يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

MIR-15a المستخرج الناتجة عن الدموع كأداة تشخيصية جديدة لاعتلال الشبكية السكري

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66687

⸱

ديسمبر 30, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المقالة بروتوكولا لجمع واكتشاف miR-15a من الدموع كأداة تشخيصية جديدة لاعتلال الشبكية السكري.

الملخص

اعتلال الشبكية السكري (DR) هو مضاعفات رئيسية لمرض السكري، حيث يؤثر على نسبة كبيرة من مرضى السكري. التشخيص المبكر والتدخل ضروريان لمنع فقدان الرؤية الدائم. طرق التشخيص الحالية، رغم فعاليتها، إلا أن لها حدودا. الميكرو الريبي الصغير، وهو رنا صغير غير مشفر يعيق استقرار و/أو ترجمة ال mRNA عن طريق الارتباط بالمناطق الثلاثية غير المترجمة (3'-UTRs) من ال mRNA المستهدف، أصبح معروفا بشكل متزايد على أنه مرتبط بشكل كبير بالسكري ويمكن الحصول عليه من خلال الدموع. بحثت هذه الدراسة في إمكانية وجود miR-15a الخارجي المستخرج من سائل الدموع كمؤشر تشخيصي جديد للطبيب المتخصص. تم الحصول على عينات دمعة من 135 مريضا سكري (36 مصابين باعتلال الشبكية السكري [DR] و50 بدون DR) و49 ضابطا أصحاء. تم عزل الإكسوسومات، وتم قياس مستويات تعبير miR-15a الإكسوسومي باستخدام PCR الرقمي بالقطرات (ddPCR). أظهرت النتائج أن تعبير miR-15a في الخارج قد تغير لدى مرضى السكري ومرضى DR مقارنة بالأفراد الأصحاء. تشير هذه النتائج إلى أن miR-15a الخارجي المستخرج من سائل الدموع قد يلعب دورا في الآليات الجزيئية الكامنة وراء السكري ومضاعفاته. علاوة على ذلك، يحمل إمكانات كمؤشر تشخيصي غير جراحي وموثوق لاعتلال الشبكية السكري، حيث يوفر حساسية عالية وخصوصية.

المقدمة

اعتلال الشبكية السكري (DR) هو أحد أبرز مضاعفات الأوعية الدقيقة في مرض السكري، ويهدد رؤية ملايين الأشخاص حول العالم. وقد قدر انتشار مرض السكري العالمي من بيانات السكان في أطلس النازحين لعام 2019 بنسبة 22.7٪ من إجمالي سكان مرضى السكري حول العالم، مع استمرار ارتفاع عدد الحالات الجديدة، خاصةفي الدول المتقدمة والنامية. سريريا، يتميز الاعتلال الشبكي السكري في المرحلة المبكرة أو غير التكاثري (NPDR)، أو اعتلال الشبكية السكري التكاثفي في المرحلة المتأخرة أو اعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR)، ووجود وذمة بقعية. زيادة نفاذية الأوعية الدموية وانسداد الشعيرات الدموية هما من التغيرات المرضية الشائعة التي تلاحظ في NPDR، كما لوحظ عدم طبيعي في الأوعية الدموية الجديدة في القزحية أو البقعة أو القرص البصري أو الشبكية في حالة PDR 2,3. التقدم إلى اضطراب الرؤية الجنجي (PDR)، الذي قد يؤدي إلى نزيف زجاجي وانفصال الشبكية، قد يسبب ضعفا كبيرا في الرؤية3. في جميع الحالات، يمكن اكتشاف التغيرات المرضية من خلال تنظير القاع أو فحص تصوير القاع بواسطة أطباء عيون مدربين4. باستخدام طريقة تصوير القاع القياسية، يمكن اكتشاف اعتلال الشبكية السكري بنسبة حساسية 78٪-96٪وخصوصية 86٪-97٪. ومع ذلك، تكتشف هذه الطريقة فقط بعد حدوث ضرر في الشبكية. هناك حاجة غير ملباة للكشف المبكر عن الشبكية قبل ظهور علامات الشبكية الظاهرة سريريا، مثل نزيف الشبكية البلطة، وتمدد الأوعية الدقيقة، والإفرازات، وتكاثر الأوعية الجديدة.

أدى تقدم الأدوات الجزيئية إلى اكتشاف الإكسوسومات كأداة تشخيصية محتملة لأمراض مختلفة، بما في ذلك السرطانوأمراض القلب والأوعية الدموية. الإكسوسومات هي جسيمات بحجم نانوي ترتبط بغشاء ثنائي الطبقة الدهنية تفرزه معظم الخلايا إلى فضاء الحويصلات خارج الخلية (EV). يمكن نقل هذه الإكسوسومات عبر السوائل الحيوية مثل الدم، الدموع، اللعاب، والبول، مما يجعلها سهلة الوصول للإجراءات التشخيصية غير الجراحية أو قليلة التوغل8. تحمل علامات خلايا منشأ مختلفة تشمل البروتينات والدهون والأحماض النووية. ومن الأمور ذات الاهتمام الخاص الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة المحمولة داخل المركبات الكهربائية (EVs). على الرغم من أن هذه الحمض النووي الريبي غير مشفرة للبروتينات، إلا أنها تلعب أدوارا محورية في تنظيم الجينات وقد تورطت في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك خلايا البنكرياس β، التي تعد مهمة جدا في تطور السكري 9,10.

على وجه التحديد، ثبت أن miR-15a له ارتباط قوي بتطور مرض السكري، خاصة من خلال تنظيم إنتاج الأنسولين ووظائف خلايا بيتا في البنكرياس11. وقد أظهرت مجموعتنا مؤخرا أن miR-15a يتغير في بلازما اعتلال الشبكية السكري. بالإضافة إلى ذلك، أظهر أيضا أن miR-15a يفرز بواسطة خلايا بيتا في البنكرياس، وينتقل عبر مجرى الدم إلى الشبكية12. يعتبر سائل الدموع سائلا سهل الوصول إليه، ويمكن الحصول عليه بسهولة من العين بطريقة غير جراحية وفعالة من حيث التكلفة. يحتوي على مزيج من بروتينات مختلفة ودهون وإلكتروليتات وجزيئات أخرى، مما يعكس الحالة الفسيولوجية لسطح العين والأنسجة المحيطة، بما في ذلك الشبكية14. تم اكتشاف عدد أكبر من ال miRNA في سائل الدموع مقارنة بمحلول المصل والاخلاط المائي15,16. يتغير تركيب الدموع استجابة لحالات جهازية مختلفة، بما في ذلك السكري17. في الواقع، أظهرت تحليلات سائل الدموع إمكانات واعدة لمراقبة وتشخيص أمراض أخرى غير متعلقة بالعين مثل التصلب المتعدد وسرطان الثدي18,19. مع الارتباط المباشر بين اعتلال الشبكية السكري والعين، سيكون من الأكثر أهمية البحث عن الخصائص التشخيصية المحتملة لسائل الدمع في هذا المرض. لوحظ أن مستويات IL-1RA وIL-8 وIL-6 وTNF-α في سوائل الدموع لدى مرضى اعتلال الشبكية السكري تتغير أيضا حسب شدة المرض20,21. مقارنة بفحص تنظير القاع التقليدي، يقدم تحليل سائل الدموع لاعتلال الشبكية السكري مزايا محتملة من حيث سهولة الوصول، وعدم الجراحة، والخصوصية، ويسمح بالكشف المبكر قبلبداية المرض.

لذا، الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو دراسة إمكانات miR-15a الخارجية المستمقة من سائل الدموع كمؤشر تشخيصي جديد لاعتلال الشبكية السكري من خلال عزل وقياس ال miRNA من سوائل الدموع لدى مرضى اعتلال الشبكية السكري. وبهذا الشكل، سيكون هناك طريقة جديدة للكشف عن اعتلال الشبكية السكري من خلال فحص سائل الدموع، والتي يمكن اكتشافها حتى قبل ظهور مضاعفات الشبكية، مما يسمح باتخاذ تدابير وقائية أو علاجية مبكرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت الدراسة بموافقة لجنة أخلاقيات البحث الطبي في مركز جامعة ملايا الطبي (رقم المرجع: 20165-2446). تم الحصول على موافقة كتابية من جميع الأشخاص قبل التجنيد. تم تضمين ما مجموعه 135 شخصا من بين المرضى الذين يحضرون عيادة العيون في مركز جامعة ملايا الطبية (UMMC)، كوالالمبور. شملت معايير الإدراج المرضى الذين تلقوا خدمات تحت UMMC وتتراوح أعمارهم بين 20-80 عاما. تم استبعاد المرضى الذين يخضعون لعلاج نشط بالأنسولين، أو لديهم تاريخ من العلاج بالليزر أو مضادات VEGF خلال الأشهر الثلاثة الماضية، أو الذين يتناولون مضادات الصفائح الدموية أو مميعات الدم بانتظام من الدراسة. ثم تم تقسيم المشاركين إلى ثلاث مجموعات: (1) ضابط صحي (ضابط)، (2) مريض سكري بدون اعتلال الشبكية (DM No DR)، و(3) مريض سكري يعاني من اعتلال الشبكية (DR). ملخص البروتوكول مقدم في الشكل 1. تفاصيل المواد والمواد المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

figure-protocol-1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. تحضير المواد    

  1. ضع طقم ضمادات أساسي معقم يحتوي على ملقطين، وستة كرات قطنية، وأربع فوط شاش، وصينية، وحقيبة خطر بيولوجي.
  2. صب 5 مل من محلول ري كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ في صينية كهربائية.
  3. افتح عبوة مناديل تنظيف الجفون وضعها على الحقل المعقم.
  4. جهز أنبوبا يحتوي على 250 ميكرولتر من محلول حافظ.
  5. اطو شريط شيرمر على مستوى الوتد وهو لا يزال في عبوته قبل وضع الشريط المعقم على الحقل المعقم.
  6. ارتد قفازات جراحية بطريقة معهرة.
  7. باستخدام ملقط معقم، ترطب كرات القطن بمحلول ري كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪ w/v.

2. إعداد الأشخاص البشريين    

  1. دع الشخص يجلس بشكل مريح واطلب إغلاق عينيه.
  2. امسح الجلد المحيط بالبرج أربع مرات باستخدام كرات قطنية منقوعة في محلول ري.
  3. امسح الجلد المحيط بالحجاج بمنديل تنظيف الجفون.

3. جمع سائل الدموع البشري

  1. اجمع سوائل الدموع باستخدام شريط شيرمرز الموضوع عند الفورنيكس الصدغي السفلي.
  2. عند وضع الشريط المطوي جزئيا على العين اليمنى، اطلب من الشخص أن ينظر إلى اليسار. اسحب الجفن السفلي للأسفل لكشف الفورنيكس السفلي.
  3. باستخدام زوج من الملقط المعقم، ضع شريط شيرمر على الثلثين الخارجيين من الشكل السفلي للملتحمة. تجنب ترك الشريط يلامس الجلد لمنع تلوث العينة بالعرق أو المواد الأخرى على الجلد.
  4. ضع وسادة شاش تحت الشريط لمنع ملامسة الجلد.
  5. اترك التمزقات تمتص في الشريط حتى علامة 20 مم أو بحد أقصى 5 دقائق، أيهما يأتي أولا.
  6. إذا لم يتم الوصول إلى علامة مستوى 20 مم، قم بتوثيق مستوى التمزقات بناء على العلامات للسماح بتوحيد حجم سائل الدموع.
  7. باستخدام زوج من الملقط المعقم، قم بإزالة شريط شيرمر بعناية ووضعه في أنبوب يحتوي على محلول ملحي بمحلول محلول محلول الفوسفات 1x (PBS).
  8. ضع الأنبوب في صندوق تبريد لنقله إلى المختبر.
  9. نظف السطح المحيط بالحافة عن طريق مسح أي محلول متبقي على الجلد.

4. المعالجة المسبقة لعينات الدموع    

  1. دحرجة أنبوب يحتوي على شريط شيرمر منقوع في PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. حرك الأنبوب على جهاز هزاز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بطرد المركزي بالأنبوب عند 2000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. انقل المحلول إلى أنبوب جديد، ثم وضع علامة وحافظ عليه عند -80 درجة مئوية حتى المعالجة التالية.
  5. تخلص من الشريط المتبقي.

