لتشمل نماذج مختلفة تركز على البروتين ، مما يؤدي في النهاية إلى التقدم نحو تحقيق الحد الأدنى من الخلايا.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

شكر وتقدير

يقر م. ي. بالتمويل المقدم من برنامج البحث والابتكار في الدراسات العليا في مقاطعة جيانغسو ، الصين (المنحة رقم. KYCX22_2803). LK ممتن لدعم أبحاث العلوم الطبيعية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو في الصين ، الصين (منحة رقم 17KJB180003) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بجامعة جيانغسو نورمال ، الصين (منحة رقم 17XLR037) ، وتطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو ، الصين ، وبرنامج جيانغسو للأستاذ المعين خصيصا ، الصين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-ديولويل-<م > SN < / م >-جلسيرو -3-فوسفوكولين (DOPC)أفانتي850375P
1،2-ديولويل-<م > SN < / م >-جلسيرو -3-فوسفو-إل سيرين (ملح الصوديوم) (DOPS)أفانتي840035P
1,4 ديثيوثريتول (DTT)سيجما ألدريتش1.11474
1-بالميتويل -2-أوليويل SN-جلسيرو -3-فوسفوكولين (POPC)أفانتي850457P
3،5 أمبير دوري (cAMP)سيجما ألدريتشA9501
50 مل أنابيبإيبندورف إيبندورفأنابيب بيولوجيا
50٪ بيروكسيد الهيدروجينسيجما ألدريتش516813
أسيتاتسيجما ألدريتشA6283
مسحوق أجارسيجما ألدريتش05040
ألانينسيجما ألدريتشA4349
خلايا الأميكون المقلوبةميركميليبورUFSC05001
أسيتات الأمونيوم (NH4OAc)سيجما ألدريتشA7262
الأرجينينسيجما ألدريتشA4474
الهليونسيجما ألدريتشA0884
أسبارتاتسيجما ألدريتشA5474
ATPروش11140965001
أتو 488 DOPEسيجما ألدريتش67335
أتو 647N DOPEسيجما ألدريتش42247
قارورة إرلينماير محيرةشونيو250 مل ، 1000 مل
ألبومين مصل الأبقار (BSA)روش10711454001
أنبوب الطرد المركزيأنابيب إيبندورفإيبندورف 3810X
رف أنبوب الطرد المركزيEppendorf0030119819
نظام التصوير الكيميائي والتألقUvitecAlliance Q9 المتقدم
الكلوروفورمسيجما ألدريتش288306
الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (LSM)ZEISSLSM 780
شرائح غرفة عد الخلايا الكونتيسةالحرارية فيشر العلميةC10283
CoverslipThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
الكرياتين كيناز (CK)روش10127566001
فوسفات الكرياتين (CP)ثقافة سيجما ألدريتش10621714001
Huanqiu90 مم
CysteinSigma-AldrichC5360
Cytidine 5ملح ثنائي الصوديوم ثلاثي الفوسفات (CTP)علاء الدينC101487
غشاء غسيل الكلىطيفأنابيب RC القياسية MWCO: 12-14 كيلو د
E.Z.N.A. دورة طقم نقيأوميغا Bio-TekD6492-01
التعشيب ذات درجة الحرارة الدائمة للتسخين الكهربائيأداة YihengDHP-9602
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)Biosharp1100027
قارئ لوحة الفلورسنتBioTekSynergy 2
الزيت المفلورSuzhou CChip الأداة العلمية2٪HFE7500
حمض الفولينيكSigma-Aldrich47612
الصحافة الفرنسيةG.HeinemannHTU-DIGI-Press
GlucoseSigma-AldrichG7021
جلوتاماتسيجما ألدريتشG5667
الجلوتامينسيجما ألدريتشG5792
الجلسرينسيجما ألدريتشG5516
جليسينسيجما ألدريتشG7126
جوانوزين 5'-ثلاثي فوسفات ملح الصوديوم هيدرات (GTP)روش10106399001
هيبسسيجما ألدريتشH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
هيستيدينسيجما ألدريتشH6034
إيزولوسينسيجما ألدريتشI5281
الأيزوبروبيل - بيتا ؛ - د - ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG)سيجما - ألدريتشI5502
ك < ساب > 2 < / sub > HPO < sub > 4 < / sub >سيجما - ألدريتشP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LysinSigma-AldrichL5501
