مقالة منهجية

الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة

4.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66679

⸱

يونيو 7, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 4Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا محسنا للحقن المجهري للأجنة ، وهي خطوة حاسمة لإنشاء الذباب المعدل وراثيا.

الملخص

يعد التحوير الوراثي في ذبابة الفاكهة نهجا أساسيا لدراسة وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي. الحقن المجهري للأجنة هو خطوة حاسمة لبناء الذباب المعدل وراثيا. يتطلب الحقن المجهري بعض أنواع المعدات ، بما في ذلك حاقن دقيق ، ومناور دقيق ، ومجهر مقلوب ، ومجهر ستيريو. البلازميدات المعزولة بمجموعة البلازميد المصغرة مؤهلة للحقن المجهري. تخضع الأجنة في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك ، للحقن المجهري. مصفاة الخلية تخفف من عملية إزالة الأجنة. يجب تحديد الوقت الأمثل لنزع الأجنة وتجفيفها تجريبيا. لزيادة كفاءة الحقن المجهري للأجنة ، يجب أن تكون الإبر التي أعدها مجتذب مشطوفة بواسطة مطحنة إبرة. في عملية طحن الإبر ، نستخدم مضخة هواء القدم مع مقياس ضغط لتجنب التأثير الشعري لطرف الإبرة. نقوم بشكل روتيني بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد ونحصل على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات. تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا مفصلا للحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة.

المقدمة

ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster قابلة للغاية للتلاعب الجيني والتحليل الجيني. يستخدم ذباب الفاكهة المعدل وراثيا على نطاق واسع في البحوث البيولوجية. منذ أن تم تطويره في أوائل ثمانينيات القرن العشرين ، كان التحوير بوساطة P-element transposon لا غنى عنه لأبحاث ذبابة الفاكهة 1. في بعض السيناريوهات ، تم استخدام ترانسبوزونات أخرى ، مثل piggyBac و Minos في الجينات المحورة في ذبابة الفاكهة أيضا2. يتم إدخال جينات التحوير عبر transposon بشكل عشوائي في جينوم ذبابة الفاكهة ، وقد تختلف مستويات التعبير عن الجينات المحورة في مواقع جينومية مختلفة بسبب تأثيرات الموضع وبالتالي لا يمكن مقارنتها2. تم التغلب على هذه العيوب من خلال الجينات المحورة 3 الخاصة بالموقع بوساطة phiC31. يشفر جين phiC31 البكتيري إنزيم التكامل الذي يتوسط إعادة التركيب الخاصة بالتسلسل بين موقعي attB و attP في ذبابة الفاكهة3. تم تمييز العديد من مواقع إرساء attP وهي متوفرة في مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة 3،4،5،6،7،8،9.

تم استخدام نظام التحوير phiC31 لذبابة الفاكهة على نطاق واسع من قبل مجتمع الذباب. من بين مواقع الالتحام attP ، عادة ما تكون attP18 على الكروموسوم X ، و attP40 على الكروموسوم الثاني ، و attP2 على الكروموسوم الثالث هي المواقع المفضلة لتكامل الجينات المحورة على كل كروموسوم لأن جينات التحوير في المواقع الثلاثة تظهر مستويات عالية من التعبير المستحث مع وجود مستويات منخفضة من التعبير القاعدي5. ومع ذلك ، وجد فان دير غراف وزملاؤه مؤخرا أن موقع attP40 ، القريب من موضع جين Msp300 ، والجينات المحورة المدمجة في attP40 تسبب تجمعا نوويا لعضلات اليرقات في ذبابة الفاكهة10. في دراسة حديثة أخرى ، وجد دوان وزملاؤه أن كروموسوم attP40 متماثل الزيجوت يعطل التنظيم الكبيبي الطبيعي لفئة الخلايا العصبية لمستقبلات حاسة الشم Or47b في ذبابة الفاكهة11. تشير هذه النتائج إلى أنه يجب تضمين ضوابط صارمة عند تصميم التجارب وتفسير البيانات.