5. عزل الإكسوسوم

ملاحظة: يتم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

  1. قم بإذابة محلول التمزق على الثلج لمدة 10 دقائق.
  2. عدل عمود الدوران لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  3. قم بإزالة المخرج السفلي للعمود وضعه على لوحة جمع النفايات المرفقة.
  4. أزل حصيرة الختم العلوية ودع مخزن التخزين يمر عبر العمود عبر القوة الجاذبية.
  5. أضف 250 ميكرولتر من PBS ودعه يمر عبر العمود.
  6. كرر الخطوة 5.5.
  7. ضع عينة بحجم 110 ميكرولتر على أعلى كل عمود وتسمح للعينة بالدخول إلى العمود.
  8. انقل العمود إلى لوحة جمع عينات مقدمة.
  9. أضف 100 ميكرولتر من PBS ودعه يمر عبر العمود إلى لوحة جمع العينات.
  10. انقل العمود إلى لوحة جمع النفايات.
  11. أضف 4× 200 ميكرولتر PBS إلى العمود ودعه يدخل العمود لإزالة نسبة البروتينات الحرة من التحميل الأول.
  12. أضف 110 ميكرولتر من العينة إلى العمود. اسمح بالدخول إلى العمود.
  13. ضع العمود على لوحة جمع عينات. أضف 100 ميكرولتر من PBS ودعه يمر عبر العمود.
  14. قم بطرد مركزي مؤقت للوحة جمع العينات عند 100 x g لمدة 30 ثانية. الإكسوسومات المعزولة جاهزة الآن لعزل الحمض النووي الريبي.

6. عزل الحمض النووي الريبي

ملاحظة: يتم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

  1. موضوع 200 ميكرولتر من الإكسوسومات المعزولة إلى عزل RNA.
  2. أضف 60 ميكرولتر من مخزن التحلل إلى الإكسوسومات المعزولة. Vortex لمدة 5 ثوان.
  3. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  4. أضف 20 ميكرولتر من مخزن المثبط، دوامة لمدة 20 ثانية، وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  5. الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. انقل المادة الشفافة عديم اللون إلى أنبوب جديد.
  7. أضف حجما واحدا من الأيزوبروبانول.
  8. Vortex لمدة 5 ثوان وانقل الحل إلى عمود الدوران المصغر الموجود في المجموعة.
  9. الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ثانية عند 8000 × جرام. تخلص من تدفق المرور.
  10. اغسل العمود ب 700 ميكرولتر من محلول الغسيل RWT.
  11. جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية عند 8000 × جرام. تخلص من التدفق المباشر.
  12. اغسل العمود بسعة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل RPE.
  13. جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية عند 8000 × جرام. تخلص من التدفق المباشر.
  14. أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى عمود الدوران الصغير للعينة الصغيرة.
  15. الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 8000 × g. تخلص من أنبوب التدفق وأنبوب التجميع.
  16. ضع عمود الدوران الصغير في أنبوب تجميع جديد بسعة 2 مل.
  17. قم بطرد المركزي على العمود والأنبوب بقوة 18,000 × g لمدة 5 دقائق. تخلص من التدفق وأنبوب التجميع.
  18. ضع عمود الدوران الصغير في أنبوب جديد بسعة 1.5 مل وأضف 15 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase في مركز غشاء عمود الدوران.
  19. حضن لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  20. الطرد المركزي عند 18,000 × g لمدة دقيقة واحدة لإطلاق الحمض النووي الريبي. الحمض النووي الريبي جاهز للمعالجة في المرحلة النهائية.
  21. إجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية لمراقبة الجودة والتحقق من إنتاج الحمض النووي الريبي.

7. تخليق cDNA

  1. إجراء تخليق cDNA باستخدام مجموعات تجارية متاحة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  2. جهز الخليط الرئيسي وفقا للجدول 1 في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
  3. اخلط المحلول عن طريق التوصيل بأنبوب لأعلى وأسفل.
  4. مكيدة 5.1 ميكرولتر من الخليط الرئيسي إلى أنابيب PCR بسعة 0.1 ميكرولتر.
  5. أضف 9.9 ميكرولتر من العينة إلى الأنبوب المخصص الذي يحتوي على الخليط الرئيسي.
  6. ضع أنابيب PCR في جهاز تدوير حراري وشغل الجدول وفقا للجدول 2.
    ملاحظة: الحمض النووي القائم على الحمض النووي جاهز لمزيد من التحليل.
المكونالحجم/رد الفعل
مخزن RT 10x1.5 ميكرولتر
مزيج 100M dNTP0.15 ميكرولتر
مثبط RNAse (200U/μL)0.19 ميكرولتر
نسخ إنزيم RT متعدد (50U/μl)1 ميكرولتر
20x RT Primer0.75 ميكرولتر
RNAse Free Water1.51 ميكرولتر
عينة9.9 ميكرولتر
الحجم الكلي15 ميكرولتر

الجدول 1: تحضير خليط PCR الرئيسي المستخدم لتخليق cDNA من الحمض النووي الريبي المعزول.

الخطوةدرجة الحرارةالمدة
النسخ العكسي16 درجة مئوية30 دقيقة
42 درجة مئوية30 دقيقة
توقف85 درجة مئوية5 دقائق
انتظر4 درجة مئوية

الجدول 2: ظروف الدورة الحرارية لتخليق cDNA.

8. PCR رقمي بقطرات

ملاحظة: يتم إجراء PCR رقمي للقطرات (ddPCR) باستخدام مجموعات متوفرة تجاريا وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

  1. جهز الخليط الرئيسي ل ddPCR في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل وفقا للجدول 3.
  2. مكياجها 19.8 ميكرولتر من الماستر في أنابيب PCR بسعة 0.1 ميكرولتر. أضف 2.2 ميكرولتر من العينات وامزج جيدا عن طريق حقن الخليط صعودا وهبوطا لمدة 10 مرات.
  3. انقل 20 ميكرولتر من خليط العينة إلى مسار عينة خرطوشة ddPCR.
  4. أضف 50 ميكرولتر من الزيت إلى ممر الزيت في الخرطوشة.
  5. ثبت حشية على الخرطوشة باستخدام الخطاف الموجود على اللوحة.
  6. ضع الخرطوشة في آلة توليد القطرات. يشير صوت النقر إلى إدخال الكارتريدج بشكل صحيح في آلة توليد القطرات.
  7. انقل بعناية جميع القطرات الناتجة إلى آبار في صفيحة تحتوي على 96 بئرا. أضف على الأقل بئر واحد بدون تحكم في القالب بالإضافة إلى تحكم سلبي.
  8. قم بختم اللوح باستخدام ورق معدني قابل للثقب في آلة عزل الألواح (انظر جدول المواد).
  9. ضع اللوحة في جهاز تدوير حراري وشغل حسب الجدول 4.
  10. انقل اللوحة إلى جهاز قراءة القطرات ليعد القطرات الموجبة والسالبة.
  11. قم بقياس عدد النسخ لكل مل باستخدام قيمة رقم النسخ/20 ميكرولتر المولدة من التشغيل.
المكونالحجم/رد الفعل
2x ddPCR Supermix للمجسات (بدون dUTP)10 ميكرولتر
20x برايمر/مسبار1 ميكرولتر
عينة7 ميكرولتر
RNAse Free Water2 ميكرولتر
الحجم الكلي20 ميكرولتر

الجدول 3: تحضير خليط PCR الرئيسي المستخدم في ddPCR.

الخطوةدرجة الحرارةالمدةالمنحدرالدورة
تنشيط الإنزيمات95 درجة مئوية10 دقائق~2 °C/s لكل خطوة1
إزالة الطبيعة94 درجة مئوية30 ثانية40
التلدين60 درجة مئويةدقيقة واحدة40
تعطيل الإنزيمات98 درجة مئوية10 دقائق1
انتظر4 درجة مئويةلا يوجدلا يوجد

الجدول 4: ظروف الدورة الحرارية لجهاز ddPCR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

المنحنى القياسي
تم إنشاء منحنى قياسي لتحديد الحجم الدقيق للتمزق الذي تم جمعه من كل مريض. بشكل أساسي، تم تعريض أحجام مختلفة من نطاقات المواد الحافظة بين 3 ميكرولتر إلى 25 ميكرولتر لشرائط شيرمر. وتمت ملاحظة مسافة المنطقة الرطبة على نهر شيرمر. تم تكرار الإجراء ثلاث مرات لكل إجراء، وتم حساب القراءة المتوسطة. تم إنشاء منحنى قياسي لحجم التمزقات المجمعة مقابل مسافة المناطق الرطبة في شيرمر (الشكل 2) وتم الإشارة إليه كمرجع لحجم الدموع المجمعة.

...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

فحص تنظير القاع، والتصوير المقطعي البصري للتماسك، وتصوير الأوعية الفلورية هي تقنيات الكشف المتوفرة حاليا للكشف عن اعتلال الشبكية السكري. غالبا ما تستخدم هذه التقنيات الثلاث معا لتقديم تقييم شامل لمختلف أمراض الشبكية والمشيمة. تنظير القاع هو فحص سريري يجرى بشكل روتيني أثناء تقييم اعتلال الشبكية السكري. يتم تنفيذ هذه الطريقة بواسطة أطباء عيون مدربين وتعد المعيار الذهبي لتشخيص اعتلال الشبكية السكري. تتيح هذه الطريقة تقييما تفصيليا للشبكية ولديها القدرة على توثيق مظهر الشبكية للمقارنات المست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنهم لا يملكون مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا البحث معهد ألكون للأبحاث (IF011-2020) ومنحة أبحاث ما بعد الدكتوراه من FOM UMSC Care لعام 2021.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.9٪ بدون كلوريد الصوديومعين ميديكير سدن برهدGB16165967618
محلول محلول الفوسفات 1xثيرمو فيشر العلمي10010-023
أنظمة حيوية تطبيقية   مجموعة النسخ العكسي MicroRNA من TaqManأنظمة حيوية تطبيقية4366596
ddPCR Supermix للمجسات (بدون dUTP)مختبرات بيوراد1863024
لوحات ddPCR 96-Wellمختبرات بيوراد12001925
خرطوشات DG8مختبرات بيوراد1864008
حشيات DG8مختبرات بيوراد1863009
زيت توليد القطرات للمجساتمختبرات بيوراد1863005
مجموعة عزل إكسوسومات إكسوسبين-96أنظمة التوجيه الخلويEX07-96
مجموعة متقدمة من مصل miRNeasyتشياغن  217204
مادة ختم ألواح PCR من نوع PX1مختبرات بيوراد1814000
نظام PCR رقمي قطرة QX100مختبرات بيورادQX100
مولد قطرات QXDx مختبرات بيوراد12001049
شارع شيرمرأوبتيكSCH-100
T100 Thermal Cyclerمختبرات بيوراد1861096
اختبار Taqman MicroRNA MTOMED 20 (معرف الاختبار: 000389)أنظمة حيوية تطبيقية4440887تسلسل الهدف: UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

المراجع

  1. Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
  2. Sayin, N., Kara, N., Pekel, G. Ocular complications of diabetes mellitus. World J Diabetes. 6 (1), 92-108 (2015).
  3. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: Pathophysiology and treatments. Int J Mol Sci. 19 (6), 1816(2018).
  4. Yang, Z., Tan, T. E., Shao, Y., Wong, T. Y., Li, X. Classification of diabetic retinopathy: Past, present and future. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1079217(2022).
  5. Goh, J. K. H., et al. Retinal imaging techniques for diabetic retinopathy screening. J Diabetes Sci Technol. 10 (2), 282-294 (2016).
  6. Parizadeh, S. M., et al. Circulating exosomes as potential biomarkers in cardiovascular disease. Curr Pharm Des. 24 (37), 4436-4444 (2018).
  7. Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncol. 84, 31-40 (2018).
  8. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  9. Fluitt, M. B., Kumari, N., Nunlee-Bland, G., Nekhai, S., Gambhir, K. K. miRNA-15a, miRNA-15b, and miRNA-499 are reduced in erythrocytes of pre-diabetic African-American adults. Jacobs J Diabetes Endocrinol. 2 (1), 014(2016).
  10. Belgardt, B. F., et al. The microRNA-200 family regulates pancreatic beta cell survival in type 2 diabetes. Nat Med. 21 (6), 619-627 (2015).
  11. Sun, L. L., et al. MicroRNA-15a positively regulates insulin synthesis by inhibiting uncoupling protein-2 expression. Diabetes Res Clin Pract. 91 (1), 94-100 (2011).
  12. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxid Redox Signal. 27 (13), 913-930 (2017).
  13. Posa, A., et al. Schirmer strip vs. capillary tube method: Non-invasive methods of obtaining proteins from tear fluid. Ann Anat. 195 (2), 137-142 (2013).
  14. Ohashi, Y., Dogru, M., Tsubota, K. Laboratory findings in tear fluid analysis. Clin Chim Acta. 369 (1), 17-28 (2006).
  15. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals miR-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  16. Chan, H. W., et al. A pilot study on microRNA profile in tear fluid to predict response to anti-VEGF treatments for diabetic macular edema. J Clin Med. 9 (9), 2920(2020).
  17. Barmada, A., Shippy, S. A. Tear analysis as the next routine body fluid test. Eye (Lond). 34 (10), 1731-1733 (2020).
  18. Tomečková, V., et al. Experimental analysis of tear fluid and its processing for the diagnosis of multiple sclerosis. Sensors (Basel). 23 (11), 5251(2023).
  19. Daily, A., et al. Development and validation of a short-term breast health measure as a supplement to screening mammography. Biomark Res. 10 (1), 76(2022).
  20. Quevedo-Martínez, J. U., et al. Pro-inflammatory cytokine profile is present in the serum of Mexican patients with different stages of diabetic retinopathy secondary to type 2 diabetes. BMJ Open Ophthalmol. 6 (1), e000717(2021).
  21. Sorkhabi, R., Ahoor, M. H., Ghorbani Haghjo, A., Tabei, E., Taheri, N. Assessment of tear inflammatory cytokines concentration in patients with diabetes with varying severity of involvement. Exp Eye Res. 224, 109233(2022).
  22. Adigal, S. S., et al. Human tear fluid analysis for clinical applications: Progress and prospects. Expert Rev Mol Diagn. 21 (8), 767-787 (2021).
  23. Mackay, D. D., Garza, P. S., Bruce, B. B., Newman, N. J., Biousse, V. The demise of direct ophthalmoscopy: A modern clinical challenge. Neurol Clin Pract. 5 (2), 150-157 (2015).
  24. Saeedi, P., et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition. Diabetes Res Clin Pract. 157, 107843(2019).
  25. Kong, L., et al. Significance of serum microRNAs in pre-diabetes and newly diagnosed type 2 diabetes: A clinical study. Acta Diabetol. 48, 61-69 (2011).
  26. Baldeón, R. L., et al. Decreased serum level of miR-146a as sign of chronic inflammation in type 2 diabetic patients. PLoS One. 9 (12), e115209(2014).
  27. Liang, Y. Z., et al. Identification of neuroendocrine stress response-related circulating microRNAs as biomarkers for type 2 diabetes mellitus and insulin resistance. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 132(2018).
  28. Wan, S., et al. Increased serum miR-7 is a promising biomarker for type 2 diabetes mellitus and its microvascular complications. Diabetes Res Clin Pract. 130, 171-179 (2017).
  29. Santovito, D., et al. Plasma microRNA signature associated with retinopathy in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 11 (1), 4136(2021).
  30. Smit-McBride, Z., et al. Unique molecular signatures of microRNAs in ocular fluids and plasma in diabetic retinopathy. PLoS One. 15 (7), e0235541(2020).
  31. Sun, Y., Liu, W., Zuo, C. Regulatory role of miRNA-23a in diabetic retinopathy. Exp Ther Med. 22 (6), 1-9 (2021).
  32. Wong, W. K. M., et al. MicroRNA profiling from tears as a potential non-invasive method for early detection of diabetic retinopathy. Methods Mol Biol. 2678, 117-134 (2023).
  33. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  34. Arroyo, C. A. -D., et al. Diurnal variation on tear stability and correlation with tear cytokine concentration. Cont Lens Anterior Eye. 45 (6), 101705(2022).
  35. Patel, S., Mittal, R., Kumar, N., Galor, A. The environment and dry eye: Manifestations, mechanisms, and more. Front Toxicol. 5, 1173683(2023).
  36. Benito, M. J., et al. Intra- and inter-day variation of cytokines and chemokines in tears of healthy subjects. Exp Eye Res. 120, 43-49 (2014).
  37. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  38. Shoji, J., Aso, H., Inada, N. Clinical usefulness of simultaneous measurement of the tear levels of CCL17, CCL24, and IL-16 for the biomarkers of allergic conjunctival disorders. Curr Eye Res. 42 (5), 677-684 (2017).
  39. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  40. Vandermeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  41. Benlloch-Navarro, S., et al. Lipid peroxidation is increased in tears from the elderly. Exp Eye Res. 115, 199-205 (2013).
  42. Li, K., Chen, Z., Duan, F., Liang, J., Wu, K. Quantification of tear proteins by SDS-PAGE with an internal standard protein: A new method with special reference to small volume tears. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (6), 853-862 (2010).
  43. Grigor'eva, A. E., et al. Exosomes in tears of healthy individuals: Isolation, identification, and characterization. Biochem (Moscow) Suppl B Biomed Chem. 10 (2), 165-172 (2016).
  44. Hu, L., et al. Discovering the secret of diseases by incorporated tear exosomes analysis via rapid-isolation system: iTEARS. ACS Nano. 16 (8), 11720-11732 (2022).
  45. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. eLife. 10, e70725(2021).
  46. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145(2021).
  47. Aqrawi, L. A., et al. Proteomic and histopathological characterisation of sicca subjects and primary Sjögren's syndrome patients reveals promising tear, saliva and extracellular vesicle disease biomarkers. Arthritis Res Ther. 21 (1), 181(2019).
  48. Aqrawi, L. A., et al. Identification of potential saliva and tear biomarkers in primary Sjögren's syndrome, utilizing the extraction of extracellular vesicles and proteomics analysis. Arthritis Res Ther. 19 (1), 14(2017).
  49. McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D., Ciolino, J. B. Extracellular vesicles secreted by corneal epithelial cells promote myofibroblast differentiation. Cells. 9 (5), 1080(2020).
  50. Atienzar-Aroca, S., et al. Oxidative stress in retinal pigment epithelium cells increases exosome secretion and promotes angiogenesis in endothelial cells. J Cell Mol Med. 20 (8), 1457-1466 (2016).
  51. Liu, J., et al. Roles of exosomes in ocular diseases. Int J Nanomedicine. 15, 10519-10538 (2020).
  52. Kenny, A., et al. Proteins and microRNAs are differentially expressed in tear fluid from patients with Alzheimer's disease. Sci Rep. 9 (1), 15437(2019).
  53. Wijesinghe, P., et al. MicroRNAs in tear fluids predict underlying molecular changes associated with Alzheimer's disease. Life Sci Alliance. 6 (6), e202201757(2023).
  54. Urbizu, A., Arnaldo, L., Beyer, K. Obtaining miRNA from saliva-Comparison of sampling and purification methods. Int J Mol Sci. 24 (3), 2386(2023).
  55. Cirillo, P. D. R., Margiotti, K., Mesoraca, A., Giorlandino, C. Quantification of circulating microRNAs by droplet digital PCR for cancer detection. BMC Res Notes. 13 (1), 351(2020).
  56. Sangalli, E., et al. Circulating microRNA-15a associates with retinal damage in patients with early stage type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 254(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إكسوسومات الدموعالمؤشرات الحيوية لسائل الدموعتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي القطيريعزل الإكسوسوماتتوصيف الحمض الريبي النووي الميكرويتتبع الجسيمات النانويةالتشخيص غير الجراحيالوقاية من فقدان البصر
MIR-15a المستخرج الناتجة عن الدموع كأداة تشخيصية جديدة لاعتلال الشبكية السكري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.