يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وحفظ خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية عالية القابلية للحياة من الدم الكامل: دليل للمبتدئين

7.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66794

⸱

أكتوبر 25, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول دليلا يمكن الوصول إليه لجمع وتخزين وإذابة خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المناسبة لتحليلات المصب وسير العمل مثل قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي. كما يتم عرض مجموعات معطف البلازما وبافي.

الملخص

تستخدم خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) بشكل شائع في الأبحاث الطبية الحيوية على الجهاز المناعي واستجابته للأمراض ومسببات الأمراض. يصف هذا البروتوكول التفصيلي المعدات والإمدادات والخطوات الخاصة بعزل وحجز التبريد وإذابة PBMCs عالية الجودة والقابلة للحياة للغاية من خلايا الدم الكاملة المناسبة لتطبيقات المصب مثل قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي. كما يتم وصف بروتوكولات لمعالجة البلازما ومعطف بافي من الدم كله بالتوازي وبالتزامن مع PBMCs. هذا البروتوكول سهل المتابعة خطوة بخطوة ، والذي يستخدم الطرد المركزي المتدرج الكثافة لعزل PBMCs ، مصحوب بقائمة مرجعية بالإمدادات والمعدات وخطوات التحضير. هذا البروتوكول مناسب للأفراد الذين لديهم أي خبرة سابقة في التقنيات المختبرية ويمكن تنفيذه في المختبرات السريرية أو البحثية. نتجت صلاحية الخلايا عالية الجودة وتسلسل الحمض النووي الريبي عن PBMCs التي جمعها المشغلون الذين ليس لديهم خبرة مختبرية سابقة باستخدام هذا البروتوكول.

المقدمة

يوضح هذا البروتوكول طريقة وسير عمل يمكن الوصول إليهما لعزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) من الدم الكامل. يستهدف هذا البروتوكول بشكل خاص فنيي الأبحاث المبتدئين والطلاب وموظفي المختبرات السريرية بهدف تسهيل جمع وحفظ PBMCs بالتبريد دون الحصول على تدريب مسبق على التقنيات المختبرية.

يستخدم هذا البروتوكول الطرد المركزي لفصل مكونات الدم الكامل حسب الكثافة. يتكون الدم الكامل من أربعة مكونات رئيسية مدرجة بترتيب تناقص الكثافة: خلايا الدم الحمراء / كريات الدم الحمراء (~ 45٪ من الحجم) ، وخلايا الدم البيضاء (<1٪ من الحجم) ، والصفائح الدموية (<1٪ من الحجم) ، والبلازما (~ 55٪ من الحجم) 1،2،3،4،5،6. يمكن تقسيم خلايا الدم البيضاء إلى فئتين بناء على خصائص نفاياتها: مستديرة أو متعددة النواة6. تعرف PBMCs بأنها خلايا الدم البيضاء ذات النوى المستديرة وتتكون من أنواع الخلايا التالية: الخلايا الليمفاوية (الخلايا التائية ، الخلايا البائية ، الخلايا القاتلة الطبيعية) ، الخلايا المتغصنة ، والوحيدات6. تشمل خلايا الدم البيضاء متعددة النوى الخلايا المحببة ، والتي تتكون من أنواع الخلايا التالية: العدلات ، الخلايا القاعدية ، والحمضات6. خلايا الدم البيضاء متعددة النوى أكثر كثافة من PBMCs6. يتم تفصيل كثافات كل مكون من مكونات الدم الكامل في الجدول 1.

في هذا البروتوكول ، يتم جمع الدم الكامل في أنابيب الطرد المركزي المتدرجة الكثافة. تحتوي هذه الأنابيب على وسط تدرج كثافة معبأ مسبقا كثافته 1.077 g/mL. بعد الطرد المركزي ، يتم فصل الخلايا الأكثر كثافة ، بما في ذلك خلايا الدم البيضاء متعددة النوى وكريات الدم الحمراء ، عن PBMCs والصفائح الدموية بواسطة وسط تدرج الكثافة (الشكل 1A)6,7. ثم يتم جمع PBMC وجزء الصفائح الدموية وغسلها وطردها مركزيا لإزالة الصفائح الدموية. يتم جمع PBMCs المنقى الناتج وتخزينه عند -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل. يمكن إذابة PBMCs المحفوظة بالتبريد بشكل قابل للتطبيق واستخدامها مباشرة في تحليلات المصب أو معالجتها بشكل إضافي لعزل أنواع معينة من الخلايا المكونة.

