مقالة منهجية

عزل النوى من الأنسجة الدهنية العضلية البشرية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى في اتجاه مجرى النهر

DOI:

10.3791/66784

⸱

مايو 3, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Research Institute, AdventHealth, 2Steno Diabetes Center Copenhagen, 3Division of Endocrinology and Metabolism, University of Pittsburgh, 4Gerontology and Geriatric Medicine, Wake Forest University School of Medicine, 5Department of Internal Medicine - Rheumatology, Allergy, and Clinical Immunology, University of California Davis Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيولوجيا الأنسجة الدهنية العضلية (IMAT) غير مستكشفة إلى حد كبير بسبب محدودية إمكانية الوصول إلى الأنسجة البشرية. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل النوى وإعداد مكتبة IMAT البشري المجمد لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى لتحديد التركيب الخلوي لهذا المستودع الدهني الفريد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنسجة الدهنية العضلية (IMAT) هي مستودع دهني غير مدروس نسبيا يقع بين ألياف العضلات. يزداد محتوى IMAT مع تقدم العمر ومؤشر كتلة الجسم ويرتبط بالأمراض الأيضية والأمراض التنكسية العضلية. ومع ذلك ، فإن فهم الخصائص البيولوجية ل IMAT وتفاعلها مع ألياف العضلات المحيطة يفتقر بشدة. في السنوات الأخيرة ، زودنا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنوى بأطالس خاصة بنوع الخلية للعديد من الأنسجة البشرية. ومع ذلك ، لا يزال التركيب الخلوي لل IMAT البشري غير مستكشف إلى حد كبير بسبب التحديات المتأصلة في إمكانية الوصول إليه من جمع الخزعة في البشر. بالإضافة إلى الكمية المحدودة من الأنسجة التي تم جمعها ، فإن معالجة IMAT البشرية معقدة بسبب قربها من الأنسجة العضلية الهيكلية واللفافة. الطبيعة المحملة بالدهون للخلايا الشحمية تجعلها غير متوافقة مع عزل الخلية الواحدة. وبالتالي ، فإن تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى هو الأمثل للحصول على نسخ عالي الأبعاد بدقة خلية واحدة ويوفر إمكانية الكشف عن بيولوجيا هذا المستودع ، بما في ذلك التركيب الخلوي الدقيق ل IMAT. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل النوى وإعداد مكتبة IMAT البشري المجمد لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة. يسمح هذا البروتوكول بتحديد سمات آلاف النوى باستخدام نهج قائم على القطيرات ، وبالتالي توفير القدرة على اكتشاف أنواع الخلايا النادرة والمنخفضة الوفرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنسجة الدهنية العضلية (IMAT) هي مستودع دهني خارج الرحم يقيم بين ألياف العضلات وحولها1. كما هو موضح بالتفصيل في مراجعة حديثة أجراها Goodpaster et al. ، يمكن اكتشاف IMAT باستخدام التصوير المقطعي المحوسب عالي الدقة (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) (الشكل 1A ، B) ويوجد حول وداخل ألياف العضلات في جميع أنحاء الجسمبأكمله 1. تختلف كمية IMAT اختلافا كبيرا بين الأفراد وتتأثر بمؤشر كتلة الجسم والعمر والجنس والعرق وقلة الحركة2،3،4. علاوة على ذلك ، يظهر ترسب IMAT بشكل شائع في الحالات المرضية المرتبطة بتنكس العضلات5 ، وقد وثقت العديد من الدراسات زيادة كتلة IMAT لدى الأفراد المصابين بالسمنة ومرض السكري من النوع 2 ومتلازمة التمثيل الغذائي ومقاومة الأنسولين6،7،8،9. ومع ذلك ، فإن الخصائص الخلوية والبيولوجية ل IMAT بدأت للتو في التفكك. وقد شكلت إمكانية الوصول المحدودة والاختلاف في مواقع IMAT ومحتواها في جميع أنحاء الجسم تحديا لجمع العينات من هذا المستودع الدهنيالفريد 2. علاوة على ذلك ، يتم "تلوث" العينات بسهولة بالعضلات الهيكلية (SM) عند جمعها ، مما يجعل الفصل بين المساهمة البيولوجية من الأنسجة المختلفة أمرا صعبا (الشكل 1C). وتحقيقا لهذه الغاية ، فإن تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى (snRNA-seq) ، الذي اكتسب اهتماما كبيرا خلال العقد الماضي ، يعمل كمنهجية مثالية للسماح بفصل أنماط التعبير الجيني المشتقة من IMAT و SM بدقة خلية واحدة. علاوة على ذلك ، فإن عزل النوى مفيد بشكل خاص للأنسجة الدهنية بسبب الخلايا الشحمية الكبيرة المحملة بالدهون ، والتي يستحيل فصلها إلى تعليق خلية واحدة دون المساس بسلامة الخلايا. أخيرا ، تمتلك هذه التقنية القدرة على اكتشاف علامات جديدة للخلايا الشحمية الخاصة ب IMAT والكشف عن تكوين ووجود مجموعات مختلفة من الخلايا السلفية ، وكذلك دراسة تباين تكوين الخلية في الظروف المرضية والطبيعية.

figure-introduction-1
الشكل 1: صور IMAT. صورة الرنين المغناطيسي التمثيلي (MRI) ل IMAT من (أ) أنثى نحيفة في منتصف العمر و (ب) ذكر في منتصف العمر مصاب بالسمنة. الأحمر: الأنسجة الدهنية تحت الجلد ، الأصفر: الأنسجة الدهنية العضلية ، الأخضر: العضلات الهيكلية ، الأزرق: العظام. الصورة مجاملة من هيذر كورنيل ، معهد AdventHealth للبحوث الانتقالية. (C) عينة أنسجة جديدة مع IMAT (محاطة بخط أسود متقطع). الصورة مقدمة من ميغان هوبف ، معهد AdventHealth للبحوث الانتقالية وبريان بيرجمان ، جامعة كولورادو. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Goodpaster et al.1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم نشر عدد من الدراسات من صناعة الثروة الحيوانية التي تبحث في رخامي اللحوم (IMAT على وجه الخصوص) في الخنازير والدجاج والماشية باستخدام خلية واحدة (sc) و snRNA-seq10. حددت هذه الدراسات العديد من المجموعات السكانية الفرعية للخلايا الشحمية وعلامات الخلايا السلفية المحتملة ل IMAT11،12،13. ومع ذلك ، ما إذا كانت هذه التراكيب الخلوية تترجم إلى IMAT البشري غير معروف. على حد علمنا ، نظرت دراسة واحدة فقط في عدم التجانس الخلوي للعضلات البشرية مع تسلل دهني ، تم الحصول عليه من المرضى الذكور المصابين بالتهاب المفاصل العظمي الوركي ، باستخدام snRNA-seq14. أبلغ الباحثون عن عدد صغير من الخلايا الشحمية والعديد من المجموعات الفرعية السلفية الليفية (FAP) ضمن عدد كبير من النوىالعضلية 14. دراستنا هي الأولى التي تطور طريقة لاستجواب IMAT مباشرة تشريح يدويا من العضلات البشرية للتكوين الخلوي باستخدام snRNA-seq.

الأهم من ذلك ، يجب تخصيص بروتوكولات snRNA-seq للأنسجة المحددة التي تمت دراستها ، حيث أن كمية الأنسجة المتاحة والخصائص الفيزيائية للأنسجة المحددة ستحدد خطوات المعالجة المثلى. عادة ما يكون إنتاج الأنسجة ل IMAT صغيرا ، وغالبا لا يتجاوز 50 مجم ، حتى عند إجراء الخزعات الموجهة بالموجات فوق الصوتية. وبالتالي ، فإن المعالجة الصحيحة لهذا النسيج النادر أمر ضروري. نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون بمثابة مورد قيم للباحثين الذين يدرسون IMAT البشرية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت العينة المستخدمة في هذا البروتوكول جزءا من دراسة العضلات والتنقل والشيخوخة (SOMMA)15 ، والتي تمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمجموعة Western IRB-Copernicus Group (WCG) وتم تنفيذها وفقا لإعلان هلسنكي. قدم المشاركون موافقة خطية مستنيرة على مشاركتهم في الدراسة.

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من بروتوكول سابق باستخدام 100 ملغ من الأنسجة الدهنية تحت الجلد في البطن البشري على منصة نانوويل16. تم تحسين البروتوكول الحالي ل 50 ملغ من IMAT البشري وإعداد المكتبة باستخدام منصة قائمة على القطيرات. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من تحسين هذا البروتوكول لعزل النوى من IMAT غير البشرية أو غيرها من المستودعات الدهنية.

1. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف (الجدول 1 والجدول 2)

ملاحظة: قم بإعداد المخازن المؤقتة طازجة في يوم التجربة ولا تعيد استخدامها.

  1. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  2. تحضير محلول التجانس ووسط عزل النوى.
    1. احصل على دلاء من الثلج وأنابيب مخروطية مسبقة التبريد 2 × 15 مل.
    2. امزج جميع الكواشف الخاصة بمخزن التجانس (HB) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل بالترتيب المدرج في الجدول 1. ابق على الجليد. تخلط عن طريق دوامة.
    3. امزج جميع كواشف وسط عزل النوى (NIM) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل في القائمة المرتبة في الجدول 2. ابق على الجليد. تخلط عن طريق دوامة.
    4. قم بإعداد 10٪ Triton-X بإضافة 100 ميكرولتر من Triton X-100 إلى 900 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. دوامة لضمان الخلط السليم. يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT).

الكاشفالحجم (ميكرولتر)التركيز النهائي (mM)
1x2x
1 م مغل210205
1 متر تريس العازلة ، درجة الحموضة 8.0204010
2 مليون كيلو لتر255025
1.5 م سكروز (-4درجة مئوية)334668250
1 مللي متر DTT240.001 (~ 1 ميكرومتر)
100x مثبطات الأنزيم البروتيني20401x
سوبراسين 20 وحدة / ميكرولتر40800.4 وحدة / ميكرولتر
ماء خال من النيوكلياز15493098-
الحجم الكلي20004000-

الجدول 1: المخزن المؤقت للتجانس (HB). ابق على الجليد. تخلط عن طريق دوامة.

الكاشفالحجم (ميكرولتر)التركيز النهائي (mM)
1x2x
EDTA0.40.80.1
مثبط ريبولوك RNAse (40U / μL)40800.8 وحدة / ميكرولتر
1٪ BSA-PBS (-/-)1959.63919.2-
الحجم الكلي20004000-

الجدول 2: وسط عزل النوى (NIM). ابق على الجليد. تخلط عن طريق دوامة.

2. سحق الأنسجة المجمدة (الشكل 2 أ)

  1. قم بإعداد محطة العمل للتجانس.
    1. املأ العلبة بالنيتروجين السائل (LN2).
      تنبيه: عند العمل مع LN2 ، ارتد دائما نظارات واقية وقفازات تبريد.
    2. احصل على 2x هاون ، 1x مدقة ، 1x ملعقة مغرفة صغيرة ، 1x ارتداد زجاجي ، و 1x مدقة من الفولاذ المقاوم للصدأ للحارس التلقائي.
    3. قم بإعداد الحارس التلقائي.
    4. املأ دورقا بالثلج وقم بتبريد ارتداد الزجاج مسبقا.
  2. املأ مدافع الهاون (التي تحتوي على المدقة والملعقة) ب LN2 لتبريد الأدوات. دع LN2 يتبخر ويكرر.
  3. أثناء تبريد الأدوات ، أضف 1 مل من HB إلى ارتداد الزجاج.
  4. املأ كلا الهاون ب LN2 مرة أخيرة واسكب عينة IMAT 50 مجم في إحدى قذائف الهاون.
  5. سحق IMAT باستخدام المدقة عن طريق الضغط عليها برفق على قطعة الأنسجة لتقسيمها إلى قطع صغيرة. تأكد من سحق جميع القطع.
  6. سوف يتبخر LN2 ببطء أثناء سحق الأنسجة. عندما يتم سحق الأنسجة بشكل صحيح ، ولا يزال هناك 1/4 - 1/2 من هاون LN2 الأيسر ، قم بإمالة الهاون نحو شفة الهاون لجمع الأنسجة المسحوقة بواسطة الشفة. دع LN2 يتبخر تماما.
  7. مباشرة بعد تبخر آخر LN2 ، اغرف الأنسجة المسحوقة في الارتداد الزجاجي الذي يحتوي على 1 مل من HB.

3. تجانس الأنسجة المسحوقة

  1. تجانس الأنسجة المسحوقة باستخدام الحارس التلقائي. اجعل الزجاج يرتد لأعلى ولأسفل في مدقة الفولاذ المقاوم للصدأ لمدة 10 ضربات في الاتجاه الأمامي ، متبوعا ب 10 ضربات في الاتجاه العكسي.
  2. تأكد من أن المحلول غائم بعد التجانس ولا يحتوي على قطع مرئية من الأنسجة. غالبا ما يتوقع اللون الوردي الفاتح بسبب التلوث بالأنسجة العضلية.
  3. انقل التجانس إلى أنبوب منخفض الارتباط سعة 1.7 مل مبرد مسبقا على الجليد.
  4. استخدم 400 ميكرولتر من HB لشطف الارتداد للتأكد من نقل جميع المواد وإضافتها إلى الأنبوب.
    ملاحظة: يمكن معالجة عينتين في وقت واحد. للقيام بذلك ، ضاعف كمية HB و NIM. سحق وتجانس عينة نسيج واحدة وبعد ذلك مباشرة سحق وتجانس عينة الأنسجة الثانية لتكون قادرة على أداء خطوات العزل والتنظيف بالتوازي.

4. عزل النوى وتنظيفها (الشكل 2 ب)

  1. أضف 14 ميكرولتر من Triton-X (10٪) إلى التجانس لتركيز 0.1٪.
  2. احتفظ بالأنبوب على الثلج وفي الظلام لمدة 10-15 دقيقة أثناء الدوامة كل 3 دقائق.
  3. قبل البلل مصفاة خلية واحدة 100 ميكرومتر ومصفاة خلية 40 ميكرومتر (لكل عينة) مع 100 ميكرولتر من RT DPBS لكل منها في أنبوب مخروطي 50 مل.
  4. تصفية التجانس من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر.
  5. شطف أنبوب 1.7 مل مع 400 ميكرولتر من HB وتصفية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر.
  6. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر.
  7. انقل كمية متساوية من المحلول إلى أنبوبين منخفضي الربط سعة 1.7 مل مبردين مسبقا يقابلان ~ 900 ميكرولتر في كل أنبوب.
  8. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 10 دقائق عند 2700 × جم عند 4 درجات مئوية. يجب أن يكون هناك بيليه صغير مرئي بعد الطرد المركزي.
  9. قم بإزالة وتجاهل الطبقة الدهنية العلوية والمادة الطافية المتبقية ، تاركا محلول ~ 50 ميكرولتر من الأنبوب الأول.
  10. كرر للأنبوب الثاني.
  11. أعد تعليق الحبيبات تماما في الأنبوب الأول عن طريق سحب القطر برفق لأعلى ولأسفل 20x ونقله إلى أنبوب جديد منخفض الربط سعة 1.7 مل. تجنب خلق فقاعات.
  12. كرر هذا الإجراء للأنبوب الثاني وانقل المحلول المعاد تعليقه إلى نفس الأنبوب.
  13. أضف 500 ميكرولتر من NIM واخلطها مع الماصة.
  14. جهاز طرد مركزي الأنبوب بميزان عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  15. قم بإزالة المادة الطافية ، واترك ~ 50 ميكرولتر ، وماصة برفق لأعلى ولأسفل حتى يتم إعادة استخدام الحبيبات. اختياريا ، انقل الحبيبات المعاد تعليقها إلى أنبوب نظيف جديد إذا بقيت بعض بقايا الدهون على جانب الأنبوب.
  16. أضف 200 ميكرولتر من NIM واخلطها عن طريق الماصة.

5. تلطيخ النوى وعدها (الشكل 2 ج والشكل 3)

ملاحظة: لتسهيل العد ، قم بإعداد بروتوكول "عد النوى" على عداد خلية آلي ، حيث يمكن أن يؤثر ضبط المجال الساطع وقنوات DAPI على العد بشكل كبير. اضبط القنوات بحيث يتم التقاط النوى فقط وليس الحطام. تأكد من أن قناة الحقل الساطع تشير فقط إلى "الكائنات" التي تحتوي أيضا على صبغة DAPI.

  1. أضف 1 قطرة من محلول تلطيخ الخلايا الحية واتركه في الظلام ، على الجليد ، لمدة 15 دقيقة.
  2. قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 30 ميكرومتر.
  3. امزج محلول النوى عن طريق السحب وأضف 10 ميكرولتر من المحلول إلى شريحة غرفة عد الخلايا.
  4. عد النوى باستخدام عداد الخلايا الآلي.
    ملاحظة: التركيز الأمثل هو 1000 نواة / ميكرولتر المقابلة ل 1.0 × 106 / مل.
    1. تأكد من عدم وجود كتل من النوى ، لأن هذا قد يسد الشريحة لتوليد قطرات أحادية النوى (الشكل 3).
    2. إذا لم يكن تركيز النوى مرتفعا بدرجة كافية ، فقم بتدوير المحلول لأسفل عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على حبيبات ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة التعليق في حجم أصغر.
    3. إذا كانت درجة الحطام في المحلول عالية ، فأعد تعليق محلول النوى في حجم أكبر من NIM (أي 1 مل) وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 30 ميكرومتر مرة أخرى. ثم قم بالدوران لأسفل عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وأعد التعليق بالحجم المناسب بالنسبة لتركيز النوى.
  5. بعد الحصول على تركيز النوى ، انتقل مباشرة إلى الخطوة الأولى في إعداد المكتبة.

figure-protocol-1
الشكل 3: تلطيخ النوى المعزولة. صورة من عداد الخلية للنوى الملطخة ب NucBlue / DAPI (الصورة اليسرى) وصورة المجال الساطع المقابلة (الصورة اليمنى). يتضح وجود كميات صغيرة من الحطام في صورة المجال الساطع. لا يحتوي عداد الخلايا الآلي المستخدم هنا على خيار لتضمين أشرطة المقياس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. إعداد المكتبة ومعلمات التسلسل

  1. ارجع إلى بروتوكول شامل لإعداد المكتبة باستخدام نهج النوى المفردة القائم على القطيرات المتاح على صفحة الويب الخاصة بالمزود17.
    1. استهدف استعادة 10000 نواة مستهدفة. ومع ذلك، بالنسبة للعينات ذات المستوى العالي من الحطام أو النوى الهشة، يتوقع استرداد عدد أقل من النوى.
    2. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة بعد الخطوة 2.3. في بروتوكول إعداد المكتبة للجمع بين معالجة المزيد من العينات بالتوازي. قم بذلك عن طريق معالجة عينتين حتى الخطوة 2.3 في يومين متتاليين ، وفي اليوم الثالث ، قم بمعالجة العينات ال 4 معا من الخطوة 3 وما بعدها في بروتوكول إعداد المكتبة.
  2. معلمات التسلسل: تسلسل على منصة تسلسل تهدف إلى 50000 قراءة مزدوجة النهاية لكل نواة.
    ملاحظة: تم تسلسل البيانات المقدمة في هذا البروتوكول على منصة NovaSeq 6000 ، بهدف الحصول على 50000 قراءة مزدوجة النهاية لكل نواة.

figure-protocol-2
الشكل 2: سير عمل البروتوكول. رسم تخطيطي لسير العمل في (أ) الخطوتين 2 و3 و(ب) الخطوة 4 و(ج) الخطوة 5 من البروتوكول. تم إنشاء الرقم مع BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. معالجة البيانات وتحليلها

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم تقديم بعض البرامج الموصى بها وحزم R المستخدمة لمعالجة بيانات التسلسل الناتجة بإيجاز ، مع التركيز على الخطوات بعد المعالجة المسبقة الأولية (الجدول 3). توفر هذه الدراسة مقاييس عامة لمراقبة الجودة (QC) ومثالا على تقريب وإسقاط مشعب موحد (UMAP) في الشكل 4. ومع ذلك ، فإن الوصف المتعمق لتحليل المعلوماتية الحيوية خارج نطاق هذا البروتوكول. لذلك ، يمكن للقراء الرجوع إلى المراجعة الأخيرة حول أفضل الممارسات لتحليل الخلية الواحدة بواسطة Heumos et al.18.

  1. المعالجة المسبقة لبيانات التسلسل
    1. قم بتعيين النوى المفردة المقروءة إلى الجينوم المرجعي البشري GRCh38.
    2. تضمين قراءات intron في العد.
  2. قم بإجراء مراقبة الجودة وتصفية البيانات باستخدام حزمة Seurat R 19.
    1. احسب درجة تعقيد الخلية بقسمة عدد الجينات المكتشفة في عدد log(10) من القراءات المكتشفة.
    2. ارسم أهم مقاييس مراقبة الجودة باستخدام مخطط تكراري أو مخطط كمان ، بما في ذلك عدد الجينات المكتشفة لكل نواة ، ونسبة قراءة الميتوكوندريا ، ودرجة تعقيد الخلية.
    3. قم بتصفية النوى التي تحتوي على أقل من 200 أو أكثر من 10000 جين لكل نواة ، وأكثر من 10٪ من قراءات الميتوكوندريا ، ودرجة تعقيد أقل من 0.8.
  3. تطبيع البيانات وإجراء تقليل الأبعاد.
    1. استخدم الدالة SCTransform من Seurat لتطبيع البيانات باستخدام 2000 معلم متغير.
    2. بيانات الكتلة باستخدام الدالات التالية من حزمة Seurat R: RunPCA و FindNeighbors و FindClusters و RunUMAP.
    3. ارسم UMAP لتصور تجميع البيانات.
  4. تصفية الثنائيات المتوقعة باستخدام حزمة DoubletFinder R 20 وإعادة تجميع البيانات.
  5. قم بالتعليق على المجموعات باستخدام علامات الجينات المعروفة لأنواع الخلايا المتوقع وجودها في الأنسجة (نهج خاضع للإشراف) أو بناء على أفضل 5 جينات يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي بين المجموعات (نهج غير خاضع للإشراف).
  6. استخدم decontX21لتحديد درجة تلوث الحمض النووي الريبي المحيط ولضبط مصفوفة التعبير الجيني للحمض النووي الريبي المحيط.
    1. قم بتضمين مصفوفة الجينات الخام كخلفية.
  7. احفظ كائن Seurat للاستكشاف المستقبلي للبيانات.
    ملاحظة: رمز مراقبة الجودة وتحليل التجميع متاح في الملف التكميلي 1.
حزم البرامج / R المستخدمة في سير عمل البياناتالبرامج / الحزم البديلةخطوة المعالجة
سيل رينجرستارسولو ، كاليستوالتشذيب والمحاذاة ورسم الخرائط
سوراتSingleCellExperiment, Cellrangerمراقبة الجودة والتحليل واستكشاف البيانات
دوبليت فايندرscds ، scdblFinder ، فركالكشف المزدوج
ديكونتكسسوبكس، سيلبندرتعديل الحمض النووي الريبي المحيط

الجدول 3: برامج/أدوات لسير عمل البيانات.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم سير العمل هذا لتوجيه معالجة عينات IMAT البشرية المجمدة للحصول على ملفات تعريف التعبير الجيني بدقة نواة واحدة ، مما يتيح تحديد نوع الخلية. هنا ، يتم تقديم عينة تمثيلية واحدة من IMAT من أحد المشاركين في دراسة SOMMA.

تتمثل الخطوة الأولى في أي تحليل لبيانات snRNA-seq في تقييم جودة البيانات لتحديد النوى ذات الجودة الرديئة ، والتي يجب إزالتها من مجموعة البيانات. الأهم من ذلك ، يجب تحديد خطوات وعتبات التصفية لنوع معين من العينة ومجموعة البيانات التي لديك ، حيث يمكن أن تختلف المقاييس التي يتم تقييمها بشكل شائع بين الأنسجة وأنواع الخلايا22,23. يوفر الشكل 4A صورا لبعض المقاييس الرئيسية المستخدمة لتقييم جودة بيانات snRNA-seq التي تم إنشاؤها. يعتمد عدد الجينات المكتشفة لكل نواة على عمق التسلسل ونوع الخلية ولكن من المتوقع أن يكون أعلى من 200 للنوى عالية الجودة18,23. وجد أن البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول تقع ضمن النطاق المتوقع بمتوسط 1134 جينا لكل نواة ، من إجمالي 4662 نواة.

يتم تقييم النسبة المئوية لقراءات الميتوكوندريا نظرا لأن درجة عالية من تلوث الميتوكوندريا يمكن أن تنشأ من النوى التالفة أو الحمض النووي الريبي المحيط المرتبط بالنوى ، مما يشير إلى نوى ذات نوعية رديئة. في مجموعة البيانات المعروضة هنا ، تم العثور على متوسط نسبة قراءة الميتوكوندريا 2.65 ، وهو أقل بكثير من عتبة 5٪ -20٪ المستخدمة بشكل شائع في الأدبيات24،25،26. تختلف النسبة المئوية لقراءات الريبوسوم بين أنواع الخلايا والأنسجة. ومع ذلك ، نظرا لأن النسب الكبيرة من الجينات الريبوسومية يمكن أن تؤثر على تجميع البيانات ، فمن المستحسن التحقق من النسبة المئوية لقراءة الريبوسوم وربما إزالة الجينات الريبوسومية أو النوى ذات المستويات العالية من جينات الريبوسوم من مجموعة البيانات قبل التجميع. أظهرت البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول مستوى منخفضا من قراءات الريبوسوم بمتوسط 2.46٪ وبحد أقصى 16.5٪ ، وبالتالي ، لم نقم بالتصفية بناء على هذا المقياس. أخيرا ، تم حساب درجة تعقيد الخلية بناء على عدد اللوغاريتمات (10) للجينات المكتشفة مقسوما على عدد اللوغاريتمات (10) للقراءات المكتشفة. من المتوقع أن تكون النوى ذات النوعية الجيدة أعلى من 0.8 ، وتم الحصول على متوسط 0.92 في العينة المستخدمة في هذه الدراسة. بناء على مقاييس مراقبة الجودة هذه ، يمكن للمرء أن يقرر النواة التي يجب تصفيتها من مجموعة البيانات. للتحليل ، اخترنا تصفية النوى التي تحتوي على أقل من 200 أو أكثر من 10000 جين لكل نواة ، وأكثر من 10٪ من قراءات الميتوكوندريا ، ودرجة تعقيد أقل من 0.8.

بعد خطوة تقييم الجودة الأولية والتصفية ، يمكن إنشاء UMAP لتصور تجميع النوى. تم إجراء التجميع بناء على الجينات الأكثر تغيرا لعام 2000 باستخدام تحويل SCT. يمكن استخدام خطوات التجميع الأولية للتحقق مما إذا كان أي من ميزات مراقبة الجودة يتجمع معا ، على سبيل المثال ، نوى ذات قراءات عالية للميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، فإن معلومات التجميع مطلوبة لبعض طرق الكشف المزدوج ، بما في ذلك DoubletFinder20 ، الذي تم استخدامه في هذا البروتوكول. تم استخدام DoubletFinder مع معدل مضاعفة متوقع تم تعيينه على 4.8٪ كما اقترح مقدمو النظام الأساسي القائم على القطرات. بعد الإزالة المزدوجة ، تم تقدير مستوى تلوث الحمض النووي الريبي المحيط ، وهو أمر شائع بشكل خاص في مستحضرات النوى المفردة حيث يتم إطلاق الحمض النووي الريبي من السيتوبلازم عند تحلل الخلية ويتم توزيعه في مستحلب حبيبات الجل (GEMs) وتضخيمه في خطوات إعداد المكتبة التالية. ومن ثم ، تم تطوير العديد من الأدوات لتصحيح المشكلة المتأصلة في تلوث الحمض النووي الريبي المحيط (انظر الجدول 3). استخدمنا حزمة R decontX21 ، حيث يتم استخدام مصفوفة الخلفية الخام (بما في ذلك القطرات الفارغة فقط) لضبط مصفوفة التعبير الجيني ، مما يعزز توقيع التعبير الجيني الحقيقي.

يعتمد التجميع والقدرة على اكتشاف أنواع الخلايا المنخفضة الوفرة على عدد النوى. اكتشفت هذه الدراسة جميع أنواع الخلايا الرئيسية المتوقعة في IMAT (الشكل 4B) من إجمالي 3817 نواة بعد ترشيح مراقبة الجودة ، والإزالة المزدوجة ، وتعديل الحمض النووي الريبي المحيط. وشملت هذه الخلايا الجذعية ، والأسلاف الليفية الشحمية (FAPs) ، والخلايا الشحمية الناضجة ، وكذلك الخلايا المحيطة ، وخلايا العضلات الملساء ، والخلايا المناعية ، والخلايا السلفية العضلية ، والنواة العضلية من تلوث خلايا العضلات الهيكلية.

بشكل عام ، أثبتنا أن هذا البروتوكول ينتج بيانات نوى مفردة عالية الدقة تمكن من اكتشاف التعليق التوضيحي لنوع الخلية المهم لكشف البيولوجيا والأصول الخلوية ل IMAT.

figure-results-1
الشكل 4: تقييم الجودة والتجميع والتعليق التوضيحي لنوع الخلية لبيانات التسلسل. (أ) مخططات الكمان للمقاييس الأساسية لتقييم أداء العينة والتسلسل ، بما في ذلك عدد الجينات المكتشفة لكل نواة ، والنسبة المئوية لقراءات الميتوكوندريا ، والنسبة المئوية لقراءات الريبوسوم ، وتعقيد الخلية المقاس على أنه عدد اللوغاريتمات (10) للجينات المكتشفة مقسوما على عدد اللوغاريتم (10) للقراءات المكتشفة. يتم إعطاء القيم المتوسطة لكل مقياس في مربعات مغلقة. العدد الإجمالي للنوى: 4662. (ب) UMAP يعرض تجميع النوى الفردية و DotPlot المقابل يوضح التعبير الجيني النسبي لجينات علامة نوع الخلية لكل مجموعة بعد الترشيح. عدد النوى: 3817. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: رمز مراقبة الجودة وتحليل التجميع. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من التحديات المتأصلة للعمل مع IMAT. بالإضافة إلى إمكانية الوصول المحدودة ، غالبا ما يكون إنتاج مواد العينة نادرا جدا ، ويكاد يكون من المستحيل تجنب "تلوث" العضلات الهيكلية. للحصول على أفضل عينة ذات جودة ، يجب على المرء اختراق اللفافة العضلية عند إدخال إبرة الخزعة (للتأكد من عدم جمع الأنسجة الدهنية تحت الجلد) وإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة العضلية عن طريق تشريح العينة تحت المجهر مباشرة بعد التجميع ، تليها المعالجة اللاحقة للأنسجة ، والتجميد المفاجئ ، إلخ. هذه هي الطريقة الأولى لاستخدام عينات IMAT التي تم جمعها وتشريحها من العضلات الهيكلية. وبالمقارنة ، كانت بيانات snRNA-seq السابقة في IMAT من خلال عزل النوى لمزيج من خزعات العضلات الهيكلية مع تسلل دهني معروف وليس IMAT وحده.

IMAT أكثر كثافة في الطبيعة مقارنة بالأنسجة الدهنية تحت الجلد ، مما يجعل السحق المناسب للأنسجة أثناء عزل النوى ضروريا لإطلاق النوى من بنية الأنسجة. يمكن أن يؤدي السحق غير السليم إلى انخفاض إنتاجية النوى ، وهو أمر غير موات مع كمية محدودة من الأنسجة. علاوة على ذلك ، يعد حساب العدد الصحيح للنوى في محلول النوى المحضر خطوة حاسمة لضمان ما يكفي (ولكن ليس كثيرا) من النوى لتحميلها على الشريحة لتوليد GEM. يمكن أن يؤدي وجود عدد كبير جدا من النوى ، أو وجود مجموعات نوى كبيرة أو حطام ، إلى انسداد ، مما يؤثر على تركيز cDNA النهائي ، وفي النهاية ، ناتج التسلسل. من الصعب التحايل على تكتل النوى والحطام في تحضير النوى المفردة ويتأثر بجودة العينة. يمكن تقليل تكتل النوى و / أو وجود الحطام عن طريق تضمين خطوة ترشيح إضافية مع مصفاة خلية 30 ميكرومتر.

من المهم معالجة العينات بسرعة لتقليل مخاطر تدهور الحمض النووي الريبي. يمكن أن يؤدي الاحتفاظ بالمحاليل على الجليد أو تبريدها أثناء جميع الخطوات الممكنة لعزل النوى ، بالإضافة إلى إضافة كمية كافية من مثبطات الحمض النووي الريبي ، إلى تقليل التدهور. نظرا لأهمية وقت المعالجة لكل عينة ، نوصي بتشغيل عينتين كحد أقصى في المرة الواحدة. علاوة على ذلك ، يجب التعامل مع محلول النوى بعناية حتى لا تجعل النوى هشة للغاية. النوى الهشة عرضة للانفجار عند توليد GEM ، مما قد يؤدي إلى كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المحيط في العينة. في هذا البروتوكول ، تم استبعاد خطوة الترشيح باستخدام حقنة (موصوفة في بروتوكول STAR16) للحفاظ على سلامة النوى.

يعتمد اختيار طريقة إعداد المكتبة على سؤال البحث. لقد عملنا مع كل من نهج النوى المفردة القائم على القطيرات والنانو جيدا. يحدد النهج القائم على الآبار النانوية 1200-1600 نواة وحوالي 3000-6000 جين مكتشف لكل نواة16. علاوة على ذلك ، يدعم هذا النهج النسخ الكامل الطول ، والذي يسمح بالتحقيق في التباين الهيكلي والجينات الزائفة ومتغيرات اللصق27. وبالمقارنة، يمكن تحديد ملامح أكثر من 10000 نواة باستخدام النهج القائم على القطيرات، ولكن على حساب عدد أقل من الجينات المكتشفة لكل نواة (أقل بمقدار 2-3 أضعاف). بالنسبة لهذا البروتوكول ، اخترنا استخدام إحدى المنصات القائمة على القطيرات لأن العدد الأكبر من النوى المحددة يمنحنا قدرة أكبر على اكتشاف أنواع الخلايا النادرة ذات الوفرة المنخفضة28.

القيد الرئيسي ل snRNA-seq هو فقدان المحتوى الخلوي ، مما يقصر تحليل التعبير على النسخ النووية. تحتوي النواة على mRNA أقل بمقدار 10-100 مرة من الخليةبأكملها 29 ، والتي يمكن أن تكون مصدر قلق للكشف عن جميع أنواع الخلايا في الأنسجة. ومع ذلك ، وجدت دراسة حديثة أجراها Gupta et al. أن النسخ النووي - مقارنة بنسخ الخلاياالكاملة 29 - اكتشف مجموعات خلايا مماثلة وملامح تعبير للجينات ذات الصلة بيولوجيا في الخلايا preadipocytes المستزرعة والخلايا الشحمية الناضجة. تم العثور على نتائج مماثلة في أنواع الخلايا الأخرى 30,31.

يتميز عزل النوى المفردة بمزاياه في توفير أنماط التعبير الجيني ذات دقة الخلية الواحدة (sc) للخلايا الهشة غير المتوافقة مع scRNA-seq. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام عينات البنك الحيوي المجمدة ، ولا يتطلب عزل النوى هضما إنزيميا للأنسجة ، مما قد يؤدي إلى استجابة الإجهاد في الخلايا ، مما يؤثر على النسخ32. باستخدام snRNA-seq ، تمكنا من تحديد الخلايا الشحمية وأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في IMAT بشكل نسخي ، وهو ما لن يكون ممكنا مع scRNA-seq نظرا لأن الخلايا الشحمية محملة بالدهون وغير متوافقة مع النهج القائم على القطيرات.

أحد التطبيقات المهمة ل snRNA-Seq ل IMAT هو فك تشفير تكوين الخلية والاختلافات النسخية ل IMAT في حالات التمثيل الغذائي المختلفة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام مجموعات بيانات snRNA-seq لفك تعقيد تسلسل الحمض النووي الريبي السائب على IMAT لتقييم الاختلافات التركيبية للخلية على نطاق أوسع33. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يعمل تحليل الوقت الزائف لبيانات snRNA-seq على تحديد مسارات نضوج الخلايا ، والتي لها أهمية خاصة في الأنسجة مثل IMAT ، حيث لا تزال الأصول الخلوية للخلايا الشحمية الناضجة موضع نقاش.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا بريان بيرجمان ، دكتوراه في جامعة كولورادو لتقديمه صورة خزعة IMAT في الشكل 1C من دراسة MoTrIMAT (R01AG077956). نحن ممتنون لدراسة العضلات والتنقل والشيخوخة التي توفر عينة IMAT التي تظهر منها البيانات في قسم النتائج التمثيلية. قام المعهد الوطني للشيخوخة (NIA) بتمويل دراسة العضلات والتنقل والشيخوخة (SOMMA; R01AG059416) ودراساتها المساعدة SOMMA AT (R01AG066474) و SOMMA Knee OA (R01AG070647). تم تمويل دعم البنية التحتية للدراسة جزئيا من قبل NIA Claude D. Pepper Older American Independence Centers في جامعة بيتسبرغ (P30AG024827) وجامعة ويك فورست (P30AG021332) ومعاهد العلوم السريرية والانتقالية ، بتمويل من المركز الوطني لتطوير العلوم الانتقالية ، في جامعة ويك فورست (UL1 0TR001420).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 وميكرو ؛ م مرشحات حقنة كورنينج  Millipore SigmaCLS431229
1.7 مل DNA LoBind أنابيبEppendorf22431021أنابيب منخفضة الربط
10٪ Tween 20Bio-Rad1662404
100x مثبط البروتيازThermo Fisher Scientific78437
10X فاصل مغناطيسي10X الجينوم230003
10X محول دوامة10X علم الجينوم330002
15 مل أنابيب كنونيةSarstedt6،25،54،502
2100 Bioanalyzer AgilentG2939BA
50 مل أنابيب مخروطيةSarstedt6،25،47،254
CellRangerGenomicsN / A
Chromium iX accesory kit10X الجينومPN1000323
Chromium iX Controller10X الجينومPN1000326
الكروم التالي GEM Chip G مجموعة خلية واحدة   ؛10X الجينومPN1000127
الكروم التالي GEM خلية واحدة 3 'جل حبة كيت v3.1  10X الجينومPN1000129
الكروم التالي GEM أحادي الخلية GEM Kit v3.110X الجينومPN1000130
الكونتيسة 3 عداد الخلايا الآليThermo Fisher ScientificAMQAX2000عداد الخلايا الآلي
شرائح غرفة عدThermo Fisher ScientificC10228
DoubletFinderR & nbsp ؛N / A
DPBS (بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم)Thermo Fisher Scientific14190144
DTTThermo Fisher ScientificR0861
Dual Index Kit مجموعة TT A ، 96 rxns10X الجينومPN1000215
Dynabeads MyOne SILANE   ؛10X الجينومPN2000048
فالكون 100 & مايكرو; مصفاة خلية mCorning Life Science352360
Falcon 40 & micro ؛ مصفاة الخلايا mCorning Life Science352340
Glycerin (glycerol) ، 50٪ (حجم / حجم) محلول مائيشركة Ricca ChemicalCompany 3290-32
KCLThermo Fisher ScientificAM9640G
Library Construction Kit v3.110X GenomicsPN1000196
MACS SmartStrainers (30 & micro; م)Miltenyi Biotec130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cyclerEppendorf6331000017
MgCl2AmbionAM9530G
ملاط وبيستللوجستيات الرعاية الصحية   ؛14075
NucBlue Live Ready Probes ReagentThermo Fisher ScientificR37605
مياه خالية من النوكليز (غير المعالجة ب DEPC)Thermo Fisher ScientificAM9930
Probumin Bovine Serum Albumin خالي من الأحماض الدهنية ، مسحوقSigma-Aldrich820024
Qiagen Buffer EBQiagen19086
مثبط Ribolock RNAseثيرمو فيشر العلميEO0382
SeuratR & nbsp ؛غير متوفر السكروز
سيجما ألدريتشS0389
سوبر آسين 20 U/µ ؛ Lثيرمو فيشر العلميAM2695
ThermoMixer CEppendorf  5382000015
مالطهر الأنسجةGlass-Col099C K54
Tris Buffer pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
Triton X-100Thermo Fisher ScientificAC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0Gibco15575020
الخلايا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
  2. Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. The metabolic significance of intermuscular adipose tissue: Is IMAT a friend or a foe to metabolic health. Diabetes. 70 (11), 2457-2467 (2021).
  3. Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: A novel depot similar in size to visceral adipose tissue. Am J Clin Nutr. 81 (4), 903-910 (2005).
  4. Manini, T. M., et al. Reduced physical activity increases intermuscular adipose tissue in healthy young adults. Am J Clin Nutr. 85 (2), 377-384 (2007).
  5. Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular fat: A review of the consequences and causes. Int J Endocrinol. 2014, 309570(2014).
  6. Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Arch Intern Med. 165 (7), 777-783 (2005).
  7. Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. Am J Clin Nutr. 71 (4), 885-892 (2000).
  8. Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
  9. Sachs, S., et al. Intermuscular adipose tissue directly modulates skeletal muscle insulin sensitivity in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 316 (5), E866-E879 (2019).
  10. Ford, H., Liu, Q., Fu, X., Strieder-Barboza, C. White adipose tissue heterogeneity in the single-cell era: From mice and humans to cattle. Biology (Basel). 12 (10), 1289(2023).
  11. Wang, L., et al. Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork. NPJ Sci Food. 7 (1), 23(2023).
  12. Li, J., et al. Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing. BMC Genomics. 21 (1), 752(2020).
  13. Lyu, P., Qi, Y., Tu, Z. J., Jiang, H. Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of cultured bovine satellite cells. Front Genet. 12, 742077(2021).
  14. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 6 (1), 111(2023).
  15. Cummings, S. R., et al. The study of muscle, mobility and aging (SOMMA): A unique cohort study about the cellular biology of aging and age-related loss of mobility. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 78 (11), 2083-2093 (2023).
  16. Whytock, K. L., et al. Isolation of nuclei from frozen human subcutaneous adipose tissue for full-length single-nuclei transcriptional profiling. STAR Protoc. 4 (1), 102054(2023).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry Dual Index), Document Number CG000315 RevE. , Available from: https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf (2022).
  18. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (1), 550-572 (2023).
  19. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2023).
  20. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. Cell Syst. 8 (4), 329-337 (2019).
  21. Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biol. 21 (2), 57(2020).
  22. Common considerations for quality control filters for single cell RNA-seq data. 10X Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data (2022).
  23. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  24. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
  25. Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
  26. Whytock, K. L., et al. Single cell full-length transcriptome of human subcutaneous adipose tissue reveals unique and heterogeneous cell populations. iScience. 25 (8), 104772(2022).
  27. Probst, V., et al. Benchmarking full-length transcript single cell mRNA sequencing protocols. BMC Genomics. 23 (1), 860(2022).
  28. CG000148 Rev A Technical Note - Resolving cell types as a function of read depth and cell number. Technical note. 10X Genomics. , Available from: https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf (2018).
  29. Gupta, A., et al. Characterization of transcript enrichment and detection bias in single-nucleus RNA-seq for mapping of distinct human adipocyte lineages. Genome Res. 32 (2), 242-257 (2022).
  30. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  31. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
  32. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  33. Avila Cobos, F., Alquicira-Hernandez, J., Powell, J. E., Mestdagh, P., De Preter, K. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 11 (1), 5650(2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة