إعادة تشكيل تعتمد على الخبرة للاتصال العصبي الحسي الشمي للدماغ اليافع في فترة حرجة مبكرة من الحياة

Nichalas Nelson; Vanessa Miller; Nicholas Baumann; Kendal Broadie

doi:10.3791/66629

مقالة منهجية

إعادة تشكيل تعتمد على الخبرة للاتصال العصبي الحسي الشمي للدماغ اليافع في فترة حرجة مبكرة من الحياة

DOI:

10.3791/66629

⸱

مارس 1, 2024

Nichalas Nelson^*¹ , Vanessa Miller^*¹ , Nicholas Baumann¹ , Kendal Broadie¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Department of Biological Sciences, Vanderbilt University and Medical Center, ²Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University and Medical Center, ³Department of Pharmacology, Vanderbilt University and Medical Center, ⁴Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center, ⁵Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University and Medical Center

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا طرقا لتحفيز وتحليل إعادة تشكيل الخبرة الشمية المعتمدة على الكبيبات المشبكية لفص الهوائي في دماغ ذبابة الفاكهة اليافعة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحفز التجربة الحسية الشمية المبكرة في الحياة إعادة تشكيل الكبيبات المشبكية الدراماتيكية في دماغ ذبابة الفاكهة اليافع ، والتي تعتمد تجريبيا على الجرعة ، ومقيدة زمنيا ، ويمكن عكسها بشكل عابر فقط في فترة حرجة قصيرة ومحددة جيدا. يتم تحديد اتجاه إعادة تشكيل الاتصال المشبكي لدائرة الدماغ من خلال الرائحة المحددة التي تعمل على فئة مستقبلات المستجيب للخلايا العصبية الحسية الشمية. بشكل عام ، تعبر كل فئة من الخلايا العصبية عن مستقبل رائحة واحد فقط وتعصب كبيبة متشابكة شمية واحدة. في النموذج الجيني لذبابة الفاكهة ، تم تعيين المجموعة الكاملة من الكبيبات الشمية بدقة من خلال استجابة الرائحة والإنتاج السلوكي. تنشط رائحة إيثيل بوتيرات (EB) الخلايا العصبية لمستقبلات Or42a التي تعصب كبيبة VM7. خلال الفترة الحرجة في وقت مبكر من الحياة ، تؤدي تجربة EB إلى التخلص من المشبك العصبي المعتمد على الجرعة في الخلايا العصبية الحسية الشمية Or42a. تسمح الفترات الزمنية للتعرض لرائحة EB ذات الجرعات بالتحقيق في تقليم اتصال الدائرة المعتمد على الخبرة في دماغ الأحداث. يتم إجراء التصوير المجهري البؤري للكبيبات المشبكية لفص الهوائي باستخدام علامات معدلة وراثيا مدفوعة بمستقبلات Or42a توفر تقديرا كميا لعدد المشبك وحجم التعصيب. تتيح مجموعة الأدوات الجينية المتطورة لذبابة الفاكهة التشريح المنهجي للآليات الخلوية والجزيئية التي تتوسط في إعادة تشكيل دائرة الدماغ.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل إعادة تشكيل دوائر الدماغ اليافعة خلال الحياة المبكرة الفرصة الأخيرة لتغييرات الاتصال المشبكي واسعة النطاق لتتناسب مع البيئة شديدة التغير وغير المتوقعة التي يولد فيها. باعتبارها المجموعة الأكثر وفرة من ، تشترك الحشرات في آلية إعادة تشكيل الفترة الحرجة المحفوظة تطوريا¹. تفتح الفترات الحرجة مع بداية المدخلات الحسية ، وتظهر تغييرات عكسية في الدائرة لتحسين الاتصال ، ثم تغلق عندما تقاوم قوى التثبيت المزيد من إعادة البناء². تعتمد الحشرات بشكل خاص على المعلومات الحسية الشمية وتظهر فترة حرجة شمية محددة جيدا. توفر ذبابة الفاكهة نموذجا وراثيا ممتازا للتحقيق في هذه الفترة الحرجة المعتمدة على التجربة في دماغ الأحداث. تؤدي تجربة الرائحة خلال الأيام القليلة الأولى بعد الانسداد إلى تغييرات اتصال الدائرة المذهلة في الكبيبات المشبكية ^3,4 المحددة بشكل فردي. يعتمد اتجاه إعادة التصميم على تجربة رائحة الإدخال المحددة. تسبب بعض الروائح زيادة في حجم الكبيبة المشبكية لبضعة أيام بعد الانسداد (dpe)3,5,6,7 ، في حين أن الروائح الأخرى تسبب التخلص السريع من نقاط الاشتباك العصبي خلال الفترة الحرجة 0-2 dpe ، مما يؤدي إلى انخفاض حجم التعصيب ^8,9,10. على وجه التحديد ، تؤدي تجربة رائحة إيثيل بوتيرات (EB) إلى التقليم المشبكي المعتمد على الجرعة للخلايا العصبية المستقبلة لمستقبلات حاسة الشم Or42a فقط خلال هذه الفترة الحرجة المبكرة^{من العمر 8}. يمكن عكس إزالة المشبك تماما عن طريق تعديل مدخلات رائحة EB خلال الفترة الحرجة ولكنها تصبح دائمة بعد إغلاق الفترة الحرجة. يوفر هذا التقليم المشبكي المعتمد على الخبرة الشمية نظاما تجريبيا قيما لتوضيح الآليات المقيدة زمنيا الكامنة وراء إعادة تشكيل دائرة دماغ الأحداث.

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يستخدم لحث وتحليل التقليم المشبكي المعتمد على تجربة EB للخلايا العصبية الحسية الشمية لمستقبلات Or42a خلال الفترة الحرجة المبكرة من الحياة. نظهر أن المحطات المتشابكة Or42a في كبيبة الفص VM7 من فص الهوائي يمكن تمييزها على وجه التحديد عن طريق القيادة المعدلة وراثيا لعلامة mCD8 المربوطة بالغشاء :: GFP ، إما دمجها مباشرة مع مروج Or42a (Or42a-mCD8 :: GFP) ¹¹ أو باستخدام نظام التعبير الثنائي Gal4 / UAS (Or42a-Gal4 يقود UAS-mCD8 :: GFP) ¹². يمكن تسمية نقاط الاشتباك العصبي الفردية Or42a بالمثل باستخدام التعبير الوراثي المستهدف لعلامات المنطقة النشطة قبل المشبكية المدمجة في مجموعة من العلامات الفلورية (على سبيل المثال ، Bruchpilot :: RFP) ⁸ أو إشارة كثيفة الإلكترون لتحليلات المشبك الفائق البنية (على سبيل المثال ، miniSOG-mCherry)⁸. يمكن تصوير المحطات المتشابكة Or42a بمزيج من الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر والمجهر الإلكتروني النافذ. لقد أظهرنا أن تقليم الكبيبات المشبكية Or42a يعتمد على جرعة EB ، ويتدرج إلى تركيز تجربة الرائحة الموقوتة. يمكن أن تختلف النسبة المئوية لرائحة EB المذابة في الزيوت المعدنية المستخدمة كوسيلة ، وكذلك المدة الزمنية للتعرض للرائحة في التي تم تنظيمها في النمو. أخيرا ، نعرض الطرق المستخدمة لتحليل مدى تقليم الكبيبات المشبكية عن طريق قياس شدة وحجم مضان التعصيب VM7. يمكن أيضا قياس رقم المشبك عن طريق حساب النقاط المشبكية المسماة وقياس معلمات البنية الفوقية المشبكية باستخدام المجهر الإلكتروني^{النافذ 8}. بشكل عام ، البروتوكول الموضح هنا هو نهج قوي يتيح التشريح المنهجي لكل من الآليات الخلوية والجزيئية التي تتوسط تشذيب الاتصال المشبكي لدائرة حاسة الفاكهة الشمية خلال فترة حرجة للأحداث. تم استخدام الإعداد العام للتعرض للرائحة الموصوف في هذه الدراسة في الدراسات السابقة باستخدام روائح أخرى وفحص الكبيبات^الأخرى ^3,7.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التعرض للرائحة

باستخدام فرشاة رسم دقيقة ، قم بفرز 40-50 تم تنظيمها تنمويا مثل الشرانق الداكنة (90+ ساعة بعد الشرنق عند 25 درجة مئوية) في قوارير ذبابة الفاكهة من البوليسترين 25 مم × 95 مم التي تحتوي على طعام دبس دقيق الذرة القياسي (الشكل 1 أ).
ضع شبكة سلكية دقيقة من الفولاذ المقاوم للصدأ فوق نهاية قوارير ذبابة الفاكهة لاحتواء الذباب مع السماح أيضا بتدفق الهواء بشكل جيد. ثبت أغطية الشبكة السلكية بغشاء شفاف مسجل على جانب قوارير ذبابة الفاكهة .
في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، ضع 1 مل من الزيت المعدني 100٪ (التحكم في السيارة) أو قم بإذابة رائحة إيثيل بوتيرات (EB) في الزيت المعدني في أنبوب آخر لإنتاج التركيز المطلوب (على سبيل المثال ، 15٪ (150 ميكرولتر) أو 25٪ (250 ميكرولتر)).
ضع التحكم في السيارة أو أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات الرائحة في وضع مستقيم داخل حاوية Glasslock محكمة الغلق سعة 3700 مل. باستخدام الشريط اللاصق ، قم بتثبيت الأنابيب بإحكام في وسط غرف الرائحة مع قوارير ذبابة الفاكهة (الشكل 1 ب).
ضع التحكم في السيارة المختومة وغرف الرائحة EB التي تحتوي على قوارير الشرانق ذبابة الفاكهة المرحلية في حاضنة مرطبة (70٪) يتم التحكم في درجة حرارتها (25 درجة مئوية) في دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة.
قم بإزالة الذباب المغلق حديثا بعد 4 ساعات من التعرض لغرفة الرائحة وانقل بسرعة 20-25 ذبابة إلى قوارير ذبابة الفاكهة الطازجة في غرف ذات رائحة طازجة (الشكل 1 أ ، ب). تخلص من الشرانق غير المغلقة.
احتفظ بالذباب في غرف الرائحة المختومة في الحاضنات لمدة 24 ساعة. للحصول على جرعات أطول من الرائحة ، انقل الذباب بسرعة إلى قوارير ذبابة الفاكهة الجديدة في غرف الرائحة الطازجة كل 24 ساعة.
تخدير الذباب الذي تم تطويره عن طريق غمره في طبق يحتوي على 70٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة استعدادا لتشريح الدماغ الفوري ومعالجة الكيمياء المناعية.

2. تشريح الدماغ

ضع علامة على القوارير كعنصر تحكم في السيارة (زيت معدني 100٪ فقط) أو EB مكشوف (٪ EB) عن طريق وضع العلامات والحفاظ على هذه التسميات طوال مدة تشريح الدماغ والمعالجة اللاحقة. معالجة 10-20 لكل حالة وراثية / رائحة.
باستخدام الملقط ، انقل ذبابة مخدرة واحدة إلى طبق صغير من محلول ملحي مخزن بالفوسفات طازج (PBS)¹³. اغمر الذبابة في برنامج تلفزيوني واستمر في تشريح الدماغ بالكامل مع غمر الذبابة بالكامل.
باستخدام ملقط شحذ ناعم (# 5) في كلتا يديه ، ضع الجانب البطني للذبابة لأعلى وأمسك الصدر العلوي بملقط واحد والرأس تحت خرطوم بالملقط الآخر. احرص على عدم اختراق الدماغ.
قم بإزالة الرأس من بقية الجسم عن طريق السحب برفق في اتجاهين متعاكسين بكلتا يديه. يجب أن ينفصل الرأس بسهولة عن الصدر ؛ اترك الرأس المعزول للتشريح (الشكل 1C).
حرك الملقط المستخدم سابقا للإمساك بالصدر أسفل الجانب الآخر من خرطوم. ابدأ في سحب بشرة الهيكل الخارجي برفق في اتجاهين متعاكسين بحيث تمزق بين العينين لتكشف عن الدماغ.
عند السحب ، قد تنفصل الفصوص البصرية للدماغ مع الهيكل الخارجي. لمنع ذلك ، استخدم سحبا بطيئا وثابتا بالملقطين أثناء إزالة بشرة الهيكل الخارجي (الشكل 1 ج ، المنتصف).
استمر في إزالة بشرة الهيكل الخارجي من الرأس. تأكد من إزالة جميع أجزاء الهيكل الخارجي. قم بإزالة أي أنسجة متصلة بالدماغ ، بما في ذلك الجسم الدهني وأي قصبة هوائية بارزة.
لمنع الالتصاق ، اشطف طرف ماصة P20 باستخدام PBS + 0.2٪ Triton-X 100 (PBST). مباشرة بعد التشريح ، انقل الأدمغة إلى محلول التثبيت (4٪ بارافورمالدهيد (PFA) + 4٪ سكروز) في أنبوب مغطى (الشكل 1C ، D).