أسيتات المغنيسيوم رباعي الهيدرات (Mg (OAc) 2< / sub>)Sigma-AldrichM5661
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>)سيجما ألدريتشM2670
ميثيونينسيجما ألدريتشM8439
الطرد المركزيالدقيقة إيبندورف5424 R
الزيوت المعدنيةسيجما ألدريتشM5904
أنظمة الخلايا الرباعية المصغرةالبروتين Bio-Rad1645050
أجهزة الطرد المركزي متعددة الأغراضEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
الحمض النووي & قياسات فحص البروتين بالأشعة فوق البنفسجيةIMPLENNanoPhotometer N60
مجموعة NucleoBond Xtra Maxi للبلازميد من الدرجة الشفافة DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 Well ألواح البوليسترينSigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
فينيلالانينسيجما ألدريتشP8740
فوسفوينول بيروفات (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFسيجما ألدريتشPMSF-RO
بولي إيثيلين جلايكول 8000 (PEG 8000)سيجما ألدريتش89510
أسيتات البوتاسيوم (KOAc)سيجما ألدريتشP5708
كلوريد البوتاسيوم ( KCl)سيجما ألدريتشP9541
غلوتامات البوتاسيوم (K-glutamate)سيجما ألدريتشG1501
هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)سيجما ألدريتش221473
البرولينسيجما ألدريتشP8865
بيروفات كيناز (PK)سيجما ألدريتشP9136
سيرينسيجما ألدريتشS4311
شاكرZhichushakersZQZY-AF8
كلوريد الصوديوم (NaCl)سيجما ألدريتشS5886
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)سيجما ألدريتشS5881
السكروزعلاءالدين S112226
حمض الكبريتيكسيجما ألدريتش339741
مرشحات الحقنجينتنغ0.45 & مو ؛ م
أنبوب اختبارShuniu20 مل
TGX FastCast Acrylamide Kit ، 12٪Bio-Rad# 1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
التربتونسيجما ألدريتشT7293
التربتوفانسيجما ألدريتشT8941
التيروزينسيجما ألدريتشT8566
UTP ملح ثلاثي الصوديوم (UTP)علاء الدينU100365
مضخة فراغ مع نظام المياه المتداولتشنغتشو جريت وال Co.Ltdالصناعة والتجارة العلميةSHB-figure-materials-1
ValinSigma-AldrichV4638
خلاطات دوامةKylin-BellVortex QL-861
نظام تنقية المياهMerckMilliporeDirect المياه فائقة النقاء (النوع 1)
مستخلص الخميرةSigma-Aldrich70161
& beta ;-mercaptoethanolSigma-Aldrich444203
طبق آلة أجهزة

المراجع

  1. Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
  2. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synth Biol. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  3. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
  4. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (9), e2000187(2020).
  5. Lu, Y., Allegri, G., Huskens, J. Vesicle-based artificial cells: materials, construction methods and applications. Mater Horiz. 9 (3), 892-907 (2022).
  6. Fu, Z., Ochsner, M. A., De Hoog, H. P., Tomczak, N., Nallani, M. Multicompartmentalized polymersomes for selective encapsulation of biomacromolecules. Chem Commun (Camb). 47 (10), 2862-2864 (2011).
  7. Ayoubi-Joshaghani, M. H., et al. Cell-free protein synthesis: the transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices. Biotechnol Bioeng. 117 (4), 1204-1229 (2020).
  8. Yue, K., Chen, J. Y., Li, Y. Q., Kai, L. Advancing synthetic biology through cell-free protein synthesis. Comput Struct Biotechnol J. 21, 2899-2908 (2023).
