مقالة منهجية

تصوير الفاصل الزمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح دماغ الفأر الجنينية

1.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66631

⸱

مارس 8, 2024

 ,  , 
1Department of Anatomy, Keio University School of Medicine, 2Department of Molecular Neurobiology, Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center

في هذه المقالة

ملخص

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. تشارك العديد من الجينات في هذه العملية. يقدم هذا البروتوكول تقنية التصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية.

الملخص

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. هذه العملية ضرورية لوظيفة الدماغ المناسبة ، ويمكن أن يؤدي عدم تنظيمها إلى اضطرابات النمو العصبي والنفسي بعد الولادة. في الواقع ، تم العثور على العديد من الجينات المسؤولة عن هذه الأمراض تشارك في هذه العملية ، وبالتالي ، فإن الكشف عن كيفية تأثير هذه الطفرات على الديناميات الخلوية أمر مهم لفهم التسبب في هذه الأمراض. يقدم هذا البروتوكول تقنية للتصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح الدماغ التي تم الحصول عليها من أجنة الفئران. يتم تمييز الخلايا ببروتينات الفلورسنت باستخدام التثقيب الكهربائي في الرحم ، والذي يصور الخلايا الفردية المهاجرة من منطقة البطين بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. علاوة على ذلك ، يتيح لنا نظام نقل الجينات في الجسم الحي إجراء تجارب اكتساب الوظيفة أو فقدان الوظيفة بسهولة على جينات معينة عن طريق التثقيب الكهربائي المشترك لتعبيرها أو نواقل الضربة القاضية / الضربة القاضية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحليل سلوك الهجرة وسرعة هجرة الخلايا الفردية ، وهي معلومات لا يتم الحصول عليها أبدا من أدمغة ثابتة.

المقدمة

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنتج الدبقية الكعبرية (القمية) في منطقة البطين الشاب (VZ) المبطنة للبطين الجانبي الخلايا العصبية الأولى ثم السلف الدبقي مع بعض الفترة المتداخلة1. يتم إنشاء الخلايا العصبية أيضا من السلف الوسيط أو الدبقية الشعاعية القاعدية في المنطقة تحت البطينية (SVZ) المجاورة ل VZ ، وكلاهما ينشأ من الدبقية الشعاعية (القمية) 2,3. في الفئران ، تنتج الخلايا الدبقية الشعاعية الخلايا العصبية فقط في اليوم الجنيني (E) 12-14 ، كل من الخلايا العصبية والأسلاف الدبقية في E15-16 ، والأسلاف الدبقية من E17 فصاعدا4. يتمايز السكان الرئيسيون من الأسلاف الدبقية المتولدة خلال هذه المراحل الجنينية بشكل تفضيلي إلى خلايا نجمية ، على الرغم من أن بعض الخلايا تتمايز أيضا إلى خلايا قليلة التغصن5. تهاجر الخلايا العصبية وأسلاف الخلايا النجمية المتولدة في هذه المراحل نحو سطح الدماغ وتدخل الصفيحة القشرية (المادة الرمادية القشرية المستقبلية). تحدث الهجرة العصبية من VZ إلى الصفيحة القشرية على مراحل متعددة. تتبنى الخلايا العصبية أولا مورفولوجيا متعددة الأقطاب فوق منطقة تراكم الخلايا متعددة الأقطاب (MAZ) ، متداخلة مع SVZ أو المنطقة الوسيطة ، حيث تمتد بقوة وتتراجع عن عمليات رقيقة متعددة وتهاجر ببطء (الهجرة متعددة الأقطاب)6,7. بعد حوالي 24 ساعة ، تتحول الخلايا العصبية إلى مورفولوجيا ثنائية القطب ، وتمتد عملية رائدة سميكة نحو سطح الدماغ وعملية لاحقة رقيقة للخلف ، وتهاجر خطيا نحو سطح الدماغ باستخدام عملية شعاعية تمتد من الدبقية الشعاعية إلى سطح بيال كسقالة ، والتي تسمى وضع الحركة 2,8. نظرا لأن الخلايا العصبية في وضع الحركة تصل دائما إلى السطح الخارجي للصفيحة القشرية ، وتمر عبر سابقاتها أسفل المنطقة الهامشية مباشرة ، يتم محاذاة الخلايا العصبية بطريقة تعتمد على تاريخ الميلاد من الداخل إلى الخارج في اللوحة القشرية9،10،11.

في المقابل ، تهاجر أسلاف الخلايا النجمية بسرعة إلى المنطقة الوسيطة والصفيحة القشرية ، مع تغييرات اتجاهية متكررة. يختلف سلوك الهجرة هذا تماما عن الهجرة العصبية ويسمى الهجرة غير المنتظمة5. تهاجر أسلاف الخلايا النجمية أيضا على طول الأوعية الدموية في عملية تسمى الهجرة الموجهة بالأوعية الدموية. تقوم أسلاف الخلايا النجمية بالتبديل بين أوضاع الهجرة هذه والوصول إلى اللوحة القشرية 5,12. على الرغم من أن موضع الخلايا النجمية لا يتم تحديده بدقة من خلال تاريخ إنتاجها ، فقد لوحظ ميل معتدل للخلايا النجمية المولودة مبكرا للاستقرار في الجزء السطحي من الصفيحة القشرية5. ومن المثير للاهتمام ، أن الخلايا النجمية التي تستقر في الصفيحة القشرية تتولد في المراحل الجنينية وتتمايز في النهاية إلى خلايا نجمية بروتوبلازمية ، في حين أن الخلايا النجمية المتولدة بعد الولادة لا تهاجر بنشاط ، وتبقى في المادة البيضاء ، وتتمايز إلى خلايا نجمية ليفية5. كيف تحدث هذه المواصفات المعتمدة على المرحلة للأنواع الفرعية النجمية لا تزال غير واضحة.

تم تحديد عدد متزايد من الجينات المشاركة في هجرة الخلايا العصبية ، بما في ذلك تلك المشاركة في اضطرابات النمو العصبي والنفسية13،14. لذلك ، من الأهمية بمكان توضيح آثار الطفرات في هذه الجينات على سلوك الخلايا العصبية المهاجرة. كما ذكرنا سابقا ، تحدث الهجرة العصبية على مراحل متعددة. يمكن أن تحدد ملاحظات الفاصل الزمني بشكل مباشر المرحلة التي تتأثر بشكل رئيسي (خروج دورة الخلية ، والانتقال متعدد الأقطاب ثنائي القطب ، وسرعة هجرة الحركة ، وما إلى ذلك). ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء مواصفات الخلايا النجمية وهجرتها وموقعها لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. بالنظر إلى أن الخلايا النجمية تلعب أدوارا حاسمة في تكوين المشبك15 وتشكيل حاجز الدم في الدماغ أثناء نمو الدماغ16 ، فقد تؤدي العيوب التنموية في الخلايا النجمية إلى اضطرابات النمو العصبي. قد توضح دراسات الفاصل الزمني على أسلاف الخلايا النجمية هذه الآليات الجزيئية وعلاقتها بالمرض العقلي.

يوفر هذا البروتوكول طريقة لمراقبة الفاصل الزمني للخلايا المشتقة من VZ القشرية. تم بالفعل نشر بروتوكول فيديو مماثل لمراقبة هجرة الخلايا العصبية17. نصف هنا طريقة كل من الخلايا العصبية المهاجرة وأسلاف الخلايا النجمية. لتسمية هذه الخلايا ببروتينات الفلورسنت ، مثل البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء (GFP و RFP) ، يتم إدخال مخاليط البلازميد التي تحتوي على مكونات مناسبة في VZ القشري عن طريق التثقيب الكهربائي في الرحم في المراحل المناسبة18،19،20،21. تتم إزالة الأجنة التي تم التلاعب بها في المراحل المطلوبة ، ويتم تقطيع الأدمغة واستخدامها لمراقبة الفاصل الزمني باستخدام مجهر المسح بالليزر. يمكن فحص سرعة الهجرة واتجاهها والسلوكيات الأخرى ، التي لا يتم تناولها أبدا باستخدام عينات الدماغ الثابتة ، باستخدام هذه الطريقة. يمكن بسهولة نقل نواقل التثقيب الكهربائي في الرحم والتعبير والضربة القاضية / الضربة القاضية بالتزامن مع ناقلات البروتين الفلورية ، مما يمكننا من إجراء دراسات كسب الوظيفة وفقدان الوظيفة لجينات معينة.

البروتوكول

تم إجراء الدراسة الحالية بموافقة واتباع إرشادات لجنة رعاية واستخدام التابعة لمعهد البحوث التنموية ومركز أيتشي للإعاقة التنموية (# 2019-013) وجامعة كيو (A2021-030). تم الحصول على الفئران الحامل الموقوتة ICR (النوع البري) تجاريا (انظر جدول المواد). لمراقبة العلاقة بين الخلايا المهاجرة والأوعية الدموية ، تم استخدام الفئران Flt1-DsRed ، حيث تعبر الخلايا البطانية عن DsRed22. تم عبور ذكور الفئران Flt1-DsRed مع إناث الفئران ICR (كان كلا الفئران في سن 8-24 أسبوعا). تم إيواء جميع والتلاعب بها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) حتى أخذ العينات. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. في التثقيب الكهربائي الرحم

  1. قم بإعداد محلول ملحي مخزن HEPES (HBS) عن طريق إضافة كمية متساوية من المياه المعقمة إلى 2x HBS المتاحة تجاريا.
  2. هناك خياران للتخدير. إيزوفلوران (استنشاق) و MMB (حقن). في حالة استخدام MMB ، قم بإعداده على النحو التالي. أضف 0.75 مل من ميديتوميدين (1 مجم / مل) ، و 2 مل من الميدازولام (5 مجم / مل) ، و 2.5 مل من بوتورفانول (5 مجم / مل) في 19.75 مل من الماء المعقم23.
    ملاحظة: يصبح هذا الحل المخدر أقل نشاطا في غضون 2 أشهر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية مع واقي خفيف.
  3. تحضير حل أتيباميزول. تمييع 0.75 مل من أتيباميزول (5 ملغ / مل) مع 24.25 مل من الماء المعقم.
  4. تحضير 0.2٪ (وزن / حجم) محلول أخضر سريع في الماء المعقم. تعقيم مع مرشح (حجم المسام 0.22 ميكرومتر).
  5. تحضير البلازميد باستخدام مجموعة تنقية البلازميد التقليدية على أساس التحلل القلوي وتنقية العمود23 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). قم بإذابة البلازميد المنقى من مزرعة بكتيريا 100 مل في 30-50 ميكرولتر من HBS لتحضير مخزون البلازميد (3-5 ميكروغرام / ميكرولتر) (الملف التكميلي 1).
    1. امزج وخفف مخزون البلازميد مع HBS ، وأضف حجم 1/10 من 0.2٪ Fast Green لتلوين الحقن. يتم تحديد المكونات والتركيزات النهائية للبلازميدات وفقا للغرض منها (الجدول 1).
  6. اصنع الماصات الدقيقة عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب ماصة.
    ملاحظة: يتم قطع طرف الماصة بشكل غير مباشر باستخدام ملقط رفيع. يبلغ القطر الخارجي للطرف حوالي 70 ميكرومتر. ضع علامة على الماصات الدقيقة على فترات 2 ميكرولتر عن طريق امتصاص 2 ميكرولتر من الماء.
  7. حقن مخدر MMB بجرعة 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم داخل الصفاق في الفأر الحامل في مرحلة مناسبة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
    ملاحظة: يجب تحديد المراحل الجنينية المراد التلاعب بها وفقا للغرض. لتسمية الخلايا العصبية الهرمية II / III المستقبلية ، E14.5 مناسب. لتسمية السلف الدبقية ، يجب إجراء التثقيب الكهربائي على E15-16. بدلا من ذلك ، يمكن تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (1٪ -2٪).
  8. بعد تخدير الفأر بعمق ، ضعه على طبق دافئ عند 38 درجة مئوية.
    ملاحظة: تأكد من أن الماوس لا يستجيب لقرص الذيل.
  9. بعد إزالة الفراء حول موقع الجراحة باستخدام كريم مزيل الشعر ، قم بتطهير المنطقة الجراحية عدة مرات بحركة دائرية باستخدام كل من المقشر القائم على اليود والكحول بنسبة 70٪. قم بعمل شق جلدي بطول 2 سم على طول خط الوسط من مستوى الزوج الخلفي الثاني من الحلمات الأمامية ، متبوعا بشق خط الوسط 2 سم في جدار البطن على طول خط ألبا (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: في عملية شق في جدار البطن ، ارفعه قليلا بالملقط الناعم حتى لا تقطع الأعضاء الداخلية.
  10. ضع ورقة بلاستيكية معقمة على الجلد وقطعة من المناديل الورقية المعقمة عليها (الشكل 1 أ). قم بعمل ثقب في المركز لكشف المنطقة الجراحية.
    ملاحظة: يتم وضع الورقة البلاستيكية المعقمة وورق المناديل المعقمة بعد إجراء الشق لأن مجال الرؤية الواسع مطلوب لوضع الشق في إشارة إلى موضع الحلمات.
  11. بلل الورق باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، وراقب بعناية قرون الرحم من الشق ، واسحب قرن الرحم من خلال ثقوب الصفيحة البلاستيكية والورق.
  12. باستخدام ماصة دقيقة متصلة بمجموعة أنبوب الشافطة ، قم بحقن 1 ميكرولتر من مزيج البلازميد في البطين الجانبي الأيسر أو الأيمن من خلال جدار الرحم عن طريق ضغط الزفير (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن حقن البلازميد باستخدام حاقن دقيق.
  13. قرصة رأس الجنين بقطب كهربائي من نوع الملقط وتطبيق نبضات إلكترونية باستخدام كهربائي (35 فولت ل E14-16 ، 50 فولت ل E17 ، 50 مللي ثانية نبضات مربعة مع فترات 450 مللي ثانية ، 5 مرات) (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: لا تضغط على رأس الأجنة بقوة ، مما يؤدي إلى تلف الأجنة. يجب أن يكون التيار الفعلي 40-70 مللي أمبير.
  14. ضع قرن الرحم مرة أخرى في تجويف البطن.
  15. خياطة جدار البطن باستخدام خيط الحرير 5-0.
  16. ضع محلول أتيباميزول بجرعة 10 ميكرولتر / جم من وزن الجسم داخل الصفاق.
  17. خياطة الجلد باستخدام خيط الحرير 5-0.
    ملاحظة: يمكن إغلاق الجلد باستخدام مشبك تلقائي.
  18. احتفظ بالفئران التي تم التلاعب بها على طبق دافئ لمدة 30 دقيقة على الأقل. ستبدأ الفئران في التحرك في القفص.
    ملاحظة: يجب أن يتم إجراء التثقيب الكهربائي في الرحم (من الخطوات 1.7 إلى 1.16) في غضون 30 دقيقة. وقت العملية النموذجي هو 20 دقيقة.

2. تحضير الشرائح

ملاحظة: نضارة الشرائح هي مفتاح نجاح هذه التجربة. يجب تحضير الشرائح (من الخطوات 2.5-2.12) في غضون ساعتين.