تم تحسين هذا البروتوكول لتسلسل الحمض النووي الريبي عالي الجودة من PBMCs عالية القابلية للتطبيق. في هذه المقالة ، تم عزل PBMCs وحفظها بالتبريد من المرضى في عيادة خارجية. بعد ذلك ، تم عزل الخلايا الوحيدة من PBMCs بواسطة FACS وتحليلها عبر تسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول على نطاق واسع مع الاحتياجات التجريبية الأخرى مثل زراعة الخلايا ، وتحرير الجينات ، والدراسات الوظيفية خارج الجسم الحي ، وتحليلات الخلية الواحدة ، والتنميط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي أو قياس الخلايا حسب وقت الرحلة ، وعزل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي أو البروتينات ، والشرائح للكيمياء المناعية ، من بين أمور أخرى8،9،10،11،12،13،14،15 ، 16,17,18.

بالإضافة إلى جمع PBMC من أنابيب الطرد المركزي المتدرجة الكثافة ، يستعرض هذا البروتوكول كيفية جمع البلازما ومعطف بافي عبر الطرد المركزي باستخدام أنبوب EDTA. بعد الطرد المركزي ، يتم فصل الدم الكامل إلى بلازما وكريات الدم الحمراء وطبقة واجهة رقيقة تسمى معطف بافي يحتوي على كريات الدم البيضاء (الشكل 1 ب)6. يستخدم معطف بافي بشكل شائع لاستخراج الحمض النووي والتحليلات الجينومية اللاحقة19,20. تحتوي طبقة البلازما على مكونات خالية من الخلايا في الدم الكامل ويمكن استخدامها لفحوصات العلامات الحيوية21,22.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل UCSD وبرنامج حماية الإنسان KUMC ويتوافق مع إعلان هلسنكي. قدم جميع الأفراد موافقة مستنيرة للمشاركة وجمع الدم.

1. المعالجة والحفظ بالتبريد ل PBMCs

  1. قبل يوم واحد من جمع الدم ، اطبع قائمة التحقق من المواد والكواشف المدرجة في الجدول 2 وقم بإعدادها وتسميتها وفقا لذلك.
    ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لجمع 6 أنابيب طرد مركزي متدرجة الكثافة. ينتج كل أنبوب ما يقرب من 12 مليون PBMCs ، منها حوالي 50٪ و 20٪ ستكون خلايا ليمفاوية حية ووحيدات على التوالي. توسيع النطاق وفقا للاحتياجات التجريبية. لاحظ أن العدد المطلق للخلايا قد يختلف اختلافا كبيرا بين المرضى أو حالات العلاج.
  2. باستخدام تقنية الفصد القياسية ، اجمع الدم الكامل في 6 أنابيب طرد مركزي متدرجة الكثافة وأنبوب 1 EDTA حتى يتم ملؤه ، أي حوالي 6 مل من الحجم.
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى عينات من عدة مرضى أو حالات علاجية ، فقد يتم تخزين الأنابيب المجمعة لمدة تصل إلى 4 ساعات ثم معالجتها في وقت واحد.
  3. بعد التجميع ، تقوم أجهزة الطرد المركزي بجميع الأنابيب عند 1800 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: راجع الفيديو التكميلي 1 للحصول على عرض توضيحي لكيفية تشغيل جهاز طرد مركزي.
  4. بعد الطرد المركزي ، افتح بعناية أنبوب الطرد المركزي المتدرج الكثافة. استخدم ماصة نقل لإزالة وتجاهل الطبقة الصفراء الشفافة التي تحتوي على البلازما. لا تزعج الطبقة الضبابية من الخلايا مباشرة فوق وسط تدرج الكثافة. يخطئ في جانب الحذر ، وترك البلازما الزائدة بدلا من التخلص من PBMCs. كرر لجميع الأنابيب.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على وسط تدرج الكثافة ، ستكون البلازما و PBMCs فوق وسط تدرج الكثافة ؛ سوف تستقر كريات الدم الحمراء والمحببة في القاع. ارجع إلى الشكل 1 أ للحصول على تصور.
  5. مع ماصة نقل جديدة ، ماصة الحجم المتبقي الذي يحتوي على الخلايا والبلازما المتبقية في كل أنبوب صعودا وهبوطا بلطف عدة مرات فوق وسط تدرج الكثافة.
  6. بعد التعليق ، ماصة محتويات الأنبوب المعاد تعليقها في أنبوب مخروطي 50 مل مسمى. كرر لجميع الأنابيب.
  7. صب المحلول 1 (متوسط RPMI) في أنبوب سعة 50 مل حتى يصل إلى خط 50 مل.
  8. كرر الخطوات من 1.4 إلى 1.7 لكل مريض أو حالة علاجية حسب الحاجة.
    ملاحظة: تأكد من عدم خلط العينات المختلفة واستخدم ماصة نقل جديدة لتجنب التلوث.
  9. جهاز طرد مركزي أنبوب 50 مل عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قد يتم إكمال بروتوكول جمع البلازما وبافي المفصل في القسم 2 خلال هذا الوقت.
  10. تخلص من أكبر قدر ممكن من المواد الطافية. اضغط حسب الحاجة لإزالة القطرات المتبقية.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، تحتوي الحبيبات على PBMCs ، وتحتوي المادة الطافية على الصفائح الدموية والبلازما المتبقية.
  11. صب أنبوب 15 مل من المحلول 2 (RPMI متوسط + 12.5٪ مصل بشري ألبومين + 1 ميكرومتر فلافوبيريدول) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على حبيبات PBMC. اقلب الأنبوب برفق لإعادة تعليق حبيبات الخلية.
  12. نضح 15 مل من المحلول 3 (RPMI متوسط + 11.25٪ مصل بشري ألبومين + 1 ميكرومتر فلافوبيريدول + 10٪ DMSO) باستخدام ماصة نقل. أضف قطرة قطرة إلى أنبوب 50 مل.
    ملاحظة: يحتوي المحلول 3 على DMSO ، وهو سام للخلايا في درجة حرارة الغرفة. لا تقم بإضافة الحل 3 حتى يصبح جاهزا للمعالجة على الفور.
  13. اقلب الأنبوب برفق 3 مرات للخلط.
  14. املأ كل كريوفيال مسمى مسبقا ومبرد مسبقا ب 1 مل من PBMCs باستخدام ماصة متعددة الاستغناء.
    ملاحظة: راجع الفيديو التكميلي 2 للحصول على عرض توضيحي لكيفية تشغيل ماصة متعددة التوزيعات.
  15. ضع الكريوفيال داخل وعاء تجميد مبرد مسبقا. ثم انقل الحاوية إلى فريزر -80 درجة مئوية.
  16. كرر الخطوات من 1.9 إلى 1.13 لكل مريض أو حالة علاج حسب الحاجة.
  17. احتفظ بالكريوفيال داخل حاوية التجميد لمدة لا تقل عن 12 ساعة ، ثم انقلها إلى صندوق تخزين ملصق عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بنقل المبردات المجمدة إلى النيتروجين السائل (<-135 درجة مئوية) للتخزين طويل الأجل.

2. معالجة معطف البلازما وبافي من أنابيب EDTA

  1. جهاز طرد مركزي عند 1800 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، تتكون الطبقة العليا من البلازما ، ويحتوي الجزء السفلي على كريات الدم الحمراء ، وستكون الواجهة هي طبقة بافي. انظر الشكل 1B للحصول على تصور.
  2. باستخدام ماصة نقل جديدة ، ارسم أكبر قدر ممكن من البلازما دون إزعاج طبقة معطف بافي. بعد ذلك ، قم بتوزيع 0.5 مل من القسامات في كريوفيال المسمى مسبقا. نضح طبقة معطف بافي ونقلها إلى cryovial المسمى بشكل مناسب.
    ملاحظة: قد تلوث بعض البلازما وكريات الدم الحمراء مجموعة معطف بافي.
  3. كرر الخطوة 2.2 لكل مريض أو حالة علاج حسب الحاجة.
  4. بعد التجميع ، قم بتخزين الكريوفيال في فريزر -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بتخزينها في النيتروجين السائل (<-135 درجة مئوية) للتخزين طويل الأجل.

3. ذوبان PBMCs

  1. قبل يوم واحد من الذوبان ، اطبع قائمة مرجعية بالمواد والكواشف المدرجة في الجدول 3 وقم بإعدادها وتسميتها وفقا لذلك.
    ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لإذابة أنبوب واحد سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من PBMCs. ينتج كل أنبوب ما يقرب من 2 مليون PBMCs ، منها حوالي 50٪ و 20٪ ستكون خلايا ليمفاوية حية ووحيدات ، على التوالي. توسيع النطاق وفقا للاحتياجات التجريبية. لاحظ أن العدد المطلق للخلايا قد يختلف اختلافا كبيرا بين المرضى أو حالات العلاج.
  2. انقل PBMCs المجمدة من التخزين باستخدام الثلج الجاف وقم بالذوبان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، أو قبل آخر ذوبان لبلورة الجليد.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن أخذ حصة لعد الخلايا وقياسات الصلاحية ، كما هو مفصل في القسم 4.
  3. بعد الذوبان ، أضف 1 مل من المحلول 4 (PBS + 2 mM EDTA) إلى كل cryovial. بعد ذلك ، صب المحتويات في أنبوب 50 مل المسمى مسبقا يحتوي على 10 مل من المحلول 4 لكل أنبوب PBMC مذاب. انقر لإزالة القطرات المتبقية.
  4. ضع مصفاة الخلية على أنبوب فارغ سعة 50 مل ثم صب تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، انقر برفق لكسر التوتر السطحي.
  5. جهاز طرد مركزي يحتوي على كل أنبوب يحتوي على الخلايا المتوترة عند 400 × جم لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية التي تحتوي على DMSO. اضغط حسب الحاجة لإزالة القطرات المتبقية.
  7. أعد تعليق حبيبات الخلية في الوسط المطلوب المناسب للاحتياجات التجريبية النهائية (على سبيل المثال ، وسائط زراعة الخلايا ، وكوكتيل الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي ، وما إلى ذلك).

4. عد الخلايا وصلاحيتها

  1. مباشرة بعد إذابة PBMCs المجمدة في الخطوة 3.2 ، ماصة 20 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب 1.5 مل. أضف حجما متساويا من محلول Trypan Blue بنسبة 0.4٪ وماصة لأعلى ولأسفل برفق 3-4 مرات للخلط.
  2. باستخدام عداد الخلايا الآلي ، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لحساب عدد الخلايا وتقييم الصلاحية. تأكد من حساب عامل التخفيف 2.
    ملاحظة: كما هو موضح في مكان آخر ، يمكن استخدام مقياس الدم كطريقة بديلة لتقييم عدد الخلايا وصلاحيتها23.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد جمع PBMC والحفظ بالتبريد ، تم تقييم صلاحية PBMCs المذابة ، وحيدات ، والخلايا الليمفاوية من 56 عينة فريدة من خلال قياس التدفق الخلوي باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 4 باتباع تعليمات الشركات المصنعة (الشكل 2A-F). تم تحقيق متوسط ± قابلية SD ل PBMCs ، وحيدات ، والخلايا الليمفاوية من 94 ± 4.0٪ و 98 ± 1.1٪ و 93 ± 5.6٪ على التوالي (الشكل 2G). أسفر قياس الجدوى بواسطة استبعاد Trypan Blue عن متوسط صلاحية 88 ± 7.5٪ وعدد خلايا 2.3 × ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم تنفيذ هذا البروتوكول لجمع PBMC والحفظ بالتبريد بنجاح من قبل الأفراد الذين لديهم أو بدون تدريب مختبري بحثي سابق. في تطبيقنا ، أدى تسلسل FACS و RNA للوحيدات القابلة للحياة للغاية والمنقاة من PBMCs المخزنة إلى تسلسلات عالية الجودة.

تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية لهذا البروتوكول في إمكانية الوصول إليه. تستخدم التقنية المقدمة في البروتوكول أنابيب معبأة مسبقا بوسط تدرج الكثافة الصلبة. نتيجة لذلك ، يمكن جمع الدم الكامل مباشرة في الأنبوب ثم معالجته على الفور لعزل P...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي مصالح مالية أو غير مالية ذات صلة للكشف عنها.

شكر وتقدير

نود أن نشكر المرضى الذين تطوعوا بموافقتهم ووقتهم وتبرعهم بعينات الدم. كما نعرب عن تقديرنا للدكتور باتريك موريارتي وجولي آن داتون ومارك ماكليلين في المركز الطبي بجامعة كانساس لتعاونهم ولتنفيذ هذا البروتوكول في موقع بعيد. تلقت CY دعما بحثيا من منحة المعاهد الوطنية للصحة 1K08HL150271.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1000 & ميكرو; L نصائحجيلسونF174501ما يقرب من 3 نصائح مطلوبة لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
15 مل أنبوبBiopioneeerCNT-15لعقد الحلول 2/3
2 مطلوبة لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
2 مل CryovialsGlobe Scientific3012ما يقرب من 40 مبردة مطلوبة لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
20 & micro ؛ L نصائحجيلسونF174201للاستخدام في عد الخلايا ؛ يعتمد الحجم المطلوب على طريقة عد الخلايا المستخدمة. هناك حاجة إلى طرف واحد لكل 1 مل من PBMCs المجمدة غير المجمعة ليتم إذابة
الجليد 50 مل أنبوب مخروطيCEM Corporation50-187-76832 مطلوب لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
3 مطلوب لكل 1 مل من PBMCs المجمدة غير المجمعة ليتم إذابة
CD14 AntibodyBiolegend325621
CD16 الأجسام المضادةBiolegend360723
CD19 الأجسام المضادةBiolegend363007
CD3 الأجسام المضادةBiolegend300405
CD56 الأجسام المضادةBiolegend318303
CD66b الأجسام المضادةBiolegend305103
مصفاة الخليةBiopioneeerDGN2583671 مطلوب لكل 1 مل من PBMCs المجمدة غير المجمعة ليتم إذابة
CPT أنبوب تحضير الخلايا أحادية النواةBD Biosciences3627536 أنابيب مطلوبة لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
Cryo Freezer BoxLabwareSB2CC-81يحمل 81 أنبوبا
1 مطلوب لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
Cryotube RackFisherbrand05-669-45يحمل ما يصل إلى 50 مبردا
DMSOInvitrogen15575020ما يقرب من 2.5 مل مطلوب لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
DNase / RNase10977015ما يقرب من 2 مل لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
ما يقرب من 9 مل مطلوب لكل 1 مل من PBMCs المجمدة لإزالة الجليد
أنابيب EDTABD Biosciences3666431 أنبوب مطلوب لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR الأجسام المضادةBiolegend307609
مصل البشري الألبومينGeminiBio800-120ما يقرب من 25 مل مطلوب لكل مريض أو حالة علاج لمجموعة PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-Kللاستخدام في
طابعة الملصقاتفروستي PhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001يحمل ما يصل إلى 18 أنبوبا.
2 السيد Frostys المطلوب لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
Multidisdispense PipetteBrandtech705110
Multidispense PipetteTips Brandtech705744ما يقرب من 3 نصائح مطلوبة لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 PipetteGilsonF144056Mللاستخدام في عد الخلايا ؛ يعتمد الحجم المطلوب على طريقة عد الخلايا المستخدمة.
ملصقات الطابعةPhomemoPM-M110-3020ما يقرب من 45 ملصقا مطلوبا لكل مريض / حالة علاج لمجموعة PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
ما يقرب من 5 ملصقات مطلوبة لكل 1 مل من PBMCs المجمدة غير المجمعة ليتم إذابة الجليد
EDTA الخالية من RNase (0.5 م)InvitrogenAM9260Gحوالي 40 & micro ؛ L مطلوب لكل 1 مل من PBMCs المجمدة ليتم إذابة
PBS خال من RNase (10X)InvitrogenAM9625ما يقرب من 1 مل مطلوب لكل 1 مل من PBMCs المجمدة ليتم إذابة
الجليد RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVما يقرب من 80 مل مطلوب لكل مريض أو حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat
Collection Transfer PipettesFisherbrand13-711-7Mما يقرب من 5 مطلوب لكل مريض / حالة علاج لحامل أنبوب جمع PBMC / Plasma / Buffy Coat
Endicott-Seymour14-781-15يحمل ما يصل إلى 80 أنابيب CPT / EDTA
الجليد الجليد Southern السيد

المراجع

  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطيالطرد المركزي بتدرج الكثافةالحفظ بالتجميد للخلاياالطبقة المرققةبلازما EDTAقياس التدفق الخلويتسلسل الحمض النووي الريبيحيوية الخلايافرز الخلايا الوحيدة
عزل وحفظ خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية عالية القابلية للحياة من الدم الكامل: دليل للمبتدئين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.