  9. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci Rep. 5, 8663(2015).
  10. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  11. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat Protoc. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  12. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), e58882(2019).
  13. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synth Syst Biotechnol. 5 (4), 252-267 (2020).
  14. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. 4, 8(2010).
  15. Mcmanus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Arch Biochem Biophys. 674, 108045(2019).
  16. Kim, T. W., et al. Prolonged cell-free protein synthesis using dual energy sources: combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng. 97 (6), 1510-1515 (2007).
  17. Kim, D. M., Swartz, J. R. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 74 (4), 309-316 (2001).
  18. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synth Biol. 4 (4), 454-462 (2015).
  19. Rasor, B. J., et al. Mechanistic insights into cell-free gene expression through an integrated-omics analysis of extract processing methods. ACS Synth Biol. 12 (2), 405-418 (2023).
  20. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239 (3), 881-886 (1996).
  21. Li, J. J., Li, P. X., Liu, Q., Li, J. J., Qi, H. Translation initiation consistency between in vivo and in vitro bacterial protein expression systems. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1201580(2023).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Biotechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  24. Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
  25. Jaroentomeechai, T., et al. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nat Commun. 9 (1), 2686(2018).
  26. Katsura, K., et al. Phosphorylated and non-phosphorylated HCK kinase domains produced by cell-free protein expression. Protein Expr Purif. 150, 92-99 (2018).
  27. Suzuki, T., et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry. Proteomics. 6 (16), 4486-4495 (2006).
  28. Chi, H., Wang, X., Li, J., Ren, H., Huang, F. Chaperonin-enhanced Escherichia coli cell-free expression of functional CXCR4. J Biotechnol. 231, 193-200 (2016).
  29. Endo, Y., Sawasaki, T. High-throughput, genome-scale protein production method based on the wheat germ cell-free expression system. Biotechnol Adv. 21 (8), 695-713 (2003).
  30. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
  31. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 86 (1), 19-26 (2004).
  32. Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhovtsova, E. A., Alakhov, Y. B., Spirin, A. S. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem. 226 (1), 184-186 (1995).
  33. Guzman-Chavez, F., et al. Constructing cell-free expression systems for low-cost access. ACS Synth Biol. 11 (3), 1114-1128 (2022).
  34. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng. 87 (4), 465-472 (2004).
  35. Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synth Biol. 7 (12), 2841-2853 (2018).
  36. Yue, K., et al. Bottom-up synthetic biology using cell-free protein synthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 185, 1-20 (2023).
  37. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog. 21 (2), 460-465 (2005).
  38. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol. 126 (4), 554-561 (2006).
  39. McPhie, P. [4] Dialysis. Methods Enzymol. 22, 23-32 (1971).
  40. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  41. Kai, L., et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins. Methods Mol Biol. 800, 201-225 (2012).
  42. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  43. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
  44. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  45. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  46. Kai, L., Dotsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS One. 8 (2), e56637(2013).
  47. Kai, L., Sonal, H. T., Schwille, P. Reconstitution of a reversible membrane switch via prenylation by one-pot cell-free expression. ACS Synth Biol. 12 (1), 108-119 (2023).
  48. Foshag, D., et al. The E. Coli S30 lysate proteome: a prototype for cell-free protein production. N Biotechnol. 40, Pt B 245-260 (2018).
  49. Garenne, D., Beisel, C. L., Noireaux, V. Characterization of the all-E. coli transcription-translation system mytxtl by mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 33 (11), 1036-1048 (2019).
  50. Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., Garcia-Vallve, S. Optimizer: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, Web Server issue W126-W131 (2007).
  51. RNAfold WebServer. Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna. , Available from: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi (2024).
  52. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens. J Vis Exp. (145), e59495(2019).
  53. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. An economical method for cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog. 21 (4), 1146-1153 (2005).
  54. Kim, D. M., Swartz, J. R. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng. 66 (3), 180-188 (1999).
  55. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  56. Teh, S. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), 044113(2011).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا لبناء الخلايا الاصطناعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.