  1. تحضير محلول ملح هانكس المتوازن باستخدام Ca2+ و Mg2+ ؛ HBSS (+). أضف 5 مل من CaCl2 (14 جم / لتر ، معقم) و 5 مل من MgSO 4.7H2O (20 جم / لتر ، معقم) إلى 500 مل من HBSS (-). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. ضع المحلول في فقاعة بنسبة 95٪ O2 + 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق على الثلج قبل الاستخدام.
  2. إعداد وسط الثقافة. هناك حاجة إلى 2.5 مل / طبق على الأقل. أضف 2 مل من مصل الجنين البقري ، 25 ميكرولتر من L-glutamine (200 mM) ، 200 μL B27 (50x) ، 50 μL من البنسلين + الستربتومايسين (10 K وحدة / مل و 10 ملغ / مل) إلى 8 مل من الوسط العصبي القاعدي.
  3. إعداد 3 ٪ انخفاض درجة حرارة انصهار هلام الأغاروز. المسام 50 مل من HBSS (+) ، ثم إضافة 1.5 ملغ من الأغاروز درجة حرارة الانصهار المنخفضة ، والأوتوكلاف عليه. تذوب الأغاروز في فرن الميكروويف وتحتفظ به عند 50 درجة مئوية في حاضنة حمام مائي قبل الاستخدام.
  4. أضف 1.9 مل من وسط الاستزراع إلى طبق قاعدة زجاجية. ضع ملحق زراعة الخلايا عليه بعناية حتى لا تحبس المصابيح الهوائية تحت المرشح ، ثم أضف 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع على المرشح (الشكل 1 ب). ضعه على الجليد.
  5. بعد تخدير الفئران التي تم التلاعب بها عن طريق استنشاق 5٪ إيزوفلوران ، التضحية بها عن طريق خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) في المراحل المناسبة التي يجب مراعاتها.
    ملاحظة: يومان (48 ساعة) و 3 أيام بعد التثقيب الكهربائي عند E14.5 مناسبان لمراقبة الانتقال متعدد الأقطاب ثنائي القطب ووضع الحركة ، على التوالي.
  6. أخرج الأجنة وضعها في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني بارد.
  7. حدد الأجنة عن طريق التعبير عن GFP أو بروتينات الفلورسنت الأخرى تحت المجهر.
  8. بعد قطع رأس الأجنة ، قم بتشريح الأدمغة6 تحت مجهر تشريح واحتفظ بها في HBSS البارد (+).
  9. صب جل الأغاروز المذاب بنسبة 3٪ في كريومولد (انظر جدول المواد) ، ثم ضع العقول فيه ولفها عدة مرات. ضعه في درجة حرارة الغرفة حتى يصلب الأغاروز تماما ، ثم ضعه على الجليد.
  10. قم بتقطيع الأدمغة إكليليا بسمك 350 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم مهتز (انظر جدول المواد).
  11. رتب الشرائح على المرشح (بحد أقصى 6 شرائح لكل مرشح).
  12. اسحب وسط الاستزراع من داخل وخارج كوب المرشح (إجمالي 600 ميكرولتر). في هذه الخطوة ، يتم ضغط الشرائح وتثبيتها على مرشح. بعد 5 دقائق ، أضف 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى داخل ملحق زراعة الخلية.

3. التصوير بفاصل زمني

  1. احتفظ بحجرة المزرعة مثبتة على مرحلة مجهر المسح بالليزر المقلوب عند 37 درجة مئوية باستخدام سخان الغرفة أو غطاء يحيط بالمجهر قبل 30 دقيقة على الأقل من التصوير لمنع انحراف Z. قم بتزويد غرفة الثقافة بغاز مرطب بنسبة 5٪ CO2 + 40٪ O2 .
  2. اضبط طبق الثقافة مع الشرائح المحضرة أعلاه في غرفة الثقافة.
  3. باستخدام عدسة 20x لمسافة عمل طويلة (NA = 0.45) ، احصل على حوالي 10 صور Z-stack بخطوات 5 ميكرومتر كل 15-30 دقيقة لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام مرحلة XY الآلية. يتيح لنا ذلك الحصول على صور من حقول موضوعية متعددة. عادة ، نحصل على 10-20 صورة من حقول موضوعية مختلفة في تجربة واحدة بفاصل زمني.

4. تحليل التصوير

  1. قم بتحويل صور XYZT إلى XYT بأقصى إسقاط للمحور Z باستخدام ImageJ أو برامج أخرى.
    ملاحظة: إذا انزلقت الشرائح أثناء الملاحظة ، فاضبط موضع الخلايا داخل الصور باستخدام StackRed ، وهو مكون إضافي ل ImageJ ، مع وظيفته المتمثلة في تحويل الجسم الصلب (انظر جدول المواد).
  2. تتبع مسار GFP- أو غيرها من الخلايا الإيجابية للبروتين الفلوري إما يدويا أو تلقائيا. يمكن إجراء التتبع اليدوي والتلقائي باستخدام MTrackJ24 و TrackMate 25,26 (مكونات ImageJ الإضافية) ، على التوالي. يعد التتبع التلقائي باستخدام TrackMate فعالا لتحليل العديد من الخلايا بطريقة غير متحيزة. ومع ذلك ، يظل التتبع اليدوي باستخدام MTrackJ مفيدا للتتبع الدقيق للخلايا الفردية.

