مقالة منهجية

نمذجة العدوى المهبلية الصاعدة والولادة المبكرة ومراضة حديثي الولادة لدى الفئران

1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66723

⸱

أكتوبر 10, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1EGA Institute for Women's Health, University College London, 2Department of Women and Children's Health, St Thomas' Hospital, King's College London

في هذه المقالة

ملخص

الولادة المبتسرة (الولادة < 37 أسبوعا) هي قضية صحية عالمية ملحة مع خيارات الوقاية والعلاج دون المستوى الأمثل. نقدم نموذجا للفأر للولادة المبكرة الناجمة عن العدوى البكتيرية المهبلية الصاعدة ونوضح كيفية تحليل المراضة والوفيات الناتجة لحديثي الولادة.

الملخص

لا تزال الولادة المبتسرة سببا رئيسيا لوفيات الأطفال حديثي الولادة ومراضتهم على مستوى العالم، مع محدودية العلاجات الوقائية. هناك حاجة ملحة سريريا
نماذج حيوانية ذات صلة وقابلة للتكرار لترجمة التدخلات المبتكرة
لتصبح حقيقة واقعة. توجد نماذج مختلفة من الفئران للولادة المبكرة. ومع ذلك ، فإنها لا تلخص أمراض حديثي الولادة البشرية ، بما في ذلك التغيرات المرضية العصبية و
إصابة الرئة ، وهي عواقب مميزة للعدوى الصاعدة والولادة المبكرة. لقد وصفنا نموذجا ، على حد علمنا ، هو النموذج الوحيد الذي يحاكي السيناريو البشري حيث توجد هذه الأمراض الوليدية بعد تحريض الولادة المبكرة بواسطة بكتيريا حية تصعد من المهبل. توضح هذه الورقة الإعطاء داخل المهبل لسلالة متوهجة بيولوجيا من الإشريكية القولونية وتوضح بالتفصيل تقييم النتائج العصبية المرضية وإصابات الرئة باستخدام تقنيات الكيمياء المناعية والأنسجة.

المقدمة

الولادة المبتسرة (PTB ؛ الولادة < 37 أسبوعا) هي المساهم الرئيسي في وفيات حديثي الولادة في جميع أنحاء العالم1،2. تمثل 11٪ من جميع الولادات ، وهي مشكلة صحية عالمية كبرى مع مسببات معقدة غير مفهومة جيدا ، مما يجعل من الصعب التنبؤ والوقايةمنها 3،4،5. قد يعاني الناجون حديثو الولادة من PTB من نتائج ضارة في النمو العصبي ، بما في ذلك الشلل الدماغي واضطرابات الجهاز التنفسي ، مثل خلل التنسج القصبي الرئوي (BPD) ، واضطرابات الجهاز الهضمي مثل التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) 6،7،8. لذلك ، هناك حاجة ملحة لنماذج حيوانية ذات صلة سريريا وقابلة للتكرار لمعالجة المسارات البيولوجية التي تساهم في PTB وتطوير تدخلات مبتكرة.

هناك عدد من الآليات المحتملة الكامنة وراء PTB التلقائي ، مثل الشيخوخة النفضية ، أو انهيار تحمل الأم والجنين ، أو الإجهاد ، أو قصر طول عنق الرحم ، أو تلف عنق الرحم9. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن ما لا يقل عن 40٪ من PTBs العفوية مرتبطة بالعدوى الميكروبية10،11. يتم افتراض الميكروبات الصاعدة من القناة المهبلية عبر عنق الرحم إلى الرحم ومقبولة على نطاق واسع كطريق شائع للعدوى بسبب الارتباط بين الميكروبات المعزولة من السائل الأمنيوسي وتلك الموجودة في الجراثيم المهبلية12،13،14. تشمل الكائنات الحية الدقيقة التي غالبا ما ترتبط بالولادة المبكرة أنواعا من الميكوبلازما واليوريابلازم والفوزوباكتريا والمكورات العقدية ، ومعظم الحالات متعددة الميكروبات15،16.

غالبا ما تستخدم الفئران لنمذجة PTB ، حيث يتمثل النهج الأكثر شيوعا في إعطاء عديدات السكاريد الدهنية السامة البكتيرية (LPS) ، والتي يمكن توصيلها عبر طرق داخل الرحم أو داخل الصفاق أو داخل السلى للحث على مستويات الالتهاب اللازمة لبدء الولادة17. ومع ذلك ، فإن LPS لا يصنف العدوى الميكروبية الحية ، والأهم من ذلك ، لا يمكن قياس نتائج حديثي الولادة في هذه النماذج لأن LPS يؤدي إلى موت الجنين18. في السنوات الأخيرة ، تم تطوير نماذج حيوانية للعدوى البكتيرية المهبلية الصاعدة ، لكن تلخيص كل من الولادة المبكرة ونتائج حديثي الولادة المرتبطة بها كان تحديا19،20،21،22،23،24.

أنشأت مجموعتنا نموذجا جديدا للعدوى البكتيرية المهبلية الصاعدة ، والولادة المبكرة ، ومراضة حديثي الولادة التي تلخص الفيزيولوجيا المرضية ل PTB25 البشري. هنا ، نوضح كيفية تقييم علم الأمراض العصبية لحديثي الولادة وإصابات الرئة في الجراء المعرضين للعدوى المهبلية الصاعدة للأم مع سلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض (الإشريكية القولونية) التي تم ربطها بالتهاب السحايا الوليدي البشري. يوفر هذا النموذج فرصة فريدة لاستكشاف الفيزيولوجيا المرضية للعدوى الصاعدة ، بالإضافة إلى توفير الوسائل لتقييم فعالية تدخلات المخاض المبكر في تحسين نتائج حديثي الولادة.

البروتوكول

تم إجراء الإجراءات بموجب ترخيص وزارة الداخلية البريطانية (PAD4E6357) وفقا لقانون الإجراءات العلمية للحيوان (1986) وإرشادات ARRIVE. تم التحكم بإحكام في درجة الحرارة (19-23 درجة مئوية) والرطوبة (~ 55٪) ودورات الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة. أنثى العذراء C57BL / 6 Tyrc-2J الفئران (الذين تتراوح أعمارهم بين 6 و 12 أسبوعا) كانت متزاوجة بين عشية وضحاها لمدة 16-18 ساعة. تم تعيين دليل على سدادة الجماع على أنها يوم جنيني (E) 0.5.

الإشريكية القولونية المسببة للأمراض O18: K1 (A192PP) 26 ، سلالة مرت من الفئران من A192 (DSM. رقم 10719) 27 ، تم تعديله لاحتواء أوبرون لوكس (luxCDABE) ، الذي نشأ من الديدان الخيطية المتكافلة Photorhabdus Luminescens ATCC29999 (سلالة Hb) ، بما في ذلك كاسيت مقاومة الكانامايسين (Km2) 28. تم تصنيف هذه السلالة على أنها مجموعة الخطر 2 من قبل اللجنة الاستشارية لحكومة المملكة المتحدة بشأن مسببات الأمراض الخطرة (ACDP). ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) واتبع الإرشادات المحلية عند التعامل مع العوامل البيولوجية والتخلص منها.

1. نموذج الفأر للعدوى البكتيرية المهبلية الصاعدة

  1. تحضير مزارع الإشريكية القولونية
    1. قم بإعداد مرق Luria-Bertani (LB) عن طريق إذابة المسحوق في الماء المقطر (dH2O) لعمل محلول 20٪ وأوتوكلاف. بمجرد أن يبرد LB إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 50 ميكروغرام / مل كانامايسين. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
    2. قم بإعداد محلول جل البلورونيك F127 بنسبة 20٪ عن طريق إذابة المادة الصلبة في محلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS). دوامة للخلط والتحريك عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    3. أضف 10 مل من مرق LB المعالج بالمضادات الحيوية إلى حاوية عالمية معقمة سعة 30 مل. قم بإزالة مخزون الجلسرين المجمد من الإشريكية القولونية من التخزين -80 درجة مئوية. باستخدام طرف ماصة معقم ، اكشط مخزون الجلسرين المجمد من الإشريكية القولونية لتغطية نهاية الطرف برفق وإخراج الطرف مباشرة في مرق LB. قم بتأمين الحاوية العالمية بالبارافيلم ، وقم بتسميتها على أنها خطر بيولوجي ، وضعها في شاكر مداري طوال الليل (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية.
    4. في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف المزرعة البكتيرية 1:100 (0.1 مل من المزرعة + 9.9 مل من مرق LB الطازج) وأعيدها إلى شاكر المداري لمدة 1.5-3 ساعات (200 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية) ، وفحص نمو المزرعة بانتظام عن طريق قياس الامتصاص عند 600 نانومتر. ماصة 100 ميكرولتر من المزرعة مكررة في صفيحة شفافة ذات قاع مسطح من 96 بئرا. قم بقياس الامتصاص على مقياس الطيف الضوئي مع تنشيط تصحيح طول المسار. يشير OD600 بين 0.5 و 0.7 إلى مرحلة النمو الوسطية.
    5. عند الوصول إلى OD600 0.5-0.7 (~ 108-9 وحدات تشكيل مستعمرة [CFU]) ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية وقم بتخفيفها في 900 ميكرولتر من PBS المعقمة. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 1 دقيقة لغسل الحبيبات البكتيرية وإزالة مرق LB. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في PBS المعقمة ، وقم بتخفيف 1: 10,000 في PBS المعقمة (إلى 102-3 CFU).
    6. تطهير جميع الأطراف والحاويات المعرضة للبكتيريا قبل التخلص منها.
  2. تخدير
    1. في E16.5 ، قم بتخدير الفئران الحامل عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (5٪ للتحريض ، 1.5٪ للصيانة في الأكسجين). نقل تدفق التخدير ثم إلى مخروط الأنف ، ووضع الأنثى في وضع الانبطاح. تأكد من التخدير عن طريق عدم وجود رد فعل قرصة إصبع القدم والحفاظ على الأيزوفلوران عند الحد الأدنى للنسبة المطلوبة للإجراء.
      تنبيه: الأيزوفلوران هو مادة سامة للعين والجلد والجهاز العصبي المركزي. ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة. استخدم دائما نظام الكسح.
    2. قم بإعطاء 20 ميكرولتر من الإشريكية القولونية في المرحلة الوسطى (1 × 102-3 CFU معلقة في PBS المعقمة) أو PBS المعقمة (التحكم في المركبة) في المهبل باستخدام طرف ماصة معقم 200 ميكرولتر (الشكل 1). باستخدام طرف ماصة جديد معقم 200 ميكرولتر ، قم بتوصيل 20 ميكرولتر من جل البلورونيك F127 بنسبة 20٪ في المهبل لمنع تسرب البكتيريا. باستخدام شاش معقم ، ضع مسحوق الكينين على الأنبوب الداخلي لردع الفئران عن تنظيف المعلق البكتيري. سجل تاريخ ووقت العلاج.
      ملاحظة: استندت CFU المستخدمة إلى تجارب المعايرة بالتحليل الحجمي لتحقيق النمط الظاهري المطلوب (الولادة المبكرة مع الجراء الحية). يمكن تحديد CFU عن طريق إجراء التخفيفات التسلسلية والطلاء على ألواح LB agar29.
    3. قفص منفردة في أقفاص جيدة التهوية بشكل فردي (IVC) والسماح لها بالتعافي من التخدير قبل إعادة القفص إلى غرفة الاحتجاز ؛ ضع علامة واضحة على القفص على أنه خطر بيولوجي. راقب حتى يستأنف سلوكها الطبيعي.
      ملاحظة: يجب ألا يستغرق هذا الإجراء أكثر من 5 دقائق ، ويجب أن تتعافى بسرعة (في غضون 2-5 دقائق).
  3. قياس نتائج الحمل
    1. قم بإعداد الدوائر التلفزيونية المغلقة عن طريق إرفاق كاميرا واحدة بالجزء الخارجي من كل قفص لمراقبة الفئران بحثا عن علامات الولادة وولادة الجرو. يتم تسجيل الوقت المستغرق حتى الولادة كعدد الساعات من وقت إعطاء الإشريكية القولونية أو PBS داخل المهبل (الخطوة 1.2.2) إلى ولادة الجرو الأول.
    2. سجل عدد الجراء الأحياء / الأموات عند الولادة واحسب النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة لكل قمامة. راقب السد والجراء يوميا ، وسجل بقاء الجراء حتى 7 أيام بعد الولادة وضمان استعادة السدود. خذ قياسات أخرى ، مثل وزن الجرو وطوله ، خلال هذه الفترة.
      ملاحظة: تشمل إشارات الولادة زيادة الاستمالة ، والدوران في دوائر ، وتمدد وطرد أرجلهم الخلفية. نظرا لأن هذه عدوى بكتيرية حية ، فإن السدود ستصاب بالأعراض بمرور الوقت (عادة بعد 24 ساعة من العلاج). يجب أن تتعافى الأنثى من العدوى ولكن إذا كانت لا تزال تظهر عليها أعراض العدوى بعد الولادة ، أو لم تقم ببناء عش ، أو إطعام صغارها خلال اليوم الأول ، فقم بالتضحية بالحيوانات بشكل إنساني باستخدام طرق الجدول 1 (مثل التعرض لثاني أكسيد الكربون2 بتركيز متزايد وتأكيد الوفاة بسبب خلع عنق الرحم).
  4. تصوير التلألؤ البيولوجي
    1. بعد التلقيح البكتيري ، قم بتصوير الإناث في 24 ساعة و 48 ساعة لتتبع انتشار العدوى ، كما هو موضح أدناه. قم بتصوير الجراء في يوم ما بعد الولادة (P) 0 حتى P14 دون الحاجة إلى تخدير.
    2. بعد فتح برنامج التصوير ، انقر فوق تهيئة وانتظر حتى تصل الكاميرا إلى درجة حرارة التشغيل (سيتحول شريط درجة الحرارة إلى اللون الأخضر و "يقفل"). حدد المربع الخاص بالتصوير المضيء، وتأكد من ضبط مرشح الإثارة على حظر وتعيين مرشح الانبعاث على فتح.
    3. تخدير الإناث البالغات عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (5٪ للتحريض ، 1.5٪ للصيانة في الأكسجين). ضع في وضع ضعيف في آلة التصوير الحيوي (بمرحلة ساخنة) مع الحفاظ على التخدير للفئران. حدد وقت التعريض الضوئي التلقائي أو اضبط وقت التعريض الضوئي يدويا (نطاق التعريض الضوئي: 1 دقيقة - 5 دقائق). بعد التصوير ، أعد إلى أقفاصها للتعافي من التخدير قبل إعادتها إلى غرفة الانتظار.
    4. لقياس إشعاع الفوتون كميا ، حدد مناطق الاهتمام (ROIs) على صور الماوس وسجل الفوتونات في الثانية لكل سنتيمتر مربع لكل ستيراديان (فوتونات ∙ (ثانية سم2) -1∙sr-1).

2. تحليل أنسجة الجنين وحديثي الولادة

  1. جمع الأنسجة في الفترة المحيطة بالولادة
    1. في E18.5 ، التضحية بالسد عن طريق التعرض لارتفاع تركيز ثاني أكسيد الكربون2 وتأكيد الوفاة بسبب خلع عنق الرحم وإجراء شق البطن المصغر لإزالة الرحم ؛ ثم قم بعمل شق في الرحم باستخدام المقص.
    2. في حالة جمع السائل الأمنيوسي ، قم بعمل شق صغير في الأغشية واجمع السائل باستخدام ماصة باستور أو حقنة بدون إبر.
    3. باستخدام الملقط ، أمسك بيد واحدة الجزء الخارجي من الرحم عند النقطة التي يتم فيها ربط المشيمة ، وباستخدام ملقط منحني في اليد الأخرى ، افصل المشيمة برفق عن جدار الرحم الداخلي عن طريق فصل الأنسجة ، وتوجيه الجنين بعناية ، مع إرفاق الأغشية والمشيمة ، خارج الرحم. مرة أخرى ، مع وجود ملقط في كل يد ، اضغط برفق على المشيمة وامسك الأغشية وانتفها عند النقطة التي تلتقي فيها بالمشيمة (تأكد من أن هذه تنفجر بشكل نظيف).
    4. الآن بعد أن تم فصل الأنسجة ، اجمع أنسجة الحمل المطلوبة (مثل الرحم والمشيمة وأغشية الجنين وعنق الرحم والمهبل) وتشريح أنسجة الجنين (مثل الدماغ والرئتين والأمعاء).
    5. قم بتجميد الأنسجة على الفور على الثلج الجاف أو في النيتروجين السائل و / أو تثبيت الأنسجة في بارافورمالديهايد (PFA ؛ 4٪ في PBS).
    6. تخزين الأنسجة المجمدة المفاجئة في -80 درجة مئوية وإصلاح الأنسجة لمدة 24-48 ساعة; ثم يحفظ في 30٪ سكروز عند 4 درجات مئوية.
      تحذير: PFA قابل للاشتعال وقد يسبب تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي. قم بإعداد محلول 4٪ في خزانة السلامة الحيوية وارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل معها.
  2. جمع أنسجة ما بعد الولادة
    1. في P7 ، قم بتخدير الجراء باستخدام الأيزوفلوران (5٪ للتحريض ، 1.5٪ للصيانة في الأكسجين).
    2. قم بإجراء الخروج ونضح الأنسجة عن طريق شق الأذين الأيمن وحقن 10 مل من PBS في البطين الأيسر. قطع رأس الذبيحة وإزالة الدماغ والرئتين باستخدام مقص وملقط معقم. معالجة وتخزين الأنسجة كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: يمكن تحليل أنسجة الأم والجنين المجمدة بحثا عن الوسطاء الالتهابيين وغيرهم من الوسطاء عن طريق qPCR و ELISA واللطخة الغربية. تتوفر بروتوكولات هذه التقنيات بسهولة من الشركات المصنعة للكاشف أو في منشورات أخرى25،30،31.
  3. التشريح بالتبريد لأدمغة الجنين وحديثي الولادة
    1. باستخدام شفرة ، قم بإزالة المخيخ لإنشاء سطح مستو وتجميد الأنسجة على الثلج الجاف. قم بتركيب الأنسجة المجمدة على حامل العينة باستخدام مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، وقم بتغطية الأنسجة بطبقة رقيقة من OCT. اتركيه يتجمد (1-2 دقيقة).
    2. باستخدام جهاز تجميد مضبوطا على -20 درجة مئوية ، تأكد من قفل الرافعة وتحميل حامل العينة. اضبط موضع المناديل بدقة وتثبيته في مكانه. قم بقص الأنسجة وابدأ في جمع أقسام الأنسجة على شرائح دقيقة من اندماج الجسم الثفني ، وتجميد الأقسام على الفور على الثلج الجاف. قطع 50 قسما تسلسليا 40 ميكرومتر من كل نسيج.
      تنبيه: كن حذرا مع الشفرة الحادة.
    3. قم بتخزين الأقسام المجمدة على شرائح صغيرة عند -80 درجة مئوية.
  4. الكيمياء المناعية
    ملاحظة: يمكن استخدام البروتوكول أدناه لتحديد الخلايا النجمية (البروتين الحمضي الليفي الدبقي ؛ GFAP) ، الخلايا الدبقية الصغيرة (عامل التهاب الطعم الخيفي 1 ؛ IBA-1) ، والعدلات (مستضد الخلايا الليمفاوية 6 أحد أفراد الأسرة G ؛ Ly6G). يمكن العثور على معلومات الأجسام المضادة في الجدول 1.
    1. حدد خمسة أقسام لكل دماغ ، على بعد 400 ميكرومتر ، مما سيسمح بتقييم مناطق الدماغ المختلفة على أعماق متغيرة من الدماغ. أعد ترطيب الأجزاء المجمدة بقطرة من dH2O وافرد المنديل وافتحه باستخدام فرشتين رفيعتين. جفف المنديل تحت مروحة لمدة 20-30 دقيقة. باستخدام قلم كاره للماء (PAP) ، ارسم بعناية حول الأنسجة دون لمسها.
    2. في اليوم 1 ، قم بإعداد 4٪ فورمالديهايد (FA) عن طريق إضافة 5.4 مل من الفورمالديهايد في 50 مل من محلول فوسفات 0.1 متر (PB) لكوفيت واحد 50 مل (سعة 15 شريحة). اغمر الشرائح في FA لمدة 5 دقائق لإصلاح المقاطع المبردة ، مما يسمح بالالتصاق بالشرائح ، وشل حركة المستضدات.
      تنبيه: FA قابل للاشتعال ويمكن أن يسبب تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي. قم بإعداد محلول بنسبة 4٪ في خزانة السلامة الحيوية وارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل معها.
    3. تحضير مصل الألبومين البقري 0.1٪ (BSA) بإضافة 0.4 جم من BSA إلى 400 مل من 0.1 M PB. اغسل الأقسام 2x عن طريق غمرها في 0.1 M PB ، متبوعا بغسل واحد في BSA (~ 3 ثوان لكل غسلة). تخزين الشرائح في
      كوفيت تحتوي على BSA لحين الحاجة.
    4. قم بإعداد غرف الرطوبة عن طريق ترطيب المناديل الورقية ب dH2O وضعها في الغرفة ، وتصريف أي ماء زائد.
    5. تحضير مصل الماعز 5٪ (50 ميكرولتر من مصل الماعز في 1 مل من 0.1 M PB). جفف الشريحة بعناية حول قسم الأنسجة بالمناديل الورقية ، مع التأكد من أن حدود قلم PAP سليمة ، ثم ضع 50 ميكرولتر من المحلول لكل قسم من الأنسجة. احتضان في غرفة الرطوبة لمدة 30 دقيقة.
    6. قم بإزالة المصل عن طريق النقر على الشريحة على مناديل ورقية نظيفة وأضف الجسم المضاد الأساسي المخفف في BSA (يتم عرض الأجسام المضادة والتخفيفات في الجدول 1). احتضن طوال الليل عند 4 درجاتمئوية.
    7. في اليوم 2 ، احتضن الجسم المضاد الثانوي في مصل الفأر (انظر الجدول 1) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجةمئوية ، وأضفه إلى BSA (تخفيف 1: 100) (على سبيل المثال ، 5 مل BSA + 100 ميكرولتر مصل الفأر + 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية).
    8. اغسل الشرائح 2x عن طريق غمرها (~ 3 ثوان) في BSA ثم مرة واحدة في 0.1 M PB. امسك الشرائح في كوفيت تحتوي على BSA ، وامسح الحدود حول كل قسم من الأنسجة. ضع 50 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي لكل قسم من الأنسجة واحتضان لمدة ساعة واحدة في غرفة الرطوبة.
    9. تحضير مركب البيوتين الأفيدين (ABC) (تخفيف 0.1٪) عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من A و 10 ميكرولتر من B في 1 مل من 0.1 M PB. اغمر (~ 3 ثوان) الشرائح 2x في BSA ومرة واحدة في 0.1 M PB ، ثم ضع الشرائح في كوفيت يحتوي على 0.1 M PB. جفف الشرائح ، وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من محلول ABC لكل شريحة ، واحتضان لمدة ساعة واحدة في غرفة الرطوبة.
    10. تحضير محلول ديامينوبنزيديني (DAB). يزن 25 مجم من DAB لكل كوفيت ، ويذوب في 50 مل من 10 مللي مولار PB ، ويصفى بورق الترشيح رقم 4.
      تحذير: DAB هو خطر صحي مع طفرات الخلايا الجرثومية المحتملة وسرطنتها. ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة وتخلص منها بأمان.
    11. اغسل الشرائح 3 × 3 ثوان مع 10 ملي مولار PB وضعها في كوفيت تحتوي على 10 ملي PB. أضف بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) إلى محلول DAB قبل صب المحلول على الفور في كوفيتات طازجة (16.7 ميكرولتر من H2O2 لكل كوفيت). انقل الشرائح إلى كوفيت DAB واتركها لمدة ~ 3 دقائق (بحد أقصى 5 دقائق) ، مع التحقق باستمرار من شدة التلوين تحت المجهر.
      تنبيه: يمكن أن يؤدي H2O2 إلى تهيج العينين والجلد والحلق. ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    12. اغسل الشرائح (3 ثوان) مرة واحدة في 10 ملي مولار PB و 2x في dH2O واترك الشرائح تجف. اغمر الشرائح الجافة 3x في الزيلين. ضع قطرة من وسيط تثبيت DPX على غطاء ضعه فوق قسم المناديل ، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء.
      تحذير: الزيلين و DPX قابلان للاشتعال وقد يسببان تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي. تعامل في خزانة السلامة الحيوية وارتد دائما قفازات عند التعامل معها.
  5. تلطيخ Nissl
    1. في اليوم 1 ، قم بإعادة ترطيب الأنسجة ونشرها في dH2O. قم بإعداد 4٪ FA بإضافة 5.4 مل من FA في 50 مل من 0.1 M PB واستخدمه على الفور. احتضان الشرائح في 4٪ FA بين عشية وضحاها.
    2. في اليوم 2 ، انقل الشرائح من 4٪ FA إلى 70٪ إيثانول (EtOH) واحتضن طوال الليل.
    3. قم بإعداد صبغة Nissl عن طريق إذابة 4 جم من Cresyl Violet في 40 مل من 100٪ EtOH في أنبوب مخروطي مغلق سعة 50 مل. اقلبها لمدة 15 دقيقة ، أضف المحلول إلى 360 مل من dH2O الدافئ ، واخلطه على طبق تقليب لمدة 20 دقيقة. قم بتصفية المحلول قبل الاستخدام.
    4. في اليوم 3 ، اتبع إجراء التلوين الموضح في الجدول 2 ، وقم بتغطية أقسام الأنسجة باستخدام DPX.
  6. ملصقات نهاية النيك deoxynucleotidyl transferase dUTP الطرفية (TUNEL)
    1. قم بترطيب الأنسجة ونشرها في dH2O ، ثم احتضان الشرائح في 4٪ FA لمدة 5 دقائق. انقل الشرائح إلى محلول H2O2 والميثانول (CH3OH) (1:10) واحتضن لمدة 15 دقيقة. اغسل الشرائح لمدة 2 × 3 ثوان في 0.1 متر PB وضعها في كوفيت تحتوي على 0.1 M PB.
    2. قم بإعداد محلول TUNEL على الثلج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف المحلول إلى الشرائح (50 ميكرولتر لكل قسم من الأنسجة) واحتضن في غرفة رطوبة عند 37 درجةمئوية لمدة 2 ساعة.
    3. بعد 1 ساعة من الحضانة ، قم بإعداد محلول ABC كما هو موضح في الخطوة 2.4.9 واحتضان في درجة حرارة الغرفة.
    4. بعد ساعتين ، انقل الشرائح إلى محلول TUNEL STOP (300 ملي كلوريد الصوديوم ، 30 ملي سيترات الصوديوم) لمدة 10 دقائق واغمس الشرائح لغسل 3 × 3 ثوان في محلول 10 ملي PBS. احتضان الشرائح في محلول ABC لمدة 1 ساعة.
    5. تحضير كبريتات الكوبالت (1.55 جم من CoSOاللامائي 4 في 100 مل من dH2O) وسداسي هيدرات كلوريد النيكل (2.38 جم من NiCl2 ·6H2O في 100 مل من dH2O). تحضير محلول DAB Co-Ni (10 ملي PB + 25 مجم DAB + 1 مل / 100 مل من ثاني أكسيد الكربون + 1 مل / 100 مل من Ni). قم بتصفية المحلول تحت الفراغ واحتفظ به في الظلام. مباشرة قبل صب محلول DAB في الكوفيت ، أضف 16.7 ميكرولتر من H2O2 لكل 50 مل من الكوفيت.
    6. بعد 1 ساعة ، انقل الشرائح إلى كوفيت DAB واحتضان لمدة ~ 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتحقق باستمرار من شدة التلوين. أوقف التفاعل عن طريق تحريك الشرائح إلى كوفيتات تحتوي على 10 ملي مولار PB. اغسل عن طريق غمر 2 × 3 ثوان في dH2O واترك أقسام المناديل تجف قبل تغطيتها باستخدام DPX.
  7. تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوسين (H & E)
    1. أعد ترطيب الأنسجة ونشرها في dH2O واترك الأقسام تجف في الهواء.
    2. اغمر الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة.
      تنبيه: يمكن أن يسبب الهيماتوكسيلين تهيج العين والجلد. ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    3. اشطف الشرائح بماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة اللون بالكحول الحمضي لمدة 1 ثانية ، ثم اشطفها بماء الصنبور.
    4. Counterstain في 0.5٪ يوزين (1.5 جم مذاب في 300 مل من 95٪ EtOH) لمدة 30 ثانية.
      تنبيه: الإيوسين قابل للاشتعال ويمكن أن يسبب تهيج العين والجلد. قم بإعداد المحاليل في خزانة السلامة الحيوية وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    5. قم بتجفيف أقسام الأنسجة في تدرج EtOH: 50٪ ، 70٪ ، 95٪ وأخيرا 100٪ EtOH ، كل منها لمدة 3 دقائق. حرك الشرائح إلى الزيلين لمدة 2 × 5 دقائق. غطاء مع DPX.

3. تقييمات الأنسجة والكيمياء المناعية لعلم الأمراض العصبية وإصابات الرئة

ملاحظة: يمكن إجراء التقييمات على المناطق التالية: القشرة ، والقشرة الكمثرى ، والكبسولة الخارجية ، والمخطط ، والحصين ، والمهاد (الشكل 2). بالنسبة لأدمغة E18.5 ، يمكن أيضا تضمين الجسم الثفني لأن تمايز الخلايا لم يكتمل بعد ولم تهاجر الخلايا الدبقية إلى جميع مناطق الدماغ. يجب أن يكون المقيم أعمى عن مجموعات العلاج.

  1. موت خلايا TUNEL +
    1. باستخدام المجهر التقليدي ، احسب الخلايا الإيجابية لتلوين TUNEL ثنائيا عند تكبير 20x في جميع مناطق الدماغ (الشكل 2).
    2. تقييم ثلاثة مجالات بصرية مختارة عشوائيا لكل منطقة دماغية وحساب متوسط عدد الخلايا لكل منطقة دماغ.
  2. تقييم مورفولوجيا Nissl
    1. التقط صورا للأنسجة الكاملة باستخدام كاميرا ملونة بتكبير 1x واحفظها كملف TIFF أو تنسيق آخر مطلوب. قم باستيراد الصور إلى ImageJ لمزيد من التحليل.
    2. حدد مناطق الدماغ ذات الأهمية (على سبيل المثال ، القشرة والحصين) وقم بالقياس باستخدام أداة اليد الحرة (الشكل 2).
    3. للحصول على قياس الأنسجة ، يتم تطبيق الصيغة: (مم2 × 400 ميكرومتر) = حجم × 100 (منقحة32).
  3. مؤشر تشعبات الخلايا الدبقية الصغيرة
    1. باستخدام مجهر بميزة شبكة مربعة 0.049 مم × 0.049 مم ، عند التكبير 40x ، قم بحساب عدد أجسام خلايا IBA-1 + داخل الشبكة (C) ومتوسط عدد الفروع التي تعبر خطوط الشبكة (B). قم بإجراء ذلك في ثلاثة حقول مختارة عشوائيا (انظر الشكل 3) لكل منطقة دماغية موضحة في الشكل 2.
    2. استخدم الصيغة (B2 / C) لحساب مؤشر تشعبات الخلايا الدبقية الصغيرة.
  4. لمعان بصري لكثافة تلطيخ GFAP
    1. باستخدام البرنامج المشار إليه (جدول المواد) وكاميرا ملونة بتكبير 40x ، التقط ثلاثة حقول مختارة عشوائيا لكل منطقة دماغية (الشكل 2). اضغط على Ctrl+H للحصول على رسم بياني يعرض المتوسط والانحراف المعياري (SD). سجل قيم المتوسط وSD في جدول بيانات. التقط صورة تحكم للزجاج المحيط فقط (أي بدون أنسجة) وسجل قيم المتوسط و SD كما كان من قبل
    2. استخدم الصيغة التالية لحساب قيم اللمعان الضوئي (OLV) في جدول بيانات:
      OLV = (متوسط الزجاج − الانحراف المعياري للزجاج) - (متوسط [المتوسط لكل صورة − الانحراف المعياري لكل صورة])
      ملاحظة: على سبيل المثال:
      الزجاج المحيط
      متوسط ± SD = 143.5 ± 8.56
      منطقة الدماغ (على سبيل المثال ، القشرة)
      1. 136.7 ± 10.6
      2. 140.6 ± 10.4
      3. 137.4 ± 11.3
      OLV = (143.5 - 8.56) - (متوسط [136.7 - 10.6] ، [140.6 - 10.4] ، [137.4 - 11.3])
      OLV = 134.94 - 127.47
      OLV = 7.47
    3. متوسط كل قيمة لكل منطقة ولكل ثم لكل مجموعة تجريبية.
  5. تقييمات مورفولوجيا الرئة
    1. التقط مقاطع H&E بتكبير 40x (ثلاثة حقول بصرية لكل شريحة ، وقم بقياس المجالات الجوية لكل مجال) ، واحفظها ك TIFF (أو ما يعادلها) ، واستورد الصور إلى ImageJ. حدد الحقول التي تمثل قسم الرئة بأكمله عشوائيا.
    2. باستخدام أداة اليد الحرة ، حدد المساحات الجوية وسجل القياس (الشكل 4 أ). أوجد متوسط ثلاثة مساحات جوية لكل حقل ، ثم بين الحقول الثلاثة لكل قسم ، وفي النهاية ، بين الأقسام الثلاثة لكل عينة.
  6. تدفق العدلات في الرئتين
    1. التقط عينة من الصور باستخدام كاميرا ملونة بتكبير 40 ضعفا ، ثلاث مرات لكل قسم من أنسجة الرئة ، واحفظ الملف الأصلي كملف TIFF أو تنسيق آخر مطلوب. قم باستيراد الصور إلى ImageJ وعد العدلات الفردية يدويا في ثلاثة حقول من نفس الرئة. احسب متوسط العدلات لكل رئة.

النتائج

يقدم هذا البروتوكول نموذجا للفأر للعدوى المهبلية الصاعدة ويصف طرق تقييم أمراض الأعصاب لحديثي الولادة ونتائج الجهاز التنفسي. يجب أن يكون إجراء إحداث العدوى المهبلية الصاعدة سريعا (في غضون 5 دقائق) ويجب أن تتعافى الفئران في غضون دقيقتين. ظهرت السدود أعراض العدوى بعد حوالي 24 ساعة25. وهذا يشمل الحركة البطيئة ، والانتصاب الشعري ، والموقف المنحني. كان متوسط وقت الولادة التقريبي في الفئران المصابة 40.3 ساعة بعد إعطاء الإشريكية القولونية (متوسط المجموعة الضابطة PBS 52.7 ساعة) ، حدث في E18.5 مقارنة بالتسليم النهائي للمجموعة الضابطة PBS على E19.531. انخفضت النسبة المئوية للصغار المولودين على قيد الحياة لكل قمامة (من 100٪ إلى 71.4٪) مع العدوى ، وكذلك بقائهم على قيد الحياة على مدى 7 أيام بعد الولادة (الشكل 5) 25. عند استخدام البكتيريا المضيئة بيولوجيا ، يمكن للتصوير تتبع انتشار العدوى في السدود والصغار. لوحظت البكتيريا في الرحم وأغشية الجنين والمشيمة وفي بعض الأجنة في غضون 18 ساعة من الإعطاء (الشكل 6) ، وتم تنظيم الوسطاء الالتهابيين ، الذين تم قياسهم بواسطة qPCR و ELISA ، في هذه الأنسجة ، وكذلك في أنسجة الجراء في الفترة المحيطة بالولادة ، مثل الدماغ والرئتين والأمعاء25،29،31.

تم إجراء مجموعة من تقييمات علم الأمراض العصبية ، مثل تقييم التشكل وموت الخلايا وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيط الخلايا النجمية ، على الأجنة وحديثي الولادة باستخدام علم الأنسجة والكيمياء المناعية25،31،33. يمكن أيضا تقييم أنسجة الرئة (الشكل 4 والشكل 7). يشير التلوين الإيجابي ل TUNEL إلى تدهور الحمض النووي ، وهي مرحلة لاحقة من موت الخلية34. نرى زيادة كبيرة في تلطيخ TUNEL في القشرة ، والقشرة الكمرية ، والكبسولة الخارجية ، والحصين ، والمهاد في أدمغة الجراء المعرضين للإشريكية القولونية أثناء الحمل (الشكل 8 أ ، ب) 31. يمكن تصنيف الخلايا الدبقية الصغيرة المسماة IBA-1 ، وهي الخلايا المناعية المقيمة في الدماغ ، حسب حالتها المورفولوجية ، حيث تشير التشعبات إلى نمط ظاهري أثناء الراحة ، بينما تصبح الخلايا المنشطة والبلعمة أميبية أو مستديرة في الشكل35. لذلك ، بدلا من تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة ، نقدم استراتيجية لتقييم نمطها الظاهري كمؤشر على حالتها. نرى زيادة في تشعبات IBA1 + في القشرة الخارجية والمخطط للإشريكية القولونية ، مقارنة بمجموعة PBS (الشكل 8 ج ، د) 31. تمت زيادة الخلايا النجمية التفاعلية المسماة ب GFAP ، والتي يمكن أن تترافق مع الالتهاب والإصابة العصبية ، في قشرة الكمثري والكبسولة الخارجية في بكتريا قولونية الجراء (الشكل 8E ، F) 31،36،37. يسمح تلطيخ Nissl بتقييم التغيرات المورفولوجية الإجمالية في بنية الدماغ ؛ كريسيل البنفسجي هو صبغة نسيجية قياسية للخلايا العصبية ويصنف على كل من حبيبات الحمض النووي الريبي النووي الإضافي ونوى الخلية. في بكتريا قولونية ، نرى انخفاض سمك القشرة (الشكل 9) 31. وبالمثل ، فإن H & E ، التي تلطخ على التوالي نواة وسيتوبلازم الخلايا ، تسمح بتقييم مورفولوجيا الرئة (الشكل 4) 31. نرى زيادة في المجال الجوي في بكتريا قولونية الفئران المكشوفة ، بالإضافة إلى زيادة في عدد العدلات Ly6G + ، وهو مؤشر على الالتهاب (الشكل 7) 31.

بالنسبة لتحليلات البيانات ، تم تحليل الوقت اللازم للتسليم بواسطة اختبار t غير مقترن إذا كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي. بالنسبة لبيانات النسبة المئوية للصغار المولودة على قيد الحياة ، كان التحول الجذر التربيعي المقوس مطلوبا أولا لتحويل توزيع النسبة (يحده النطاق من 0 إلى 1) إلى توزيع طبيعي ، وهو أحد المتطلبات لتكون قادرا على إجراء اختبار t. تم تحليل بقاء الجرو من خلال اختبار Log-rank (Mantel-Cox). بالنسبة لعلم الأنسجة والكيمياء المناعية ، تم استخدام إما اختبار Mann-Whitney U أو اختبارات t المتعددة مع تصحيح ويلزي ، اعتمادا على نوع البيانات وما إذا كانت قد تم توزيعها بشكل طبيعي. للحصول على قوة إحصائية كافية ، نوصي باستخدام ما لا يقل عن خمسة سدود لكل مجموعة معالجة.

figure-results-1
الشكل 1: إعطاء الإشريكية القولونية داخل المهبل والجدول الزمني للعلاج للحث على الولادة المبكرة ومراضة حديثي الولادة في الفئران. (أ) الإشريكية القولونية [1] ، متبوعا ب 20٪ جل البلورونيك F127 [2] ، يتم إعطاؤه في مهبل الفأر باستخدام طرف ماصة معقم 200 ميكرولتر. يضاف مسحوق الكينين إلى introitus [3]. (ب) يتم تسليم الإشريكية القولونية إلى المهبل في اليوم الجنيني 16.5. يمكن جمع الأنسجة ، مثل الرئتين والدماغ ، خلال فترة الجنين أو حديثي الولادة. الاختصار: EN = اليوم الجنيني N ؛ PN = يوم ما بعد الولادة N ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مناطق الدماغ التي تم تقييمها لعلم الأمراض العصبية. مثال على تلطيخ Nissl لدماغ الجرو حديثي الولادة والمناطق التي يمكن تقييمها لعلم الأمراض العصبية. يمكن تقييم جميع مناطق الدماغ من أجل TUNEL و IBA-1 و GFAP. اخترنا تقييم مورفولوجيا القشرة والحصين باستخدام Nissl. التكبير: 1x. شريط المقياس = 1.5 مم. الاختصارات: TUNEL = نهاية نهاية deoxynucleotidyl transferase dUTP الطرفية ؛ IBA-1 = عامل التهاب الطعم الخيفي 1 ؛ GFAP = بروتين حمضي ليفي دبقي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تقييم مؤشر تلطيخ وتشعبات IBA-1 الإيجابي. لتحديد مؤشر تشعب خلايا IBA-1+ ، احسب عدد أجسام الخلايا داخل الشبكة ومتوسط عدد الفروع التي تعبر خطوط الشبكة الأفقية والرأسية. الاختصار: IBA-1 = عامل التهاب الطعم الخيفي 1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: قياسات المجال الجوي في رئتي الجرو (تلطيخ H & E). (أ) تحديد الخطوط العريضة للمساحات الجوية وقياسها باستخدام أداة اليد الحرة في ImageJ. (ب) يزداد متوسط مساحة المجال الجوي في الجراء المعرضين للإشريكية القولونية مقارنة ب PBS. (ج) صور H & E التمثيلية لرئتي الجرو المعرضين ل PBS والإشريكية القولونية في الرحم. التكبير: 40x. شريط المقياس = 59.5 ميكرومتر. الاختصارات: H = الهيماتوكسيلين. ه = يوزين. ن = 2 من 4 لترات. * P < 0.05. تم اقتباس هذا الرقم من Boyle et al.31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: آثار الإشريكية القولونية داخل المهبل في الوقت المحدد للولادة وبقاء الجراء. (أ) يتم تقليل وقت الولادة في وجود الإشريكية القولونية. (ب) تنخفض النسبة المئوية للصغار المولودين أحياء بشكل كبير و (ج) ينخفض بقاء الجراء في الإشريكية القولونية الجراء المعرضين للإشريكية القولونية. وقت التسليم: ن = 8-10 لترات لكل مجموعة ؛ الجراء المولودين على قيد الحياة: ن = 10-17 لترا لكل مجموعة ؛ بقاء الجرو: ن = 10-12 لترا لكل مجموعة. * P < 0.05 ، ** p < 0.001. تم اقتباس هذا الرقم من Boyle et al.31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تصوير التلألؤ البيولوجي لمراقبة الإشريكية القولونية انتشار. (أ) الإشريكية القولونية المضيئة بيولوجيا تصعد من المهبل إلى قرون الرحم في غضون 48 ساعة. (ب) تظهر قرون الرحم المشرحة عدوى بالإشريكية القولونية في غضون 18 ساعة ، (ج) كما تفعل المشيمة وأغشية الجنين. تم اقتباس هذا الرقم من Suff et al.25 و Boyle et al.31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: تلطيخ Ly6G للعدلات في رئتي الجنين. (أ) تلطيخ Ly6G (إيجابي: رؤوس الأسهم) ، لتقييم تدفق العدلات ، في PBS و E. قولونية الأجنة المعرضة. (ب) يزداد متوسط عدد خلايا Ly6G + بشكل ملحوظ في أجنة الإشريكية القولونية . التكبير: 40x. شريط المقياس = 59.5 ميكرومتر. ن = 10 من 5 لترات لكل مجموعة. * P < 0.05. الاختصارات: Ly6G = مستضد الخلايا الليمفاوية 6 موضع مركب G6D. تم اقتباس هذا الرقم من Boyle et al.31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: أمثلة على تلطيخ TUNEL و IBA1 و GFAP. (أ) تلطيخ TUNEL لموت الخلايا في دماغ الجرو بعد الولادة المعرض ل PBS أو الإشريكية القولونية. (ب) يزداد متوسط عدد خلايا TUNEL + في القشرة ، وقشرة الكمثري ، والكبسولة الخارجية ، والحصين ، والمهاد. (ج) الكيمياء المناعية IBA1 للدبقية الصغيرة في مجموعات PBS و E. قولونية . (د) يزداد مؤشر التشعب ، كمقياس لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ، في الكبسولة الخارجية والمخطط في الإشريكية القولونية الجراء. (ه) تلطيخ GFAP للخلايا النجمية ، (F) الذي يزداد في قشرة الكمثري والكبسولة الخارجية في الإشريكية القولونية الجراء. شريط المقياس = 59.5 ميكرومتر. الاختصارات: GFAP = بروتين حمضي ليفي دبقي ؛ TUNEL = ملصقات نهاية النيك deoxynucleotidyl transferase dUTP الطرفية ؛ بير = قشرة بيريفورم ؛ EC = كبسولة خارجية; Str = المخطط ؛ الورك = الحصين. ثال = المهاد. المجموع = جميع المناطق ؛ CA = كورنو الأموني. OLV = قيم اللمعان البصري. تحليلات الكيمياء المناعية: ن = 5-7 من 5 لترات لكل مجموعة. * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001 ، NS - غير مهم. تم اقتباس هذا الرقم من Boyle et al.31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9
الشكل 9: مثال على تقييمات تلطيخ Nissl الإيجابية والسلبية والمورفولوجيا. (أ) تلطيخ Nissl لدماغ الجرو بعد الولادة لتقييم بنية الأنسجة وتشكلها. (ب) لا يوجد تأثير على عرض الدماغ ولكن (ج) يتم تقليل سمك القشرة في الجراء المعرضين للإشريكية القولونية. (د) لا يوجد فرق في حجم الحصين. التكبير: 1x. شريط المقياس = 1.5 مم. ن = 5-7 من 5 لترات لكل مجموعة. ** < 0.01. تم اقتباس هذا الرقم من Boyle et al.31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الأجسام المضادة الأوليةالتخفيفالأجسام المضادة الثانوية / التخفيفالتخفيف
أرنب مضاد ل GFAP1:6000الماعز المضادة للأرانب1:100
أرنب مضاد للIBA11:1000الماعز المضادة للفئران1:100
ماوس مضاد ل Ly6G1:1000الماعز المضادة للأرانب1:100

الجدول 1: الأجسام المضادة للكيمياء المناعية.

درجالكاشفالوقت (دقيقة)
1وصمة عار NISSL10
2الماء المقطر العذب2
3الماء المقطر العذب2
470٪ EtOH2
590٪ EtOH2
696٪ EtOH2
796٪ EtOH مع 3-5 قطرات من حمض الخليك الجليدي2-5 (تحقق باستمرار)
8100٪ EtOH2
9إيزوبوبانول2
10الزيلين2
11الزيلين2
12الزيلين2

الجدول 2: إجراء Nissl.

المناقشة

هنا ، نصف تحريض نموذج فأر جديد للولادة المبكرة ومراضة حديثي الولادة عن طريق الصعود المهبلي البكتيري. اخترنا الإشريكية القولونية K1 لأنها سبب شائع للإتان الوليدي والتهاب السحايا وتنتقل عموديا من الأم إلى الجنين38،39،40. مفتاح نجاح هذا النموذج هو استخدام جل البلورونيك الحساس للحرارة ، والذي يمنع تسرب المعلق البكتيري من المهبل ، مما يسمح للعدوى بالتأسيس والصعود إلى الرحم. نظرا لأن هذا النموذج يستخدم البكتيريا الحية المشتقة من عزل تسمم الدم ، فمن الأهمية بمكان مراقبة السدود عن كثب27. إذا رفضت الحركة أو الأكل أو لا تهتم بصغارها (على سبيل المثال ، إهمال التعشيش والتغذية) ، فيجب التضحية بها بشكل إنساني على الفور.

في الغالب ، تتبدد الأعراض المصاحبة للعدوى في غضون 24 ساعة من الولادة. من الضروري أيضا أن تدرك أن الأنماط المصلية المختلفة للإشريكية القولونية وسلالات البكتيريا الأخرى سيكون لها تأثيرات متفاوتة على طول الحمل ، ومدى العدوى / الالتهاب ، ونتائج حديثي الولادة. نقترح إجراء تجارب الجرعة الأولية مع CFUs مختلفة عند استخدام أنماط مصلية بكتيرية جديدة / سلالات لتحديد الحد الأدنى من التركيز اللازم للنمط الظاهري المطلوب وتحديد نقاط نهاية إنسانية صارمة لمنع المعاناة. يجب توخي الحذر الشديد عند توصيل مسببات الأمراض الحية; السماح للأدبيات بتوجيه الاستخدام المناسب لهذه الكائنات الحية عند نمذجة العدوى الصاعدة.

سلالة الفأر مهمة أيضا ، حيث تختلف أجهزتها المناعية. على سبيل المثال ، لا يكون للتوقيت و CFUs المستخدمة في هذا النموذج نفس النتائج عند إجراؤها في الفئران C57BL / 6. اخترنا استخدام الفئران C57BL / 6 Tyrc-2J حيث أظهرت تجارب المسار الزمني عددا أكبر بكثير من العدوى في هذه السلالة مقارنة ب CD-1 و BALB / c و C57BL / 6. بالإضافة إلى ذلك ، هناك دليل على أن الفراء الأسود يروي إشارات الإضاءة الحيوية ، وهي نتيجة مفيدة قابلة للقياس في هذا النموذج29. قد يختلف يوم الحمل الأمثل للإعطاء البكتيري أيضا مع مسببات الأمراض وإجهاد الفئران. هناك عدم تجانس كبير في نماذج PTB قبل السريرية. لذلك ، من المهم مراعاة هذه المتغيرات من أجل تطوير نتائج قابلة للتكرار17.

اعتبار آخر هو طول الوقت الذي تتعرض فيه للتخدير. نظرا لأن التعرض المفرط أثناء الحمل يرتبط بالسمية العصبية لدى الجراء ، فمن الضروري الحفاظ على الوقت الذي يقضيه تحت التخدير إلى الحد الأدنى (على سبيل المثال ، 5 دقائق كحد أقصى) وتضمين الضوابط المعرضة لنفس البيئة ومعالجتها بمادة السيارة41،42،43. تشمل مجموعات التحكم الإضافية المفيدة لهذا النموذج الولادة غير المعالجة داخل المهبل من هلام البلورونيك فقط والتخدير فقط.

تستخدم الكيمياء المناعية على نطاق واسع كأداة تجريبية لتحديد البروتينات والخلايا المختلفة ، ويمكن استخدامها لتوصيف البنية والاتصال في الدماغ. هنا ، نصف كيفية تحليل الخلايا الرئيسية للجهاز العصبي المركزي المرتبطة بالالتهاب العصبي والإصابة العصبية. نقدم أيضا طرقا لتقييم موت الخلايا المبرمج الخلوي والبقع النسيجية المفيدة لقياس مورفولوجيا الدماغ والرئة. تبدأ الاعتبارات المهمة لضمان نجاح هذه البروتوكولات بالاستخدام الدقيق لقلم PAP. إذا لامس قلم PAP الأنسجة ، فسوف يفشل التلوين ولكن إذا كانت المعلمة عريضة جدا ، فقد تجف الأقسام طوال الليل. وبالمثل ، يجب أن تبقى غرفة الرطوبة رطبة لتجنب جفاف الأقسام.

عند إجراء تلطيخ Nissl ، فإن خطوة حمض الخليك الجليدي هي الأكثر أهمية ؛ يجب فحص الأقسام باستمرار. عندما تصبح الهياكل الرئيسية للدماغ مرئية ، يجب نقل الأقسام على الفور إلى EtOH لإيقاف رد الفعل. اخترنا تقييم القشرة والحصين ، حيث تم الإبلاغ عن انخفاض سمك القشرة وانخفاض حجم الحصين في الأطفال الخدج من البشر والنماذج الحيوانية الأخرى ولكن يمكن تقييم المناطق الأخرى لتغيرات المورفولوجيا44،45،46،47. يجب أيضا إيلاء اهتمام وثيق لتطوير تلطيخ DAB. يجب أن يكون هذا موقوتا وثابتا بين التجارب.

تحليل البيانات هو القيد الأكثر شيوعا للكيمياء المناعية بسبب صعوبة تحديد النتائج ، والتي غالبا ما تعتبر ذاتية. بينما يتم إجراء تحليل GFAP باستخدام قياسات اللمعان البصري بمساعدة الكمبيوتر ، يمكن أن يؤثر التلوين غير المتسق على هذه القياسات. بالإضافة إلى ذلك ، تتضمن تقييمات مورفولوجيا الدماغ والرئة قياسات يدوية يدوية تعتمد على حكم المراقب. لتجنب عدم الاتساق ، نكرر هذه التقييمات مرتين وفي فترة زمنية قصيرة. لتقليل أي تحيز بشكل أكبر ، من المهم أن يكون المقيم أعمى عن مجموعات المعالجة. يمكن أن يكون النشاط المناعي المنخفض أيضا عاملا مقيدا. قد يشير نقص الإشارة إلى أن المستضد المعني غائب أو قد يكون بسبب فشل البروتوكول. لمعالجة هذا الأمر ، نقوم بتضمين عينة من الأنسجة يمكن أن تكون بمثابة عنصر تحكم إيجابي حيثما أمكن ذلك ونكرر إجراء التلوين عندما نلاحظ إشارة منخفضة أو غائبة للتأكد من أن هذا لم يكن نتيجة لخطأ تجريبي.

بالإضافة إلى البروتوكولات الموضحة ، يمكن إجراء التحليلات المناعية لأنسجة الأم والجنين وحديثي الولادة بواسطة qPCR و ELISA. لقد لاحظنا زيادة مستويات mRNA والبروتين الالتهابي في المعرضة للعدوى25،31،48. نفترض أن علم الأمراض العصبية لحديثي الولادة الذي نوضحه من الناحية النسيجية يمكن أن يكون نتيجة لالتهاب دماغ الجنين والرئة والأمعاء25،31. تشمل تقييمات علم الأمراض العصبية الأخرى التي أجريناها بروتين المايلين الأساسي (MBP) للتحقيق في تكوين النخاع و NeuN لتلطيخ نوى الخلايا العصبية25،31. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم علامات أخرى للعدلات والخلايا الدبقية الصغيرة لفهم النمط الظاهري وسلوك هذه الخلايا بشكل أفضل بعد التعرض للعدوى في الرحم49،50. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء اختبارات سلوكية لتحديد التأثير طويل المدى على النسل.

هذا النموذج لا يخلو من القيود. على سبيل المثال ، نرى تباينا في علم الأمراض بين الفضلات وداخلها. قد يكون هذا نتيجة استخدام بكتيريا حية ، حيث لا يمكن السيطرة على انتشار العدوى. وبالتالي ، يختلف نمط ومدى العدوى الصاعدة إلى قرون الرحم وغالبا ما تكون غير متماثلة. قيد آخر هو إمراضية الإشريكية القولونية ، والتي يمكن أن تتسبب في بعض الأحيان في أن تصبح السدود مريضة جدا بحيث لا يمكن رعاية صغارها. الفئران ليست أيضا أفضل نموذج لإصابة الرئة ، بسبب تكوين الحويصلات الهوائية التي تحدث بعد الولادة ، وليس قبل الولادة ، كما هو الحال في البشر51. فشلنا في تضخيم أنسجة الرئة عندما تم جمع العينات ، مما قد يؤثر على نتائجنا. ومع ذلك ، فإن نتائجنا تتوافق مع التغييرات التي لوحظت في النماذج الحيوانية لاضطراب الشخصية الحدية لحديثي الولادة52،53.

يلخص هذا النموذج الحالة البشرية المفترضة حيث تصعد العدوى البكتيرية من المهبل إلى الرحم ، مما يحفز الولادة المبكرة. بعد نشرنا الأولي لهذا النموذج ، قام آخرون بتكرار أو إنتاج نماذج مماثلة ، مما يؤكد بشكل أكبر على قابلية التكاثر وأهمية هذه المنهجية19،54. بشكل حاسم ، يعرض هذا النموذج الأمراض الشائعة التي يعاني منها حديثي الولادة الخدج ، حيث فشلت النماذج الأخرى. قد يكون هذا بسبب استخدام سلالة بكتيرية مرتبطة على وجه التحديد بتعفن الدم عند حديثي الولادة. LPS ، الذي يستخدم بشكل شائع للحث على المخاض المبكر في النماذج الحيوانية ، قاتل للصغار ، لذلك لا يمكن قياس نتائج حديثي الولادة18. كافحت نماذج أخرى من العدوى الصاعدة أيضا من أجل إنتاج صغار على قيد الحياة أو في إظهار مراضة حديثي الولادة19،20،21،22،23،24،55،56. تعتبر النماذج الحيوانية ذات الصلة سريريا ، مثل تلك التي نصفها ، أساسية لفهم الفيزيولوجيا المرضية للولادة المبكرة ولتطوير تدخلات مبتكرة من شأنها تحسين نتائج حديثي الولادة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين إفصاحات ذات صلة.

شكر وتقدير

الإشريكية القولونية تم إهداء K1 A192PP-luxABCDE من قبل البروفيسور بيتر تايلور ، كلية لندن الجامعية. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 3 في عام BioRender.com. تم دعم هذا البحث من قبل زمالة التطوير الوظيفي للأبحاث السريرية Wellcome 222970 / Z / 21 / Z (NS) ، ومنحة Action Medical Research و Borne GN2647 (NS و S.N.W. و DP) ؛ ومنحة رفاهية المرأة RG2365 (A.K.B. ، N.S. ، M.H. ، S.N.W. ، و DP).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مضاد GFAP، أيها الأرنبتقنيات أجيلينتZ033429-2
Anti-IBA1، rabbit واكو019-19741
Anti-Ly6G، فأرةبيو ليجند127601
كاميرا AVT-Horn 184 3CCDسوني
بيوتين-16-DUTPميرك11093070910
أغطية الزجاج البوروسيليكات المستطيلةفيشر ساينتفيك12363128
أسيتات كريسيل بنفشثيرموفيشر ساينتيفيك405760100
كريوستات CM1900لايكا
كوفيت زجاجي  ميركBR472700
ديامينوبنزيدين (DAB)جينيرون40480004-3
ملقط تشريح، من الفولاذ المقاوم للصدأ، 10 سم، مسنن، منحنيشركة وورلد بريسيجن إنسترومنتس المحدودة15915
ملقط تشريح، من الفولاذ المقاوم للصدأ، 10 سم، مسنن، مستقيمشركة وورلد بريسيجن إنسترومنتس المحدودة15914
مقص تشريح، طوله 10 سم، مستقيمشركة وورلد بريسيجن إنسترومنتس المحدودة14393
DPX ميرك100579
إيوسينسيغما-ألدرتشHT110116
محلول الفورمالديهايد 4٪ مخزنميرك100496
الجسم المضاد IgG من نوع الماعز المضاد للأرانب (H+L)، بيوتينيلمختبرات فيكتورBP-9100-50
الأجسام المضادة IgG المضادة للماعز المضادة للفئران (H+L)، بيوتينيلمختبرات فيكتورBA-9400-1.5
GraphPad Prism v.8 برنامج جراف باد
H2O2سيغما-ألدرتش7722-84-1
الهيماتوكسيلينسيغما-ألدرتشMHS16
ImageJالمعاهد الوطنية للصحة
الإيزوفلوران (IsoFlo)زويتيس50019100
نظام التصوير في الجسم الحي IVIS Lumina II/برنامج الصور الحيةبيركين إلمر / ريفيتي
الميكروسلايداتVWRISO8037/I
Optimas 6.51 شركة ميديا سايبرنيتيكس
بارافورمالديهايدسيغما-ألدرتش158127
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرمو فيشر ساينتفيك (لايف تكنولوجيز)14190094
Pluronic F-127 سيغما-ألدرتشP2443
الكينينمستلزمات المختبرات العلميةس0132
قلم مسحة العين الحاجز الكاره للماء من ReadyProbesثيرمو فيشر ساينتفيك R3777
هيدروكسيد الصوديومهانيويلS8045
فوسفات الصوديوم أحادي الأساس اللامائيفيشر ساينتفيكBP329-1
سكروزميركS9378
Terminal transferase ميرك3333574001
مجموعة VECTASTEIN ABC-HRP من نوع بيروكسيدازمختبرات فيكتورPK-4000
زيلين (درجة نسيجية) سيغما-ألدرتش534056

المراجع

  1. WHO. WHO: recommended definitions, terminology and format for statistical tables related to the perinatal period and use of a new certificate for cause of perinatal deaths. Modifications recommended by FIGO as amended October 14, 1976. Acta Obstet Gynecol Scand. 56 (3), 247-253 (1977).
  2. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of under-5 mortality in 2000–15: an updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet. 388 (10063), 3027-3035 (2016).
  3. Chawanpaiboon, S., et al. regional, and national estimates of levels of preterm birth in 2014: a systematic review and modelling analysis. Lancet Glob Health. 7 (1), e37-e46 (2019).
  4. Unicef. Levels and trends in child mortality report 2017. , Unicef. (2017).
  5. Blencowe, H., et al. National, regional, and worldwide estimates of preterm birth rates in the year 2010 with time trends since 1990 for selected countries: a systematic analysis and implications. Lancet. 379 (9832), 2162-2172 (2012).
  6. Jung, E., et al. The fetal inflammatory response syndrome: the origins of a concept, pathophysiology, diagnosis, and obstetrical implications. Semin Fetal Neonatal Med. 25 (4), 101146(2020).
  7. Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: consequences for the neonate. Semin Immunopathol. 42 (4), 451-468 (2020).
  8. Boyle, A. K., Rinaldi, S. F., Norman, J. E., Stock, S. J. Preterm birth: inflammation, fetal injury and treatment strategies. J Reprod Immunol. 119, 62-66 (2017).
  9. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  10. Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
  11. Jones, H. E., et al. Differing prevalence and diversity of bacterial species in fetal membranes from very preterm and term labor. PLoS One. 4 (12), e8205(2009).
  12. Cobo, T., et al. Characterization of vaginal microbiota in women with preterm labor with intra-amniotic inflammation. Sci Rep. 9 (1), 18963(2019).
  13. Romero, R., et al. Microbial invasion of the amniotic cavity in patients with suspected cervical incompetence: prevalence and clinical significance. Am J Obstet Gynecol. 167 (4 Pt 1), 1086-1091 (1992).
  14. Mendz, G. L., Kaakoush, N. O., Quinlivan, J. A. Bacterial aetiological agents of intra-amniotic infections and preterm birth in pregnant women. Front Cell Infect Microbiol. 3, 58(2013).
  15. DiGiulio, D. B., et al. Prevalence and diversity of microbes in the amniotic fluid, the fetal inflammatory response, and pregnancy outcome in women with preterm pre-labor rupture of membranes. Am J Reprod Immunol. 64 (1), 38-57 (2010).
  16. DiGiulio, D. B. Diversity of microbes in amniotic fluid. Semin Fetal Neonatal Med. 17 (1), 2-11 (2012).
  17. Miller, F. A., Sacco, A., David, A. L., Boyle, A. K. Interventions for infection and inflammation-induced preterm birth: a preclinical systematic review. Reprod Sci. , (2022).
  18. Migale, R., et al. Specific lipopolysaccharide serotypes induce differential maternal and neonatal inflammatory responses in a murine model of preterm labor. Am J Pathol. 185 (9), 2390-2401 (2015).
  19. Spencer, N. R., et al. Development of a mouse model of ascending infection and preterm birth. PLoS One. 16 (12), e0260370(2021).
  20. Pavlidis, I., et al. Cervical epithelial damage promotes Ureaplasma parvum ascending infection, intrauterine inflammation and preterm birth induction in mice. Nat Commun. 11 (1), 199(2020).
  21. Vornhagen, J., et al. Group B streptococcus exploits vaginal epithelial exfoliation for ascending infection. J Clin Invest. 128 (5), 1985-1999 (2018).
  22. Bernardini, R., et al. Neonatal protection and preterm birth reduction following maternal group B streptococcus vaccination in a mouse model. J Matern Fetal Neonatal Med. 30 (23), 2844-2850 (2017).
  23. Tantengco, O. A. G., et al. Modeling ascending Ureaplasma parvum infection through the female reproductive tract using vagina-cervix-decidua-organ-on-a-chip and feto-maternal interface-organ-on-a-chip. Faseb J. 36 (10), e22551(2022).
  24. Randis, T. M., et al. Group B streptococcus β-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J Infect Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  25. Suff, N., et al. Ascending vaginal infection using bioluminescent bacteria evokes intrauterine inflammation, preterm birth, and neonatal brain injury in pregnant mice. Am J Pathol. 188 (10), 2164-2176 (2018).
  26. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J Antimicrob Chemother. 56 (1), 160-165 (2005).
  27. Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
  28. Winson, M. K., et al. Engineering the luxCDABE genes from Photorhabdus luminescens to provide a bioluminescent reporter for constitutive and promoter probe plasmids and mini-Tn5 constructs. FEMS Microbiol Lett. 163 (2), 193-202 (1998).
  29. Suff, N. The use of cervical gene therapy for the prevention of infection-related preterm birth [Ph. D. Thesis]. , University College London. (2017).
  30. Boyle, A. K., Rinaldi, S. F., Rossi, A. G., Saunders, P. T. K., Norman, J. E. Repurposing simvastatin as a therapy for preterm labor: evidence from preclinical models. Faseb J. 33 (2), 2743-2758 (2019).
  31. Boyle, A. K., et al. Ascending vaginal infection in mice induces preterm birth and neonatal morbidity. Am J Pathol. 195 (5), 891-906 (2025).
  32. Kendall, G. S., Robertson, N. J., Iwata, O., Peebles, D., Raivich, G. N-methyl-isobutyl-amiloride ameliorates brain injury when commenced before hypoxia ischemia in neonatal mice. Pediatr Res. 59 (2), 227-231 (2006).
  33. Rocha-Ferreira, E., et al. Curcumin: novel treatment in neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Front Physiol. 10, 1351(2019).
  34. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods Mol Biol. 887, 41-47 (2012).
  35. Lier, J., Streit, W. J., Bechmann, I. Beyond activation: characterizing microglial functional phenotypes. Cells. 10 (9), (2021).
  36. Schmidt-Kastner, R., Wietasch, K., Weigel, H., Eysel, U. T. Immunohistochemical staining for glial fibrillary acidic protein (GFAP) after deafferentation or ischemic infarction in rat visual system: features of reactive and damaged astrocytes. Int J Dev Neurosci. 11 (2), 157-174 (1993).
  37. Pekny, M., Pekna, M. Astrocyte reactivity and reactive astrogliosis: costs and benefits. Physiol Rev. 94 (4), 1077-1098 (2014).
  38. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent imaging reveals novel patterns of colonization and invasion in systemic Escherichia coli K1 experimental infection in the neonatal rat. Infect Immun. 83 (12), 4528-4540 (2015).
  39. Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology (Reading). 148 (Pt 9), 2745-2752 (2002).
  40. Bonacorsi, S., Bingen, E. Molecular epidemiology of Escherichia coli causing neonatal meningitis. Int J Med Microbiol. 295 (6-7), 373-381 (2005).
  41. Hartling, L., Liang, Y., Lacaze-Masmonteil, T. Chorioamnionitis as a risk factor for bronchopulmonary dysplasia: a systematic review and meta-analysis. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 97 (1), F8-F17 (2012).
  42. Liang, G., et al. Isoflurane causes greater neurodegeneration than an equivalent exposure of sevoflurane in the developing brain of neonatal mice. Anesthesiology. 112 (6), 1325-1334 (2010).
  43. Yang, B., et al. Comparison of neurodegeneration and cognitive impairment in neonatal mice exposed to propofol or isoflurane. PLoS One. 9 (6), e99171(2014).
  44. Schmitz-Koep, B., et al. Decreased cortical thickness mediates the relationship between premature birth and cognitive performance in adulthood. Hum Brain Mapp. 41 (17), 4952-4963 (2020).
  45. Nagy, Z., Lagercrantz, H., Hutton, C. Effects of preterm birth on cortical thickness measured in adolescence. Cereb Cortex. 21 (2), 300-306 (2011).
  46. Dimitrova, R., et al. Preterm birth alters the development of cortical microstructure and morphology at term-equivalent age. Neuroimage. 243, 118488(2021).
  47. Dada, T., et al. Mouse model of intrauterine inflammation: sex-specific differences in long-term neurologic and immune sequelae. Brain Behav Immun. 38, 142-150 (2014).
  48. Suff, N., et al. Cervical gene delivery of the antimicrobial peptide, human beta-defensin (HBD)-3, in a mouse model of ascending infection-related preterm birth. Front Immunol. 11, 106(2020).
  49. McKenna, E., et al. Neutrophils: need for standardized nomenclature. Front Immunol. 12, 602963(2021).
  50. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  51. Jackson, C. M., et al. Pulmonary consequences of prenatal inflammatory exposures: clinical perspective and review of basic immunological mechanisms. Front Immunol. 11, 1285(2020).
  52. Durrani-Kolarik, S., et al. miR-29b supplementation decreases expression of matrix proteins and improves alveolarization in mice exposed to maternal inflammation and neonatal hyperoxia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (2), L339-L349 (2017).
  53. Nguyen, L., et al. Sex-differences in LPS-induced neonatal lung injury. Sci Rep. 9 (1), 8514(2019).
  54. Zhang, Y., Edwards, S. A., House, M. Cerclage prevents ascending intrauterine infection in pregnant mice. Am J Obstet Gynecol. , (2023).
  55. Kammala, A. K., et al. Extracellular vesicles-mediated recombinant IL-10 protects against ascending infection-associated preterm birth by reducing fetal inflammatory response. Front Immunol. 14, 1196453(2023).
  56. Tantengco, O. A. G., et al. Inflammatory response elicited by Ureaplasma parvum colonization in human cervical epithelial, stromal, and immune cells. Reproduction. 163 (1), 1-10 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نمذجة العدوى المهبلية الصاعدة والولادة المبكرة ومراضة حديثي الولادة لدى الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.