ذبابة الفاكهة هي كائن نموذجي مثالي للاستجواب في الجسم الحي لوظيفة الجينات بسبب دورة حياتها القصيرة وتكلفتها المنخفضة وسهولة صيانتها. يعتمد الفحص الجيني على مستوى الجينوم على بناء مكتبات معدلة وراثيا على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة12،13،14،15. لقد أنشأنا سابقا 5551 بنية UAS-cDNA / ORF بناء على نظام تسلسل تنشيط GAL4 / المنبع الثنائي (GAL4 / UAS) ، والذي يغطي 83٪ من جينات ذبابة الفاكهة المحفوظة في البشر في المجموعة الذهبية لمركز موارد جينوم ذبابة الفاكهة (DGRC)16. يمكن استخدام بلازميدات UAS-cDNA / ORF لإنشاء مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا في ذبابة الفاكهة. يمكن لتقنية الحقن المجهري للأجنة الفعالة تسريع إنشاء مكتبات الذباب المعدلة وراثيا.

بالنسبة للحقن المجهري للجنين ، عادة ما يتم كسر طرف الإبرة ضد غطاء17. وبالتالي ، غالبا ما تصبح الإبر مسدودة أو تسبب تسرب كميات كبيرة من السيتوبلازم ، وعندما تنشأ هذه المشكلات ، يجب استخدام إبر جديدة. على الرغم من أن إبر الميلا يمكن أن تعزز كفاءة الحقن المجهري ، إلا أن محلول الطحن يدخل الطرف المشطوف أثناء عملية الطحن. لا يتبخر محلول الطحن في الطرف المشطوف بسرعة بشكل طبيعي ؛ لذلك ، لا يمكن استخدام الإبر للحقن المجهري مباشرة بعد الميلات. هذه العوامل تقلل من كفاءة إجراءات الحقن المجهري للأجنة. هنا ، باستخدام الجينات المحورة الخاصة بالموقع بوساطة phiC31 في ذبابة الفاكهة كمثال ، نقدم بروتوكولا للحقن المجهري للأجنة لجين التحوير في ذبابة الفاكهة. لمنع محلول الطحن من دخول الإبرة ، نستخدم مضخة هواء لممارسة ضغط الهواء داخل الإبرة ، وبالتالي منع محلول الطحن من دخول الطرف المشطوف. الإبر المشطوفة جاهزة لتحميل العينات والحقن المجهري مباشرة بعد الميلات.

البروتوكول

1. إعداد البلازميدات

  1. اعزل البلازميدات من 4 مل من المزارع البكتيرية الليلية باستخدام مجموعة البلازميد المصغرة. Elute مع 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشفط.
    ملاحظة: ليس من الضروري عزل البلازميدات باستخدام مجموعة تحضير البلازميد ميدي. يمكن لمجموعة miniprep البلازميد أن تلبي تماما المتطلبات التجريبية للحقن المجهري للجنين. في هذا البروتوكول ، تحتوي بلازميدات UAS-cDNA / ORF المحضرة على عشر نسخ من UAS ، ومحفز Hsp70 الأدنى ، وموقع attB ، وجين أبيض صغير ، وجين مهم.
  2. تحديد تركيز الحمض النووي للبلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينه في الفريزر -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تركيز البلازميد ليس حاسما لنجاح الحقن المجهري للجنين، حيث أن تركيزات البلازميد التي تتراوح من 20 نانوغرام/ميكرولتر إلى 1683 نانوغرام/ميكرولتر تعمل بشكل جيد للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة (الجدول التكميلي 1).
  3. قبل الحقن المجهري مباشرة ، قم بإذابة البلازميدات وأجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 5 دقائق.
  4. نقل 10 ميكرولتر من كل بلازميد من الطبقة العليا من السائل إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.

2. سحب الإبر

  1. قم بتشغيل مجتذب الإبرة بالإعدادات المحددة (الحرارة: 500 ، السحب: 50 ، Vel: 60 ، التأخير: 90 ، الضغط: 200 ، اختبار المنحدر: 510).
  2. أدخل شعرية زجاجية من البورسليكات (القطر الخارجي 1.0 مم ، القطر الداخلي 0.75 مم ، الطول 10 سم) في مجتذب الإبرة وأغلق الغطاء.
  3. اضغط على زر السحب . كل شعرية زجاجية تصنع إبرتين.

3. إبر الطحن (الشكل 1)

  1. استخدم مطحنة إبرة مثبتة بلوحة كاشطة مناسبة (لأحجام طرف 0.7-2.0 ميكرومتر) لمطحنة الإبرة.
  2. بلل قطعة القماش (سلك مرجعي) بمحلول طحن (100 مل من الماء المقطر مع 0.9 جم من كلوريد الصوديوم ، 1 مل من عامل الترطيب) وثبت قطعة القماش.
  3. قم بتشغيل مطحنة الإبرة وحافظ على دوران لوحة الطحن.
  4. قم بتوصيل إبرة بمضخة هواء القدم بمقياس ضغط عبر أنبوب شعري من السيليكون ، ثم قم بتركيب الإبرة على حامل إبرة لمطحنة الإبرة. اضبط زاوية الإبرة بالنسبة للوحة الطحن إلى 35 درجة (الشكل 1 أ ، ب).
  5. اضبط موضع طرف الإبرة فوق سطح لوحة الطحن مباشرة باستخدام مقبض تحكم خشن تحت المجهر (الشكل 1C).
    ملاحظة: تحتوي الإبر المسحوبة التي تم الحصول عليها في القسم 2 على تفتق 6-8 مم وطرف أقل من 1 ميكرومتر (الشكل 1 د) ، كما هو موضح في دليل المستخدم الخاص بالساحب.
  6. حافظ على الضغط الداخلي للإبرة عند 40 رطل / بوصة مربعة باستخدام مضخة هواء القدم. اضبط موضع طرف الإبرة باستخدام مقبض تحكم دقيق تحت المجهر ، واجعل طرف الإبرة يلمس لوحة الطحن.
  7. طحن لمدة 3-5 ثوان. عندما تخرج فقاعات هواء صغيرة من طرف الإبرة ، قم بتفريغ الإبرة (الشكل 1E).
    ملاحظة: في عملية الطحن ، يمنع استخدام مضخة الهواء محلول الطحن من السحب.
  8. ضع الإبر الأرضية في علبة تخزين.
    ملاحظة: استخدم الإبر المطحونة حديثا قدر الإمكان ، على الرغم من أنه يمكن الاحتفاظ بالإبر المطحونة في علبة تخزين لبضعة أسابيع على الأقل قبل الحقن المجهري.

4. تحضير الماصات لتحميل البلازميدات

  1. قم بتسخين ماصة سعة 200 ميكرولتر مع اللهب الخارجي لموقد الكحول.
  2. بمجرد أن يبدأ في الذوبان ، قم بتمديد الماصة.
  3. اقطع الطرف المختوم للماصة الممتدة بالمقص ، ثم تكون الماصة الممتدة جاهزة لتحميل الحمض النووي في إبرة أرضية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، تتوفر نصائح طويلة ودقيقة للغاية لملء الإبر المطحونة تجاريا.
  4. ضع هذه الماصات في صندوق بلاستيكي معقم.

5. جمع الأجنة

  1. اجمع الذباب (vas-phiC31 ؛ + ؛ attP2) الذي يعبر عن phiC31 integrase ويحمل موقع الالتحام attP2 بعد 3 أيام من فقسه من 50 قارورة ونقله إلى قفص (φ 90 مم × 150 مم). أضف القليل من معجون الخميرة الطازج إلى وسط كل طبق أجار عنب18.
  2. إعداد 2-4 أقفاص من الذباب. احتفظ بالأقفاص والأطباق عند 25 درجة مئوية وقم بتغيير الأطباق كل يوم لمدة 2-4 أيام.
    ملاحظة: جمعت هذه الدراسة بين جين الأسهر phiC31 (Stock # 36313 ، مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة ) على الكروموسوم الأول وجين التحوير attP2 (Stock # 36313 ، مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة ) على الكروموسوم الثالث. يتم استخدام المخزون الناتج (vas-phiC31 ؛ + ؛ attP2) في هذا البروتوكول. يجب تحضير معجون الخميرة يوميا ، ويجب إطعام معجون الخميرة الطازج للذباب. يجب تنظيف الأقفاص المستبدلة وتجفيفها للتخلص من الأجنة المتبقية في الأقفاص.
  3. في يوم الحقن المجهري ، قم بتغيير الأقفاص والأطباق في الصباح. ثم قم بتغيير اللوحات كل 30 دقيقة واجمع الأجنة من هذه اللوحات. قم بتغيير جميع الأقفاص والأطباق في درجة حرارة الغرفة (RT) وبعد ذلك احتفظ بالأقفاص والأطباق عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: تفضل بعض البروتوكولات احتضان الأقفاص والأطباق عند 18 درجة مئوية لوضع البيض. يعتمد ذلك على عدد الأجنة التي يحتاجها المرء للحقن المجهري.

6. إزالة الأجنة

  1. تحضير 30٪ مبيض عن طريق خلط 60 مل من المبيض (يحتوي على محتوى الكلور النشط من 34-46 جم / لتر) و 140 مل من الماء المقطر المزدوج.
  2. قم بإزالة الذباب المتبقي على ألواح أجار عصير العنب بفرشاة أو ملقط ، وشطف الأجنة في مصفاة خلية بالماء المقطر المزدوج.
  3. جفف مصفاة الخلية التي تحتوي على الأجنة بالمناديل الورقية.
  4. ضعه في طبق بتري يحتوي على 30٪ مبيض ، وقم بتدوير مصفاة الخلية باليد أو رج أفقي لمدة 1.5 دقيقة عند 60 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: الشطف هو خطوة حاسمة. إذا لم يكن وقت الشطف طويلا بما فيه الكفاية ، فلن تنفجر قشرة الجنين تماما. إذا كان وقت الشطف طويلا جدا ، فسوف يتسبب ذلك في أن يصبح الجنين طريا وينكسر بسهولة. يجب غمر مصفاة الخلية بالكامل في المبيض بنسبة 30٪. ارتد زوجا من القفازات المطاطية ومعطف المختبر لتجنب الإصابات الناجمة عن التبييض.
  5. شطف الأجنة لمدة 2 دقيقة بالماء المقطر المزدوج المخزن في زجاجة غسيل بلاستيكية في المختبر لإزالة المبيض المتبقي. اختر الأجنة العائمة للتشكيلة.

7. اصطفاف الأجنة

  1. قطع أجار عصير العنب الصلب إلى شرائح طويلة باستخدام شفرة.
    ملاحظة: استخدم عصير العنب الأرجواني لتسهيل اصطفاف الأجنة البيضاء.
  2. نقل الأجنة على شريط طويل باستخدام فرشاة الرسم.
  3. اصطف حوالي 60 جنينا بإبرة تشريح على طول حافة شريط طويل مع مواجهة مؤخرتها للخارج من الشريط. اصطف حوالي 60 جنينا في غضون 5 دقائق.
    ملاحظة: الميكروبايل هو نتوء مخروطي الشكل في القطب الأمامي للجنين ، يدخل من خلاله المنوي لتخصيب البويضة (الشكل 2 أ). لذلك ، بناء على نتوء مخروطي الشكل في القطب الأمامي للجنين ، من السهل تحديد الجزء الخلفي من الجنين المنزوع الأيوان.
  4. ضع شريطا على الوجهين مقاس 18 مم بالطول على طول حافة غطاء الغطاء (18 مم × 18 مم) وقم بإزالة دعامة الورق. اضغطي برفق على غطاء الأجنة المحاذاة. تأكد من لصق الأجنة على مركز الشريط.

8. تجفيف الأجنة

  1. ضع غطاء الغطاء مع الأجنة المصطفة في صندوق يحتوي على مجفف. يختلف وقت التجفيف حسب درجة الحرارة والرطوبة.
    ملاحظة: وقت التجفيف أمر بالغ الأهمية للحقن المجهري ويحتاج إلى تحديد تجريبي. عادة ما يكون وقت التجفيف 9-10 دقائق في الصيف و 17-18 دقيقة في الشتاء.
  2. تغطية الأجنة بزيت الهالوكربون.
    ملاحظة: لا تسقط الكثير من الزيت على الأجنة ، لأن الزيت الزائد قد يفيض على المادة اللاصقة. نسبة حجم زيت الهالو كربون 700 وزيت الهالو كربون 27 هي 1: 3.

9. حقن الأجنة المجهري

  1. قم بتحميل 2 ميكرولتر من الحمض النووي في الإبرة باستخدام الماصة الممدودة. تأكد من عدم وجود فقاعات في الإبرة. ضع الإبرة في حامل الإبرة الخاص ب micromanipulator.
  2. ضع الأجنة المحاذية المغطاة بزيت الهالو كربون تحت مجهر مقلوب. تأكد من أن الأطراف الخلفية للأجنة تواجه الإبرة.
  3. استخدم المناور الدقيق لتقريب الإبرة من الأجنة. امسح الإبرة. تأكد من أن قطرة السائل الخارجة من الإبرة مرئية. بدءا من ضغط حقن 300 hPa وضغط توازن 20 hPa ، اضبط ضغط الحقن وضغط التوازن لضمان الحجم الأمثل لقطرة السائل.
  4. استخدم المناور الدقيق لإدخال الإبرة في الأطراف الخلفية للأجنة ، واستخدم التحكم في القدم المتصل بالحاقن الدقيق لحقن الحمض النووي (الشكل 2). إذا كانت هالة صغيرة مرئية ، يتم حقن الحمض النووي بنجاح في الجنين.
    ملاحظة: حدد الأجنة متعددة النوى للحقن واقتل الأجنة الأكبر سنا باستخدام الزر "نظيف". إذا تسربت كمية كبيرة من السيتوبلازم بعد الحقن ، فإن الأجنة تكون غير جافة. إذا تسربت كمية صغيرة فقط من السيتوبلازم أو لم تتسرب أي كمية منه بعد الحقن ، فإن الحقن تعتبر ناجحة. إذا تسرب أكثر من ثلث الأجنة من السيتوبلازم بعد الحقن ، فقم بتمديد وقت التجفيف بمقدار 1-2 دقيقة. إذا كان أكثر من ثلث الأجنة جافا بشكل مفرط ، فقم بتقصير وقت التجفيف بمقدار 1-2 دقيقة.
  5. قم بإزالة الإبرة من الجنين. حرك الإبرة إلى الطرف الخلفي للجنين التالي. كرر الخطوات المذكورة أعلاه.
  6. ضع الأجنة المحقونة في صفيحة أجار. ضع الطبق في غرفة على حرارة 18-20 درجة مئوية. في اليوم التالي ، نقل لوحة إلى حاضنة عند درجة حرارة 25 °Cوالرطوبة من 50 ٪ -60 ٪ ، واحتضان لمدة 1 يوم.
    ملاحظة: بعد الحقن ، احتفظ بالأجنة عند درجة حرارة 18-20 درجة مئوية لإبطاء نموها ، وتسهيل دمج الحمض النووي البلازميد في جينوم ذبابة الفاكهة ، وزيادة معدل بقاء الأجنة المحقونة.

10. جمع اليرقات

  1. استخدم إبرة تشريح لكشط وفك الطعام في قنينة. زود الطعام ببضع قطرات من الماء المقطر.
    ملاحظة: اترك الماء المقطر يمتص في الطعام لمنع اليرقات من الغرق.
  2. اخراج لوحات من الحاضنة.
  3. جمع اليرقات المفرغة مع فرشاة الرسم تحت المجهر ستيريو ونقلها إلى القارورة.
  4. ضع القارورة في حاضنة عند درجة حرارة 25 درجة مئويةورطوبة50٪ -60٪.

11. الحصول على الذباب المعدل وراثيا

  1. اجمع الذباب المفقس بعد تحضين القارورة عند 25 درجة مئويةلمدة 10 أيام.
  2. اعبر ذبابة ذكر واحدة إلى ثلاث ذباب أنثى عذراء من موازنات TM2 / TM6C Sb1 Tb1 ، واعبر ذبابة أنثى واحدة إلى ثلاثة ذباب ذكور من موازنات TM2 / TM6C Sb1 Tb1 .
  3. ضع الصلبان في حاضنة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية ورطوبة 50٪ -60٪.
  4. فحص ذرية الذباب بعيون برتقالية. هذه هي الذباب المعدل وراثيا (الشكل 3A-C).
    ملاحظة: الذباب الذي يحمل نسخة من جين التحوير في موقع الالتحام attP2 له عيون برتقالية.
  5. اعبر ذبابة ذكر برتقالية العينين إلى ثلاث ذباب أنثى عذراء من موازنات TM2 / TM6C Sb1 Tb1 لإنشاء مخزون.
    ملاحظة: يجب إعداد أكثر من جيل واحد من الصلبان من أجل شطب جين التحوير phiC31 على الكروموسوم الأول.

النتائج

طرف إبرة الحقن مشطوف بمطحنة إبرة (الشكل 1). يمكن للمرء شطبة 50-60 إبرة في ساعة واحدة. يتم حقن الحمض النووي (DNA) في الجزء الخلفي من الجنين في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك (الشكل 2 أ). يمكن تحديد موقع الجزء الخلفي من الجنين بسهولة بناء على الميكروبايل في مقدمة الجنين (الشكل 2 أ). لا يمكن استخدام الأجنة في مراحل الأرومة الخلوية والمعدة للحقن ، حيث أن كل نواة محاطة بغشاء خلوي في هذه المراحل ، وبالتالي ، فإن فرصة الحصول على الذباب المعدل وراثيا تكاد تكون صفرا (الشكل 2 ب). تتشوه الأجنة المفرطة عند ثقبها ولا يمكن استخدامها للحقن المجهري (الشكل 2C). يمكن للأجنة غير المجففة أن تقذف كمية كبيرة من السيتوبلازم عند وخزها بالإبرة (الشكل 2 د) ، مما يؤدي إلى انخفاض معدل بقاء الأجنة. الأجنة المجففة بشكل مناسب قد تتسرب أو لا تتسرب كمية صغيرة من السيتوبلازم عند حقنها (الشكل 2E).

خط ذبابة الفاكهة الذي يعبر عن phiC31 integrase ويحمل موقع الالتحام attP2 المستخدم للحقن المجهري للجنين في هذا البروتوكول له عيون بيضاء (الشكل 3A) ، والذباب المسن من هذا النمط الجيني له عيون وردية ناتجة عن بروتين الفلورسنت الأحمر المتراكم المعبر عنه على وجه التحديد في العين (الشكل 3B). نستخدم الجين الأبيض المصغر كعلامة انتقائية للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة ، ويتم التعرف على الذباب المعدل وراثيا من خلال لون العين الذي يتراوح من الأصفر الفاتح إلى الأحمر. الذباب المعدل وراثيا الذي يحمل جين التحوير في موقع الالتحام attP2 له عيون برتقالية (الشكل 3C) ، والتي يمكن للمرء أن يعرفها بسهولة من الذباب الذي لا يحمل جينات محورة.

figure-results-1
الشكل 1: طحن الإبر. (أ) تستخدم مضخة هواء القدم المزودة بمقياس ضغط لتطبيق ضغط الهواء على الإبرة. (ب) تركب إبرة على مطحنة إبرة بزاوية 35 درجة على سطح لوح طحن. (ج) استخدم مقبض ضبط خشن لوضع طرف الإبرة فوق سطح لوحة الطحن مباشرة ، ثم استخدم مقبض ضبط دقيق لبدء ميل الطرف. د: يقع طرف إبرة مسحوبة تحت المجهر. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. (ه) إبرة مشطوفة تحت المجهر. يشار إلى الطرف المشطوف للإبرة بسهم. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: أجنة ذبابة الفاكهة مناسبة للحقن المجهري. (أ) يمكن حقن جنين ذبابة الفاكهة في مرحلة ما قبل الأرومة أو البلاستوديرم المخلوي في القطب الخلفي للجنين، ويرمز له بقطع ناقص أحمر. يشار إلى micropyle في القطب الأمامي للجنين بواسطة سهم. (ب) لا يمكن استخدام جنين ذبابة الفاكهة في مرحلة البلاستوديرم الخلوي للحقن المجهري. (ج) يبدو الجنين المفرط الجفاف مشوها. (د) يؤدي الجفاف غير الكافي للجنين إلى تسرب كمية كبيرة من السيتوبلازم بعد الحقن. ه: للحقن الناجح، قد تتسرب كمية صغيرة من السيتوبلازم. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: لون العين من ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا التي تحمل جين التحوير في موقع الالتحام attP2. (أ) خط حقن attP2 الذي يعبر عن إنزيم phiC31 integrase (vas-phiC31 ؛ + ؛ attP2) له عين بيضاء. يستخدم RFP المعبر عنه على وجه التحديد في العين كعلامة انتقائية لجين التحوير phiC31. (ب) خط حقن attP2 القديم الذي يعبر عن phiC31 integrase له عين وردية ناتجة عن بروتين RFP المتراكم في العين. (ج) الذباب الذي يحمل جين التحوير المدمج في موقع الالتحام attP2 له عين برتقالية. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: التحوير في ذبابة الفاكهة الناتج عن الحقن المجهري الجنيني ل 100 بلازميدات متميزة. تم حقن ما مجموعه 100 بلازميدات متميزة بتركيزات مختلفة تتراوح من 20 نانوغرام / ميكرولتر إلى 1683 نانوغرام / ميكرولتر في الأجنة ، وتم الحصول على الذباب المعدل وراثيا ل 85 من 100 بلازميد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: كفاءة الحقن المجهري للأجنة للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة. تم حقن ما مجموعه 120 بلازميدات متميزة في الأجنة ، وتم الحصول على الذباب المعدل وراثيا ل 101 من 120 بلازميد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

هنا ، نقدم بروتوكولا للحقن المجهري للأجنة لالجينات المحورة في ذبابة الفاكهة. بالنسبة للجينات المحورة الخاصة بالموقع بوساطة phiC31 ، قمنا بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد وحصلنا على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات (الجدول التكميلي 2). في تجربتنا ، يكفي الحمض النووي البلازميد المعزول بواسطة مجموعة مصغرة من البلازميد للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة. وقد لا يكون لتركيزات الحمض النووي البلازميد التي تتراوح بين 20 نانوغرام/ميكرولتر إلى 1683 نانوغرام/ميكرولتر أي تأثير واضح على معدل نجاح الجينات المحورة لأن معظمها يمكن أن ينتج ذبابا محورا وراثيا (الجدول التكميلي 1).

يعد تحضير إبر الحقن أمرا بالغ الأهمية للحقن المجهري الفعال للجنين. يتم إغلاق إبرة الحقن بعد سحبها بواسطة مجتذب الإبرة. بالنسبة للجينات المحورة الروتينية بوساطة phiC31 في ذبابة الفاكهة ، عادة ما يتم كسر طرف الإبرة بواسطة غطاء17. ومع ذلك ، فإن الإبر المكسورة عشوائيا غالبا ما تكون غير مناسبة تماما للحقن المجهري للأجنة ، حيث قد يتم حظرها أو تسبب تسرب كمية كبيرة من السيتوبلازم وبالتالي يجب استبدالها بأخرى جديدة أثناء الحقن. لا يتم عادة حظر إبر الحقن التي تكون أطرافها مشطوفة بواسطة مطحنة أو تثير تسربا سيتوبلازميا كبيرا ، مما يقلل من تكرار استبدال الإبرة. لاحظنا أن محلول الطحن يمكن أن يدخل الطرف المشطوف للإبرة بمجرد فتح الطرف أثناء الطحن. بمجرد دخوله الإبرة ، لن يجف محلول الطحن بسرعة بشكل طبيعي. لمنع محلول الطحن من السحب ، نقوم بتوصيل إبرة الحقن بمضخة هواء القدم بمقياس ضغط. أثناء طحن طرف الإبرة ، نستخدم مضخة الهواء لتطبيق ضغط الهواء على الإبرة ، وبالتالي ، يتم منع محلول الطحن من دخول الطرف المشطوف ، مما يتيح استخدام الإبرة المشطوفة على الفور. معا ، يجب أن تساعد مضخة هواء القدم المزودة بمقياس الضغط على تسريع الجينات المحورة في ذبابة الفاكهة ، خاصة بالنسبة لعدد كبير من البلازميدات.

يعد تحديد الأجنة في مرحلة ما قبل الأرومة أو البلاستوديرم المخلوي أمرا بالغ الأهمية للحقن المجهري19،20 ، لأن حقن الأجنة في مراحل لاحقة بالكاد ينتج ذبابا محورا وراثيا. يستخدم الذباب الذي يقل عمره عن 10 أيام لوضع البيض لأنه يميل إلى وضع بيض أكثر من البيض الأكبر سنا. في عملية إزالة الأجنة ، يتم استخدام مصفاة خلوية لتبسيط معالجة التبييض والشطف بالماء المقطر المزدوج للأجنة. بعد شطف الجنين ، تشير الأجنة العائمة إلى أن قشر البيض قد عولج جيدا ويمكن استخدامه للحقن المجهري اللاحق. يعد كل من وقت إزالة الأجنة وتجفيفها أمرا بالغ الأهمية للحقن المجهري ويجب تحسينه تجريبيا ، لأن وقت التجفيف المطول أو التجفيف يمكن أن يقتل الأجنة. يتأثر وقت التفريغ والتجفيف بدرجة الحرارة والرطوبة التي تختلف من مكان إلى آخر ومن وقت لآخر ويجب تعديلها وفقا لذلك بناء على معدل الفقس الجنيني.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم العمل من قبل صندوق البحث العلمي للمواهب رفيعة المستوى ، جامعة جنوب الصين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 مو ؛ m مصفاة الخليةNEST258367
3M لاصق على الوجهين3M415
زجاج البورسليكاتSUTTERB100-75-10
لوحة جلخ الماسSUTTER104E
مشتعل / براون مجتذب ماصة دقيقةSUTTERP-1000
هواء القدم مع مقياس الضغطShenfengSF8705D
زيت الهالوكربون 27سيجماH8773
زيت الهالوكربون 700سيجماH8898
مجهر مقلوبنيكونكليس Ts2R
مضخة الحقن الدقيقeppendorfFemtoJet 4i
MicromanipulatoreppendorfTransferMan 4r
Micropipette BevelerSUTTERنظارات غطاء المجهر BV-10
(18 مم × 18 مم)CITOLAS10211818C
(25 مم × 75 مم)بتري CITOLAS188105W
(90 مم × 15 مم)LAIBOER4190152
Photo-Flo 200Kodak1026269
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
Stereo مجهرنيكونSMZ745
مضخة شرائح مجهر طبق Kit

المراجع

  1. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  2. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
  3. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  4. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  5. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
  6. Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
  7. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  8. Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), Bethesda. 1095-1102 (2012).
  9. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
  10. Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598(2022).
  11. Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), Bethesda. 022(2023).
  12. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  13. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  14. Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  15. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
  16. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  17. Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
  18. Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
  19. Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  20. Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

31

مقالات ذات صلة