النتائج

تنتج الخلايا الدبقية الكعبرية في VZ الحبيبي الخلايا العصبية فقط حتى E14 ، وكل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في E15 و E16. لمراقبة السلوكيات المهاجرة للخلايا العصبية والخلايا الدبقية في وقت واحد ، قمنا بتصنيفها باستخدام GFP المحسن (EGFP) و RFP ، على التوالي ، باستخدام مروج خاص بالخلايا العصبية ، Tα1 المروج27 ، ومروج البروتين الحمضي الليفي الدبقي البشري (hGFAP)28 ، والذي يتم تنشيطه بشكل تفضيلي في الخلايا النجمية. تكرر أسلاف الخلايا النجمية انقسامات الخلايا أثناء الهجرة ، مما يؤدي إلى تخفيف البلازميد في الخلايا. لتجنب ذلك ، تم استخدام نظام ناقل ترانسبوزون يتكون من بلازميد مانح (pPB) وناقل تعبير ترانسبوزاز (pCAG-hyPBase)29,30. يحتوي البلازميد المانح المستخدم هنا (pPB-CAG-LNL-RFP) على كاسيت loxP-neo-loxP (LNL) ، ويعبر عن RFP اعتمادا على Cre recombinase. الفئران ICR (النوع البري ؛ WT) بالكهرباء مع البلازميدات المشار إليها في الشكل 2A في E15 ، وتم تحضير الشرائح بعد 3 أيام. خلال هذه الفترة الزمنية ، وصلت المجموعة الأولى من الخلايا العصبية EGFP + إلى سطح الصفيحة القشرية (الشكل 2B) ، لكن العديد من الخلايا العصبية EGFP + كانت لا تزال تهاجر. تم إجراء مراقبة الفاصل الزمني لمدة 24 ساعة. خلال هذه الملاحظة ، هاجرت الخلايا العصبية ذات العملية الرائدة السميكة خطيا نحو سطح الدماغ بمعدل ثابت نسبيا في الصفيحة القشرية (19.54 ± 6.21 ميكرومتر / ساعة ، متوسط الانحراف المعياري ± ، 70 خلية). تم تتبع مسارات الترحيل تلقائيا باستخدام برنامج TrackMate (خطوط أرجوانية في الشكل 2B). في نفس المجال الموضوعي ، تم تصور أسلاف الخلايا النجمية باستخدام RFP (الشكل 2C). نظرا لأن مروج hGFAP نشط أيضا في الخلايا الدبقية الشعاعية في المراحل الجنينية المتأخرة ، فإن بعض الخلايا العصبية المشتقة من تلك الخلايا الدبقية الشعاعية تعبر أيضا عن RFP (الأسهم الزرقاء في الشكل 2B ، C). يتم نقل هذه الخلايا العصبية دائما تقريبا باستخدام ناقل تعبير EGFP. لذلك ، تم تحديد أسلاف الخلايا النجمية على أنها خلايا إيجابية مفردة RFP.

على عكس الخلايا العصبية ، تهاجر أسلاف الخلايا النجمية بسرعة وبشكل عشوائي مع تغييرات اتجاهية متكررة داخل المنطقة الوسيطة والصفيحة القشرية (الهجرة غير المنتظمة) 5. تم تتبع هجرة أسلاف الخلايا النجمية يدويا بواسطة برنامج MTrackJ (خطوط أرجوانية في الشكل 2C) ، والتي كشفت عن حركتها العالية (88.37 ± 33.61 ميكرومتر / ساعة ، 5 خلايا). لمراقبة العلاقة بين أسلاف الخلايا النجمية والأوعية الدموية ، تم استخدام الفئران Flt1-DsRed ، التي تعبر عن DsRed ، وهو RFP ، في الخلايا البطانية. في هذه التجربة ، كان من المفترض أن يتم تحديد أسلاف الخلايا النجمية فقط بواسطة EGFP. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير نظام rDIO5 ، حيث يمكن التخلص من تعبير EGFP اعتمادا على hGFAP-Cre في الخلايا العصبية باستخدام مروج Dcx (مروج مبكر خاص بالخلايا العصبية)31 التنشيط المعتمد على مجموعة أخرى من الحمض النووي recombinase وتسلسل التعرف عليه (Dre-rox) (الشكل 2D ، يتم توفير تسلسل pPB-CAG-rDIO-EGFP في الملف التكميلي 1)32 ، 33. تم إدخال نظام rDIO في الماوس Flt1-DsRed في E15 بواسطة التثقيب الكهربائي في الرحم ، وتم تحضير الشرائح بعد 24 ساعة. نتيجة لذلك ، لوحظ أن أسلاف الخلايا النجمية الإيجابية EGFP هاجرت بنشاط على طول الأوعية الدموية (الهجرة الموجهة بالأوعية الدموية)5 (الشكل 2E).

figure-results-1
الشكل 1: تدفق الملاحظات المتتابعة للخلايا المشار إليها في التثقيب الكهربي للرحم. (أ) تخدير الفأر الحامل في مرحلة مناسبة، ويقطع تجويف البطن. المنطقة الجراحية مغطاة بالبلاستيك المعقم والأوراق الورقية المعقمة. تتعرض قرون الرحم ، ويتم حقن الأجنة ب 1 ميكرولتر من خليط البلازميد والنبضات الإلكترونية المطبقة. يتم خياطة جدار البطن والجلد ، ويتم وضع الفئران التي تم التلاعب بها مرة أخرى في قفص المنزل. (ب) توضع الشرائح المحضرة من أدمغة مكهربة على مرشح ملحق زراعة الخلايا (6 شرائح كحد أقصى) في طبق قاعدة زجاجية. يتم تركيب أطباق القاعدة الزجاجية التي تحتوي على شرائح في غرفة الثقافة. يحتوي نظام الفاصل الزمني هذا على غطاء أكريل يغطي المجهر بالكامل للحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. تم تجهيز غرفة الثقافة ، التي يتم فيها توفير الغاز المختلط المرطب ، بمرحلة مجهر داخل الغطاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: ملاحظات اللقطات المتتابعة للخلايا العصبية وأسلاف الخلايا النجمية. (أ) طريقة وضع العلامات التفاضلية للخلايا العصبية (EGFP ، الأخضر) وأسلاف الخلايا النجمية (RFP ، الأحمر) ، وصورة تمثيلية لشريحة محضرة بعد يومين من التثقيب الكهربائي عند 2 ساعة من بداية التصوير بفاصل زمني (يمين). (ب، ج) صور الفاصل الزمني لخلايا EGFP + (B) و RFP + (C) على نفس حقل الهدف الموضح في (A) - اليمين من 2 h إلى 21 h من الملاحظة. (ب) تم عرض مسارات الخلايا المهاجرة EGFP + التي تم اكتشافها تلقائيا بواسطة برنامج TrackMate باللون الأرجواني. (ج) تم تتبع مسارات خلايا RFP + يدويا باستخدام برنامج MTrackJ. يشار إلى الخلايا الإيجابية المزدوجة EGFP / RFP ، والتي يعتقد أنها خلايا عصبية ، بأسهم زرقاء. (د) استراتيجية وضع العلامات على أسلاف الخلايا النجمية باستخدام نظام rDIO في أجنة الفئران Flt1-DsRed. ه: النتيجة التمثيلية للهجرة الموجهة بالأوعية الدموية. برزت خلية (سهم) عملية رائدة (رأس السهم) ، وهاجرت على طول الأوعية الدموية المعبرة عن DsRed (أرجواني) نحو سطح القفص. أ ب. لوحة قشرية. عز; المنطقة المتوسطة. فز. منطقة البطين. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر (A - C) ، 50 ميكرومتر (E). هذا الرقم مقتبس من Tabata H. et al.5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخلايا العصبية (الطبقات الثانية / الثالثة)أسلاف الخلايا النجميةنظام rDIO
(وضع العلامات الخاصة بالخلايا النجمية)
pCAG-EGFP0.5 ميكروغرام / ميكرولترPB-CAG-LNL-EGFP0.5 ميكروغرام / ميكرولترpPB-CAG-rDIO-EGFP0.5 ميكروغرام / ميكرولتر
أو Ta1-EGFP (أكثر تحديدا للخلايا العصبية)0.5 ميكروغرام / ميكرولترhGFAP-Cre0.75 ميكروغرام / ميكرولترhGFAP-Cre0.75 ميكروغرام / ميكرولتر
pCAG-hyPBase0.5 ميكروغرام / ميكرولترpDcx-دري0.5 ميكروغرام / ميكرولتر
pCAG-hyPBase0.5 ميكروغرام / ميكرولتر

الجدول 1: المكونات التمثيلية لمزيج البلازميد لكل هدف. يمكن استبدال نواقل EGFP ب RFP مكافئ أو نواقل تعبير بروتين فلورية أخرى. لتسمية أسلاف الخلايا النجمية ، يتم استخدام نظام ناقل ترانسبوزون. نواقل pPB هي ناقلات PiggyBac transposon لتكامل الجينوم. pCAG-hyPBase هو ناقل تعبير ترانسبوزاز PiggyBac. LNL هو كاسيت loxP-neo-loxP للتعبير المعتمد على Cre. rDIO-EGFP هو Cre-loxP و Dre-roxP يعتمدان على / إيقاف الكاسيت لتعبير EGFP. لمراقبة النمط الظاهري لاكتساب الوظيفة أو فقدان الوظيفة للجينات المرغوبة ، يمكن إضافة متجهات التعبير أو متجهات ضربة قاضية عند 1 ميكروغرام / ميكرولتر. يجب تعديل تركيز هذه المتجهات في كل حالة.

الملف التكميلي 1: تسلسل البلازميد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

قدم هذا البروتوكول طريقة لمراقبة الفاصل الزمني للخلايا المشتقة من VZ الشاحب (القشري). لتسمية الخلايا المهاجرة من VZ ، استخدمنا في التثقيب الكهربائي للرحم ، حيث تم تمييز الخلايا الفردية بوضوح بنسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى من الملصقات بوساطة النواقل الفيروسية. باستخدام التثقيب الكهربائي في الرحم ، يمكن إدخال أي نوع من النواقل في أي تركيبة بسهولة في الخلايا الدبقية الشعاعية (الخلايا الجذعية العصبية) في الأجنة الحية. يمكن تصنيف الخلايا العصبية والأسلاف الدبقية بشكل انتقائي باستخدام محفزات مختلفة. نظرا لأن عدد نسخ البلازميدات التي أدخلها التثقيب الكهربائي في الرحم مرتفع ، يمكن إجراء دراسات اكتساب الوظيفة وفقدان الوظيفة بسهولة عن طريق التثقيب الكهربائي المشترك لناقلات تعبير GFP والنواقل المختلفة المتعلقة بالجينات ذات الأهمية ، مثل ناقلات التعبير وناقلات الضربة القاضية / خروج المغلوب. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام التثقيب الكهربائي في الرحم لإدخال ناقلات البلازميد في VZ لمناطق الدماغ المختلفة بخلاف VZ القشرية ، والتي تمكننا من مراقبة هجرة أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا العصبية المثبطة ، وأسلاف oligodendrocyte من الأبراج العقدية34،35،36 والخلايا العصبية الهرمية الحصين37.

في دراسات الفاصل الزمني ، يمكن تقييم آثار تجارب اكتساب الوظيفة وفقدان الوظيفة على سلوك الخلية باستخدام برنامج TrackMate و MTrackJ. تشارك العديد من الجينات ، بما في ذلك تلك المسؤولة عن اضطرابات النمو العصبي والإعاقات الذهنية ، في هجرة الخلايا العصبية. يمكن أن تكشف دراسات الفاصل الزمني بشكل مباشر كيف تنظم هذه الجينات سلوك الخلية. بالمقارنة مع هجرة الخلايا العصبية ، فإن الآليات الجزيئية لهجرة الخلايا الدبقية ليست مفهومة جيدا. قد تكشف هذه الطريقة ليس فقط عن التطور الطبيعي للخلايا الدبقية ، ولكن أيضا العوامل الوراثية والبيئية التي يمكن أن تؤثر على تطور الخلايا الدبقية وعلاقتها بالمرض العقلي.

الحد من هذه الطريقة هو أنها تعتمد حتما على طريقة زراعة الشرائح في المختبر . ومن المثير للاهتمام أن الخلايا العصبية المهاجرة لا تفقد الإشارات الاتجاهية للهجرة نحو سطح الدماغ ، حتى في الشرائح المزروعة في المختبر. ومع ذلك ، يجب على المحققين توخي الحذر بشأن القطع الأثرية. يتم إرفاق الخلايا القريبة من السطح بالمرشح ، وتتشوه حواف الشرائح بسهولة. يجب استبعاد هذه الخلايا من التحليل. يجب النظر في تجارب التحكم إن أمكن. من المهم ملاحظة أن شرائح الدماغ تلخص التطور الطبيعي في غضون 24 ساعة تقريبا. لذلك ، يجب تحديد توقيت تحضير الشريحة من التثقيب الكهربائي بحيث تحدث الأحداث المراد تحليلها في هذه النافذة الزمنية. لمراقبة الانتقال متعدد الأقطاب ثنائي القطب ، يجب إعداد شرائح 2 أيام بعد التثقيب الكهربائي. لتحليل الهجرة في وضع الحركة ، بعد 3 أيام مناسب. تعد مراقبة الهجرة الموجهة بالأوعية الدموية مهمة أكثر صعوبة من التجارب الأخرى. تتحلل الخلايا البطانية بسهولة في شرائح دون تدفق الدم. لتقليل تدهور الأوعية الدموية ، يجب تحضير الشرائح في أسرع وقت ممكن والحفاظ عليها في وسط يحتوي على 20٪ مصل و 40٪ O2 غاز. قد تعزز التجارب التكميلية الأخرى ، مثل التحليلات النسيجية للأدمغة الثابتة أو التصوير الحي في الجسم الحي باستخدام المجهر ثنائي الفوتون ، الملاحظات الموجودة في تحليلات الفاصل الزمني للشرائح.

باختصار ، هذه الطريقة هي الخيار الوحيد لمراقبة سلوك الخلية لمدة 24 ساعة. مع تطور ناقلات البلازميد الجديدة ، سيتوسع نطاق تطبيقات هذه الطريقة في المستقبل.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

مروج Tα1 هو هدية من P. Barker و F.D. ميلر. مروج Dcx هو هدية من Q. Lu. كان hGFAP-Cre هدية من ألبي ميسينج. تم توفير نظام ناقل PiggyBac transposon من قبل معهد سانجر. تم توفير الفئران Flt1-DsRed بواسطة M. Ema (جامعة شيغا). تم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI (رقم المنحة JP21K07309 إلى H. Tabata ، JP20H05688 و JP22K19365 إلى K. Nakajima) ومؤسسة Takeda للعلوم ، صندوق Keio Gijuku Fukuzawa التذكاري للنهوض بالتعليم والبحث ، صناديق Keio Gijuku للتطوير الأكاديمي إلى K. Nakajima.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة أنبوب الشفاطدروموند2-040-000
أتيباميزول (5 مجم / مل)ميجيميباتيا
أوتوككليببيكتون ديكنسون4276309 مم
B27 مكملجيبكو17504-044
بوتورفانول (5 مجم / مل)ميجيفيتورفال
إدراج ثقافة الخلاياميليبورPICM ORG 50
مجهر متحد البؤرنيكونA1RHD25مجهزة بعدسة لمسافات عمل طويلة (S Plan Fluor ELWD 20XC)
الثقافة CryomoldTissue-Tek4566
TokkenTK-NBCMPجهازثقافة
NEPA GeneNEPA21
Fast GreenSigma-AldrichF7258
خلاط الغازTokkenTK-MIGM01-02
طبق القاعدة الزجاجيةIwaki3910-035قطر القاعدة الزجاجية 27 مم
الشعيرات الدموية الزجاجيةNarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS (-)Wako084-08345
وحدة السخانTokkenTK-0003HU20مصنوع حسب الطلب ، بما في ذلك غطاء المحرك والسخان
hGFAP-CreAddgene# 40591هدية من Albee Messing
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 ملم)Gibco25030
حرارة انصهار منخفضة agaroseLonza50100
Medetomidine (1 مجم / مل)MeijiMedetomin
حاقن دقيقNarishigeIM-300
Midazolam (5 مجم / مل)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal mediumGibco21103-049
pCAG-hyPBaseتم إدخال hyPBase cDNA من pCMV-hyPBase (هدية من معهد سانجر) في اتجاه مجرى مروج CAG ل pCAGGS (هدية من J. Miyazaki).
pDcx-Dreتم تبادل مروج Dcx من Dcx4kbEGFP70 (هدية من Q. Lu) مع مروج CAG ل pCAG-NLS-HA-Dre34 (هدية من Pawel Pelczar ، Addgene # 51272).
بنسلين + ستربتومايسينجيبكو15140122
طقم تنقية البلازميدInvitrogenPureLink HiPure البلازميد midiprep kit (K210005)
CAG-LNL كاسيت من pCALNL-DsRed (هدية من Connie Cepko ، Addgene # 13769) ، و TurboRFP cDNA (Evrogen ، FP232) تم إدخالها في موقع الاستنساخ ل pPB-CAG.EBNXN (هدية من معهد سانجر).
pPB-CAG-rDIO-EGFPتم إدخال التسلسل الذي يحتوي على مواقع rox الاصطناعية ، كاسيت DIO الاصطناعي ، و EGFP cDNA من pEGFP-N1 (Clontech ، U55762) في الاتجاه العكسي & nbsp ؛ في موقع الاستنساخ ل pPB-CAG.EBNXN (هدية من معهد سانجر). يتم توفير التسلسل في الملف التكميلي.
مجتذبNarishigePN-31
StackRedمكون إضافي ل ImageJhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
إبرة خياطةNazmeC-24-521-R رقم 11/2 دائرة ، طول 14 مم
خياطة الخيطNazmeC-23-B2الحرير ، مقاس 5-0
فئران ICR الحامل (النوع البري)اليابان SLCICR الماوس
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
قطب كهربائي من نوع الملقطBEX أو NEPA GeneCUY650P5 
T & alpha; 1-EGFPEGFP (cDNA) من pEGFP-N1 (Clontech, U55762) تم إدخاله في اتجاه مجرى T & alpha; 1 مروج في البلازميد 253 (هدية من P. Barker و F.D.Miller)
الميكروتوم الاهتزازيLeica أو Zeissالاهتزازية الشفرة الدقيقة VT1000S أو Hyrax V50.
غرفة مخصص درجة pPB-CAG-LNL-RFP

المراجع

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
  2. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  3. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. P Natl Acad Sci USA. 101 (9), 3196-3201 (2004).
  4. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  5. Tabata, H., et al. Erratic and blood vessel-guided migration of astrocyte progenitors in the cerebral cortex. Nat Commun. 13 (1), 6571(2022).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar Migration: The third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  7. Tabata, H., Kanatani, S., Nakajima, K. Differences of migratory behavior between direct progeny of apical progenitors and basal progenitors in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (9), 2092-2105 (2009).
  8. Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145 (1), 61-83 (1972).
  9. Sekine, K., Honda, T., Kawauchi, T., Kubo, K., Nakajima, K. The outermost region of the developing cortical plate is crucial for both the switch of the radial migration mode and the Dab1-dependent "inside-out" lamination in the neocortex. J Neurosci. 31 (25), 9426-9439 (2011).
  10. Shin, M., et al. Both excitatory and inhibitory neurons transiently form clusters at the outermost region of the developing mammalian cerebral neocortex. J Comp Neurol. 527 (10), 1577-1597 (2019).
  11. Sekine, K., et al. Reelin controls neuronal positioning by promoting cell-matrix adhesion via inside-out activation of integrin α5β1. Neuron. 76 (2), 353-369 (2012).
  12. Morimoto, K., Tabata, H., Takahashi, R., Nakajima, K. Interactions between neural cells and blood vessels in central nervous system development. BioEssays. 230091, (2023).
  13. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Med Mol Morphol. 49 (2), 63-75 (2016).
  14. Ishii, K., Kubo, K., Nakajima, K. Reelin and neuropsychiatric disorders. Front Cell Neurosci. 10, 229(2016).
  15. Bosworth, A. P., Allen, N. J. The diverse actions of astrocytes during synaptic development. Curr Opin Neurobiol. 47, 38-43 (2017).
  16. Tabata, H. Crosstalk between blood vessels and glia during the central nervous system development. Life. 12 (11), 1761(2022).
  17. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. J Vis Exp. (125), e55886(2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient Gene Transfer into the Embryonic Mouse Brain Using in Vivo Electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Fukuchi-Shimogori, T. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  22. Matsumoto, K., et al. Study of normal and pathological blood vessel morphogenesis in Flt1-tdsRed BAC Tg mice. Genesis. 50 (7), 561-571 (2012).
  23. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  24. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  25. Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  26. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Gloster, A., et al. The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growth and regeneration in transgenic mice. J Neurosci. 14 (12), 7319-7330 (1994).
  28. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
  29. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. P Natl Acad Sci USA. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Meth. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J Neurosci Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
  32. Sauer, B. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32 (20), 6086-6095 (2004).
  33. Hermann, M., et al. Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis. Nucleic Acids Res. 42 (6), 3894-3907 (2014).
  34. Kanatani, S., et al. The COUP-TFII/Neuropilin-2 is a molecular switch steering diencephalon-derived GABAergic neurons in the developing mouse brain. P Natl Acad Sci USA. 112 (36), E4985-E4994 (2015).
  35. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  36. Kanatani, S., Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. COUP-TFII is preferentially expressed in the caudal ganglionic eminence and is involved in the caudal migratory stream. J Neurosci. 28 (50), 13582-13591 (2008).
  37. Kitazawa, A., et al. Hippocampal pyramidal neurons switch from a multipolar migration mode to a novel "climbing" migration mode during development. J Neurosci. 34 (4), 1115-1126 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة