تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا محسنا للحقن المجهري للأجنة ، وهي خطوة حاسمة لإنشاء الذباب المعدل وراثيا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد التحوير الوراثي في ذبابة الفاكهة نهجا أساسيا لدراسة وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي. الحقن المجهري للأجنة هو خطوة حاسمة لبناء الذباب المعدل وراثيا. يتطلب الحقن المجهري بعض أنواع المعدات ، بما في ذلك حاقن دقيق ، ومناور دقيق ، ومجهر مقلوب ، ومجهر ستيريو. البلازميدات المعزولة بمجموعة البلازميد المصغرة مؤهلة للحقن المجهري. تخضع الأجنة في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك ، للحقن المجهري. مصفاة الخلية تخفف من عملية إزالة الأجنة. يجب تحديد الوقت الأمثل لنزع الأجنة وتجفيفها تجريبيا. لزيادة كفاءة الحقن المجهري للأجنة ، يجب أن تكون الإبر التي أعدها مجتذب مشطوفة بواسطة مطحنة إبرة. في عملية طحن الإبر ، نستخدم مضخة هواء القدم مع مقياس ضغط لتجنب التأثير الشعري لطرف الإبرة. نقوم بشكل روتيني بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد ونحصل على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات. تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا مفصلا للحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة.
المقدمة
ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster قابلة للغاية للتلاعب الجيني والتحليل الجيني. يستخدم ذباب الفاكهة المعدل وراثيا على نطاق واسع في البحوث البيولوجية. منذ أن تم تطويره في أوائل ثمانينيات القرن العشرين ، كان التحوير بوساطة P-element transposon لا غنى عنه لأبحاث ذبابة الفاكهة 1. في بعض السيناريوهات ، تم استخدام ترانسبوزونات أخرى ، مثل piggyBac و Minos في الجينات المحورة في ذبابة الفاكهة أيضا2. يتم إدخال جينات التحوير عبر transposon بشكل عشوائي في جينوم ذبابة الفاكهة ، وقد تختلف مستويات التعبير عن الجينات المحورة في مواقع جينومية مختلفة بسبب تأثيرات الموضع وبالتالي لا يمكن مقارنتها2. تم التغلب على هذه العيوب من خلال الجينات المحورة 3 الخاصة بالموقع بوساطة phiC31. يشفر جين phiC31 البكتيري إنزيم التكامل الذي يتوسط إعادة التركيب الخاصة بالتسلسل بين موقعي attB و attP في ذبابة الفاكهة3. تم تمييز العديد من مواقع إرساء attP وهي متوفرة في مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة 3،4،5،6،7،8،9.
تم استخدام نظام التحوير phiC31 لذبابة الفاكهة على نطاق واسع من قبل مجتمع الذباب. من بين مواقع الالتحام attP ، عادة ما تكون attP18 على الكروموسوم X ، و attP40 على الكروموسوم الثاني ، و attP2 على الكروموسوم الثالث هي المواقع المفضلة لتكامل الجينات المحورة على كل كروموسوم لأن جينات التحوير في المواقع الثلاثة تظهر مستويات عالية من التعبير المستحث مع وجود مستويات منخفضة من التعبير القاعدي5. ومع ذلك ، وجد فان دير غراف وزملاؤه مؤخرا أن موقع attP40 ، القريب من موضع جين Msp300 ، والجينات المحورة المدمجة في attP40 تسبب تجمعا نوويا لعضلات اليرقات في ذبابة الفاكهة10. في دراسة حديثة أخرى ، وجد دوان وزملاؤه أن كروموسوم attP40 متماثل الزيجوت يعطل التنظيم الكبيبي الطبيعي لفئة الخلايا العصبية لمستقبلات حاسة الشم Or47b في ذبابة الفاكهة11. تشير هذه النتائج إلى أنه يجب تضمين ضوابط صارمة عند تصميم التجارب وتفسير البيانات.
ذبابة الفاكهة هي كائن نموذجي مثالي للاستجواب في الجسم الحي لوظيفة الجينات بسبب دورة حياتها القصيرة وتكلفتها المنخفضة وسهولة صيانتها. يعتمد الفحص الجيني على مستوى الجينوم على بناء مكتبات معدلة وراثيا على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة12،13،14،15. لقد أنشأنا سابقا 5551 بنية UAS-cDNA / ORF بناء على نظام تسلسل تنشيط GAL4 / المنبع الثنائي (GAL4 / UAS) ، والذي يغطي 83٪ من جينات ذبابة الفاكهة المحفوظة في البشر في المجموعة الذهبية لمركز موارد جينوم ذبابة الفاكهة (DGRC)16. يمكن استخدام بلازميدات UAS-cDNA / ORF لإنشاء مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا في ذبابة الفاكهة. يمكن لتقنية الحقن المجهري للأجنة الفعالة تسريع إنشاء مكتبات الذباب المعدلة وراثيا.
بالنسبة للحقن المجهري للجنين ، عادة ما يتم كسر طرف الإبرة ضد غطاء17. وبالتالي ، غالبا ما تصبح الإبر مسدودة أو تسبب تسرب كميات كبيرة من السيتوبلازم ، وعندما تنشأ هذه المشكلات ، يجب استخدام إبر جديدة. على الرغم من أن إبر الميلا يمكن أن تعزز كفاءة الحقن المجهري ، إلا أن محلول الطحن يدخل الطرف المشطوف أثناء عملية الطحن. لا يتبخر محلول الطحن في الطرف المشطوف بسرعة بشكل طبيعي ؛ لذلك ، لا يمكن استخدام الإبر للحقن المجهري مباشرة بعد الميلات. هذه العوامل تقلل من كفاءة إجراءات الحقن المجهري للأجنة. هنا ، باستخدام الجينات المحورة الخاصة بالموقع بوساطة phiC31 في ذبابة الفاكهة كمثال ، نقدم بروتوكولا للحقن المجهري للأجنة لجين التحوير في ذبابة الفاكهة. لمنع محلول الطحن من دخول الإبرة ، نستخدم مضخة هواء لممارسة ضغط الهواء داخل الإبرة ، وبالتالي منع محلول الطحن من دخول الطرف المشطوف. الإبر المشطوفة جاهزة لتحميل العينات والحقن المجهري مباشرة بعد الميلات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد البلازميدات
- اعزل البلازميدات من 4 مل من المزارع البكتيرية الليلية باستخدام مجموعة البلازميد المصغرة. Elute مع 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشفط.
ملاحظة: ليس من الضروري عزل البلازميدات باستخدام مجموعة تحضير البلازميد ميدي. يمكن لمجموعة miniprep البلازميد أن تلبي تماما المتطلبات التجريبية للحقن المجهري للجنين. في هذا البروتوكول ، تحتوي بلازميدات UAS-cDNA / ORF المحضرة على عشر نسخ من UAS ، ومحفز Hsp70 الأدنى ، وموقع attB ، وجين أبيض صغير ، وجين مهم. - تحديد تركيز الحمض النووي للبلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينه في الفريزر -80 درجة مئوية.
ملاحظة: تركيز البلازميد ليس حاسما لنجاح الحقن المجهري للجنين، حيث أن تركيزات البلازميد التي تتراوح من 20 نانوغرام/ميكرولتر إلى 1683 نانوغرام/ميكرولتر تعمل بشكل جيد للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة (الجدول التكميلي 1). - قبل الحقن المجهري مباشرة ، قم بإذابة البلازميدات وأجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 5 دقائق.
- نقل 10 ميكرولتر من كل بلازميد من الطبقة العليا من السائل إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
2. سحب الإبر
- قم بتشغيل مجتذب الإبرة بالإعدادات المحددة (الحرارة: 500 ، السحب: 50 ، Vel: 60 ، التأخير: 90 ، الضغط: 200 ، اختبار المنحدر: 510).
- أدخل شعرية زجاجية من البورسليكات (القطر الخارجي 1.0 مم ، القطر الداخلي 0.75 مم ، الطول 10 سم) في مجتذب الإبرة وأغلق الغطاء.
- اضغط على زر السحب . كل شعرية زجاجية تصنع إبرتين.
3. إبر الطحن (الشكل 1)
- استخدم مطحنة إبرة مثبتة بلوحة كاشطة مناسبة (لأحجام طرف 0.7-2.0 ميكرومتر) لمطحنة الإبرة.
- بلل قطعة القماش (سلك مرجعي) بمحلول طحن (100 مل من الماء المقطر مع 0.9 جم من كلوريد الصوديوم ، 1 مل من عامل الترطيب) وثبت قطعة القماش.
- قم بتشغيل مطحنة الإبرة وحافظ على دوران لوحة الطحن.
- قم بتوصيل إبرة بمضخة هواء القدم بمقياس ضغط عبر أنبوب شعري من السيليكون ، ثم قم بتركيب الإبرة على حامل إبرة لمطحنة الإبرة. اضبط زاوية الإبرة بالنسبة للوحة الطحن إلى 35 درجة (الشكل 1 أ ، ب).
- اضبط موضع طرف الإبرة فوق سطح لوحة الطحن مباشرة باستخدام مقبض تحكم خشن تحت المجهر (الشكل 1C).
ملاحظة: تحتوي الإبر المسحوبة التي تم الحصول عليها في القسم 2 على تفتق 6-8 مم وطرف أقل من 1 ميكرومتر (الشكل 1 د) ، كما هو موضح في دليل المستخدم الخاص بالساحب. - حافظ على الضغط الداخلي للإبرة عند 40 رطل / بوصة مربعة باستخدام مضخة هواء القدم. اضبط موضع طرف الإبرة باستخدام مقبض تحكم دقيق تحت المجهر ، واجعل طرف الإبرة يلمس لوحة الطحن.
- طحن لمدة 3-5 ثوان. عندما تخرج فقاعات هواء صغيرة من طرف الإبرة ، قم بتفريغ الإبرة (الشكل 1E).
ملاحظة: في عملية الطحن ، يمنع استخدام مضخة الهواء محلول الطحن من السحب. - ضع الإبر الأرضية في علبة تخزين.
ملاحظة: استخدم الإبر المطحونة حديثا قدر الإمكان ، على الرغم من أنه يمكن الاحتفاظ بالإبر المطحونة في علبة تخزين لبضعة أسابيع على الأقل قبل الحقن المجهري.
4. تحضير الماصات لتحميل البلازميدات
- قم بتسخين ماصة سعة 200 ميكرولتر مع اللهب الخارجي لموقد الكحول.
- بمجرد أن يبدأ في الذوبان ، قم بتمديد الماصة.
- اقطع الطرف المختوم للماصة الممتدة بالمقص ، ثم تكون الماصة الممتدة جاهزة لتحميل الحمض النووي في إبرة أرضية.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، تتوفر نصائح طويلة ودقيقة للغاية لملء الإبر المطحونة تجاريا. - ضع هذه الماصات في صندوق بلاستيكي معقم.
5. جمع الأجنة
- اجمع الذباب (vas-phiC31 ؛ + ؛ attP2) الذي يعبر عن phiC31 integrase ويحمل موقع الالتحام attP2 بعد 3 أيام من فقسه من 50 قارورة ونقله إلى قفص (φ 90 مم × 150 مم). أضف القليل من معجون الخميرة الطازج إلى وسط كل طبق أجار عنب18.
- إعداد 2-4 أقفاص من الذباب. احتفظ بالأقفاص والأطباق عند 25 درجة مئوية وقم بتغيير الأطباق كل يوم لمدة 2-4 أيام.
ملاحظة: جمعت هذه الدراسة بين جين الأسهر phiC31 (Stock # 36313 ، مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة ) على الكروموسوم الأول وجين التحوير attP2 (Stock # 36313 ، مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة ) على الكروموسوم الثالث. يتم استخدام المخزون الناتج (vas-phiC31 ؛ + ؛ attP2) في هذا البروتوكول. يجب تحضير معجون الخميرة يوميا ، ويجب إطعام معجون الخميرة الطازج للذباب. يجب تنظيف الأقفاص المستبدلة وتجفيفها للتخلص من الأجنة المتبقية في الأقفاص. - في يوم الحقن المجهري ، قم بتغيير الأقفاص والأطباق في الصباح. ثم قم بتغيير اللوحات كل 30 دقيقة واجمع الأجنة من هذه اللوحات. قم بتغيير جميع الأقفاص والأطباق في درجة حرارة الغرفة (RT) وبعد ذلك احتفظ بالأقفاص والأطباق عند 25 درجة مئوية.
ملاحظة: تفضل بعض البروتوكولات احتضان الأقفاص والأطباق عند 18 درجة مئوية لوضع البيض. يعتمد ذلك على عدد الأجنة التي يحتاجها المرء للحقن المجهري.
6. إزالة الأجنة
- تحضير 30٪ مبيض عن طريق خلط 60 مل من المبيض (يحتوي على محتوى الكلور النشط من 34-46 جم / لتر) و 140 مل من الماء المقطر المزدوج.
- قم بإزالة الذباب المتبقي على ألواح أجار عصير العنب بفرشاة أو ملقط ، وشطف الأجنة في مصفاة خلية بالماء المقطر المزدوج.
- جفف مصفاة الخلية التي تحتوي على الأجنة بالمناديل الورقية.
- ضعه في طبق بتري يحتوي على 30٪ مبيض ، وقم بتدوير مصفاة الخلية باليد أو رج أفقي لمدة 1.5 دقيقة عند 60 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: الشطف هو خطوة حاسمة. إذا لم يكن وقت الشطف طويلا بما فيه الكفاية ، فلن تنفجر قشرة الجنين تماما. إذا كان وقت الشطف طويلا جدا ، فسوف يتسبب ذلك في أن يصبح الجنين طريا وينكسر بسهولة. يجب غمر مصفاة الخلية بالكامل في المبيض بنسبة 30٪. ارتد زوجا من القفازات المطاطية ومعطف المختبر لتجنب الإصابات الناجمة عن التبييض. - شطف الأجنة لمدة 2 دقيقة بالماء المقطر المزدوج المخزن في زجاجة غسيل بلاستيكية في المختبر لإزالة المبيض المتبقي. اختر الأجنة العائمة للتشكيلة.
7. اصطفاف الأجنة
- قطع أجار عصير العنب الصلب إلى شرائح طويلة باستخدام شفرة.
ملاحظة: استخدم عصير العنب الأرجواني لتسهيل اصطفاف الأجنة البيضاء. - نقل الأجنة على شريط طويل باستخدام فرشاة الرسم.
- اصطف حوالي 60 جنينا بإبرة تشريح على طول حافة شريط طويل مع مواجهة مؤخرتها للخارج من الشريط. اصطف حوالي 60 جنينا في غضون 5 دقائق.
ملاحظة: الميكروبايل هو نتوء مخروطي الشكل في القطب الأمامي للجنين ، يدخل من خلاله المنوي لتخصيب البويضة (الشكل 2 أ). لذلك ، بناء على نتوء مخروطي الشكل في القطب الأمامي للجنين ، من السهل تحديد الجزء الخلفي من الجنين المنزوع الأيوان. - ضع شريطا على الوجهين مقاس 18 مم بالطول على طول حافة غطاء الغطاء (18 مم × 18 مم) وقم بإزالة دعامة الورق. اضغطي برفق على غطاء الأجنة المحاذاة. تأكد من لصق الأجنة على مركز الشريط.
8. تجفيف الأجنة
- ضع غطاء الغطاء مع الأجنة المصطفة في صندوق يحتوي على مجفف. يختلف وقت التجفيف حسب درجة الحرارة والرطوبة.
ملاحظة: وقت التجفيف أمر بالغ الأهمية للحقن المجهري ويحتاج إلى تحديد تجريبي. عادة ما يكون وقت التجفيف 9-10 دقائق في الصيف و 17-18 دقيقة في الشتاء. - تغطية الأجنة بزيت الهالوكربون.
ملاحظة: لا تسقط الكثير من الزيت على الأجنة ، لأن الزيت الزائد قد يفيض على المادة اللاصقة. نسبة حجم زيت الهالو كربون 700 وزيت الهالو كربون 27 هي 1: 3.
9. حقن الأجنة المجهري
- قم بتحميل 2 ميكرولتر من الحمض النووي في الإبرة باستخدام الماصة الممدودة. تأكد من عدم وجود فقاعات في الإبرة. ضع الإبرة في حامل الإبرة الخاص ب micromanipulator.
- ضع الأجنة المحاذية المغطاة بزيت الهالو كربون تحت مجهر مقلوب. تأكد من أن الأطراف الخلفية للأجنة تواجه الإبرة.
- استخدم المناور الدقيق لتقريب الإبرة من الأجنة. امسح الإبرة. تأكد من أن قطرة السائل الخارجة من الإبرة مرئية. بدءا من ضغط حقن 300 hPa وضغط توازن 20 hPa ، اضبط ضغط الحقن وضغط التوازن لضمان الحجم الأمثل لقطرة السائل.
- استخدم المناور الدقيق لإدخال الإبرة في الأطراف الخلفية للأجنة ، واستخدم التحكم في القدم المتصل بالحاقن الدقيق لحقن الحمض النووي (الشكل 2). إذا كانت هالة صغيرة مرئية ، يتم حقن الحمض النووي بنجاح في الجنين.
ملاحظة: حدد الأجنة متعددة النوى للحقن واقتل الأجنة الأكبر سنا باستخدام الزر "نظيف". إذا تسربت كمية كبيرة من السيتوبلازم بعد الحقن ، فإن الأجنة تكون غير جافة. إذا تسربت كمية صغيرة فقط من السيتوبلازم أو لم تتسرب أي كمية منه بعد الحقن ، فإن الحقن تعتبر ناجحة. إذا تسرب أكثر من ثلث الأجنة من السيتوبلازم بعد الحقن ، فقم بتمديد وقت التجفيف بمقدار 1-2 دقيقة. إذا كان أكثر من ثلث الأجنة جافا بشكل مفرط ، فقم بتقصير وقت التجفيف بمقدار 1-2 دقيقة. - قم بإزالة الإبرة من الجنين. حرك الإبرة إلى الطرف الخلفي للجنين التالي. كرر الخطوات المذكورة أعلاه.
- ضع الأجنة المحقونة في صفيحة أجار. ضع الطبق في غرفة على حرارة 18-20 درجة مئوية. في اليوم التالي ، نقل لوحة إلى حاضنة عند درجة حرارة 25 °Cوالرطوبة من 50 ٪ -60 ٪ ، واحتضان لمدة 1 يوم.
ملاحظة: بعد الحقن ، احتفظ بالأجنة عند درجة حرارة 18-20 درجة مئوية لإبطاء نموها ، وتسهيل دمج الحمض النووي البلازميد في جينوم ذبابة الفاكهة ، وزيادة معدل بقاء الأجنة المحقونة.
10. جمع اليرقات
- استخدم إبرة تشريح لكشط وفك الطعام في قنينة. زود الطعام ببضع قطرات من الماء المقطر.
ملاحظة: اترك الماء المقطر يمتص في الطعام لمنع اليرقات من الغرق. - اخراج لوحات من الحاضنة.
- جمع اليرقات المفرغة مع فرشاة الرسم تحت المجهر ستيريو ونقلها إلى القارورة.
- ضع القارورة في حاضنة عند درجة حرارة 25 درجة مئويةورطوبة50٪ -60٪.
11. الحصول على الذباب المعدل وراثيا
- اجمع الذباب المفقس بعد تحضين القارورة عند 25 درجة مئويةلمدة 10 أيام.
- اعبر ذبابة ذكر واحدة إلى ثلاث ذباب أنثى عذراء من موازنات TM2 / TM6C Sb1 Tb1 ، واعبر ذبابة أنثى واحدة إلى ثلاثة ذباب ذكور من موازنات TM2 / TM6C Sb1 Tb1 .
- ضع الصلبان في حاضنة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية ورطوبة 50٪ -60٪.
- فحص ذرية الذباب بعيون برتقالية. هذه هي الذباب المعدل وراثيا (الشكل 3A-C).
ملاحظة: الذباب الذي يحمل نسخة من جين التحوير في موقع الالتحام attP2 له عيون برتقالية. - اعبر ذبابة ذكر برتقالية العينين إلى ثلاث ذباب أنثى عذراء من موازنات TM2 / TM6C Sb1 Tb1 لإنشاء مخزون.
ملاحظة: يجب إعداد أكثر من جيل واحد من الصلبان من أجل شطب جين التحوير phiC31 على الكروموسوم الأول.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
طرف إبرة الحقن مشطوف بمطحنة إبرة (الشكل 1). يمكن للمرء شطبة 50-60 إبرة في ساعة واحدة. يتم حقن الحمض النووي (DNA) في الجزء الخلفي من الجنين في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك (الشكل 2 أ). يمكن تحديد موقع الجزء الخلفي من الجنين بسهولة بناء على الميكروبايل في مقدمة الجنين (الشكل 2 أ). لا يمكن استخدام الأجنة في مراحل الأرومة الخلوية والمعدة للحقن ، حيث أن كل نواة محاطة بغشاء خلوي ف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، نقدم بروتوكولا للحقن المجهري للأجنة لالجينات المحورة في ذبابة الفاكهة. بالنسبة للجينات المحورة الخاصة بالموقع بوساطة phiC31 ، قمنا بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد وحصلنا على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات (الجدول التكميلي 2). في تجربتنا ، يكفي الحمض النووي البلازميد المعزول بواسطة مجموعة مصغرة من البلازميد للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة. وقد لا يكون لتركيزات الحمض النووي البلازميد التي تتراوح بين 20 نانوغرام/ميكرولتر إلى 1683 نانوغرام/ميكرولتر أي تأثير وا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم العمل من قبل صندوق البحث العلمي للمواهب رفيعة المستوى ، جامعة جنوب الصين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 100 مو ؛ m مصفاة الخلية | NEST | 258367 | |
| 3M لاصق على الوجهين | 3M | 415 | |
| زجاج البورسليكات | SUTTER | B100-75-10 | |
| لوحة جلخ الماس | SUTTER | 104E | |
| مشتعل / براون مجتذب ماصة دقيقة | SUTTER | P-1000 | |
| هواء القدم مع مقياس الضغط | Shenfeng | SF8705D | |
| زيت الهالوكربون 27 | سيجما | H8773 | |
| زيت الهالوكربون 700 | سيجما | H8898 | |
| مجهر مقلوب | نيكون | كليس Ts2R | |
| مضخة الحقن الدقيق | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | نظارات غطاء المجهر BV-10 | |
| (18 مم × 18 مم) | CITOLAS | 10211818C | |
| (25 مم × 75 مم) | بتري CITOLAS | 188105W | |
| (90 مم × 15 مم) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep | Qiagen | 27106 | |
| Stereo مجهر | نيكون | SMZ745 |
المراجع
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
- Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
- Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), Bethesda. 1095-1102 (2012).
- Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
- Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598(2022).
- Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), Bethesda. 022(2023).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
- Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
- Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
