تصف هذه الدراسة التصوير بالرنين المغناطيسي المشترك (MRI) والموجات فوق الصوتية المركزة النبضية منخفضة الكثافة (FUS) ، باستخدام الفئران الحية ذات القسطرة الوريدية الوداجية لمراقبة فتح الحاجز الدموي الدماغي (BBB).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مراقبة فتح الحاجز الدموي الدماغي في الفئران باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية المركز قبل السريري
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يحتوي الدماغ على حاجز دموي شبه انتقائي للغاية ، يسمى الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ، والذي يمنع توصيل العوامل الجزيئية العلاجية إلى الدماغ. يعد دمج الموجات فوق الصوتية المركزة النبضية منخفضة الكثافة الموجهة بالرنين المغناطيسي (FUS) مع الحقن المسبق للفقاعات الدقيقة تقنية واعدة لتعديل BBB غير الغازي وغير السام. يمكن أن يوفر التصوير بالرنين المغناطيسي تباينا فائقا في الأنسجة الرخوة وتقييمات كمية مختلفة ، مثل نفاذية الأوعية الدموية ، والتروية ، والتوزيع المكاني والزماني لعوامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي. والجدير بالذكر أن تقنيات التصوير بالرنين المغناطيسي المحسنة بالتباين مع عوامل تباين MR القائمة على الجادولينيوم قد ثبت أنها المعيار الذهبي للكشف عن فتحات BBB. تحدد هذه الدراسة منهجية شاملة تتضمن بروتوكولات التصوير بالرنين المغناطيسي والإجراءات الحيوانية لمراقبة فتح BBB في نموذج الفئران. يوفر نموذج الفئران فائدة إضافية تتمثل في استخدام قسطرة الوريد الوداجي ، مما يسهل الإدارة السريعة للأدوية. يسهل محول الطاقة قبل السريري الموجه بالتجسيم تحسين وتبسيط الإجراءات الحيوانية وبروتوكولات التصوير بالرنين المغناطيسي. تتميز الطرق الناتجة بقابلية التكرار والبساطة ، مما يلغي الحاجة إلى الخبرة الجراحية المتخصصة. يسعى هذا البحث إلى المساهمة في تحسين الإجراءات قبل السريرية باستخدام نماذج الفئران وتشجيع المزيد من التحقيق في تعديل BBB لتعزيز التدخلات العلاجية في الاضطرابات العصبية.
المقدمة
ينظم BBB حركة الأيونات والجزيئات والخلايا بين الأوعية الدموية وأنسجة المخ< فئة sup = "xref">1. تسمح هذه الوظيفة بالحفاظ على وظيفة الخلايا العصبية والصحة مع منع إيصال العوامل الجزيئية العلاجية إلى أنسجة المخ. يمكن أن تؤدي النفاذية المحدودة ل BBB إلى تقليل فعالية وفعالية علاجات أورام المخ والأمراض التنكسية العصبية ، مثل مرض باركنسون ، والتصلب الجانبي الضموري ، ومرض الزهايمر < فئة sup = "xref">2. ومن ثم ، فقد تم التحقيق في طرق مختلفة ، مثل التوصيل المعزز بالحمل الحراري ، والحقن المباشر داخل الجمجمة ، والاضطراب التناضحي ، وتصميم الأدوية المعزز ، لتجاوز BBB للتسليم الخاضع للرقابة للعوامل العلاجية< فئة الدعم = "xref">3،< sup class = "xref" >4،5.
ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لها قيود جوهرية مثل الغزو ، وخطر الإصابة بالعدوى ، وخطر النزيف ، وعدم التجانس ، والتدفق السريع للأدوية. الموجات فوق الصوتية المركزة النبضية منخفضة الكثافة (FUS) مع حقن الفقاعات الدقيقة هي تقنية واعدة غير جراحية تسمح بتعطيل BBB الموضعي والعكس. يمكن أن تؤدي التأثيرات الميكانيكية للموجات فوق الصوتية إلى جانب الفقاعات الدقيقة إلى تغيير نفاذية BBB بشكل عابر (أي فتح BBB) < فئة sup = "xref" >6 ، < sup class = "xref" >7. لمزيد من التقدم في تطبيقات العلاج باستخدام فتح BBB ، من الضروري إجراء تجارب الصغيرة في الجسم الحي.
في هذه الدراسة ، قدمنا بروتوكولات التصوير بالرنين المغناطيسي والإجراءات الحيوانية لمراقبة فتح BBB في نموذج الفئران. تضمن البروتوكول نموذجا للفئران مع قسطرة الوريد الوداجي المعنية من قبل منظمة تجارية (انظر جدول المواد). يتميز نموذج الفئران لقسطرة الوريد الوداجي بالفوائد المحتملة للإعطاء السريع للأدوية واختبارات المراقبة الديناميكية الدموية والقسطرة المستقرة. تم الانتهاء من فتح BBB باستخدام نظام FUS قبل السريري. تم تصميم هذا النظام خصيصا لفتح BBB في نماذج الصغيرة مثل الفئران والفئران ، ويشتمل هذا النظام على مكونات أساسية ، مثل نظام الطاولة ، وكمبيوتر التحكم ، ومحول الطاقة ، ومزيل المياه ، والملحقات المصاحبة. لا يؤدي استخدام نظام FUS قبل السريري الموجه بالتجسيم إلى تعزيز الدقة فحسب ، بل يبسط أيضا الإجراءات الحيوانية وبروتوكولات التصوير بالرنين المغناطيسي ، مما يساهم في استنساخ وبساطة البروتوكول التجريبي الشامل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع التجارب على في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو (UCSF). تم استخدام ذكور فئران Sprague-Dawley (200-250 جم) في هذه الدراسة. تم إيواء الفئران ورعايتها وفقا لإرشادات مكتب رعاية واستخدامه التابع للمعاهد الوطنية للصحة في الفئران والجرذان. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
< p class = "jove_title" >1. تحضيرملاحظة: بالنسبة للإجراءات الداخلية ، تم نقل إلى غرفة التحضير وتم تنفيذ الإجراءات على النحو التالي:
- ضع الفئران بشكل فردي في غرفة لوسيت وعرض الأيزوفلوران (2٪ -3٪) الممزوج بالأكسجين المستخرج من خزان الأكسجين الطبي حتى يفقدوا الوعي (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
ملاحظة: يتيح التخدير باستخدام الأيزوفلوران تنفيذ بروتوكول التصوير بالرنين المغناطيسي طويل الأمد. - قم بإزالة الفئران من الغرفة واحلق الشعر من المناطق الأمامية والخلفية من الرقبة باستخدام كريم إزالة الشعر (إزالة الشعر).
- ضع مرهم التشحيم على العينين.
- ضع الأنف في مخروط الأنف للحفاظ على التخدير مع التنفس التلقائي (مبخر الأيزوفلوران بين 2٪ -2.5٪ ، مقياس تدفق الأكسجين إلى 1-1.5 لتر / دقيقة).
- ضع الجرذ المخدر على طاولة جراحية ساخنة وتأكد بقرص إصبع القدم.
ملاحظة: تضمن بروتوكول التصوير بالرنين المغناطيسي تسلسلات محسنة للتباين ، مثل تصوير صدى التدرج المرجح T1 وتصوير صدى الدوران المرجح T2. تم إجراء هذه التسلسلات قبل وبعد حقن عوامل التباين القائمة على الجادولينيوم (GAD) لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الدماغي (BBB). يتضمن ذلك إدارة عوامل تباين GAD أثناء وجود الجرذ في ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي < فئة sup = "xref" >7. لتسهيل هذه العملية ، تم استخدام أنابيب القسطرة الممتدة من القسطرة المقنية في الفئران. تضمن التمديد موصل قسطرة وأنابيب بولي إيثيلين بقياس 30 سم. لضمان السالكية ومنع التسرب ، تم مسح أنبوب التمديد بالجلسرين الهيباريني (250 وحدة دولية من الهيبارين / 1 مل من الجلسرين).
ملاحظة: تم نقل ووضعها على طاولة في نظام FUS التجسيمي. تم وضع أنف الجرذ في مخروط الأنف للحفاظ على التخدير. يشتمل نظام FUS على مولد وظيفة ومكبر للصوت RF وراسم الذبذبات. قبل إعداد محول الطاقة ، تأكدنا من الاتصال الصحيح لجميع الأجهزة بالنظام. تم الانتهاء من إعداد محول الطاقة باستخدام الخطوات التالية:
- ضع مؤشرا حادا في موضع Bregma في الجمجمة واحفظ الموضع. يمكن تحديد موقع Bregma عن طريق الإشارة إلى موقع 9.0 مم أمام Lambda على خط الوسط8. يمكن العثور على Lambda في وسط الخط الفاصل بين طبلة الأذن الثنائية < sup class = "xref" >9.
- ضع جل الموجات فوق الصوتية على رأس الفئران وكيس اقتران الماء ومحول الطاقة (تردد 1 ميجاهرتز). تأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين جلد الفئران وكيس اقتران الماء ومحول الطاقة.
- قم بتوصيل كابل BNC متحد المحور للمحول بإدخال وحدة نظام FUS.
- في كمبيوتر التحكم) انقر فوق التحميل للحصول على صور الفئران المسجلة مسبقا ؛ يتم اختيار عدد من النقاط البؤرية والضغط الصوتي.
- في كمبيوتر التحكم) انقر فوق اختبار الحركة في وحدة العلاج للتأكد من أن محول الطاقة يمكن أن ينتقل بين البقع خلال فترة الانفجار.
- قم بإعداد معلمات الصوتنة الموضحة في الخطوة 3.
- قم بتنشيط microbubble.
ملاحظة: تميزت الفقاعة الدقيقة المستخدمة في هذه الدراسة بقطر 1.7 ميكرومتر وتركيز 0.2 × 109 جسيمات لكل مليلتر < فئة سوب = "xref" >10. تم تنشيط قارورة الفقاعات الدقيقة بناء على تعليمات الوصف المقدمة من البائع وتقرير منشور سابقا11.- قم بإعداد حقنة سعة 5 مل بطرف قفل لور ومليئة ب 5 مل من حقن كلوريد الصوديوم 0.9٪ الخالي من الإضافات.
- قم بإزالة الغطاء الأخضر ، وقم بتوصيل المحقنة بدبوس التوزيع ذو التهوية (انظر جدول المواد) عن طريق تثبيته في اتجاه عقارب الساعة.
- قم بإزالة حماية الدبوس وضعها في وسط السدادة المطاطية للقارورة. اضغط لأسفل بقوة حتى يتم إدخال السنبلة بالكامل في السدادة.
- أفرغ المحقنة سعة 5 مل بالكامل في القارورة عن طريق الضغط على قضيب المكبس.
- رج القارورة بقوة لمدة 20 ثانية لخلط جميع المحتويات. سيظهر سائل أبيض حليبي ثابت أن الكريات المجهرية الدهنية لسداسي فلوريد الكبريت قد تشكلت.
- للحصول على الجرعة المطلوبة ، اقلب المحقنة ، واسحب الحجم المقصود من التعليق ببطء إلى حقنة سعة 5 مل.
- استخدم مضخة التسريب
ملاحظة: تم استخدام نهج التسريب < sup class = "xref" > 12 لتوصيل الفقاعات الدقيقة للفئران باستخدام مضخة حقنة. تم توصيل حقنة تحتوي على فقاعات دقيقة بموصل قسطرة يتم إدخاله في الفئران. تم نقل الفقاعات الدقيقة من خلال أنابيب البولي إيثيلين ، وتم ضبط معدل تدفق مضخة التسريب على 0.66 مل / دقيقة. يسمح معدل التسريب هذا بحقن 2 مل من الفقاعات الدقيقة من حقنة 3 مل على مدى 3 دقائق. بدأ التسريب قبل الصوتنة لمدة 1 دقيقة واستمر طوال فترة صوتنة 2 دقيقة.
أداء صوتنة - .
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم اختيار نبضات FUS مع المعلمات التالية: (1) المنطقة المستهدفة: الحصين الأيسر. (2) عدد البقع: 6 لتغطية الحصين في الدماغ. (3) طول الانفجار: 10 مللي ثانية ؛ (4) فترة الانفجار: 1200 مللي ثانية. (5) الضغط الصوتي: 0.65 ميجا باسكال ؛ (6) "وضع الاندفاع" في قائمة وضع الصوتنة في نظام FUS ؛ (7) وقت الصوتنة: 120 ثانية.
4. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام ماسح ضوئي قبل السريري 3T
- بعد الصوتنة ، انقل إلى طاولة في ماسح ضوئي خال من التبريد 3T قبل السريرية.
- ضع الفئران في وضع الانبطاح. حافظ على درجة حرارة وسادة التسخين في الماسح الضوئي ، وراقب معدل التنفس باستخدام مستشعر وسادة تعمل بالهواء المضغوط. قم بإجراء بروتوكول التصوير بالرنين المغناطيسي لاختبار أنواع مختلفة من التصوير بالرنين المغناطيسي (الجدول 1).
- قم بتضمين تقنيات التصوير الكمي الأخرى ، مثل التصوير المرجح بالانتشار (DWI) ، ورسم الخرائط T2 * ، ورسم الخرائط T1 ، والتصوير بالرنين المغناطيسي الديناميكي المعزز بالتباين (DCE) ، بالإضافة إلى التصوير بالرنين المغناطيسي المحسن للتباين ، لإثبات عمليته المحتملة لدراسات التصوير المتنوعة. راجع الجدول 1 للاطلاع على بروتوكولات التصوير بالرنين المغناطيسي المستخدمة في هذه الدراسة.
- حقن عوامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي القائمة على GAD (Gadavist ، 1 مليمول / كجم) بعد تسلسل صدى التدرج MR المرجح T1 ، والحصول على صور ما بعد GAD.
ملاحظة: بالنسبة لفأر 200 جرام ، قمنا بحقن 200 ميكرولتر من عامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي وتبعناه بمحلول ملحي 200 ميكرولتر لشطف الأنبوب.
ملاحظة: بعد فحص التصوير بالرنين المغناطيسي ، تم حقن 2 مل من محلول إيفانز الأزرق (2٪ مخفف بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، وسمح للفأر بالراحة لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للمحلول بالانتشار والدوران في جميع أنحاء الجسم. بعد ذلك ، تم القتل الرحيم للفئران باستخدام جرعة زائدة من الأيزوفلوران (5٪) للفحص العياني للدماغ (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). لتأكيد القتل الرحيم ، كان من الضروري تثقيب أصابع القدم ولوحظ توقف عن التنفس لمدة دقيقة واحدة على الأقل. تم إجراء عملية التروية ، تلاها فحص دماغ الفئران. يتم تلخيص إجراء التروية على النحو التالي:
- إجراء بضع الصدر باستخدام مقص الجراحة لكشف الأعضاء في الصدر وتصور منطقة القلب.
- شق (~ 5 مم) الأذين الأيمن.
- أدخل محلول ملحي في البطين الأيسر لأغراض التروية.
- افتح عظم الجمجمة بمقص جراحي لكشف النقاب عن الدماغ وتقديمه.
ملاحظة: يجب أن يؤدي التروية الكافية إلى مظهر مشرق موحد للدماغ ، بينما تشير المناطق الزرقاء المستمرة إلى تسرب الألبومين المرتبط ب BBB ، كما اكتشفه إيفانز الأزرق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً قبل سريري لمراقبة فتح الحاجز الدموي الدماغي (BBB) في نموذج جرذان باستخدام نظام تجاري للموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) للحيوانات. تم إعداد نظام FUS على طاولة مختبر أو حامل عربة كبير (الشكل 1). خُدرت الجرذان باستخدام الإيزوفلوران المخلوط بالأكسجين عبر القمع الأنفي في الإطار المزود بحامل المحول. وتم إدخال ميكروفون مائي (hydrophone) يرن عند 500 kHz للكشف عن التكهف الصوتي في محول FUS الذي يمتلك تردداً رنينياً قدره 1.0 MHz.
كما هو موضح في
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تطوير بروتوكول وإجراء حيواني باستخدام نموذج الفئران لقسطرة الوريد الوداجي لدراسات فتح BBB. في حين أن العديد من البروتوكولات قبل السريرية موجودة ، فإن هذا البروتوكول يشتمل على نظام FUS متاح تجاريا ونموذج الفئران ، مما يقلل من إجراءات تحضير وبالتالي يضمن قابلية التكاثر التجريبي.
في هذا البروتوكول ، استند اختيار الفقاعات الدقيقة إلى ثباتها وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. يمكن اعتبار الفقاعات الدقيقة التجارية الأخرى كبدائل. Kotopoulis et al. قام بالتحقيق ومقارنة أنواع الفقاعات الدقيقة المختلفة م...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح ذي الصلة للإعلان.
شكر وتقدير
< p class = "jove_content">تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل K99DE032397 منحة المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والقحف الوجهي (NIDCR) ، ومنحة البذور لقسم UCSF (رقم 7504831) ، ومنحة UCSF RAP (PI: Kazim Narsinh ، MD) ، ومؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG ، GA 3535 / 1-1).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 مل حقنة | BD plastipak | ||
| 20 مل ، كلوريد الصوديوم 0.9٪ | Hospira، Inc | 00409-7101-67 | |
| 3 مل حقنة | BD plastipak | ||
| 5 مل حقنة | BD plastipak | ||
| إبرة حادة ، 21 G | SAI تقنيات التسريب | B21-50 | |
| موصل القسطرة ، 21 G | SAI التسريب تقنيات | CC-25-25 | |
| حل قفل القسطرة | التسريب | SAI Sku # HGS-10 | (500 µ/mL) Glycerol |
| Evans Blue | Sigma aldrich | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., Israel | ||
| Gadavist | Bayer | 2068062 | |
| GE isoflurane Vaporizer | مضخة حقنة GE Healthcare | ||
| IPS-12RS | Inovenso | IPS-12 | |
| isoflurane USP | Vet one | 501017 | |
| Lumason microbbuble | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| ذكور فئران Sprague-Dawley (200 & ndash; 250 جم) | مختبرات | ||
| تشارلز ، 18 جم | BD Precisionglide | ||
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات | Mediatech | 21-030-CVR | |
| أنابيب البولي إيثيلين | BD Intramedic | ||
| قبل السريرية 3T الماسح الضوئي Bruker Biospin الخالي من التبريد ؛ | Bruker | Biospec3T | |
| Rat مع قسطرة الوريد الوداجي | مختبرات | ||
| RK-50 & nbsp ؛ محول الموجات فوق الصوتية المركز | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 نظام الموجات فوق الصوتية المركزة | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts | Inc. ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| تنفيس التوزيع دبوس | بي براون | 4550560 |
المراجع
- Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).
- Meng, Y., et al. Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery. Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).
- Mungur, R., et al. Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment. Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).
- Boado, R. J., et al. Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor. Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).
- Hendricks, B. K., et al. Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers. Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).
- Hynynen, K., et al. Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Hynynen, K., et al. Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Yao, X., et al. Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound. J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).
- Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
- Kotopoulis, S., et al. SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).
- Bracco Diagnostics Inc. LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).
- Lapin, N. A., et al. Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent. Sci Rep. 10, 16546(2020).
- Vlachos, F., et al. Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI. Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).
- Singh, A., et al. An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D. Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).
- Plaksin, M., et al. Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
- Singh, A., et al. Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping. Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