3. الكيمياء المناعية للدماغ

إصلاح الدماغ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع الدوران من طرف إلى طرف. مع الحفاظ على الأدمغة في الأنبوب ، قم بإيقاف تشغيل الماصة والتخلص بشكل صحيح من المثبت الخطير. اغسل الأدمغة الثابتة بسرعة 3x باستخدام PBS (الشكل 1 د).
غالبا ما يمكن العثور على الأدمغة عالقة في غطاء الأنابيب بعد الدوران. لمنع الفقدان العرضي للأدمغة ، وهو خطر دائم في جميع عمليات النقل ، استخدم مجهر تشريح أثناء سحب السوائل.
استعدادا لوضع العلامات على الأجسام المضادة ، قم بحظر الأدمغة الثابتة لمدة 1 ساعة في RT في PBST + 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) + 0.5٪ مصل الماعز الطبيعي (NGS) مع دوران ثابت من طرف إلى طرف (الشكل 1 د).
قم بإزالة الكتلة واحتضان الأدمغة بالجسم المضاد الأساسي المحدد المخفف بشكل مناسب في PBST + 0.2٪ BSA + 0.1٪ NGS. احتضان الأدمغة طوال الليل (14-16 ساعة) عند 4 درجات مئوية مع دوران مستمر.
ملاحظة: مثال على الأجسام المضادة المستخدمة: الفئران المضادة ل CadN (التخفيف 1:50) ¹⁴ لتسمية الكبيبات المشبكية والدجاج المضاد ل GFP (1: 1000) ⁸ لتسمية Or42a-mCD8::GFP (الشكل 1D).
ماصة من الجسم المضاد الأساسي. اغسل الأدمغة 3 مرات لمدة 20 دقيقة لكل منها باستخدام PBST. احتضان الأدمغة بالأجسام المضادة الثانوية المخففة في PBST مع 0.2٪ BSA + 0.1٪ NGS لمدة ساعتين في RT مع دوران مستمر.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، احتضان الأدمغة طوال الليل (14-16 ساعة) عند 4 درجات مئوية. تمييع الأجسام المضادة في PBST مع 0.2 ٪ BSA + 0.1 ٪ NGS ؛ الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة هنا: 488 الماعز المضادة للدجاج (1: 250) و 546 الماعز المضادة للفئران (1: 250).
ماصة من الأجسام المضادة الثانوية. اغسل الأدمغة 3 مرات لمدة 20 دقيقة لكل منها باستخدام PBST. انتهي بغسل الأدمغة لمدة 20 دقيقة باستخدام برنامج تلفزيوني (الشكل 1 د).
قم بإعداد شرائح المجهر الزجاجي (75 مم × 25 مم) عن طريق إضافة شريطين رفيعين من الشريط اللاصق على الوجهين إلى الشريحة ~ 25 مم بعيدا عن بعضهما البعض. هذا يوفر فاصل لتجنب سحق الأدمغة.
ماصة ~ 10-15 ميكرولتر من وسط التركيب بين شريطين من الشريط لتركيب الأدمغة. باستخدام طرف ماصة P20 الذي تم شطفه مسبقا باستخدام PBST ، انقل الأدمغة المصنفة إلى شريحة المجهر (الشكل 1E).
بمجرد نقل الأدمغة ، استخدم فرشاة رسم دقيقة لمواءمتها ، مع التأكد من أن فصوص الهوائي متجهة لأعلى. ابحث عن الجانب الذي يحتوي على سنام مقوس ، والذي سيحتوي على فصوص الهوائي.
بمجرد توجيه الأدمغة بشكل صحيح ، قم بتغطيتها بغطاء زجاجي (رقم 1.5H) ، مع التأكد من أن غطاء الغطاء آمن على الشريط. بعد ذلك ، املأ جوانب غطاء الغطاء بوسيط تثبيت إضافي (الشكل 1E).
أغلق حواف الغطاء بطلاء أظافر شفاف. اترك الشريحة تجف تماما ، ثم قم بتخزينها في الثلاجة للتصوير اللاحق.

4. التصوير البؤري

أعمى جميع شرائح الدماغ إلى كل من النمط الجيني وظروف التجربة قبل التصوير عن طريق وضع علامة على الشريحة بملصق مشفر لفك تشفيرها لاحقا.
استخدم مجهرا متحد البؤر للمسح بالليزر بهدف غمر الزيت 63x. نستخدم مجهر Zeiss 510 META في جميع الصور المعروضة هنا (الشكل 1F).
استخدام خطوط الليزر المناسبة للفلوروفورات المستخدمة. هنا ، استخدم ليزر Argon 488 و HeNe 543 للكبيبات المشبكية لفص الهوائي وتصوير الخلايا العصبية الحسية الشمية Or42a (الشكل 2).
حدد الكسب الأمثل والإزاحة لكلتا القناتين ، مع الحفاظ على الكسب لكلتا القناتين <750 وإزاحة ≈0. يتم ذلك للتأكد من أن الإشارة إلى الضوضاء هي الأمثل مع الحد من الخلفية.
تصوير الموضع في مركز الدماغ. عند التصوير ، تتواجد كبيبات VM7 بالقرب من الفتحة المتبقية في منتصف الدماغ بعد إزالة المريء أثناء التشريح (الشكل 2 أ).
ملاحظة: ستكون كبيبات VM7 دائما قريبة من فتحة المريء. ومع ذلك ، يختلف الموقع والحجم الدقيق قليلا بناء على تشريح الدماغ والاختلافات المتزايدة ، لذا ضع ذلك في الاعتبار عند التصوير.
حدد دقة التصوير وسمك الشريحة البصرية. هنا ، يتم استخدام دقة 1024 × 1024 بسمك شريحة Z-stack يبلغ 0.37 ميكرومتر.
خذ إسقاط Z-stack متحد البؤر بالكامل من خلال فص الهوائي ، مما يضمن التقاط التعصيب الكامل للخلايا العصبية Or42a لكبيبات VM7.

5. قياسات متشابكة

قم بتحميل الصورة ذات النمط الجيني / الحالة العمياء في فيجي (1.54f). قم بتقسيم قنوات خط الليزر بالنقر فوق صورة > اللون > تقسيم القنوات.
في القناة الحسية الشمية Or42a ، حدد الشرائح التي تحتوي على تعصيب Or42a عن طريق التمرير عبر كامل مكدس Z ، وتحديد مكان بدء التألق وانتهائه.
قم بإنشاء إسقاط شرائح المجموع بما في ذلك الشرائح التي تحتوي على تعصيب الخلايا العصبية Or42a فقط بالنقر فوق Image > Stacks > Z Project > Sum Slices وإدخال النطاق المطلوب.
في فيجي ، انقر فوق أداة Lasso في الشريط العلوي لتتبع الخطوط العريضة لتعصيب الخلايا العصبية Or42a في كبيبة VM7 ، ومعالجة كل كبيبة جانب دماغي بشكل مستقل (الشكل 3).
اضرب المحيط في عدد شرائح Z-stack وسمك كل شريحة للحصول على حجم تعصيب الكبيبة المشبكية VM7. لتحديد رقم المشبك ، يمكن استخدام أداة البحث عن الحد الأقصى جنبا إلى جنب مع ماكرو مكدسات البحث الأقصى لحساب نقاط المشبك في المنطقة المحددة ^8,15.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 سير العمل للتعرض لرائحة الفترة الحرجة المعتمدة على الخبرة الشمية وطرق تصوير الدماغ. يبدأ البروتوكول بمطابقة عمر الشرانق الداكنة للفراات مباشرة قبل الانسداد (الشكل 1 أ). يتم وضع الشرانق في غرف الرائحة لمدة 4 ساعات ، ثم يتم قلب البالغين المغلقين حديثا في قوارير جديدة إما في التحكم في السيارة أو غرف رائحة EB ذات الجرعات (الشكل 1 ب). عادة ما نتعرض للرائحة لمدة 24 ساعة ، على الرغم من أن أي مدة ممكنة. بعد التعرض للرائحة ، يبدأ تشريح الدماغ بإزالة الرأس من الصدر ثم إزالة الهيكل الخارجي للبشرة بالملقط الدقيق (الشكل 1C). يتم تنظيف الدماغ المعزول من أي أنسجة مرتبطة يمكن أن تتداخل مع التصوير ثم يتم تثبيته على الفور في 4٪ بارافورمالدهيد و 4٪ سكروز في برنامج تلفزيوني. إصلاح قصير من 30 دقيقة يكفي لسلامة جيدة من أنسجة المخ. يبدأ البروتوكول الكيميائي المناعي بكتلة 1 ساعة (على سبيل المثال ، BSA ، NGS) ، الحضانة الليلية في الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال ، anti-GFP ، -CadN) ، ثم حضانة قصيرة لمدة 2 ساعة في الأجسام المضادة الثانوية (الشكل 1 د). يتم تثبيت الأدمغة الموسومة على شرائح زجاجية تحت أغطية محكمة الغلق مع رفع السطح الظهري للدماغ للحصول على أفضل تصوير لفصوص الهوائي (الشكل 1E). لاحظ أن جميع العينات أعمى عن كل من النمط الجيني وظروف التجربة عن طريق تمييز الشريحة بتسمية مشفرة لفك تشفيرها لاحقا. يتم استخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر بهدف غمر الزيت 63x لتصوير فصوص هوائي الدماغ المركزية (الشكل 1F). يتم اختيار خطوط الليزر المثلى للفلوروفورات المستخدمة (على سبيل المثال ، Argon 488 و HeNe 543) لتصوير تعصيب الخلايا العصبية الحسية الشمية Or42a ل VM7 في سياق الكبيبات المحيطة.

من المهم تحديد الكسب الأمثل ، والإزاحة ، ودقة التصوير ، وسمك الشريحة البصرية لالتقاط إسقاط Z-stack بالكامل لتعصيب الخلايا العصبية Or42a في كبيبات VM7. يتم تصوير جميع الأنماط الجينية وظروف الخبرة المراد مقارنتها بإعدادات مجهرية متطابقة. تتم معالجة مكدسات Z باستخدام برنامج ImageJ مع تغييرات تعتمد على الخبرة يتم تقييمها بشكل أساسي من خلال حجم التعصيب ^7,14. هناك طريقتان تم من خلالهما حساب القياسات الحجمية. يحسب المرء منطقة التعصيب شريحة تلو الأخرى باستخدام دالة ImageJ lasso ثم يضرب كل قيمة في سمك كل شريحة (ميكرومتر) ^8,9. يستخدم الآخر مجموع شرائح Z وضرب عدد شرائح Z-stack بسمك الشريحة لتحديد متوسط الحجم. كلتا الطريقتين تعطي نتائج متسقة. بالإضافة إلى قياسات الحجم ، يمكن أيضا تقييم شدة التألق بإسقاط أقصى كثافة لكبيبات VM7¹⁶. يتم تقييم المجموع المرجح لجميع وحدات البكسل عبر الإسقاط الأقصى لشريحة مجموع ImageJ ، مع جمع رقم البكسل في كل مستوى كثافة لحساب الكثافة الإجمالية ^8,9. يمكن طرح الخلفية عن طريق تحديد منطقة كبيبية ذات حجم متطابق. طريقة الطرح هذه تستغرق وقتا أطول ولكنها أكثر دقة ، لأنها تمثل مستويات مختلفة من وسم الأجسام المضادة الخلفية في كل عينة دماغية لإنتاج تقدير كمي أكثر تمثيلا لقيم شدة مضان التعصيب. يتم إجراء قياسات الشدة في نطاق نموذجي من 18-30 شريحة بصرية (0.37 ميكرومتر / شريحة) داخل مكدس Z ، بمتوسط لكل دماغ¹⁶. في جميع الحالات تقريبا ، تعطي شدة مضان التعصيب وقياسات الحجم نتائج متسقة.

وفي جميع طرائق القياس، تظل النتائج التمثيلية ثابتة؛ تؤدي تجربة رائحة EB المبكرة إلى فقدان كبير لتعصيب الخلايا العصبية Or42a. يمكن تحديد كبيبة VM7 بشكل موثوق من خلال الحجم والشكل والموقع بين كبيبات شمية شمية أخرى محددة بدقة (الشكل 2A) ومن خلال التعبير المستهدف لملصق غشاء Or42a-mCD8::GFP مقترنا بوضع العلامات الكبيبية مع الكاديرين المضاد للأعصاب (CadN; الشكل 2 ب). يؤدي التعرض الموقوت للتحكم في السيارة ذات الرائحة (الزيت المعدني) إلى تعصيب الخلايا العصبية Or42a الذي لا يمكن تمييزه عن طبيعي غير معالج. ومع ذلك ، فإن تجربة رائحة EB في الأيام القليلة الأولى بعد الانسداد (dpe) تسبب تقليم الكبيبات المشبكية (الشكل 2C). تقتصر آلية التقليم هذه تماما على الفترة الحرجة المبكرة القصيرة ^8,10. عادة ما نستخدم الآن التعرض للرائحة لمدة 24 ساعة لتقييم التقليم المشبكي الكبيبي VM7 والانخفاض الناتج في حجم التعصيب في دماغ ذبابة الفاكهة اليافعة. يحافظ التعرض لمدة 24 ساعة (0-1 نقطة في البوصة) للتحكم في السيارة ذات الرائحة (الزيت المعدني) على التعصيب الطبيعي والكثيف Or42a-mCD8::GFP (أخضر) في الكبيبات المشبكية VM7 (دوائر بيضاء متقطعة) في كلا فصوص هوائي نصف الكرة المخية (الشكل 2D ، يسار). في تناقض صارخ ، يؤدي التعرض لمدة 24 ساعة (0-1 dpe) إلى 25٪ من رائحة EB المذابة في الزيت المعدني إلى تقليم قوي لتعصيب Or42a-mCD8::GFP (أخضر) وفقدان الحجم الكبيبي المشبكي (الشكل 2D ، يمين). هذه النتائج واضحة بصريا وواضحة باستمرار. واحدة من أعظم سمات بروتوكول تجربة الرائحة هذا هي وضوح نتائج تصوير الدماغ ، والتي هي أيضا قابلة للغاية لشدة مضان التعصيب المباشر ومقاييس الحجم.

الميزة الرئيسية لبروتوكول تجربة الرائحة هذا هي القدرة على تسخيره لدراسة التقييد الزمني والآليات المعتمدة على جرعة الرائحة خلال فترة التقليم المشبكي الحرجة. بالنسبة للتخلص من المشبك العصبي Or42a المدفوع ب EB في كبيبة VM7 ، تقتصر آلية إعادة البناء بشكل أساسي على الأحداث المبكرة (0-2 dpe) ، مع عدم وجود تقليم متشابك يعتمد على الخبرة عند النضج (7-9 dpe) باستثناء التعديل الطفيف عند أعلى مستويات التعرض EB⁸. يحدد هذا التقييد الزمني فترة حرجة ، وفهم آلية التوقيت هذه هو هدف مهم. سمة أخرى لهذا البروتوكول هي أن التقليم المشبكي المعتمد على الخبرة يعتمد على جرعة EB (الشكل 3). يؤدي التعرض الموقوت للتحكم في السيارة ذات الرائحة (الزيت المعدني) مع رائحة EB بنسبة 0٪ إلى تعصيب الخلايا العصبية Or42a الطبيعي للكبيبة المشبكية VM7 ، والتي لا يمكن تمييزها عن غير معالج. يظهر حساب حجم تعصيب الخلايا العصبية Or42a ثلاثي الأبعاد حجما نموذجيا لدماغ الأحداث الطبيعي (2260 ميكرومتر³ ؛ الشكل 3 أ ، يسار). تظهر النتائج التمثيلية أن زيادة تركيز رائحة EB يؤدي إلى تقليم كبيبات مشبكية أكبر تدريجيا. على سبيل المثال ، يؤدي التعرض لمدة 24 ساعة (0-1 dpe) إلى 15٪ من رائحة EB إلى فقدان تعصيب واضح ومتسق (الشكل 3A ، الوسط). يظهر القياس الكمي لحجم التعصيب ثلاثي الأبعاد انخفاضا مذهلا مقارنة بأدوات التحكم في السيارة (760 ميكرومتر³ مقابل 2260 ميكرومتر³). يؤدي التعرض لمدة 24 ساعة (0-1 dpe) إلى 25٪ من رائحة EB إلى فقدان المزيد من التعصيب (281 ميكرومتر³ ؛ الشكل 3 أ ، يمين). تظهر الكميات التمثيلية لهذا النطاق من تركيزات رائحة EB نتائج متسقة لشدة التألق (الشكل 3B) وحجم التعصيب (الشكل 3C). يسمح هذا الاعتماد على الجرعة بدراسة وسائل منع التقليم المشبكي وكذلك تعزيز التقليم مع التعرض لرائحة أقل لإظهار زيادة إعادة تشكيل الكبيبات المشبكية. أظهرت بعض الدراسات السابقة التأثير المعاكس لزيادة حجم الكبيبات باستخدام روائح أخرى مع هذا البروتوكول¹⁰. يؤدي التعرض لرائحة EB في الفترة الحرجة دائما إلى تقليم الكبيبات المشبكية المشبكية المذهلة والتي يمكن اكتشافها بسهولة.

figure-results-1
الشكل 1: مخطط انسيابي لدراسات التعرض للرائحة في دماغ صغار ذبابة الفاكهة . (أ) يتم جمع الشرانق الداكنة الفاراتية (90+ ساعة بعد التشرنق عند 25 درجة مئوية) ووضعها في غرف الرائحة. في ظل ظروف الرائحة ، يسمح ب 4 ساعات للكسر ، ثم يتم نقل ذباب الأحداث إلى قارورة جديدة. (ب) ينقسم الذباب المطابق للعمر إما إلى ظروف تجربة التحكم في السيارة (زيت معدني 100٪) أو إيثيل الزبدات (EB ؛ ٪ v / v في الزيوت المعدنية). تسمح الشبكة السلكية الدقيقة (الداخلية) بالوصول إلى الرائحة. يتعرض الذباب عادة لمدة 20 ساعة إضافية ليصبح المجموع 24 ساعة من التعرض ، 0-1 يوم بعد الانقطاع (dpe). (ج) تشريح الذباب عن طريق إزالة الرأس أولا، ثم يستخدم ملقط رفيع لإزالة الهيكل الخارجي للبشرة بدقة وعزل الدماغ اليافع. يتم تطهير الدماغ المعزول من جميع الأنسجة المحيطة والقصبة الهوائية البارزة. د: تثبت الأدمغة المعزولة، وتحجب، ثم تحضن بالتتابع في الأجسام المضادة الأولية والثانوية. يتضمن نطاق الأجسام المضادة المستخدمة عادة مسبارا غشائيا عاما للكشف عن الكبيبات المشبكية لفص الهوائي ومسبار غشائي محدد للخلايا العصبية الحسية الشمية Or42a. (ه) توضع الأدمغة الموسومة في وسط تركيب على شريحة مجهرية زجاجية بها فواصل شريطية تحت غطاء مختوم. يعد اتجاه الدماغ الصحيح (السطح الظهري لأعلى) أمرا بالغ الأهمية للتصوير الأمثل لفصوص الهوائيات. (F) يتم تصوير الأدمغة باستخدام مجهر فلوري متحد البؤر للمسح بالليزر. يتم تعمية جميع العينات عن النمط الجيني وظروف التجربة قبل التصوير والتحليلات الكمية اللاحقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تقليم الكبيبات المشبكية ذات الفترة الحرجة المعتمدة على تجربة الرائحة. (أ) يتم تعيين الكبيبات الشمية ذات الفص الهوائي (AL) بدقة. يظهر عدد قليل من الكبيبات المتشابكة التمثيلية. تقوم فئة الخلايا العصبية الحسية الشمية لمستقبلات Or42a (OSN) بتعصيب كبيبات VM7 على وجه التحديد. (B) Or42a-mCD8::GFP الخلايا العصبية الموسومة (الخضراء) تعصب كثيف كبيبات VM7 المقترنة على الجانبين الأيسر (L) والأيمن (R) من الدماغ ، مع وضع علامات على الأجسام المضادة N-Cadherin (CadN) لجميع الكبيبات المشبكية AL (أرجواني). خط الطيران هو w¹¹¹⁸ ؛ Or42a-mCD8::GFP/+. (ج) تمثيل رسومي تخطيطي لتعصيب Or42a OSN للكبيبات المشبكية VM7 في حالة التحكم في السيارة (زيت معدني 100٪ ؛ يسار) والتعرض لإيثيل الزبدات (٪ EB v / v في الزيوت المعدنية ؛ يمين) خلال الفترة الحرجة للأحداث. يحدث تقليم التعصيب المعتمد على الخبرة فقط مع التعرض المبكر ل EB ، مع التخلص من نقاط الاشتباك العصبي وفقدان المحاور العصبية ، مما يؤدي إلى انخفاض حجم التعصيب. (د) صور تمثيلية متحدة البؤر لتعصيب Or42a OSN للكبيبات المشبكية VM7 المقترنة (دوائر مخططة بيضاء متقطعة؛ Or42a-mCD8::GFP ، أخضر) بعد التحكم في مركبة الزيت (يسار) وتعرض EB بنسبة 25٪ (يمين) لمدة 24 ساعة (0-1 نقطة في البوصة). تؤدي تجربة رائحة EB إلى التقليم المشبكي وفقدان حجم التعصيب. هذه الآلية المعتمدة على التجربة مقيدة مؤقتا ولا يمكن عكسها بشكل عابر إلا خلال فترة حرجة شمية محددة جيدا في الأيام القليلة الأولى بعد الكشف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: القياس الكمي لشدة وحجم مضان الكبيبات المشبكية المعتمدة على جرعة EB. (أ) Or42a-mCD8::GFP المسمى التعصيب في كبيبة مشبكية VM7 (خضراء) معرضة من 0-1 dpe للتحكم في الزيت المعدني للمركبة ذات الرائحة (0٪ EB ، يسار) ، 15٪ EB (وسط) ، أو 25٪ EB (يمين). أدناه: نفس الصور مع التعصيب الكبيبي المحدد (الدوائر البيضاء) وحجم التعصيب 3 الأبعاد المحسوبة. يحتوي التحكم في السيارة على تعصيب الكبيبة المشبكية VM7 بواسطة الخلايا العصبية Or42a التي لا يمكن تمييزها عن غير المعالجة. تجربة الفترة الحرجة مع التعرض للرائحة بنسبة 15٪ EB تؤدي إلى تقليم واضح للكبيبات المشبكية ، مع انخفاض بنسبة 66٪ في حجم التعصيب ثلاثي الأبعاد في هذه الحالة. يؤدي التعرض لمستوى أعلى من 25٪ EB إلى تقليم أكبر ، مع فقدان ما يقرب من 90٪ من حجم الكبيبة المشبكية في هذه الحالة. وبالتالي ، يمكن للمرء أن يتخيل التقليم المعتمد على الجرعة مع زيادة تجربة الرائحة. (ب) النتائج التمثيلية ل Or42a-mCD8::GFP المسمى شدة التألق داخل الكبيبات المشبكية VM7 المعرضة من 0-1 dpe للتحكم في السيارة ذات الرائحة (زيت ، أخضر) ، 15٪ EB (وسط ، برتقالي) ، أو 25٪ EB (يمين ، أسود). (C) النتائج التمثيلية لأحجام التعصيب ثلاثية الأبعاد للكبيبات VM7 تحت نفس ظروف التعرض للرائحة في الفترة الحرجة. تظهر مخططات التشتت جميع نقاط البيانات الفردية بمتوسط ± SEM. يشار إلى الأهمية على أنها p≤0.05 (*) و p ≤ 0.01 (**) و p ≤ 0.001 (***) و p ≤ 0.0001 (****). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخدام بروتوكول التعرض للرائحة وتصوير الدماغ المقدم هنا للحث بشكل موثوق وقياس تقليم الكبيبات المشبكية للخلايا العصبية الحسية الشمية المعتمدة على الخبرة خلال فترة حرجة في وقت مبكر من الحياة. بدأت الدراسات السابقة التي تستخدم نموذج العلاج هذا لاستكشاف إعادة تشكيل الدوائر الشمية في التعرض للرائحة^{في اليوم الثاني} بعد الإغلاق³^،⁴^،⁵. في المقابل ، نبدأ التعرض للرائحة في الشرانق الفاراتية قبل الانسداد البالغ ونجد أن الغالبية العظمى من إعادة البناء تحدث خلال ال 24 ساعة الأولى بعد^{الإغلاق} ^8,9. وبالتالي ، فإن الخطوة الأساسية في بروتوكول التعرض للرائحة هذا هي وضع الشرانق الداكنة المرحلية في غرف الرائحة قبل الإغلاق (الشكل 1). هذا ليس للتعرض لرائحة العذراء في حد ذاته ولكن لضمان التعرض للرائحة فور التعرض للبالغين. اخترنا البالغين الأحداث المغلقين لمدة 4 ساعات بعد التدريج لمزامنة الأعمار داخل نافذة زمنية ضيقة ولتجنب الاختلافات في أوقات التعرض للرائحة. يتماشى هذا الفاصل الزمني للتجربة السابقة مع الدراسات الحديثة التي توضح أن التعود الشمي EB يغلق بعد يومين فقط بعد الإغلاق¹⁰. ومع ذلك ، فإن عواقب اختلافات توقيت التعرض للرائحة خلال الفترة الحرجة (على سبيل المثال ، 0-1 مقابل 1-2 أيام) لم يتم توصيفها بشكل جيد. تقوم الخلايا العصبية الحسية الشمية Or42a بتعصيب كبيبة VM7 بشكل انتقائي في الفص الهوائي ، والتي يمكن التعرف عليها بسهولة بناء على الخرائط الكبيبية الدقيقة وعلامات التعصيب المستهدفة (على سبيل المثال ، Or42a-mCD8::GFP; الشكل 2). لا يؤدي التعرض لرائحة EB خلال الفترة الحرجة إلى تغيير تعبير المروج Or42a أو مستويات^{المراسل 8}. يؤدي التعرض الموقوت للرائحة إلى التخلص المتسلسل من المشبك العصبي وفقدان التعصيب العصبي من الخلايا العصبية لمستقبلات Or42a. هذا التقليم قابل للعكس تماما خلال الفترة الحرجة المبكرة من العمر (0-2 نقطة في البوصة) ولكن ليس عند نضج البالغين (7-9 نقطة في البوصة) عندما لا تغير التغيرات في بيئة الرائحة التعصيب. إن التقييد الزمني الصارم لهذه الآلية المعتمدة على التجربة الحسية هو سؤال رئيسي معلق في هذا المجال. تبذل العديد من المحاولات لإعادة فتح اللدونة الشبيهة بالفترة الحرجة عند النضج. البروتوكول الوارد هنا هو وسيلة قوية للتحقيق.

تسمح سهولة التعرض للرائحة وبروتوكول تصوير الدماغ الموصوف هنا بإمكانية الوصول على نطاق واسع والقدرة على التكيف على نطاق واسع. تخضع تجربة التعرض للرائحة وإنهائها ومدتها تماما لتقدير المحقق للسماح بالدراسات المستهدفة لخصائص الفترة الحرجة ، وإعادة عرض قابلية الانعكاس ، وإعادة فتح اللدونة الشبيهة بالفترة الحرجة. وبالمثل ، يمكن التلاعب بسهولة بقوة تجربة الرائحة لدراسة تقليم الكبيبات المشبكية المعتمدة على الجرعة (الشكل 3). الأهم من ذلك ، يمكن استخدام الدراسات التي تستخدم تركيزات EB أقل (على سبيل المثال ، 15٪ EB) لاختبار التلاعب الذي يمكن أن يعزز معدل أو مدى إعادة تشكيل الكبيبات المشبكية. على سبيل المثال ، يمكن أن تظهر النتائج التقليم المشبكي عند مستويات EB المنخفضة (على سبيل المثال ، 15٪) بحيث لا يمكن تمييزه عن مستويات EB الأعلى (على سبيل المثال ، 25٪). عبر عمليات التلاعب المختلفة ، يمكن مقارنة النتائج بالتعصيب المتسق لأدوات التحكم في السيارة ذات الرائحة والتقليم القوي للكبيبات المشبكية التي تحدث عند 25٪ EB (الشكل 3). أحد قيود هذه الطريقة هو أن التعرض للرائحة يعتمد كليا على تقلب الرائحة الذائبة. تؤثر العوامل المتغيرة مثل درجة الحرارة والرطوبة النسبية على فعالية التعرض للرائحة⁸. يمكن أن تؤثر كثافة الذباب في غرف الروائح أيضا على التعرض للرائحة ، على سبيل المثال ، من خلال إنتاج الروائح المشتقة من الذباب. يوصى بكثافة لا تزيد عن 20-25 ذبابة لكل قارورة. من المحتمل أن يكون تركيز الرائحة المطلوب للحث على تقليم الكبيبات المشبكية القوي جدا أعلى مما يحدث عادة في الطبيعة^10,17. ستكون هناك حاجة إلى تقنيات تصوير عالية الدقة لفحص إزالة المشبك العصبي بتركيزات أقل من الرائحة. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الحالي يسمح بدراسات متسقة وموثوقة لمجموعة من التلاعبات.

هناك فوائد هائلة لهذا التعرض للرائحة وبروتوكول تصوير الدماغ. ذبابة الفاكهة هي نموذج حيواني مفيد للغاية تم تأسيسه على مجموعة أدوات وراثية واسعة ومتطورة ، والتي يمكن استغلالها بشكل منهجي للدراسة الواسعة للتفاعلات بين الجينات والبيئة في إعادة تشكيل الدوائر الشمية في الفترة الحرجة. تتضمن الأمثلة الموضحة هنا خط المحرك المعدل وراثيا Or42a-Gal4 ، وعلامة غشاء UAS-mCD8 :: GFP ، و Or42a-mCD8 :: GFP الانصهار المباشر. لا توجد فروق مميزة بين تقليم الكبيبات المشبكية مع الانصهار المباشر Or42a مقابل نهج وضع العلامات غير المباشرة Gal4 / UAS ^8,9. يوفر برنامج التشغيل Or42a-Gal4 القدرة على التعامل مع الخلايا العصبية المستقبلة الشمية المستهدفة وتصور التغييرات المعتمدة على الخبرة في تعصيب VM7 ، في حين أن خط الاندماج المباشر يحرر النظام المحورة وراثيا الثنائي UAS-Gal4 للتلاعبات الأخرى التي تستهدف الخلايا. يمكن استخدام العديد من الخطوط الطافرة والمحورة وراثيا الأخرى من مجموعة أدوات ذبابة الفاكهة الشاملة لاختبار آليات التقييد الزمني والمعتمدة على الخبرة ، بما في ذلك تحديد الخلايا التي تتوسط التقليم المشبكي ، ومسارات الإشارات بين الخلايا التي تنقل معلومات تجربة حاسة الشم ، والآلية داخل الخلايا اللازمة للقضاء على المشبك المستهدف. بشكل عام ، يسمح هذا البروتوكول بالاستجواب المنهجي للعديد من الآليات التي تقود إعادة تشكيل دائرة الدماغ المعتمدة على الخبرة الشمية. يمكن أيضا استخدام بروتوكول التعرض للرائحة وتصوير الدماغ هذا للتحقيق في التعديلات السلوكية للتجربة الشمية الخاصة بالفترة الحرجة ، والتلاعب الجيني والصيدلاني الذي قد يتيح إعادة فتح اللدونة الشبيهة بالفترة الحرجة عند النضج والجوانب الأخرى لدونة الدائرة الشمية التي تتجاوز تقليم الكبيبات المشبكية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء Broadie Lab الآخرين على مدخلاتهم القيمة. تم إنشاء الأرقام باستخدام BioRender.com. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعهد الوطني للصحة MH084989 و NS131557 إلى K.B.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي> للتعرض للرائحة < / قوي >
< >ذبابة الفاكهة < / م > قوارير	جينيسي Scientific	32-110
إيثيل الزبدات	Sigma Aldrich	E15701
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ؛	فيشر العلمية	05-408-129
الزيوت المعدنية	Sigma Aldrich	M3516
غرف الرائحة فرش	Glasslock
	Winsor & amp نيوتن	سلسلة 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
شبكة سلكية	Scienceware	378460000<
strong> تشريح الدماغ< / قوي >
إيثانول ، 190 دليل	على مختبرات Decon	2801	مخفف إلى 70٪
ملقط	أدوات العلوم الدقيقة	11251-30	Dumont # 5
بارافورمالدهايد	علوم المجهر الإلكتروني	157-8	مخفف إلى 4٪
أطباق بتري	فيشر العلمية	08-757-100B
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	Thermo Fisher Scientific	70011-044	مخفف إلى 1x
السكروز	فيشر العلمي ؛	BP220-1
المجهر الإلكتروني	سيلجارد	24236-10
تريتون-إكس 100	فيشر العلمية	BP151-100<
قوي>الكيمياء المناعية للدماغ< / قوي>
488 الماعز المضاد للدجاج	Invitrogen	A11039
546 الماعز المضاد للفئران	Invitrogen	A11081
زلاليم مصل البقر ؛	Sigma Aldrich	A9647
دجاج مضاد ل GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 × 25 مم
شريط على الوجهين	سكوتش	34-8724-5228-8
Fluoromount-G & nbsp ؛	علوم المجهر الإلكتروني	17984-25
شرائح المجهر	فيشر Scientific	12-544-2	75 × 25 مم
طلاء الأظافر	سالي هانسن	109	Xtreme Wear ، مصل
الماعز الطبيعي	Sigma Aldrich	G9023
الفئران المضادة	CadN الدراسات التنموية بنك الورم الهجين	AB_528121
<قوي> Confocal / Analysis < / قوي >
أي جهاز كمبيوتر / كمبيوتر محمول
مجهر متحد البؤر	Carl Zeiss		Zeiss 510 META & nbsp ؛
		فيجي	الإصدار 2.14.0 / 1.54f

طلاء علوم غير المرئي ل برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

English, S., Barreaux, A. M. The evolution of sensitive periods in development: insights from insects. Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).
Fabian, B., Sachse, S. Experience-dependent plasticity in the olfactory system of Drosophila melanogaster and other insects. Fron Cell Neurosci. 17, 1130091(2023).
Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
Devaud, J. M., Acebes, A., Ramaswami, M., Ferrús, A. Structural and functional changes in the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a critical age. J Neurobiol. 56 (1), 13-23 (2003).
Sachse, S., et al. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56 (5), 838-850 (2007).
Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Pro Natl Acad Sci U S A. 108 (36), E646-E654 (2011).
Kidd, S., Struhl, G., Lieber, T. Notch is required in adult Drosophila sensory neurons for morphological and functional plasticity of the olfactory circuit. PLoS Genet. 11 (5), e1005244(2015).
Golovin, R. M., Vest, J., Vita, D. J., Broadie, K. Activity-dependent remodeling of Drosophila olfactory sensory neuron brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 39 (16), 2995-3012 (2019).
Golovin, R. M., Vest, J., Broadie, K. Neuron-specific FMRP roles in experience-dependent remodeling of olfactory brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 41 (6), 1218-1241 (2021).
Chodankar, A., Sadanandappa, M. K., Raghavan, K. V., Ramaswami, M. Glomerulus-selective regulation of a critical period for interneuron plasticity in the drosophila antennal lobe. J Neurosci. 40 (29), 5549-5560 (2020).
Stephan, D., et al. Drosophila Psidin regulates olfactory neuron number and axon targeting through two distinct molecular mechanisms. J Neurosci. 32 (46), 16080(2012).
Doll, C. A., Broadie, K. Activity-dependent FMRP requirements in development of the neural circuitry of learning and memory. Development. 142 (7), 1346-1356 (2015).
Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. J Vis Exp. (118), e55128(2016).
Okumura, M., Kato, T., Miura, M., Chihara, T. Hierarchical axon targeting of Drosophila olfactory receptor neurons specified by the proneural transcription factors Atonal and Amos. Genes to Cells. 21 (1), 53-64 (2016).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Vita, D. J., Meier, C. J., Broadie, K. Neuronal fragile X mental retardation protein activates glial insulin receptor mediated PDF-Tri neuron developmental clearance. Nat Comm. 12 (1), 1160(2021).
Gugel, Z. V., Maurais, E. G., Hong, E. J. Chronic exposure to odors at naturally occurring concentrations triggers limited plasticity in early stages of Drosophila olfactory processing. eLife. 12, 85443(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Or42a

إعادة تشكيل تعتمد على الخبرة للاتصال العصبي الحسي الشمي للدماغ اليافع في فترة حرجة مبكرة من الحياة

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة