مقالة منهجية

استخراج الحمض النووي والمقارنة بين عينات الذباب الميت القديمة والطازجة

1.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66737

⸱

مايو 3, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hainan Province Tropical Forensic Engineering Research Center, Department of Forensic Medicine, Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine), 2Hainan Vocational College of Political Science and Law, Hainan Gongping Forensic Center, 3Department of Forensic Medicine, Hebei Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

توضح هذه المقالة بروتوكولا لاستخراج الحمض النووي للذبابة الميتة حديثا وقديما باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الشائعة المعدلة.

الملخص

تم اختيار ما مجموعه خمس عينات من عينات Chrysomya megacephala - ثلاث عينات جديدة ، وعينة واحدة مخزنة في الكحول لمدة 2 سنوات ، وعينة واحدة مخزنة في تخزين جاف مختوم لمدة 2 سنوات محمية من الضوء فقط - للتحقيق فيما إذا كانت مجموعة استخراج الحمض النووي في الدم يمكن أن تستخرج الحمض النووي من الذباب الميت ولتحديد ما إذا كان الكحول يمكن أن يطيل الحفاظ على الحمض النووي للذباب الميت. أولا ، تم استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي في الدم لاستخراج الحمض النووي من أنسجة الصدر. بعد ذلك ، تم فحص نقاء الحمض النووي وتركيزه باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة ومقياس الفلور. أخيرا ، تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي للحمض النووي المستخرج باستخدام بادئات خاصة بالذباب الميتوفيلي الموجودة في تسلسل جين CO I للميتوكوندريا. أظهرت النتائج أن نقاء الحمض النووي لجميع العينات كان أكبر من 2.0. لوحظ أن تركيز الحمض النووي بالترتيب التالي: عينات جديدة > عينات قديمة محفوظة بالكحول > عينات قديمة غير معالجة. كان لجميع العينات نطاقات كهربائية محددة بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. في الختام ، يمكن استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي للدم لاستخراج الحمض النووي من الذباب الميت بنجاح ، وتركيز الحمض النووي لعينات الذباب الطازجة أكبر من تركيز عينات الذباب القديمة. يمكن تخزين الذباب في الكحول لفترة طويلة.

المقدمة

لطالما كان الاستدلال على وقت الوفاة أحد القضايا الرئيسية والصعبة التي يجب حلها في الممارسة القضائية. في ممارسة علم الطب الشرعي ، بالنسبة للقضية الجنائية ، يلعب تحديد فترة ما بعد الوفاة دورا حاسما في استنتاج وقت الجريمة ، وحبس المشتبه به ، وتضييق نطاق التحقيق. تعتمد الطرق التقليدية للاستدلال على وقت الوفاة في المقام الأول على ظواهر ما بعد الوفاة المبكرة ، والتي لا يمكن استخدامها بشكل عام إلا لاستنتاج وقت الوفاة في غضون 24 ساعة. ومع ذلك ، لا يمكن تحديد وقت الوفاة الطويل من خلال ظواهر ما بعد الوفاة. من المسلم به الآن بشكل عام في مجتمع علوم الطب الشرعي أن علم الحشرات الشرعي لديه القدرة على أن يكون وسيلة فعالة للاستدلال على وقت أطول من الوفاة.

سميت الحشرات Necrophagous ليرقاتها التي تتغذى على الجثث. من بينها ، كلما كانت هناك جثة ، سيكون الذباب الميت البالغ أول من يصل إلى الجثة ويضع بيضه أو يرقاته. تتغذى اليرقات على أنسجة الجثة وتنضج إلى الشرانق ، والتي تنتقل إلى البالغين. يلعب الذباب الميت دورا كبيرا في ممارسة علم الطب الشرعي بسبب دورة حياته المنتظمة وتوزيعه الجغرافي ، على سبيل المثال ، خصم وقت الوفاة وتحديد مكان الوفاة 1,2. ومع ذلك ، فإن العائق أمام استخدام الذباب الميت في ممارسة الطب الشرعي هو تحديد الأنواع. لا تزال الطرق المورفولوجية تستخدم كطريقة موثوقة لتحديد أنواع الذباب الميت. ومع ذلك ، يتطلب تحديد الأنواع المورفولوجية درجة عالية من سلامة الحشرات. إذا كان الذباب في مراحل نمو مختلفة ، أو بسبب التغيرات المورفولوجية الناجمة عن الخيارات البيئية ، فإن كل ذلك يجعل الفحص المورفولوجي أكثر صعوبة. على وجه الخصوص ، بالكاد يمكن التعرف على مورفولوجيا الشرانق وقذائف العذراء ، والتي توجد غالبا في مسرح الجريمة. هذا ، إلى جانب ندرة الخبراء المورفولوجيين ، يجعل صعوبة كبيرة في تحديد الأنواع من الناحية المورفولوجية. لذلك ، ظهر تطبيق طرق البيولوجيا الجزيئية لتحديد أنواع الذباب ، مما يقلل من صعوبة التعرف المورفولوجي وهو مستقل عن مرحلة النمو3،4،5،6،7.

تتمثل الخطوة الأولى في تحديد أنواع الذباب الميت بناء على طرق البيولوجيا الجزيئية في الاستخراج الفعال للحمض النووي ، في حين أن المجموعات المتخصصة لاستخراج الحمض النووي للحشرات ليست متاحة بشكل شائع حاليا. وكيفية استخدام مجموعات الدم الشائعة لاستخراج الحمض النووي للذباب الميت تصبح أكثر أهمية من الناحية الجنائية. غالبا ما يتم تشويه الذباب الميت الموجود في مسرح الجريمة أو خضع للتحلل وتدهور الحمض النووي. عينات الذباب ليست متاحة على الفور لاستخراج الحمض النووي بعد الحصول عليها ، أو إذا أمكن ، يجب الاحتفاظ بعينات كاملة بسبب متطلبات الحفاظ على الأدلة. بناء على المتطلبات المذكورة أعلاه ، في هذه الدراسة ، قمنا بتطبيق مجموعة الحمض النووي للدم بناء على هضم البروتيناز K ، واخترنا ثلاث عينات Chrysomya megacephala طازجة (Diptera ، Lepidoptera) (الشكل 1) ، وعينة قديمة من C. megacephala وضعت في الكحول لمدة عامين ، وعينة واحدة من C. megacephala وضعت في مخزن محمي من الضوء لمدة عامين ، وزنت كل عينة من العينات الخمس ، انتخب أنسجة الصدر الحشرية لاستخراج الحمض النووي. بمقارنة جودة ونقاء الحمض النووي المستخرج من العينات القديمة والجديدة ، تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي للحمض النووي المستخرج باستخدام بادئات خاصة بالذباب الميتوفيلي الموجودة في تسلسل جين ثاني أكسيد الكربون figure-introduction-1 الميتوكوندريا.

البروتوكول

ملاحظة: تم استخدام ما مجموعه خمس عينات من عينات C. megacephala في هذا البروتوكول - ثلاث عينات طازجة (طازجة 1 ، طازجة 2 ، وطازجة 3) ، وعينة واحدة مخزنة في الكحول لمدة عامين (قديم 1) ، وعينة واحدة مخزنة في تخزين جاف مغلق لمدة عامين محميين من الضوء فقط (قديم 2). يجب تسمية العينات وفقا للمتطلبات التجريبية.

1. تخزين العينات العامة والمستحضرات

  1. اختيار العينة وإعدادها
    ملاحظة: تأكد من العمل في غطاء الدخان عند تطبيق أسيتات الإيثيل لتنفيذ الذباب الميت. أخرج السائل من سطح الذبابة قبل الوزن.
    1. عينات طازجة: ضع ثلاث عينات ذباب مجمعة في قوارير الغاز بعد قتلها بأسيتات الإيثيل. قم بوزن العينات وتسميتها باسم Fresh 1 و Fresh 2 و Fresh 3 واستخدمها على الفور في التجارب.
      ملاحظة: كانت عينات الذباب الطازجة في هذا البروتوكول تحتوي على كتل 56.8 مجم و 49.3 مجم و 52.1 مجم.
    2. العينة القديمة 1: أخرج عينات الذباب التي قتلتها أسيتات الإيثيل وتخزينها في أنابيب طرد مركزي مملوءة بالكحول لمدة عامين في احتواء محكم الإغلاق ، محمي من الضوء في درجة حرارة الغرفة. وزن العينة بعد امتصاص السائل السطحي بورق الترشيح ؛ نسميها القديمة 1.
      ملاحظة: كانت كتلة Old 1 42.3 mg في هذا البروتوكول.
    3. العينة القديمة 2: أخرج عينة الذباب التي قتلتها أسيتات الإيثيل وتخزينها في أنبوب طرد مركزي لمدة عامين في احتواء محكم الإغلاق ، محمي من الضوء في درجة حرارة الغرفة. وزنها ونسميها القديمة 2.
  2. التحضير قبل الاستخراج
    1. أضف كمية صغيرة من النيتروجين السائل لتبريد وعاء من الفولاذ المقاوم للصدأ ؛ انتظر حتى يتبخر كل النيتروجين السائل.
    2. ضع عينة ذبابة في الحاوية ؛ صب النيتروجين السائل ببطء لمنع النيتروجين السائل من التناثر والتأثير على عينة الحشرات.
    3. تجميد العينات في النيتروجين السائل. قم بإزالة العينات بعد تبخر النيتروجين السائل.
    4. افصل الصدر بشكل فردي ، وضعه في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل ، وقطعه إلى أصغر شرائح ممكنة.
      ملاحظة: قطع العينة إلى قطع صغيرة بحيث يمكن شقها بالكامل ، ويمكن إطلاق الحمض النووي بكميات كبيرة.
    5. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لكل ذبابة ، وقم بتجميدها بشكل فردي ، ثم قم بإزالتها إلى أنبوب طرد مركزي جديد لمنع التلوث المتبادل للحمض النووي.

2. استخراج الحمض النووي

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) في جهاز طرد مركزي دقيق. يجب تنفيذ جميع الخطوات مع الالتزام الصارم بمبادئ التعقيم وتجنب التلوث المتبادل.

  1. تحلل الأنسجة
    1. أضف 180 ميكرولتر من محلول تحلل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على عينة مقطوعة.
    2. أضف 20 ميكرولتر من البروتيناز K. تخلط جيدا عن طريق الدوامة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان وتحتضن عند 56 درجة مئوية حتى تتحلل أنسجة الحشرات تماما.
      ملاحظة: إضافة المزيد من Proteinase K يجب أن يكون إذا لم يتم هضم الأنسجة بالكامل. عادة ما يكتمل التحلل في 1-3 ساعات ، كما يمكن أن يمدد وقت التحلل بين عشية وضحاها.
  2. ترسيب الحمض النووي
    1. دوامة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية. أضف 200 ميكرولتر من محلول التحلل إلى العينة ، واخلطها جيدا عن طريق الدوامة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية.
    2. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول (96-100٪) واخلطه جيدا مرة أخرى عن طريق الدوامة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية.
      ملاحظة: يمكن إضافة المخزن المؤقت للتحلل والإيثانول معا في خطوة واحدة لتوفير الوقت. قد يتكون راسب أبيض عند إضافة مخزن التحلل والإيثانول.
  3. ماصة الخليط في عمود امتزاز الحمض النووي يوضع في أنبوب تجميع 2 مل. أجهزة الطرد المركزي في 6000 × غرام لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق وأنبوب التجميع.
  4. ضع عمود امتزاز الحمض النووي من الخطوة السابقة في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل ، وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة البروتين ، وأجهزة طرد مركزي عند 6000 × جم لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق وأنبوب التجميع.
  5. انقل عمود امتزاز الحمض النووي إلى أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل ، وأضف 500 ميكرولتر من محلول تحلية المياه ، وأجهزة طرد مركزي عند 20000 × جم لمدة 3 دقائق لتجفيف غشاء عمود امتزاز الحمض النووي. تجاهل التدفق وأنبوب التجميع.
    ملاحظة: تضمن خطوة الطرد المركزي هذه إزالة أي إيثانول متبقي قبل الشطف التالي. إذا كان هناك أي ترحيل للإيثانول ، أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 20000 × غرام لمدة 1 دقيقة.
  6. ضع عمود امتزاز الحمض النووي في أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 2 مل ، وقم بسحب 100 ميكرولتر مباشرة من محلول شطف الحمض النووي على غشاء العمود ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 1 دقيقة للإذاعة.
    ملاحظة: الشطف مع 100 ميكرولتر (بدلا من 200 ميكرولتر) يزيد من تركيز الحمض النووي النهائي في الشطف ولكنه يقلل أيضا من إجمالي إنتاج الحمض النووي. لزيادة إنتاجية الحمض النووي إلى أقصى حد ، كرر الشطف مرة واحدة كما هو موضح في الخطوة 2.8.
  7. قم بتخزين عينات الحمض النووي في 4 درجة مئوية (حتى 1 أسبوع) أو -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

3. الكشف عن تركيز الحمض النووي

  1. تحديد قيم OD 260 و OD 280 لمقارنة نقاء الحمض النووي وتركيز الحمض النووي بواسطة قارئ الصفيحة الدقيقة. كرر ثلاث مرات على كل عينة.
  2. حدد تركيز الحمض النووي المستخرج بواسطة مقياس الفلورومتر باستخدام المجموعة المصاحبة له ، مع ثلاث نسخ متماثلة لكل عينة.
    1. خذ 190 ميكرولتر من محلول العمل في أنبوبي طرد مركزي سعة 0.5 مل ، وخذ 10 ميكرولتر لكل من المعيار # 1 والمعيار # 2 ، وأضفهما إلى حلول العمل ، واحفظهما بعيدا عن الضوء لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
      ملاحظة: يتم معايرة المعيار #1 والمعيار #2 بدقة لتركيز معين من الحمض النووي. يجب تكوين الحلول القياسية بدقة لضمان تشكيل منحنى قياسي دقيق. المعيار # 1 هو عينة من الحمض النووي المزدوج (dsDNA) 0.2 نانوغرام / ميكرولتر ؛ المعيار # 2 هو 2,000 نانوغرام / ميكرولتر. حل العمل هو صبغة ترتبط على وجه التحديد ب dsDNA.
    2. خذ 2 ميكرولتر من اختبار الحمض النووي واخلطه مع 198 ميكرولتر من محلول العمل في أنبوب طرد مركزي سعة 0.5 مل ، واحفظه بعيدا عن الضوء لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
      ملاحظة: إذا كان تركيز الحمض النووي منخفضا ، أضف 5 ميكرولتر من اختبار الحمض النووي مع 195 ميكرولتر من محلول العمل.
    3. بعد 15 دقيقة ، قم بتشغيل الجهاز وحدد قياس تركيز dsDNA | بعيد المدى. أولا ، اختبر المعيار # 1 ، ثم المعيار # 2 للحصول على المنحنى القياسي.
      ملاحظة: يجب استخدام الحل القياسي في نفس اليوم بعد تكوينه ؛ سيؤدي تركه لفترة طويلة جدا إلى حدوث خطأ كبير في المنحنى القياسي.
    4. ضع العينات المراد اختبارها في آبار الفحص واحدة تلو الأخرى ، واضبط حجم ارتفاع الحمض النووي إلى 2 ميكرولتر ، وكرر القياس ثلاث مرات ، وخذ متوسط القيمة ، وسجل.

4. PCR والكشف الكهربائي

ملاحظة: تم أخذ تسلسل جين ثاني أكسيد الكربون figure-protocol-1 الميتوكوندريا بطول 278 bp لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل مع التمهيدي الأمامي C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG ، والتمهيدي العكسي C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8 ، ثم تم التحقق من الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز بنسبة 2٪ للتحقق من تأثير التضخيم وتم التحقق من طول منتجات التضخيم.

  1. إعداد 20 ميكرولتر من نظام تضخيم PCR عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من مزيج 2x Taq ، و 1 ميكرولتر من كل برايمر ، و 5 ميكرولتر من ddH2O ، و 3 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ؛ تخلط جيدا لمدة 10 ثوان في جهاز طرد مركزي.
  2. استخدم معلمات ركوب الدراجات PCR التالية: التمسخ 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ تمسخ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تلدين 48 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تمديد 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية لما مجموعه 40 دورة ؛ والتمديد النهائي 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. قم بإخضاع المنتجات بعد PCR إلى 2٪ من الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، وبعد الرحلان الكهربائي ، ضعها على نظام تصوير جل لتحليل الصور.

النتائج

استخدمنا قارئ الصفائح الدقيقة لقياس قيم OD260 و OD280 لمحلول الحمض النووي المستخرج ثم حصلنا على قيم OD260 / OD280 لتقييم نقاء الحمض النووي. كان OD260 / OD280 لجميع العينات الطازجة والعينة القديمة 1 أكبر من 2. كان ل OD260 / OD280 للعينة القديمة 2 قيمة قصوى تبلغ 2.187 على الرغم من أن المتوسط كان 1.753 ، وتذبذبت قياساتها الثلاثة بشكل كبير بسبب القيم الصغيرة (≤0.01) لكل من OD280 و OD280 (الجدول 1). بناء على قيمة OD260 التي تم الحصول عليها ، قمنا بتقدير تركيز الحمض النووي. كان تركيز الحمض النووي للعينات الثلاثة بالترتيب: عينات جديدة > عينة قديمة 1 > عينة قديمة 2 ، تم قياسها باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة ، لكن الفرق بين العينات الطازجة والعينات القديمة كان صغيرا ، فقط ~ 10-20 نانوغرام / ميكرولتر (الجدول 1) ، في حين أن تركيز الحمض النووي للعينات الطازجة الثلاث المقاسة بواسطة مقياس الفلور Qubit كان أكبر من ذلك الذي تم قياسه بواسطة قارئ الصفائح الدقيقة بمقدار 125-130 نانوغرام / ميكرولتر ، بفارق 15 نانوغرام / ميكرولتر في العينة القديمة 1 و 1.3 نانوغرام / ميكرولتر فقط في العينة القديمة 2. تركيز الحمض النووي للعينات الطازجة > العينة القديمة 1 > العينة القديمة 2 (الجدول 2).

يحتوي الحمض النووي المستخرج بطريقة الاستخلاص المستخدمة حاليا على جميع مكونات الحمض النووي من مصادر مختلفة في العينة. هذا يعني أن محلول الحمض النووي لم يكن مجرد محلول للحمض النووي الجيني للذبابة. تم اختيار البادئات لتضخيم شظايا جين ثاني أكسيد figure-results-1 الكربون الميتوكوندريا على وجه التحديد من خلال الرجوع إلى الأدبيات والتحقق منها بواسطة NCBI-Blast Primer. أظهرت النتائج أن التمهيدي الأمامي C1-J-2495 والتمهيدي العكسي C1-N-2800 لجين CO figure-results-2 الميتوكوندريا كانا بادئات خاصة بالذباب مع تعدد أشكال تسلسلي وغطت العديد من أنواع الذباب. لم تظهر نتائج التضخيم الجينات البشرية. كانت زوجا من المؤشرات الحيوية الموثوقة للحمض النووي لتحديد الذباب الميت وتم اختيارها للتحقق من نتائج هذه التجربة.

أظهرت جميع العينات المختلفة نطاقات كهربائية واضحة بأطوال تتراوح بين 250 نقطة أساس و 400 نقطة أساس. كانت النطاقات أكثر إشراقا في العينات الطازجة منها في العينات القديمة ، وكانت العينات القديمة الموضوعة بالكحول (الشكل 2 ، القديم 1) أكثر إشراقا من العينات القديمة غير المعالجة (الشكل 2 ، القديم 2) ، لكن العينات القديمة كان لها أيضا شريطان في مواضع مختلفة. لم يكن لعنصر التحكم الفارغ نطاقات (الشكل 2).

figure-results-3
الشكل 1: صور لرأس الأقحوا من زوايا مختلفة. (أ) ذكر؛ ب: أنثى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 2: مخطط كهربية لمنتجات تضخيم PCR. النطاقات الثلاثة الأولى من اليسار هي منتجات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي من عينات الذباب الطازجة. الفرقة الكهربية الرابعة هي منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي من عينة الذباب القديمة المحفوظة في الكحول. النطاق الخامس هو منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي من عينة الذباب القديمة دون أي حفظ خاص. الفرقة السادسة عبارة عن عنصر تحكم فارغ ؛ إنه نظيف ، مما يثبت عدم حدوث تلوث أثناء تضخيم PCR. في أقصى اليمين يوجد سلم الحمض النووي (DNA)، حيث حددنا مواضع الحمض النووي (DNA) التي يبلغ طولها 250 bp و400 bp. كانت النطاقات الكهربائية لجميع منتجات PCR للعينات أعلى بقليل من 250 نقطة أساس وأقل من 400 نقطة أساس. يتطابق هذا الموقف مع طول الجين المستهدف 278 bp. من الواضح للعين المجردة أن أشرطة الحمض النووي التي تمثل عينات جديدة أكثر إشراقا من تلك الموجودة في العينات القديمة. تتكون العينات القديمة من نطاقات الحمض النووي الأخرى الموجودة هناك في جينات أقل كثافة وغير مستهدفة بأطوال مختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عينةطازج1فريش2فريش3قديم1قديم2
OD260 / OD2802.354±0.0362.245±0.0272.060±0.0382.143±0.0121.753±0.421
الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر)119.91±1.686116.084±4.96595.239±3.40186.845±6.1410.151±0.168

الجدول 1: قياس نقاء الحمض النووي وتركيزه باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة.

عينةطازج1فريش2فريش3قديم1قديم2
الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر)243.333±1.528237.667±2.082226.000±2.000101.000±0.00011.433±0.058

الجدول 2: قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الفلورومتر.

المناقشة

استخراج الحمض النووي هو الرابط الأكثر أهمية في التحديد الجزيئي للذباب الميت ، وتؤثر طريقة استخراجه وجودة الحمض النووي المستخرج بشكل مباشر على الكشف اللاحق. في هذه التجربة ، نجحنا في استخراج الحمض النووي من الذباب الميت باستخدام مجموعة دم شائعة ، دون الحاجة إلى شراء مجموعة خاصة لاستخراج الحمض النووي للحشرات ، مما يجعل استخراج الحمض النووي للحشرات أسهل في الإنجاز.

سطح الذباب غني بالكيتين ، خاصة في مراحل اليرقات والعذراء حيث يمكن أن يصل الكيتين للبشرة إلى 60-70٪ ، مما يجعل استخراج الحمض النووي من الذباب الميت صعبا9. وجدنا أثناء عملية الاستخراج أنه إذا كانت العينة رطبة ، على الرغم من أننا قمنا بقص العينة بشكل كاف ، فقد ظلت العينة هلامية عند تطبيق البروتيناز K للهضم. هذا منع السائل المضاف من المرور مرة أخرى عبر عمود الامتزاز. لحل هذه المشكلة ، قمنا أولا بتطبيق النيتروجين السائل لتجميد العينات بسرعة لجعل الذباب هشا وسهل الطحن ، فضلا عن سهولة الهضم الكامل. إذا كان النيتروجين السائل غير متاح للطحن ولا يزال يتعين تحسين كفاءة استخراج الحمض النووي ، يمكن وضع عينات الذباب في منطقة جيدة التهوية لمدة 48 ساعة تقريبا. يمكن ترك العينات تجف قبل قصها بشكل كاف واستخراج الحمض النووي لاحقا.

بالنظر إلى أن تدهور الحمض النووي للعينات القديمة كان مصدر قلق أكبر ، تم اختيار عينات ذبابة الصدر لاستخراج الحمض النووي في هذه التجربة بسبب ارتفاع محتوى الحمض النووي للصدر. ومع ذلك ، فإن استخدام الصدر مدمر للغاية للسلامة المورفولوجية للذبابة من أجل الحفاظ الكامل على الأدلة اللاحقة والحاجة إلى تحديد المورفولوجية. يصعب استخراج العينات عندما كان الصدر متعفنا. إذا كانت العينات جديدة ، فقد يكون من الأفضل استخراج الحمض النووي للقدم والجناح. يتم توزيع القدم والجناح بشكل متماثل وثنائي ، ويمكن الاحتفاظ بخصائص مورفولوجية أكثر اكتمالا بعد استخراج الأنسجة من جانب واحد. ومع ذلك ، فإن تركيز الحمض النووي المستخرج من الجناح والقدم منخفض نسبيا ، وهو أمر محفوف بالمخاطر بالنسبة للدراسات اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت العينات صغيرة وفقدتبسهولة 10.

عند استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي لاستخراج الحمض النووي ، كانت قيم OD260 / OD280 المقاسة بواسطة قارئ الصفيحة الدقيقة أكبر من 2 باستثناء العينة القديمة 2. أولا ، يمكن تحديد أن البروتين قد تمت إزالته بشكل أكثر شمولا ، ولكن قد يكون هناك تلوث بالحمض النووي الريبي ، أو فواصل مزدوجة للحمض النووي بسبب الطرد المركزي المتكرر ، أو تدهور الحمض النووي في العينات القديمة11. ثانيا ، قد يشير أيضا إلى أن الكحول يطيل الحفاظ على الحمض النووي الريبي.

يتم حساب تركيز الحمض النووي من قيمة OD260 لقارئ الصفيحة الدقيقة ، بينما يتم استخدام مقياس الفلور Qubit لإنشاء منحنى قياسي أولا ، ثم قياس قيمة الامتصاص لحساب تركيز الحمض النووي. يمكن لكلتا الطريقتين تحقيق قياس تركيز الحمض النووي النزرة ، ولكن لكل منهما مزاياه وعيوبه: يطبق قارئ الصفيحة الدقيقة OD260 لحساب تركيز الحمض النووي ، ولكن طريقة حسابه هي أيضا تقدير. إذا تم خلط العينة بعدد كبير من النيوكليوتيدات أو البروتينات والمواد الأخرى التي يمكنها امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ، فسيكون الخطأ الضوئي أكبر ، لذلك يجب أن نحاول إزالتها مسبقا.

تستخدم قارئات الصفائح الدقيقة وأجهزة قياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للكشف ، والذي لا يمكنه التمييز بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي والأحماض النووية المتدهورة والنيوكليوتيدات الحرة والشوائب الأخرى ، كما يتأثر الامتصاص بشكل كبير بتلوث المواد الأخرى ، مما يجعل قراءاته غير موثوقة نسبيا. أثناء ارتفاع العينات ، والتي يتم قياسها عادة في قطرات ، يتم رفع العينات مباشرة دون تخفيف أو معالجة ، مما يسمح بالقياس المتزامن لعينات متعددة والحساب المباشر لنقاء الحمض النووي من قياسات OD260 / OD280. من ناحية أخرى ، تم تصميم مقياس الفلور Qubit لقياس تركيز الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل فقط من خلال تطبيق محلولين قياسيين للتركيز المعروف لإنشاء منحنى قياسي وتطبيق خصائص الأصباغ الفلورية التي ترتبط على وجه التحديد بالحمض النووي المزدوج الشريط. ومع ذلك ، يجب معالجة كل عينة بشكل فردي ثم قياسها بشكل فردي ، وهو أمر مرهق لتطبيقات عينات الدفعات ، ولا يمكن قياس نقاء الحمض النووي المستخرج. في التطبيق المحدد للاثنين يمكن اختيارها وفقا لاحتياجاتهم الخاصة لاختبار جودة الحمض النووي12،13،14.

كان تركيز الحمض النووي للعينات الطازجة أكبر من تركيز العينات القديمة الموضوعة في الكحول وأكبر من العينات القديمة غير المعالجة ، بغض النظر عما إذا كان تركيز الحمض النووي قد تم قياسه بواسطة قارئ صفيحة دقيقة أو مقياس فلور كيوبت. للتخزين طويل الأجل ، يمكن غمر العينات في الكحول لمنع نمو البكتيريا والفطريات15,16.

كان لطرق القياس المختلفة تأثير أقل على قياسات الحمض النووي للعينات القديمة دون أي علاج ، ربما لأن العينات القديمة كانت أكثر تدهورا ، خاصة أن البروتين والحمض النووي الريبي قد يتحلل بشكل أسرع من الحمض النووي. في المقابل ، كانت العينات الطازجة تحتوي على المزيد من البروتين والحمض النووي الريبي ، وبالتالي كان لها تأثير أكبر على النتائج. إذا تمت مقارنة تركيزات الحمض النووي المزدوجة الشريط فقط ، فيجب أن نستخدم نتائج مقياس الفلورومتر كيوبت ، وخلقت نتائج تجاربنا أيضا تدرجا كبيرا في تركيز الحمض النووي في العينات القديمة والجديدة.

يمكن استخدام محتوى الحمض النووي لكل من العينات الطازجة والقديمة بعد استخراج الحمض النووي لتحليل البيولوجيا الجزيئية اللاحقة. كما في هذه التجربة ، كانت البادئات المختارة لجين ثاني أكسيد figure-discussion-1 الكربون الميتوكوندريا 278 نقطة أساس فقط ، ويمكن تضخيمها جميعا بنجاح بواسطة الحمض النووي. جين ثاني أكسيد figure-discussion-2 الكربون الميتوكوندريا هو ، بدوره ، موضع معترف به في الذباب لإمكانية تشفير الحمض النووي ، مما يسمح بتحديد أنواع الذباب الميت عن طريق تحليل التسلسلاللاحق 17. يمكن تحقيق البيولوجيا الجزيئية للعينات المحفوظة الأطول بنجاح عن طريق اختيار البادئات لتسلسلات الحمض النووي الأقصر الأخرى. وتجدر الإشارة إلى أن النطاقات الكهربية للعينات القديمة كان لها شريطان لهما مواضع مختلفة وتسلسلات أقصر ، ربما بسبب التضخيم غير المحدد للبادئات الناجم عن تدهور الحمض النووي إلى جانب انخفاض درجة حرارة التلدين.

ومع ذلك ، في هذه التجربة ، تم الاحتفاظ بعدد أقل من العينات لفترة طويلة لتلبية الحاجة إلى التجارب المتكررة ، في حين أن النتائج تتطلب عينات تمثيلية فقط. لذلك ، لم نجري اختبار التكرار ، والذي قد يكون استكشافيا للحفاظ على العينات القديمة والجديدة ولكنه لا يؤثر على الاستخراج الناجح لعينات الذباب الميتة.

باختصار ، يمكن أن يساعد استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي للدم أيضا في استخراج الحمض النووي للذبابة الميتة. يمكن استخراج كل من العينات القديمة والجديدة بنجاح ، ويمكن استخدام جميع الحمض النووي المستخرج للتحليل اللاحق. الكحول هو أيضا مواتية للحفاظ على المدى الطويل من عينات الحمض النووي للذباب.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يتم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82060341،81560304) ومشروع البحث العلمي لمنصة الابتكار الأكاديمي في مقاطعة هاينان (YSPTZX202134).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المخزن المؤقت AEQiagen172026832شطف الحمض النووي
المخزن المؤقت ALQiagen172028374المخزن
ATLQiagen172028162تحلل الأنسجة
العازلة AW1Qiagen172028760المخزن المؤقت لإزالة البروتين
Buffer AW2Qiagen57203108تحلية المياه العازلة
C1-J-2495Taihe BiotechnologyTW21109216forword التمهيدي
C1-N-2800Taihe BiotechnologyTW21109217التمهيدي العكسي
D2000 سلم الحمض النوويالوقت الحقيقي (بكين) التكنولوجيا الحيويةRTM415قياس موضع العصابات الكهربية
DNeasy Mini Spin العمودQiagen166050343امتصاص الحمض
النووي حاضنة الحمام الجافMiulabDKT200-2Dيستخدم لتسخين
MIX-30S Mini MixerMiulabMUC881206عمل تذبذبي
Proteinase KQiagen172026218تعطيل نوكليازات داخل الخلايا والبروتينات الأخرى
Qubit 3.0 مقياس الفلورالحراري فيشر العلمي2321611188
السرعة الطرد المركزي الدقيقScilogex9013001121معيار أجهزة الطرد المركزي
# 1Thermo Fisher Scientific2342797
Standard # 2Thermo Fisher Scientific2342797
Tanon 3500R Gel ImagerTanon16T5553R-455جل التصوير
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Thermo CyclerZhuhai HemaVRB020Aحل عمل PCR العادي
Thermo Fisher Scientific2342797
محلول المؤقت في عمود

المراجع

  1. Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. Forensic entomology: applications and limitations. Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).
  2. Wydra, J., Matuszewski, S. The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium. Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).
  3. Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology. Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).
  4. Odeniran, P. O., et al. molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria. Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).
  5. Wells, J. D., Stevens, J. R. Application of DNA-based methods in forensic entomology. Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).
  6. Kotrba, M., et al. DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species. J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).
  7. Weedon, M. N., et al. Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation. BMJ. 372, 214(2021).
  8. Cai, J. -F., et al. The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China. Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).
  9. Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects. Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).
  10. Guo, Y. Q., et al. Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies. J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).
  11. Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures. J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).
  12. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J Vis Exp. (48), e2699(2011).
  13. Masago, K., et al. Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests. Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).
  14. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).
  15. Adams, Z. J., Hall, M. J. Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length. Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).
  16. Fliegerova, K., et al. Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population. Anaerobe. 29, 80-84 (2014).
  17. Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review. Acta Trop. 238, 106778(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح


Formal Correction: Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples
Posted by JoVE Editors on 8/12/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66737

الوسوم

Chrysomya megacephala

مقالات ذات صلة