مقالة منهجية

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد من دماغ الفأر البالغ الطازج عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا

2.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66769

⸱

سبتمبر 6, 2024

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا بروتوكولا لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من منطقة ما تحت المهاد (أو هياكل الدماغ الصغيرة المكافئة) باستخدام فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) ، في وقت قصير نسبيا. يمكن استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد المصنفة بواسطة MACS للتحليل خارج الجسم الحي ويمكن طلاءها لإجراء فحوصات في المختبر .

الملخص

الخلايا الدبقية الصغيرة ، باعتبارها الضامة المقيمة في الدماغ ، ضرورية للحفاظ على توازن الدماغ. إنها تشكل الدوائر العصبية أثناء التطور ، وتمسح بيئتها بحثا عن الحطام أو الخلايا الميتة ، وكذلك تستجيب للعدوى والإصابة في الدماغ ، من بين العديد من الوظائف الأخرى. ومع ذلك ، لم يتم تحديد دورها المهم في النمو العصبي واللدونة المشبكية والفيزيولوجيا المرضية بشكل كامل ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى مزيد من التحقيق. للحصول على فهم أكثر شمولا لدور الخلايا الدبقية الصغيرة في هذه العمليات ، نحتاج إلى عزل الخلايا الدبقية الصغيرة وتوصيفها وراثيا واستقلابيا ووظيفيا. ومع ذلك ، فإن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الفئران البالغة ، وخاصة من هياكل الدماغ الصغيرة ، يمثل تحديا لأنها تمثل نسبة صغيرة من إجمالي خلايا الدماغ ، وغالبا ما يكون إنتاج الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة منخفضا جدا. هنا ، يسمح لنا العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام ميكروبيدات CD11b + بفرز الخلايا الدبقية الصغيرة من منطقة ما تحت المهاد لدماغ فأر بالغ حديث النفاذ. تسمح لنا الطريقة الحالية بتحقيق نقاء وعائد مرتفعين نسبيا في فترة قصيرة مع الحفاظ على صلاحية الخلية.

المقدمة

تتوافق الخلايا الدبقية الصغيرة مع 5-20٪ من إجمالي الخلايا العصبية وهي الخلايا الدبقية الوحيدة التي تنشأ من أسلاف الكريات الحمر في كيس الصفار وتبدأ في استعمار الدماغ النامي حول اليوم الجنيني E9.5 1,2. إنها خلايا طويلة العمر مع القدرة على الخضوع للتجديد الذاتي ببطء ، بشكل مستقل عن الخلايا المشتقة من نخاع العظام3. باعتبارها بعض الخلايا الأكثر ديناميكية ، فهي قادرة على اكتساب أنماط ظاهرية متنوعة استجابة للإشارات السياقية والبيئية 2,4. من بين الإشارات القادرة على تعديل نشاطها ، فإن تلف الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، والنشاط العصبي ، وكذلك العناصر الغذائية ، هي الأكثر فعالية. أظهرت مجموعة متزايدة من الأبحاث الدور المحوري للخلايا الدبقية الصغيرة في الإصابة والأمراض التنكسية العصبية والسمنة2،5،6. ومع ذلك ، فإن الدور الدقيق للخلايا الدبقية الصغيرة في كل من العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجيا المرضية يتطلب مزيدا من الدراسة. لذلك ، فإن توصيفها النسخي والأيضي والوظيفي في ظل ظروف مختلفة له أهمية كبيرة ويتطلب عزلها ، لأن الدراسات في الموقع مناسبة لتوطين الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين والمقارنات النوعية ، وكذلك التوصيف المورفولوجي للخلايا الدبقية الصغيرة.

هناك العديد من التقنيات الموصوفة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة ، من بينها طريقة التدرجPercoll 7 ، وفرز خلايا قياس التدفق الخلوي (FACS) 8 ، وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). يعتمد اختيار الطريقة المناسبة على أهداف الدراسة ومستوى النقاء المطلوب للتطبيقات النهائية. إن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة النقية عن دماغ الفأر البالغ ، وخاصة من هياكل الدماغ الصغيرة مثل منطقة ما تحت المهاد ، يمثل تحديا بسبب العدد المحدود من الخلايا الدبقية الصغيرة. يسمح التفكك اللطيف الآلي لمنطقة ما تحت المهاد باستخدام تقنية Miltenyi بتنقية محصول الخلايا الدبقية الصغيرة المرتفع نسبيا في وقت قصير مع القدرة على متابعة ما يصل إلى ثماني عينات في نفس الوقت باستخدام جهاز فك ارتباط OCTO لطيف MACS.

يتبع تجانس الأنسجة تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام تقنية MACS القائمة على العمود وحبات CD11b + فائقة المغناطيسية بحجم النانو. لذلك ، تتم معالجة جميع العينات بنفس الطريقة تماما مما ينتج عنه خلايا CD11b + سليمة. من الجدير بالذكر أن CD11b ليس موجودا حصريا في الخلايا الدبقية الصغيرة ولكن يتم التعبير عنه أيضا في خلايا النسب النخاعية الأخرى ، بما في ذلك الضامة والوحيدات9. للحد من ذلك ، يضمن تروية الدماغ بمحلول ملحي بارد قبل استخراج منطقة ما تحت المهاد (انظر خطوة البروتوكول 2.6) القضاء على معظم الخلايا النخاعية ، تاركا فقط جزءا صغيرا محتملا من الضامة المقيمة أو تلك الملتصقة بالأوعية الدموية. تشكل الضامة المقيمة والوحيدات في الجهاز العصبي المركزي المستقر السليم نسبة صغيرة من إجمالي الخلايا المناعية في الدماغ (~ 10٪ و <2٪ على التوالي)10,11. لذلك ، عندما يتم فرز خلايا الدماغ باستخدام حبات CD11b + ، يمكن عزل كل من الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم ، على الرغم من أن الغالبية العظمى هي الخلايا الدبقية الصغيرة.

يتيح لنا العائد النهائي للخلايا الدبقية الصغيرة والحفاظ على صلاحيتها إجراء فحوصات خارج الجسم الحي ، وكذلك في المقايسات المختبرية ، مع ميزة تحليل مناطق معينة من الدماغ ذات الأهمية. أظهرت أحدث الأدلة أن مجموعة الخلايا الدبقية الصغيرة غير متجانسة للغاية ، وتمثل التعبير الجيني الخاص بالمنطقة والخصائص المورفولوجية والوظيفة2،12،13. لذلك ، يهدف البروتوكول الحالي إلى عزل وتحليل الخلايا الدبقية الصغيرة البالغة بطريقة خاصة بالمنطقة. في الواقع ، يمكننا توصيف الملامح الجينية والنسخية والانتقالية للخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد للبالغين باستخدام طرق مثل RT-qPCR وتسلسل الحمض النووي الريبي ، بالإضافة إلى إجراء التحليل الوظيفي في المختبر .

البروتوكول

أجريت جميع التجارب على الموصوفة في امتثال صارم لتوصيات الاتحاد الأوروبي (2013/63 / EU) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية لجامعة بوردو (CEEA50) ووزارة التعليم العالي والبحث والابتكار الفرنسية (ملخص غير تقني للمشروع المعتمد NTS-FR-619193 v.1 ، 23-12-2022).

يتم تنفيذ البروتوكول التالي على الفئران البالغة C57BL / 6 بمتوسط عمر 2-4 أشهر. ومع ذلك ، يمكن إجراؤه في جميع أعمار الفئران وظروفها مع الأخذ في الاعتبار أن مشهد الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي قد يتغير ويمكن زيادة النسبة المئوية للبلاعم المقيمة والوحيدات (على سبيل المثال في الشيخوخة والتنكس العصبي).

1. إعداد الحلول

ملاحظة: تتم الإشارة بدقة إلى وحدات التخزين والحلول التالية إلى عزل خلايا Cd11b +.

  1. حدد الحجم الإجمالي ل D-PBS / 0.5٪ مصل البقر الزلال (BSA) المطلوب بناء على عدد العينات. قم بإعداد المحلول باستخدام D-PBS المتاح تجاريا مع الكالسيوم والمغنيسيوم ومسحوق BSA (انظر جدول المواد).
  2. قم بإعداد أنابيب التفكك الموسومة (C-Tubes) واملأ كل منها ب 1900 ميكرولتر من المخزن المؤقت Z ، المتوفر في مجموعة تفكك أنسجة المخ البالغة (انظر جدول المواد). قم بإذابة الإنزيمات واحتفظ بها على الجليد ، جنبا إلى جنب مع جميع المخازن المؤقتة المطلوبة في الخطوات التالية.
  3. قم بإعداد ووضع الحجم المناسب من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (انظر جدول المواد) اللازم للتروية (الخطوة 2.6) على الجليد. احسب 10 مل لكل بالإضافة إلى 10٪ زائدة.
  4. لتحليل RT-qPCR ، قم بإعداد المخزن المؤقت qPCR لكل عينة: 2.5 ميكرولتر من ثيوجلسرين + 250 ميكرولتر من محلول التحلل ، باستخدام مجموعة متاحة تجاريا لتنقية الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
  5. لتحديد كمية البروتين ، قم بإعداد محلول التحلل عن طريق تخفيف كوكتيل مثبطات الفوسفاتيز وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني 1: 100 في مخزن مؤقت لاستخراج الثدييات (انظر جدول المواد).
  6. للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ومقايسة البلعمة ، قم بإعداد 1x HBSS من 10x HBSS المتاح تجاريا (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت FACS عن طريق إضافة 0.2٪ BSA إلى 1x HBSS.

2. إزالة الدماغ

  1. تخدير بجرعة 20 مغ/كغ من الزيلازين؛ ثم ، القتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة من 400 مجم / كجم من بنتوباربيتال ووضعه في صينية تشريح.
    ملاحظة: يمكن أن تعمل أيضا تركيبات مخدرة أخرى للقتل الرحيم للحيوان.
  2. املأ حقنة سعة 10 مل ب 10 مل من الثلج البارد 1x PBS وأرفقها بإبرة فراشة 21 جرام.
  3. بمجرد تخدير الفأر تماما (تحقق عن طريق قرص الكفوف لضمان عدم الاستجابة) ، توقف التنفس ، والقلب في حالة رجفان ، خيمة الجلد بالملقط وفتح التجويف الصدري بالمقص ، على مستوى الأضلاع الأخيرة والقص.
  4. استخدم المقص لعمل قطع عميق على طول جانبي القفص الصدري باتجاه الجزء العلوي من القفص الصدري لكشف القلب.
  5. أدخل إبرة 21 G في الجزء البعيد من البطين الأيسر (تأكد من أن ما يقرب من 1/3 من الإبرة داخل البطين). قم على الفور بعمل شق من خلال الأذين الأيمن باستخدام المقص.
  6. قم ببث 10 مل من الثلج البارد 1x PBS لتنظيف الدماغ من أي خلايا مناعية منتشرة.
    ملاحظة: افحص الدماغ بصريا للتأكد من نظافته وأدائه جيدا.
  7. قطع رأس الماوس ، واستخراج الدماغ بعناية ، ووضعه على طبق بتري مملوء بالثلج ومغطى بورق الألمنيوم.
    ملاحظة: يساعد طبق بتري والرقائق في رؤية قطع الدماغ. من المفيد الحفاظ على بيئة باردة أثناء تقطيع قطع الدماغ للحد من الأنشطة الأيضية.
  8. عزل ما تحت المهاد باستخدام ملقط وتقطيعه إلى قطع صغيرة مع شفرات الحلاقة.
    1. لتحديد وتشريح منطقة ما تحت المهاد ، ضع الدماغ رأسا على عقب بحيث تكون القشرة بطنية وتكون منطقة ما تحت المهاد مرئية ظهريا على السطح العلوي. افصل منطقة ما تحت المهاد ، التي تقع في الجزء السفلي من الدماغ على جانبي البطين الثالث ، باستخدام ملقط منحني. متوسط وزن ما تحت المهاد من الفئران البالغة C57BL / 6 هو 15 ملغ.
      ملاحظة: يجب أن تكون قطع الدماغ صغيرة قدر الإمكان (<0.5 مم). يعد التقطيع إلى قطع صغيرة خطوة حاسمة لأنه يسمح بتفكك أفضل وإنتاجية أعلى للخلايا.
  9. اجمع قطع منطقة ما تحت المهاد في أنابيب التفكك (C-Tubes) المملوءة مسبقا ب 1900 ميكرولتر من Buffer Z (الخطوة 1.2).
    ملاحظة: للحصول على عائد جيد من الخلايا الدبقية الصغيرة يكفي لإجراء المقايسات ، قم بتجميع ما لا يقل عن اثنين (لتحديد كمية البروتين) أو ثلاثة (ل qPCR و RNAseq) تحت المهاد لكل أنبوب.

3. تفكك الأنسجة

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات على الجليد. لا دوامة تعليق الخلية في أي خطوة ؛ امزج بعناية فقط مع ماصة سعة 1000 ميكرولتر.

  1. تحضير مزيج الإنزيم 2 وفقا للجدول 1 (حساب الحجم الكلي لجميع الأنابيب + 10 ٪ الزائدة). في كل أنبوب C ، أضف 50 ميكرولتر من الإنزيم الموجود في المزيج 1 (انظر الجدول 1) و 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2. يتم توفير جميع الإنزيمات في مجموعة تفكك أنسجة المخ البالغة (انظر جدول المواد).
  2. أغلق الأنابيب C وضعها رأسا على عقب في جهاز التفكك باستخدام أقواس التسخين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتشغيل البرنامج 37C_ABDK_02.
  3. قم بإعداد أنابيب مفاجئة سعة 15 مل (انظر جدول المواد) مع مصافي 70 ميكرومتر فوقها. بلل المصفاة ب 2 مل من D-PBS.
  4. عند انتهاء برنامج التفكك / الهضم ، أفرغ الأنبوب C على المصفاة وخدشه بطرف 200 ميكرولتر لتقليل فقد الخلايا عن طريق زيادة ترشيح الخلايا وتقليل التصاق تجانس الأنسجة على الفلتر.
  5. اغسل الأنبوب ب 2 × 5 مل من D-PBS ، وأفرغ الغسلات على المصفاة ، وخدشها بطرف 200 ميكرولتر بين الغسالات.
  6. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ونضح المادة الطافية تماما. أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية بالحجم المناسب من D-PBS البارد وفقا للجدول 1.
  7. امزج على الفور بعناية مع 450 ميكرولتر من كاشف تدرج الكثافة (محلول إزالة الحطام ، انظر جدول المواد) وقم بالتراكب برفق شديد مع 2 مل من D-PBS البارد (انظر الجدول 1).
    ملاحظة: للحصول على طبقات تدرج الكثافة المختلفة ، يجب تراكب D-PBS برفق قطرة قطرة ، بأقل "إزعاج" ممكن ، 1 مل في المرة الواحدة باستخدام ماصة 1 مل.
  8. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تسارع بطيء وفرامل بطيئة (إذا كان 9 يعادل ممتلئا ، فاستخدم 5).
  9. يتم تشكيل ثلاث مراحل. نضح المرحلتين العلويتين تماما وتجاهلهما. تأكد من عدم نضح المرحلة السفلية الثالثة.
  10. املأ 1800 ميكرولتر من D-PBS البارد واقلب الأنبوب برفق 3 مرات.
  11. جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تسارع كامل وفرامل كاملة ونضح المادة الطافية تماما. أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية عن طريق السحب ببطء لأعلى ولأسفل باستخدام 2 مل من D-PBS / BSA.

4. العزل المغناطيسي لخلايا CD11b +

  1. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ونضح المادة الطافية تماما. أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت D-PBS / BSA.
  2. أضف 10 ميكرولتر من خليط الميكروبيدات CD11b واخلطه جيدا مع الماصة.
  3. احتضان لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية في الثلاجة ، وليس على الجليد ؛ غسل الخلايا بإضافة 1 مل من D-PBS / BSA وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ؛ نضح الطافي تماما. أعد التعليق بعناية في 500 ميكرولتر من D-PBS / BSA.
  4. قم بتشغيل برنامج POSSEL2 على الفاصل باتباع الإرشادات التي تظهر على الشاشة. ضع الأعمدة الصغيرة (انظر جدول المواد) في المجال المغناطيسي.
    ملاحظة: يمكن اختيار أعمدة صغيرة أو كبيرة لفرز الخلايا المغناطيسية ، وفقا لمتوسط عدد الخلايا المتوقعة. الأعمدة الصغيرة لها سعة تصل إلى 1 × 107 خلايا مسماة وأعمدة كبيرة تصل إلى 1 × 108. عند عزل الخلايا عن الهياكل الصغيرة ، مثل منطقة ما تحت المهاد ، ينصح باستخدام أعمدة صغيرة. تختلف أحجام الكواشف عند استخدام أعمدة كبيرة (انظر تعليمات الشركة المصنعة).
  5. بلل الأعمدة (انظر جدول المواد) ب 500 ميكرولتر من D-PBS / BSA. إذا كانت هناك حاجة إلى الكسر السالب للخلايا (CD11b-) لمزيد من التحليل ، فضع لوحة تجميع أسفل الأعمدة ثم ضع تعليق الخلية في الأعمدة.
  6. نفذ ثلاث خطوات غسيل عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من D-PBS / BSA في وقت واحد في العمود ، في كل مرة تنتظر مرور المخزن المؤقت عبر العمود.
    ملاحظة: من المهم منع جفاف الجزء العلوي من العمود ، لذلك ينصح بعدم الانتظار حتى يمر كل المخزن المؤقت.
  7. نقل إجمالي النفايات السائلة لجزء CD11b من آبار لوحة التجميع إلى أنابيب سعة 15 ملليلتر.
  8. قم بإزالة العمود من الفاصل ، وضعه على أنبوب سعة 5 مل ، وماصة 1 مل من D-PBS / BSA في العمود.
  9. اغسل على الفور جزء الخلية المسمى مغناطيسيا عن طريق تطبيق المكبس المرفق مع العمود بإحكام.
  10. في النهاية ، عد خلايا CD11b + باستخدام مقياس الدم أو أي طريقة أخرى ؛ نتوقع ~ 15000 خلية لكل منطقة تحت المهاد.
  11. قم بطرد مركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.

5. التحليلات

  1. لتحليل RT-qPCR ، أعد تعليق كريات الخلية باستخدام المخزن المؤقت qPCR (للتحضير ، انظر الخطوة 1.3) وقم بتخزين الأنابيب عند - 80 درجة مئوية حتى استخراج mRNA. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي ، ثم معالجته وتحليله باتباع إرشادات MIQE14. أخيرا ، قم بتوليف cDNA وإجراء qPCR باستخدام جهاز RT-PCR. انظر جدول المواد لجميع المجموعات المتاحة تجاريا المستخدمة.
  2. لتحديد كمية البروتين ، اغسل كريات الخلية باستخدام D-PBS (بدون BSA) على الأقل 2x للتخلص من BSA. ثم ، أعد تعليق كريات الخلية من اثنين من منطقة ما تحت المهاد مع 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل. تابع القياس الكمي للبروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: لقد اتبعنا تعليمات الشركة المصنعة15 لتحديد البروتينات لإجراء فحص نشاط كينازات سيرين / ثريونين.
  3. للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا الدبقية الصغيرة ، أعد تعليق الحبيبات في 1x HBSS. عالج الخلايا باتباع بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة فحص قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا المعالجة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (للتحضير ، انظر الخطوة 1.5) وقم بإجراء FACS للكشف عن الخلايا المجهدة بالتأكسد.
  4. لمقايسة البلعمة ، احتضان الخلايا المصنفة في D-PBS / BSA مع حبات اللاتكس الفلورية (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة. اضبط عدد الخرزات ليحتوي على 4 حبات لكل خلية في المتوسط. ثم أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإعادة التعليق في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وقراءة انبعاث التألق بواسطة FACS (λex 575 nm ؛ λem 610 nm).

النتائج

يعتمد تقييم العائد النهائي على مستوى النقاء وكمية الخلايا المعزولة ويمكن تحديده بواسطة RT-qPCR ، وعد الخلايا ، وتحديد كمية البروتين. تم تأكيد نقاء الخلايا المغناطيسية المعزولة من منطقة ما تحت المهاد من خلال تحليل التعبير الجيني ل CD11b و C1qa و Gad1 و GFAP باستخدام RT-qPCR (الشكل 1). يتم التعبير عن CD11b و C1qa في الغالب بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة في حالة مستقرة CNS16 و Gad1 و GFAP بمثابة علامة عصبية ونجمية على التوالي. تراوح إجمالي cDNA من منطقة ما تحت المهاد من 55 إلى 98 نانوغرام. من الجدير بالذكر أن الكسر الموجب فقط أظهر تعبير CD11b و C1qa ، مما يشير إلى عدم وجود أي خسارة محتملة للخلايا الدبقية الصغيرة في الجزء السالب. يتم توفير الاشعال في الجدول 2.

علاوة على ذلك ، تضمن المستويات الثانوية للعلامات العصبية والنجمية أن الغالبية العظمى من الخلايا المعزولة هي خلايا دبقية صغيرة لأن الضامة المقيمة والوحيدات تشكل 10٪ فقط من إجمالي مشهد الخلايا المناعية للدماغ السليم10,11. تثبت هذه النتائج فعالية الانتقاء المغناطيسي وتمهد الطريق لتطبيق RT-qPCR لتقييم مستويات التعبير لجميع الجينات ذات الأهمية في الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد المصنفة حديثا. وبالمثل ، يمكن إجراء تحليل RNAseq على الخلايا الدبقية الصغيرة المصنفة تحت المهاد للحصول على رؤية شاملة لنسخها.

تم تحديد كمية الخلايا المعزولة عن طريق عد الخلايا ووجد أنها ~ 15000 خلية لكل منطقة تحت المهاد (المذكورة في خطوة البروتوكول 4.10). بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد تركيز البروتين في الخلايا الدبقية الصغيرة المصنفة ، مما كشف عن متوسط تركيز قدره 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر في خلايا CD11b + المعزولة من اثنين من منطقة ما تحت المهاد المجمعة (الشكل 2). تسمح هذه المعرفة بإجراء فحوصات مختلفة اعتمادا على الحد الأدنى من عتبة البروتين. علاوة على ذلك ، من خلال تجميع المزيد من منطقة ما تحت المهاد ، يمكن تحقيق تركيز أعلى ، وتوسيع نطاق التحليلات المحتملة. تسهل البروتينات المستخرجة من الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد تقنيات متنوعة ، بما في ذلك المقايسات المناعية AlphaLISA ومقايسات نشاط الكيناز.

علاوة على ذلك ، يسمح البروتوكول الموصوف للباحثين بإجراء العديد من التحليلات خارج الجسم الحي ، مما يتيح استكشاف نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة ودورها في منطقة ما تحت المهاد في كل من السياقات الفسيولوجية والمرضية. يمثل القياس الكمي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية جانبا حاسما من الاستجابة المناعية للخلايا الدبقية الصغيرة17. لذلك ، بعد الانفصال ، يمكن معالجة الخلايا الدبقية الصغيرة بالكواشف المتاحة تجاريا والتي تسمح باكتشاف أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا الحية من خلال إظهار إشارة فلورية متزايدة عند الأكسدة. الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة مغناطيسيا من ثلاثة تحت المهاد المجمعة كافية للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة FACS ، كما هو موضح في الشكل 3A ، على الرغم من أن نتائجنا تظهر تباينا كبيرا جدا في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية للخلايا بين الظروف التي قمنا بتحليلها. من الجدير بالذكر أنه باستخدام المجموعة التجارية المذكورة أعلاه (انظر جدول المواد) ، تمكنا أيضا من تقييم صلاحية خلايا Cd11b + التي تم فرزها ، وذلك بفضل صبغة الخلايا الميتة غير المبررة للخلايا والتي تظهر زيادة في التألق عند ربط الحمض النووي. على وجه التحديد ، تظهر بياناتنا أن 99٪ من الخلايا على قيد الحياة (الشكل 3B). تم استخدام استراتيجيات البوابات للتمييز بين الخلايا الحية والميتة ، وكذلك الخلايا المجهدة وغير المجهدة بالأكسدة ، بناء على خصائصها الفلورية.

ميزة رئيسية أخرى للنشاط الدبقي الصغير هي البلعمة ، وهي عملية ديناميكية ومنظمة بإحكام تلعب دورا رئيسيا في المراقبة المناعية ، وإصلاح الأنسجة ، والتوازن العام للجهاز العصبي المركزي18. ومن اللافت للنظر أن خلايا Cd11b + المصنفة بخرز مغناطيسي مقترن يمكن استزراعها لمدة 24 ساعة ثم حضنها بميكروبيدات اللاتكس الفلورية في نقاط زمنية مختلفة لتقييم التغيرات في نشاط البلعمة في ظل ظروف مختلفة ، إما عن طريق FACS أو عن طريق الفحص المجهري الفلوري. يمكن أيضا أن تتعرض الخلايا الدبقية الصغيرة المصنفة حديثا لحبيبات الفلورسنت أو أي نوع من الجسيمات المقترنة بالأس الهيدروجيني (مثل المشابك العصبية) مباشرة داخل الأنبوب ، ويمكن تقييم البلعمة عن طريق تحليل FACS.

على وجه التحديد ، قمنا بحضنها مباشرة في الأنبوب الذي يحتوي على معلق خلوي مصنف ، أو الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من اثنين من منطقة ما تحت المهاد المجمعة أو دماغ كامل مع حبات اللاتكس الفلورية. يمكن تمييز الخلايا الدبقية الصغيرة التي تصيب حبة فلورية واحدة على الأقل عن الخلايا غير البلعمية عن طريق قياس التدفق الخلوي لأن الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية ستظهر تألقا معززا. تم استخدام الضوابط السلبية ، غير المحتضنة بالخرز ، للبوابة. في كلتا الحالتين التجريبيتين (الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون (HFD)) لاحظنا نسبة منخفضة جدا من الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية (الشكل 4 أ). ومع ذلك ، تظهر هذه النتيجة هنا لإثبات فعالية هذه الطريقة ، والتي ، بشكل ملحوظ ، تسمح أيضا بالتمييز بين الخلايا التي البلعمة 1 حبة ، 2 حبة ، 3 حبات ، وهلم جرا (الشكل 4B). أخيرا ، يمكن تطبيق جميع مناهج omics على الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة. نقترح تجميع ثلاثة تحت المهاد للحصول على خلايا كافية لإجراء هذه المقايسات.

figure-results-1
الشكل 1: تقييم نقاء خلايا CD11b + بواسطة RT-qPCR. القياس الكمي في الخلايا المصنفة لتعبير mRNA ل integrin CD11b ، الوحدة الفرعية للمكون الفرعي C1q A C1q ، حمض الجلوتاميك ديكاربوكسيلاز Gad1 والبروتين الحمضي الليفي الدبقي GFAP طبيعي على مستويات mRNA لجينات التدبير المنزلي Eef1a1 و Sdha. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تكميم البروتين من خلايا تحت المهاد بعد فرز الخلايا. القياس الكمي لتركيز البروتين في خلايا CD11b + و CD11b. تم تحليل كل من خلايا CD11b + و CD11b في 20 ميكرولتر من محلول التحلل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا الحية الدبقية الصغيرة. القياس الكمي للخلايا (A) المجهدة بالأكسدة و (B) الخلايا الحية في مجموعة من خلايا Cd11b + المصنفة ، مع مخططات كفاف FACS النسبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: القياس الكمي لنشاط البلعمة الدبقية الصغيرة. (أ) القياس الكمي للخلايا البلعمية في خلايا Cd11b + المصنفة من منطقتين تحت المهاد أو دماغ واحد ، مع مخطط كفاف FACS النسبي. (ب) النسبة المئوية للخلايا البلعمية وفقا لعدد الخرزات البلعمية ذات المخطط الكنتوري النسبي ل FACS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مزيج الانزيم 2
انزيم أالعازلة Yانزيم ف
10 ميكرولتر20 ميكرولتر50 ميكرولتر
د-برنامج تلفزيونيحل إزالة الحطامتراكب D-PBS
هيكل 15-100 ملغ1000 ميكرولتر450 ميكرولتر2 مل

الجدول 1: تحضير خليط التفكك (تشير الأحجام إلى عينة واحدة) والطبقات المتدرجة العلوية.

جيناتبروتينأماميعكس
إتغامإنتغرين ألفا M (CD11b)CTCATCACTGCTGGCCTATACAAGCAGCTTCATTCATGTCCTT
سدهاسكسينات ديهيدروجيناز كومبلكس فلافوبروتين الوحدة الفرعية أCCCTCATATGTGGACATCAACAAGGTCTTGTCGATAACAGGT
C1qaالمكون المكمل 1 ، المكون الفرعي q ، بولي ببتيد ألفاCGAGGTGTGGATCGAAAAGGGAAGATGCTGTCGGCTTCAGT
جاد1الغلوتامات ديكاربوكسيلاز 1GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAGCTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT
جفابالبروتين الحمضي الليفي الدبقيAGGTCCGCTTCCTGGAACAGGGCTCCTTGGCTCGAA

الجدول 2: تسلسل التمهيدي RT-qPCR.

فرز خلايا قياس التدفق الخلوي (FACS)فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS)
الأجسام المضادة البيوكيميائية الموسومة بالفلورسنتحبات مغناطيسية مترافقة مع الأجسام المضادة
التمايز خارج علامات سطح الخليةالتمايز فقط وفقا لعلامات سطح الخلية
عائد أولي كبيرعائد أولي متواضع
أبطأ من MACS للتعامل المتزامن مع العديد من العيناتأسرع من FACS للمعالجة المتزامنة للعديد من العينات
أقل لطفا من أجهزة MACألطف من FACS

الجدول 3: تمثيل خصائص وقيود نظام مراقبة الأصول الميدانية ونظام إدارة القذائف

المناقشة

يقدم البروتوكول الحالي عزل الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد من دماغ الفأر البالغ الذي تم اختراقه حديثا عن طريق فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا. تؤكد النتائج المعروضة أعلاه نقاء الخلايا المعزولة وقابليتها للحياة ، فضلا عن فعالية هذه الطريقة في توصيف الخلايا الدبقية الصغيرة خارج الجسم الحي وظيفيا ، على سبيل المثال من خلال نشاط البلعمة وقياس كمية إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية. يمكن أيضا استخدام الطرق الكلاسيكية لعزل مجموعة خلايا معينة للخلايا الدبقية الصغيرة. تجزئة تدرج الكثافة هي طريقة معروفة لفصل الخلايا المختلفة وجزيئاتها وفقا لحجمها و / أو كثافتها. يمكن تطبيق هذه التقنية لعزل وثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية. ومع ذلك ، فإن تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة البالغة تتطلب مزيدا من الفرز لخلايا الدماغ المعزولة باستخدام فرز الخلايا الفلورية المنشطة أو المغناطيسية المناعية.

على وجه التحديد ، يعتمد FACS على الأجسام المضادة البيوكيميائية الموسومة بالفلورسنت لتسمية الخلايا وتمييزها وفقا لعدد كبير من المتغيرات التي تتجاوز علامات السطح ، مثل حجمها وحالتها الأيضية. ومع ذلك ، يمكن أن تكون عملية تنقية الخلايا أبطأ وليست لطيفة ، مما يزيد من عدد الخلايا الميتة ، فضلا عن الحاجة إلى عائد أولي كبير. لذلك ، فإن العدد الصغير من الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد هو بالفعل عامل مقيد. يستخدم MACS حبات مغناطيسية مترافقة مع أجسام مضادة معينة ضد حوامل خلوية معينة ويمكن أن يعمل مع عائد أولي متواضع يسهل الدراسات الخاصة بالمنطقة حول ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة. بسبب المجال المغناطيسي القوي للميكروبيدات ، يلزم وضع الحد الأدنى من الملصقات ؛ وبالتالي ، فهو ألطف من FACS ، مما يضمن الحفاظ على سلامة الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يكون MACS أسرع من FACS عندما تكون المعالجة المتزامنة للعديد من العينات ضرورية. يوفر هذا ميزة واضحة تتمثل في الحفاظ على قابلية عالية للخلية يمكن أن تأتي أيضا من عائد أولي صغير (الجدول 3).

تشمل التحديات الرئيسية في عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من منطقة ما تحت المهاد ، والتي يمكن معالجتها بفعالية من خلال تقنية MACS ، تحقيق عائد نهائي كاف وضمان الحفاظ على سلامة الخلايا. تعتمد كمية الخلية المطلوبة على طبيعة التحليل المختار بعد العزل. على سبيل المثال ، تتطلب دراسة الدور الوظيفي للخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر عددا كبيرا من الخلايا. وهذا يؤكد أهمية وجود تجمع أولي لنفس منطقة الدماغ من فئران متميزة ذات ظروف مماثلة قبل الشروع في عملية العزل. على العكس من ذلك ، فإن تقنيات مثل تسلسل الخلية المفردة عالي الدقة لا تتطلب عددا كبيرا من الخلايا ، وبالتالي ، لا يلزم تجميع العديد من الفئران.

لزيادة إنتاجية الخلايا إلى أقصى حد ، من الضروري الالتزام بخطوات محددة في البروتوكول. يبدأ التفكك الفعال عن طريق قطع منطقة ما تحت المهاد إلى قطع صغيرة ، ثم عن طريق ضمان الحفاظ عليها في المخزن المؤقت في أسفل الأنبوب أثناء العملية. بعد ذلك ، يضمن الجمع بين التفكك الميكانيكي والتدهور الأنزيمي للمصفوفة خارج الخلية إنتاجية عالية للخلايا. ومع ذلك ، يجب أن نكون حذرين للغاية في تفسير النتائج لأن التفكك الأنزيمي الذي يتم إجراؤه عند 37 درجة مئوية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات نسخية ومتعدية19. لمنع التعديلات بوساطة تقنية ، يمكن استخدام الضوابط المناسبة مع مثبطات النسخ والترجمة19. من الممكن أيضا المضي قدما في التفكك الأنزيمي عند درجة حرارة منخفضة ، كما هو الحال في غرفة باردة (قد تقل الفعالية) على الرغم من أن التفكك قد يعتمد على التأثير الميكانيكي أكثر من الأنزيمية. بعد التفكك ، يتم غسل تعليق الخلية مسبقا ونقله إلى المصافي ، ويتم إجراء غسلتين أكثر شمولا للأنابيب لمنع فقدان الخلايا. خطوة أخرى حاسمة هي إزالة الحطام والمايلين التي تحققت عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة وتشكيل طبقات مختلفة. ومن ثم ، فإن تحقيق عائد نهائي كبير يتطلب معالجة دقيقة لكل من الأنسجة تحت المهاد وتعليق الخلايا ، والحفاظ عليها دائما على الجليد لإبطاء عملية التمثيل الغذائي والحفاظ على النمط الظاهري في الجسم الحي .

علاوة على ذلك ، هناك بعض النقاط التي يجب أن نكون حذرين للغاية لتحقيق أعلى نقاء للخلايا الدبقية الصغيرة والحفاظ على النمط الظاهري لخلايا الخلايا الدبقية الصغيرة. في البداية ، يعد التروية الذي يتم إجراؤه عند 4 درجات مئوية أمرا بالغ الأهمية للقضاء على جميع خلايا CD11b + المنتشرة لضمان أعلى نقاء محتمل للخلايا الدبقية الصغيرة. ومع ذلك ، في حالة اضطراب حاجز الدم في الدماغ ، يمكن لنسبة أعلى من الخلايا المناعية المنتشرة استعمار الدماغ الذي يتداخل مع دراسة الخلايا الدبقية الصغيرة نفسها. للتخفيف من هذه المشكلة ، يتضمن النهج البديل تنفيذ جولة ثانوية من العزل المغناطيسي باستخدام الميكروبيدات المترافقة مع الجسم المضاد CD45. CD45 هي علامة سطح الخلية التي تظهر تعبيرا عاليا في الضامة20 والتدفق اللاحق لهذه الجولة يشمل فقط الخلايا الدبقية الصغيرة. هذه الاستراتيجية لاستخدام جولتين من العزل المغناطيسي تعزز خصوصية العملية. ومع ذلك ، فإنه يستغرق وقتا إضافيا ، مما يشكل خطرا محتملا لمقاطعة السلامة الخلوية و / أو النمط الظاهري للخلايا الدبقية الصغيرة. ومن ثم ، فإن العامل الحاسم للحفاظ على الخصائص الوظيفية للخلايا وسلامتها ينطوي على عزل أنسجة المخ بسرعة وإبقائها على الجليد حتى تبدأ عملية التفكك. باختصار ، يعزز هذا النهج التحليلي فهم وظيفة وسلوك الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يوفر رؤى قيمة حول استجاباتها الديناميكية في منطقة ما تحت المهاد.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يتم دعم AN من قبل المعهد الجامعي الفرنسي (IUF) ، وجامعة بوردو ، والمؤسسة الفرنسية لأبحاث الدماغ (FRC) ، و GLN (مجموعة تغذية الدهون) ، والوكالة الوطنية للبحوث (ANR ، PRC 2023-MicroNRJ). وحظيت الزراعة المحافظة على الموارد بدعم من مؤسسة البحوث الطبية (FRM-ARF201809006962). تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج Horizon Europe للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي في إطار شبكات الدكتوراه MSCA 2021 ، رقم 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging والأمراض المرتبطة بالعمر ، الخلود.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة تفكك الدماغ للبالغينMiltenyi130-107-677تحتوي المجموعة على المخزن المؤقت Z ، العازلة Y ، الإنزيمات A و P ، محلول إزالة الحطام ، المخزن المؤقت A (لإذابة الإنزيم A).
الألبومين البقري FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads ، الإنسان والفأر - حجم صغيرMiltenyi130-093-636
CellROX Green Flow Cellmetry Assay KitInvitrogenC10492
الطرد المركزي ، غطاء Snap-Pop 15 ملCellTreat978449
DPBS والكالسيوم والمغنيسيوم والجلوكوز والبيروفاتجيبكو14287-072
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator مع سخاناتMiltenyi130-096-427
كوكتيل مثبط الفوسفاتيز (100x)Thermofisher78420
Inhibitor ، خالي من EDTA (100x) Thermofisher78437
HBSS (10x) ، كالسيوم ، المغنيسيوم ، لا الفينولالأحمر Thermofisher14065056
حبات اللاتكس ، البوليسترين المعدل بالكربوكسيل ، الأحمر الفلوريSigma-AldrichL3280
LightCycler   ؛ 480 SYBR Green I MasterRoche 4707516001تم استخدام هذا الكاشف لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
أجهزة MACS SmartStrainers (70 & micro; م)Miltenyi130-110-916
Protein Assay KitThermofisher23235
M-PER استخراج الثدييات العازلةThermofisher78503
MS ColumnsMiltenyi130-042-201يشار إليها باسم الأعمدة الصغيرة في البروتوكول.
فاصل MultiMACS Cell24 PlusMiltenyi130-098-637
PBSS ، درجة الحموضة 7.4   ؛Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177تم استخدام المجموعة لتصنيع الحمض النووي (cDNA).
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011تحتوي المجموعة على 1-Thioglycerol و BL buffer (يشار إليه باسم المخزن المؤقت للتحلل في البروتوكول) وتم استخدامه لعزل الحمض النووي الريبي الكلي.
مكنسة كهربائية أمان لوك 21 جمبيكتون ديكنسون367282
أنبوب Thermofisher 78420 كوكتيل مثبط البروتياز Halt Protease Micro BCA

المراجع

  1. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  3. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584(2021).
  6. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  7. Lee, J. -K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
  8. Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
  9. Lee, E., Eo, J. -C., Lee, C., Yu, J. -W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
  10. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  11. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  12. Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
  13. Tan, Y. -L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  14. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  15. PamGene International B. V. 1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells.pdf. PamGene International B. V. , (2022).
  16. Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48(2017).
  17. Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743(2020).
  18. Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790(2019).
  19. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
  20. DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152(2019).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD11b
عزل الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد من دماغ الفأر البالغ الطازج عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.