مقالة منهجية

عزل السلف الليفي الأديبوجيني والتوسع والتمايز عن نموذج الفأر الشوكي

DOI:

10.3791/66717

⸱

نوفمبر 15, 2024

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Department of Medical Genetics, University of British Columbia, 2Aspect Biosystems

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول عزل الأسلاف الليفية العضلية الهيكلية والقلبية (FAPs) من الفأر الشوكي (Acomys) عن طريق التفكك الأنزيمي وفرز الخلايا المنشطة بالتألق. يمكن توسيع FAPs التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول بشكل فعال وتمييزها إلى الخلايا الليفية العضلية والخلايا الشحمية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا لبرنامج الإصلاح الاستثنائي ، يعد الفأر الشوكي نموذجا بحثيا ناشئا للطب التجديدي. السلف الليفي الدهني المنشأ عبارة عن خلايا مقيمة في الأنسجة قادرة على التمايز إلى خلايا دهنية وخلايا ليفية وخلايا غضروفية. تعتبر الأسلاف الليفية الأديبوجينية أساسية لتنظيم تجديد الأنسجة لأنها مسؤولة عن إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية بعد الإصابة. تركز هذه الدراسة على التحقيق في الدور المحدد للأسلاف الليفية الأديبوجينية في إصلاح قلب الفأر الشوكي وتجديد العضلات الهيكلية. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تحسين بروتوكول لتنقية أسلاف الفأر الشوكي الليفي الدهني عن طريق قياس التدفق الخلوي من العضلات الهيكلية والقلبية المنفصلة إنزيميا. السكان الذين تم الحصول عليهم من هذا البروتوكول قادرون على التوسع في المختبر ، ويمكن تمييزهم إلى الخلايا الليفية العضلية والخلايا الشحمية. يقدم هذا البروتوكول أداة قيمة للباحثين لفحص الخصائص المميزة للفأر الشوكي ، ومقارنتها بالعضلات الشوكية. سيوفر هذا رؤى يمكن أن تعزز فهم آليات التجدد في هذا النموذج المثير للاهتمام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التعرف على الفأر الشوكي في البداية لبشرته الهشة بشكل استثنائي وقدرته الرائعة على إصلاح إصابات الجلد ، وقد أظهر قدرة فائقة على التجدد في مختلف أجهزة الأعضاء ، مثل الجهاز العضلي الهيكلي والكلوي والجهاز العصبي المركزي والقلب والأوعية الدموية ، عند مقارنته ب Mus musculus 1,2.

السلف الليفي الدهني (FAPs) هي مجموعة فرعية من الخلايا اللحمية الموجودة في الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الهيكل العظمي وعضلة القلب. تمتلك هذه الخلايا قدرة فريدة على الالتزام بالسلالات الليفية والدهنية في الجسم الحي وفي المختبر 3,4. تلعب FAPs دورا حاسما في تجديد الأنسجة عن طريق تعديل المصفوفة خارج الخلية ودعم وظائف أنواع الخلايا الأخرى المشاركة في عملية الإصلاح. في العضلات الهيكلية ، يتم تنشيط FAPs استجابة للإصابة وتسهيل تمايز الخلايا الجذعية العضلية وتكوين العضلات 5,6. في إصابة نقص تروية القلب ، تضع FAPs أنسجة ندبة للحفاظ على سلامة عضلة القلب. على عكس العضلات ، يتم تنشيط FAPs القلبية بشكل مزمن وتساهم في إعادة تشكيل الأمراض 7,8.

أظهرت الدراسات السابقة أن مصفوفة الفأر الشوكي خارج الخلية لها تركيبة وبنية وخصائص مختلفة تدعم التجديد مقارنة ب Mus musculus 9,10. في إصابات العضلات والقلب ، لوحظ أن FAPs تساهم في الشفاء الفائق في الفأر الشوكي11،12،13. إن فهم السلوك والتحكم التنظيمي للفأر الشوكي FAPs والسدى قد يلقي الضوء على الآلية الكامنة وراء قدراتها التجديدية. بينما تتم دراسة FAPs على نطاق واسع في نماذج حيوانية أخرى ، كما هو الحال في mus musculus14,15 ، حاليا ، لا توجد بروتوكولات منشورة لعزل FAPs للفأر الشوكي. إن تطوير مثل هذا البروتوكول من شأنه أن يسد فجوة كبيرة في هذا المجال ويمكن الباحثين من فحص الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء إمكانات التجدد للفأر الشوكي.

يصف هذا البروتوكول بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار لعزل وتوسيع وتمييز FAPs للعضلات الهيكلية والقلبية من الفأر الشوكي. ينتج عن البروتوكول الموصوف هنا معلقات أحادية الخلية عالية الجودة مناسبة لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). باستخدام rh-TGFβ1 أو وسائط متوافقة متاحة تجاريا ، وهما طريقتان تستخدمان على نطاق واسع للتمييز بين العضلات العضلية FAPs16 ، تحافظ FAPs الشوكية المصنفة على قدرتها على التمييز على طول السلالة الليفية والسلالة الأديبية ، على التوالي (الشكل 1).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع إجراءات صيانة والتجارب وفقا لموافقة لجنة رعاية بجامعة كولومبيا البريطانية واللوائح في جامعة كولومبيا البريطانية. تم إيواء في منشأة مغلقة خالية من مسببات الأمراض في ظل الظروف القياسية (دورة الضوء والظلام 12:12 ، 21-23 درجة مئوية ، ومستوى الرطوبة 40٪ -60٪) وقدمت نظاما غذائيا غنيا بالبروتين للفئران والماء حسب الحاجة. تم استخدام الفئران البالغة (من 4 إلى 6 أشهر ، 50-60 جم) من الإناث والذكور Acomys dimidiatus لهذه الدراسة. يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. إعداد الحل والمخزن المؤقت

  1. تحضير 1x محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS).
  2. تحضير PBS-EDTA عن طريق خلط 4 مل من 0.5 M EDTA (2 mM) و 996 مل من 1x PBS ، الرقم الهيدروجيني = 7.4.
  3. تحضير 250 mM CaCl2 بإضافة 2.7745 جم من CaCl2 إلى 100 مل من الماء الخالي من النيوكلياز.
  4. تحضير محلول الهضم: امزج 50 ميكروغرام / مل ليبراز ، 2.5 مللي مول CaCl2 ، و 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) في DMEM / F12.
  5. قم بإعداد المخزن المؤقت FACS عن طريق خلط 488 مل من 1x PBS و 2 مل من 0.5M EDTA و 10 مل من FBS.
  6. تحضير المخزن المؤقت للتطبيق عن طريق خلط المخزن المؤقت FACS مع يوديد البروبيديوم (PI ؛ 1 ميكروغرام / مل).
  7. قم بإعداد الوسائط الأساسية عن طريق خلط DMEM / F12 مع 5٪ FBS ، و 1٪ (v / v) قلم / بكتيريا .
  8. قم بإعداد وسائط الانتشار عن طريق خلط DMEM / F12 مع 10٪ FBS و 1٪ (v / v) قلم / بكتيريا و 2.5 نانوغرام / مل bFGF.
  9. تحضير الوسائط الليفية عن طريق خلط الوسائط الأساسية و 10 نانوغرام / مل rh-TGFβ1 ،
  10. تحضير الوسائط الأديبوجينية (1x) عن طريق خلط DMEM / F12 مع 1٪ قلم / بكتيريا وملحق تمايز 10x منشأ للفأر متاح تجاريا.
  11. تحضير 4٪ PFA بإضافة 4٪ بارافورمالدهيد (w / v) إلى 1x PBS.
  12. تحضير 0.3٪ PBS-Triton عن طريق خلط 498.5 مل من 1x PBS و 1.5 مل من TritonX-100.
  13. قم بإعداد المخزن المؤقت لحظر الحمير عن طريق خلط 5٪ (v / v) مصل حمار ، و 1٪ BSA (w / v) ، و 0.3٪ PBS-Triton.
  14. قم بإعداد المخزن المؤقت لحظر Donkey + MOM عن طريق خلط 2.5 مل من المخزن المؤقت لحظر الحمار وقطرتين من كتلة MOM.
  15. قم بإعداد محلول تلطيخ DAPI عن طريق خلط 600 نانومتر من 4 ′ ، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) في 1x PBS.

2. جمع الأنسجة

  1. القتل الرحيم للحيوان باتباع إرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية. بالنسبة للفئران الشوكية ، يوصى بإيزوفلوران متبوعا بثاني أكسيد الكربون2 (20٪ من حجم القفص / دقيقة) وخلع العمود الفقري لضمان الوفاة.
  2. ضع الماوس على مرحلة التشريح في وضع الاستلقاء ، ورشه جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع التلوث بفراء الفأر.
  3. قم بعمل شق عمودي 2-3 سم عند خط الوسط البطني وكشف القفص الصدري وعضلة البطن. قطع العضلات في عملية الخنجري مع مقص الأنسجة وفضح الحجاب الحاجز. قطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري على كلا الجانبين. استخدم مرقئا لتثبيت وتقشير الأضلاع المقطوعة.
  4. قم بشق الأذين الأيمن بمقص الأنسجة ، ضع إبرة 23 جم متصلة بحقنة سعة 20 مل في قمة القلب ، وقم بحقنها عن طريق حقن 20 مل ببطء من 2 مللي متر PBS-EDTA.
  5. استئص القلب ، وشطف في البرد 1x PBS في طبق بتري 60 ملم على الجليد ، وإزالة الأذينين ، وتنظيف الدم قدر الإمكان.
  6. إزالة الجلد فوق مفصل الركبة. استخدم ملقط ناعم لإزالة اللفافة وعزل عضلة الفخذ بالمقص باستخدام عظم الفخذ كدليل. ضع في طبق بتري منفصل مع 1x PBS الباردة.
  7. كرر الخطوة 2.6 للساق الأخرى.

3. هضم الأنسجة

  1. أضف 2 مل من محلول الهضم إلى قارورة نقل 5 مل للقلب ، و 4 مل من محلول الهضم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل لعضلتين رباعيتي الرؤوس.
  2. فرم الأنسجة بمقص الأنسجة على غطاء طبق بتري إلى أصغر من 1 مم3 قطع.
  3. أضف الأنسجة المفرومة إلى أنابيب الهضم الخاصة بها. دوامة لمدة 2 ثانية بسرعة منخفضة للخلط.
  4. احتضان في 37 درجة مئوية مع دوران لطيف ورج.
  5. بعد 20 دقيقة ، أخرج الأنابيب من المدور واترك قطع الأنسجة تستقر. خلع المادة الطافية باستخدام ماصة P1000 إلى 20 مل من مخزن FACS المثلج البارد في أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل.
  6. قم بتعبئة أنابيب الهضم ب 2 مل و 4 مل من محلول الهضم لهضم القلب والعضلات على التوالي ، وضعها مرة أخرى عند 37 درجة مئوية مع دوران لطيف ورج.
  7. كرر الخطوات من 3.5 إلى 3.6 مرة أخرى بعد 20 دقيقة أخرى. ضع المادة الطافية في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل من الخطوة 3.5.
  8. أوقف عملية الهضم بعد 60 دقيقة عن طريق إخماد المخزن المؤقت للهضم باستخدام محلول FACS المثلج البارد.
  9. قم بتصفية معلق الهضم والمادة الطافية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر فوق أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل. قم بتعبئة ما يصل إلى 40 مل باستخدام المخزن المؤقت FACS.
  10. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت لتحلل ACK. احتضانها على الثلج لمدة 5 دقائق وقم بتعبئة ما يصل إلى 40 مل باستخدام مخزن FACS المؤقت.
  11. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب الطاف.
  12. أعد التعليق في 0.5 مل من المخزن المؤقت FACS ، مع السحب لأعلى ولأسفل لضمان تشتت الخلايا بالتساوي.
  13. قم بتصفية التعليق من خلال مرشح 40 ميكرومتر على أنابيب البوليسترين ذات القاع المستدير سعة 5 مل مع غطاء مصفاة خلوية.

4. تلطيخ لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS)

  1. بالنسبة لعناصر التحكم أحادية اللون والتألق ناقص واحد (FMO) ، قم بإعداد 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ (الأجسام المضادة المخففة في المخزن المؤقت FACS) بتركيز عمل 2x في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل الموسومة مسبقا. راجع الجدول 1 لإعداد المخزن المؤقت لتلطيخ الأجسام المضادة.
  2. قم بإعداد الألوان الفردية وعناصر التحكم في FMO للعضلات والقلب بشكل منفصل.
  3. انقل 30 ميكرولتر من اللون الواحد و FMO التحكم في المخزن المؤقت للتلطيخ إلى لوحة 96 بئرا. قم بتعبئة 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  4. بالنسبة لعينة تلطيخ FACS ، قم بإعداد 0.5 مل من محلول التلوين (الجسم المضاد المخفف في المخزن المؤقت FACS) بتركيز عمل 2x في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل.
  5. أضف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى لون واحد وآبار التحكم في FMO. أضف المخزن المؤقت للتلطيخ إلى بقية تعليق الخلية وإنعاشها.
  6. احتضان في درجة حرارة 4 درجة مئوية ، محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة.
  7. قم بتعبئة الآبار ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وأنبوب العينة ب 2 مل من المخزن المؤقت FACS.
  8. أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية.
  9. كرر الخطوتين 4.7 و4.8.
  10. أعد تعليق بيليه الخلية في المخزن المؤقت للصلاحية. 100 ميكرولتر للون الواحد وعناصر التحكم FMO ، 1 مل لعينات فرز FACS.
  11. قم بإعداد أنابيب التجميع بإضافة 300 ميكرولتر من وسائط الانتشار في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.7 مل.

5. فرز الخلايا المنشط بالفلورة

  1. استراتيجية البوابة: استخدم FSC مقابل. SSC (سجل) لإزالة الحطام. استخدم FSC-H مقابل. FSC-A لبوابة الفردي. استخدم CD31 مقابل. PI إلى البوابة على خلايا قابلة للحياة وسالبة النسب. استخدم PDGFRα لبوابة FAPs (الشكل 2).
  2. فرز في أنابيب جمع أعدت مسبقا.

6. زراعة الأنسجة

  1. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المجمعة عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة P1000. احرص على عدم إزعاج بيليه الخلية.
  3. أعد تعليق الحبيبات في وسط الاستزراع (250 ميكرولتر / بئر) والبذور عند 25 ألف خلية / بئر في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 48 بئرا.
  4. الثقافة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2). قم بتغيير الوسائط كل 3 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪.

7. التمايز الليفي

  1. بمجرد أن تصبح الخلايا جاهزة للعلاج ، ضع الوسائط الأساسية و 1x DPBS في حمام دافئ أو في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
  2. نضح وسائل الإعلام الثقافية.
  3. شطف مع 200 ميكرولتر من 1x DPBS مرتين.
  4. شطف مع 200 ميكرولتر من الوسائط الأساسية مرة واحدة.
  5. أضف 250 ميكرولتر من الوسائط الليفية أو الأساسية إلى الآبار المعنية.
  6. أعد الخلايا إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  7. أوقف التمايز بعد 48 ساعة.

8. التمايز الأديبوجيني

  1. بمجرد أن تصبح الخلايا جاهزة للعلاج ، ضع الوسائط الأساسية والوسائط الدهنية و 1x DPBS في حمام دافئ أو في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
  2. نضح وسائل الإعلام الثقافية.
  3. شطف مع 200 ميكرولتر من 1x DPBS مرتين.
  4. شطف مع 200 ميكرولتر من الوسائط الأساسية مرة واحدة.
  5. أضف 400 ميكرولتر من الوسائط الدهنية أو الأساسية إلى الآبار المعنية.
  6. العودة إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  7. كل يومين ، قم بإزالة وسائط 200 ميكرولتر باستخدام ماصة من الآبار وأضف 200 ميكرولتر من الوسائط الدهنية أو الأساسية الطازجة.
  8. توقف عن التمايزفي اليوم 6 ل FAPs العضلات والهيكل العظمي ،واليوم 14 ل FAPs القلبية.

9. تلطيخ المناعة

  1. أوقف مقايسة التمايز عن طريق شفط الوسائط والشطف باستخدام 250 ميكرولتر من 1x PBS مرتين. قم بإجراء جميع عمليات الغسيل بإبرة 18 جم متصلة بحقنة سعة 3 مل لتجنب انفصال الخلايا.
  2. أضف 250 ميكرولتر من 4٪ PFA لكل بئر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
  3. قم بإزالة PFA واشطفه 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة باستخدام 250 ميكرولتر من 1x PBS.
  4. في الغسلة الأخيرة ، نضح 1x PBS وأضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحظر Donkey + MOM.
  5. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
  6. قم بإعداد محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأساسي في المخزن المؤقت لحجب الحمير (مضاد SMA ومضاد للبيريليبين) لحجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر.
  7. نضح آبار تلطيخ. اترك المخزن المؤقت لحظر Donkey + MOM تحت السيطرة جيدا إن أمكن.
  8. أضف محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأساسي في الآبار المعنية.
  9. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  10. في اليوم التالي ، اغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة باستخدام 1x PBS.
  11. قم بإعداد محلول تلطيخ الأجسام المضادة الثانوي في المخزن المؤقت لحجب الحمير بحجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر.
  12. نضح الغسيل الأخير وإضافة محلول تلطيخ الأجسام المضادة الثانوي في جميع الآبار.
  13. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة (يجب حماية العينات من الضوء من هذه النقطة فصاعدا).
  14. اغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة باستخدام 1x PBS.
  15. نضح الغسيل الأخير وإضافة 250 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI.
  16. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  17. قم بإزالة محلول تلطيخ DAPI واغسله مرة واحدة لمدة 5 دقائق باستخدام 1x PBS.
  18. أضف 100 ميكرولتر من Fluoromount-G في كل بئر.
  19. أغلق اللوحة بالغطاء وفيلم البارافين لتقليل التبخر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء حتى التصوير.
  20. صورة بالمجهر (الشكل 3 والشكل 4).
    ملاحظة: يستخدم مصل الحمير في منع المخزن المؤقت ككتلة خاصة بالأنواع ضد الأجسام المضادة الثانوية التي يثيرها الحمار والتي تستخدم في هذا البروتوكول. يتم استخدام كاشف حظر الماوس على الماوس ضد الجسم المضاد الأساسي المضاد ل SMA الذي يتم رفعه في الماوس.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلخص الشكل 1 الشكل التخطيطي لهذا البروتوكول لعزل وزراعة العضلات الهيكلية وفضلات الساقين القلبية. لجمع الأنسجة ، عادة ما يكون لون الكبد المتغير من الأحمر الداكن إلى الأصفر الباهت مؤشرا على نجاح التروية. مع الفئات العمرية المحددة للفأر الشوكي ، تكون أوزان القلب عادة حوالي 200 مجم ، بينما تبلغ عضلة الفخذ حوالي 350 مجم.

أثناء كل تغيير في محلول الهضم في الخطوات 3.5-3.7 ، يبدو مخزن الهضم في أنابيب الهضم معتما حيث يتم إطلاق الخلايا من الأنسجة. في نهاية عملية الهضم ، يجب أن يكون المحلول ملاطا متجانسا نسبيا مع بقاء بعض قطع الأنسجة. تأكد من إنهاء الهضم قبل هضم جميع الأنسجة تماما لتجنب الإفراط في الهضم ، مما سيؤثر سلبا على صلاحية الخلايا ونتائج الثقافة.

ويبين الشكل 2 مخططات التدفق المتوقعة لنظام مراقبة الأصول الميدانية (FACS). من المتوقع أن تمثل FAPs حوالي 2٪ من الخلايا الحية وخلايا LIN. النسبة المئوية لأحداث PI + هي مؤشر على جودة تحضير العينة ويجب أن تكون أقل من 10٪. في هذه الدراسة ، عادة ما يتم الحصول على 150 ألف FAPs لكل قلب (البطينين فقط) و 100 ألف FAPs من عضلتين رباعية الرؤوس.

بمجرد دخول اللوحة ، تلتصق الخلايا عادة في غضون 72 ساعة ، وتصل إلى التقاء 80٪ في غضون 5 أيام ، وتعرض مورفولوجيا الخلايا الليفية النموذجية مع الإسقاطات (الشكل 5).

figure-results-1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول والوقت التقريبي اللازم لكل خطوة. جمع المناديل: 10 دقائق لكل فأر. هضم الأنسجة: 1.5-2 ساعة. تلطيخ الخلايا: 45 دقيقة - 75 دقيقة. فرز الخلايا المنشطة بالتألق: 2 ساعة. توسع السلف الليفي الدهني (FAP): 4 أيام. تمايز FAP: 48 ساعة للتمايز الليفي ، و 6 أيام للتمايز الشحمي ل FAPs للعضلات الهيكلية ، و 14 يوما ل FAPs القلبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مخططات FACS التمثيلية لعزل العضلات الهيكلية (أعلى) والقلب (أسفل) FAP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تمايز العضلات الهيكلية الشوكية لفأر الأرصاد الوهمية. أ: التحكم في التمايز الليفي. ب: التمايز الليفي. ج: التحكم في التمايز الأديبوجيني. د: التمايز الأديبوجيني. Perilipin (أخضر) ، SMA (أرجواني) ، DAPI (أزرق) ، شريط مقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تمايز FAP القلبي للفأر الشوكي. أ: التحكم في التمايز الليفي. ب: التمايز الليفي. ج: التحكم في التمايز الأديبوجيني. د: التمايز الأديبوجيني. Perilipin (أخضر) ، SMA (أرجواني) ، DAPI (أزرق) ، شريط مقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: صور برايتفيلد لعضلة الهيكل العظمي للفأر الشوكي (A) والقلب (B) FAPs بعد 5 أيام من المزرعة ، قبل التمايز. شريط المقياس = 360 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

عناصر التحكمCD31 SCPDGFRα SCCD31 FMOPDGFRα FMOعينة
الجسم المضاد CD31+--++
الجسم المضاد PDGFRα-++-+

الجدول 1: دليل تخطيطي لإعداد كوكتيلات تلطيخ الأجسام المضادة للضوابط والعينات. SC = التحكم في لون واحد ، FMO = مضان ناقص عنصر تحكم واحد ، + = مع الجسم المضاد المقابل ، - = بدون الجسم المضاد المقابل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنسجة الفئران الشوكية أكثر حساسية للضغوط في تفكك الأنسجة ، وهناك عدة جوانب من هذا البروتوكول تهدف إلى تقليل الإجهاد لتحسين صلاحية الخلية. يتم استخدام تقنية التفكك الأنزيمي التسلسلي لإعداد العينة لخفض تركيز الإنزيم المطلوب. مع استمرار الهضم الأنزيمي ، ينخفض النشاط الأنزيمي. من خلال استبداله بإنزيمات جديدة ، يمكن تحقيق نشاط إنزيمي ثابت في جميع أنحاء عملية الهضم بأكملها بشكل أفضل ، ويتم تجنب تركيزات عالية من الإنزيم. علاوة على ذلك ، يتم تجنب تغيير المخزن المؤقت للهضم المفرط للخلايا التي تم إطلاقها بالفعل في المحلول. ثانيا ، يتم استخدام المخزن المؤقت لتحلل ACK لإزالة خلايا الدم الحمراء. على الرغم من أن القلب مثقوب ومعطر ، إلا أنه لا يزال يحتوي على خلايا دم حمراء لأنه عضو شديد الأوعية الدموية. عن طريق إزالة خلايا الدم الحمراء الملوثة ، يتم تقليل الوقت اللازم ل FACS لتجنب تدهور الخلايا. أخيرا ، من المهم العمل بسرعة وجدية من الخطوة 2.1 إلى الخطوة 6.4 ، واتباع أفضل الممارسات للعمل مع الخلايا ، مثل السحب اللطيف والحفاظ على الثلج قدر الإمكان. يصعب عرض بعض التفاصيل حتى في التنسيق السمعي البصري وقد تتطلب مستوى معينا من الخبرة.

في زراعة الخلايا ، تعد كثافة البذر الأولية أمرا بالغ الأهمية لتوسيع الخلية الأمثل. تتواصل FAPs في الطبق بطريقة paracrine وتحفز النمو عن طريق عوامل النمو المفرزة. في ظروف كثافة البذر المنخفضة ، لا تتلقى الخلايا إشارات كافية للنمو وستفشل في التوسع أو تتطلب وقتا إضافيا للزراعة للوصول إلى مستويات التقاء مناسبة للتطبيقات النهائية. هذا هو أيضا الأساس المنطقي لتغيير نصف الوسائط فقط خلال كل تغيير إعلامي في التمايز الدهني. من المهم ترك بعض الوسائط المشروطة التي تحتوي على عوامل النمو من الخلايا الشحمية التي تعتبر حاسمة لتمايزها.

أثناء التلوين المناعي ، من المهم أن تكون لطيفا عند إضافة أو إزالة المخازن المؤقتة لتقليل انفصال الخلايا. على وجه الخصوص ، في الخطوة 9.1 ، تكون الخلايا هي الأكثر عرضة للانفصال قبل التثبيت. يوصى بالشفط اليدوي ، مثل ماصة أو إبرة وحقنة ، ولكن لا ينصح باستخدام شفاطات فراغ قوية.

أحد قيود هذا البروتوكول هو أن PDGFRα هي علامة عامة ل FAPs ، وهناك حاجة إلى المزيد من العلامات لتمييز الأنواع الفرعية الفريدة من FAPs17. الأنواع الفرعية مثل أسلاف DPP4 + مثل FAPs و CD10 + FAPs الدهنية المنشأ متورطة في كل من المرض وسياق الاستتباب18،19،20. من المحتمل أن توجد مجموعات فرعية من FAP أيضا في الفأر الشوكي. قد توجد بنسب مختلفة ، أو تظهر سلوكا خلويا مختلفا ، أو لها وظائف فسيولوجية مختلفة مقارنة بالمجموعات الفرعية المقابلة لعضلة العضلات FAP. ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين للعلامات الخاصة بالنوع الفرعي FAP في الماوس الشوكي لفحص تفاصيل FAPs للفأر الشوكي.

باختصار ، يفصل هذا البروتوكول طريقة قوية وقابلة للتكرار لعزل وزراعة وتمييز العضلات الهيكلية و FAPs القلبية من الفأر الشوكي. يكتسب الفأر الشوكي زخما كنموذج حيواني جديد مفرط التجدد. FAPs والسدى متورطان بشكل كبير في الحفاظ على توازن العضلات والقلب ويساهمان في اختلال وظائف الأعضاء في نماذج الأمراض المزمنةالمتعددة 5,7. قد يوضح توصيف FAPs للفأر الشوكي الآلية الكامنة وراء قدرتها التجديدية الرائعة ويمهد الطريق نحو استراتيجيات جديدة في الطب التجديدي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعرب عن تقديرنا لآندي جونسون وجوستين وونغ ، قلب تدفق UBC ، لخبرتهما ومساعدتهما في تحسين بروتوكول FACS ، بالإضافة إلى موظفي منشأة في مركز البحوث الطبية الحيوية بجامعة كولومبيا البريطانية لرعاية الفئران الشوكية. تم عمل الشكل 1 باستخدام Biorender. تم عمل الشكل 2 باستخدام برنامج FlowJo.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 م EDTAInvitrogen15575 &ndash ؛ 038
1.7 مل أنابيب الطرد المركزيVWR87003-294
15  مل أنبوب الطرد المركزيفالكون352096
1x Dulbecco s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS)جيبكو14190-144
20 مل حقنةBD309661
4 & ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)InvitrogenD3571
40  ؛ مو مصفاة خلية mFalcon352340
48 بئر لوحة زراعة الأنسجة ذات القاع المسطحFalcon53078
5 مل من مادة البولي بروبيلينفالكون352063
5 مل أنبوب البوليسترين المستدير القاع مع غطاء مصفاة الخليةFalcon352235
5 مل حقنةBD309646
50 & nbsp ؛ أنبوب الطرد المركزي ملفالكون352070
طبق بتري 60 ممفالكون353002
96 بئر لوحة زراعة الأنسجة على شكل حرف Vكورنينج3894
Acomys dimidiatus< / em> الفئران (الفئران الشوكية)موهوبة بلطف من قبل الدكتور آشلي دبليو سيفرت (جامعة كنتاكي).
عازلة التحلل الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK)GibcoA10492-01
Anti-perilipin (1: 100)SigmaP1873
Anti-SMA (1: 100)Invitrogen14-9760-82
APC PDGFRa (1: 800) Abcamab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 GBD305195
BD PrecisionGlide Needle 23 GBD305145
ألبومين مصل الأبقارSigmaA7906-100g
BV605 CD31 (1: 500)BD biosciences744359
CaCl 2< / sub>Sigma-AldrichC4901
جهاز طرد مركزيEppendorf5810R
DMEM / F12Gibco11320033
الحمار المضاد للفأر Alexa 555 (1: 1000)InvitrogenA31570
الحمار المضاد للأرانب Alexa 647 (1: 1000)InvitrogenA31573
مصل الحمارSigmaS30-100ML
فارز FACS - MoFlo Astrios 5 ليزرBeckman coulterB52102
مصل بقري الجنينالجوزاء100-500
مقص ناعمFST14058-11
فلوروماونت-جيساوثرن بيوتك0100-01
ملقطFST11051-10
HemostatFST91308-12
بروتين مؤتلف بشري FGF الأساسي (bFGF)جيبكو13256029
بروتين مؤتلف TGF بيتا 1 البشري (TGFb1)eBiosciences14-8348-62
حاضنة - Heracell 160i CO2< / sub>ThermoFisher51033557
مجهر مقلوب - RevolveECHOn / a
LiberaseRoche5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x SupplementSTEMCELL technologies5507
Mouse on mouse (MOM) يحجب الكاشفمختبراتناقلاتMKB-2213
بارافورمالديهايدسيجماP1648-500 جم
بنسلين ستربتومايسينجيبكو15140 &ndash ؛ 122
PicoLab Mouse Diet 20LabDiet3005750-220
بروبيديوم يوديد (PI)InvitrogenP3566
قارورة نقل 5 مل أنبوبCaplugs دائم الخضرة222-3005-080
Triton X-100Sigma9036-19-5
الدقيقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1(2021).
  2. Sandoval, A. G. W., Maden, M. Regeneration in the spiny mouse, Acomys, a new mammalian model. Curr. Opin. Genet. Dev. 64, 31-36 (2020).
  3. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. A. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: Collaborators or saboteurs. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
  4. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. J Cell Sci. 124, 3654-3664 (2011).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
  6. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 122 (12), 143-152 (2010).
  7. Soliman, H., et al. Pathogenic Potential of Hic1-Expressing Cardiac Stromal Progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
  8. Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease. J Am Heart Assoc. 10, 1-15 (2021).
  9. Gawriluk, T. R., et al. Comparative analysis of ear-hole closure identifies epimorphic regeneration as a discrete trait in mammals. Nat Commun. 71 (7), 1-16 (2016).
  10. Seifert, A. W. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561(2012).
  11. Koopmans, T., et al. Ischemic tolerance and cardiac repair in the spiny mouse (Acomys). NPJ Regen Med. 6, 78(2021).
  12. Peng, H., et al. Adult spiny mice (Acomys) exhibit endogenous cardiac recovery in response to myocardial infarction. NPJ Regen Med. 6, 74(2021).
  13. Maden, M., et al. Perfect chronic skeletal muscle regeneration in adult spiny mice, Acomys cahirinus. Sci Rep. 8, 8920(2018).
  14. Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle. J Vis Exp. (184), e63983(2022).
  15. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods Mol Biol. 1556, 179-189 (2017).
  16. Molina, T., Fabre, P., Dumont, N. A. Fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle homeostasis, regeneration and diseases. Open Biol. 11 (12), 210110(2021).
  17. Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skelet Muscle. 111 (11), 1-25 (2021).
  18. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 61 (6), 1-21 (2023).
  19. Babaeijandaghi, F., et al. DPPIV+ fibro-adipogenic progenitors form the niche of adult skeletal muscle self-renewing resident macrophages. Nat Commun. 141 (14), 1-10 (2023).
  20. Schutz, P. W., Cheung, S., Yi, L., Rossi, F. M. V. Cellular activation patterns of CD10+ fibro-adipogenic progenitors across acquired disease states in human skeletal muscle biopsies. Free Neuropathol. 5, 3-3 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة