مقالة منهجية

عزل وحفظ خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية عالية القابلية للحياة من الدم الكامل: دليل للمبتدئين

DOI:

10.3791/66794

⸱

أكتوبر 25, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول دليلا يمكن الوصول إليه لجمع وتخزين وإذابة خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المناسبة لتحليلات المصب وسير العمل مثل قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي. كما يتم عرض مجموعات معطف البلازما وبافي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) بشكل شائع في الأبحاث الطبية الحيوية على الجهاز المناعي واستجابته للأمراض ومسببات الأمراض. يصف هذا البروتوكول التفصيلي المعدات والإمدادات والخطوات الخاصة بعزل وحجز التبريد وإذابة PBMCs عالية الجودة والقابلة للحياة للغاية من خلايا الدم الكاملة المناسبة لتطبيقات المصب مثل قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي. كما يتم وصف بروتوكولات لمعالجة البلازما ومعطف بافي من الدم كله بالتوازي وبالتزامن مع PBMCs. هذا البروتوكول سهل المتابعة خطوة بخطوة ، والذي يستخدم الطرد المركزي المتدرج الكثافة لعزل PBMCs ، مصحوب بقائمة مرجعية بالإمدادات والمعدات وخطوات التحضير. هذا البروتوكول مناسب للأفراد الذين لديهم أي خبرة سابقة في التقنيات المختبرية ويمكن تنفيذه في المختبرات السريرية أو البحثية. نتجت صلاحية الخلايا عالية الجودة وتسلسل الحمض النووي الريبي عن PBMCs التي جمعها المشغلون الذين ليس لديهم خبرة مختبرية سابقة باستخدام هذا البروتوكول.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول طريقة وسير عمل يمكن الوصول إليهما لعزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) من الدم الكامل. يستهدف هذا البروتوكول بشكل خاص فنيي الأبحاث المبتدئين والطلاب وموظفي المختبرات السريرية بهدف تسهيل جمع وحفظ PBMCs بالتبريد دون الحصول على تدريب مسبق على التقنيات المختبرية.

يستخدم هذا البروتوكول الطرد المركزي لفصل مكونات الدم الكامل حسب الكثافة. يتكون الدم الكامل من أربعة مكونات رئيسية مدرجة بترتيب تناقص الكثافة: خلايا الدم الحمراء / كريات الدم الحمراء (~ 45٪ من الحجم) ، وخلايا الدم البيضاء (<1٪ من الحجم) ، والصفائح الدموية (<1٪ من الحجم) ، والبلازما (~ 55٪ من الحجم) 1،2،3،4،5،6. يمكن تقسيم خلايا الدم البيضاء إلى فئتين بناء على خصائص نفاياتها: مستديرة أو متعددة النواة6. تعرف PBMCs بأنها خلايا الدم البيضاء ذات النوى المستديرة وتتكون من أنواع الخلايا التالية: الخلايا الليمفاوية (الخلايا التائية ، الخلايا البائية ، الخلايا القاتلة الطبيعية) ، الخلايا المتغصنة ، والوحيدات6. تشمل خلايا الدم البيضاء متعددة النوى الخلايا المحببة ، والتي تتكون من أنواع الخلايا التالية: العدلات ، الخلايا القاعدية ، والحمضات6. خلايا الدم البيضاء متعددة النوى أكثر كثافة من PBMCs6. يتم تفصيل كثافات كل مكون من مكونات الدم الكامل في الجدول 1.

في هذا البروتوكول ، يتم جمع الدم الكامل في أنابيب الطرد المركزي المتدرجة الكثافة. تحتوي هذه الأنابيب على وسط تدرج كثافة معبأ مسبقا كثافته 1.077 g/mL. بعد الطرد المركزي ، يتم فصل الخلايا الأكثر كثافة ، بما في ذلك خلايا الدم البيضاء متعددة النوى وكريات الدم الحمراء ، عن PBMCs والصفائح الدموية بواسطة وسط تدرج الكثافة (الشكل 1A)6,7. ثم يتم جمع PBMC وجزء الصفائح الدموية وغسلها وطردها مركزيا لإزالة الصفائح الدموية. يتم جمع PBMCs المنقى الناتج وتخزينه عند -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل. يمكن إذابة PBMCs المحفوظة بالتبريد بشكل قابل للتطبيق واستخدامها مباشرة في تحليلات المصب أو معالجتها بشكل إضافي لعزل أنواع معينة من الخلايا المكونة.

تم تحسين هذا البروتوكول لتسلسل الحمض النووي الريبي عالي الجودة من PBMCs عالية القابلية للتطبيق. في هذه المقالة ، تم عزل PBMCs وحفظها بالتبريد من المرضى في عيادة خارجية. بعد ذلك ، تم عزل الخلايا الوحيدة من PBMCs بواسطة FACS وتحليلها عبر تسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول على نطاق واسع مع الاحتياجات التجريبية الأخرى مثل زراعة الخلايا ، وتحرير الجينات ، والدراسات الوظيفية خارج الجسم الحي ، وتحليلات الخلية الواحدة ، والتنميط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي أو قياس الخلايا حسب وقت الرحلة ، وعزل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي أو البروتينات ، والشرائح للكيمياء المناعية ، من بين أمور أخرى8،9،10،11،12،13،14،15 ، 16,17,18.

بالإضافة إلى جمع PBMC من أنابيب الطرد المركزي المتدرجة الكثافة ، يستعرض هذا البروتوكول كيفية جمع البلازما ومعطف بافي عبر الطرد المركزي باستخدام أنبوب EDTA. بعد الطرد المركزي ، يتم فصل الدم الكامل إلى بلازما وكريات الدم الحمراء وطبقة واجهة رقيقة تسمى معطف بافي يحتوي على كريات الدم البيضاء (الشكل 1 ب)6. يستخدم معطف بافي بشكل شائع لاستخراج الحمض النووي والتحليلات الجينومية اللاحقة19,20. تحتوي طبقة البلازما على مكونات خالية من الخلايا في الدم الكامل ويمكن استخدامها لفحوصات العلامات الحيوية21,22.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل UCSD وبرنامج حماية الإنسان KUMC ويتوافق مع إعلان هلسنكي. قدم جميع الأفراد موافقة مستنيرة للمشاركة وجمع الدم.

1. المعالجة والحفظ بالتبريد ل PBMCs

  1. قبل يوم واحد من جمع الدم ، اطبع قائمة التحقق من المواد والكواشف المدرجة في الجدول 2 وقم بإعدادها وتسميتها وفقا لذلك.
    ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لجمع 6 أنابيب طرد مركزي متدرجة الكثافة. ينتج كل أنبوب ما يقرب من 12 مليون PBMCs ، منها حوالي 50٪ و 20٪ ستكون خلايا ليمفاوية حية ووحيدات على التوالي. توسيع النطاق وفقا للاحتياجات التجريبية. لاحظ أن العدد المطلق للخلايا قد يختلف اختلافا كبيرا بين المرضى أو حالات العلاج.
  2. باستخدام تقنية الفصد القياسية ، اجمع الدم الكامل في 6 أنابيب طرد مركزي متدرجة الكثافة وأنبوب 1 EDTA حتى يتم ملؤه ، أي حوالي 6 مل من الحجم.
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى عينات من عدة مرضى أو حالات علاجية ، فقد يتم تخزين الأنابيب المجمعة لمدة تصل إلى 4 ساعات ثم معالجتها في وقت واحد.
  3. بعد التجميع ، تقوم أجهزة الطرد المركزي بجميع الأنابيب عند 1800 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: راجع الفيديو التكميلي 1 للحصول على عرض توضيحي لكيفية تشغيل جهاز طرد مركزي.
  4. بعد الطرد المركزي ، افتح بعناية أنبوب الطرد المركزي المتدرج الكثافة. استخدم ماصة نقل لإزالة وتجاهل الطبقة الصفراء الشفافة التي تحتوي على البلازما. لا تزعج الطبقة الضبابية من الخلايا مباشرة فوق وسط تدرج الكثافة. يخطئ في جانب الحذر ، وترك البلازما الزائدة بدلا من التخلص من PBMCs. كرر لجميع الأنابيب.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على وسط تدرج الكثافة ، ستكون البلازما و PBMCs فوق وسط تدرج الكثافة ؛ سوف تستقر كريات الدم الحمراء والمحببة في القاع. ارجع إلى الشكل 1 أ للحصول على تصور.
  5. مع ماصة نقل جديدة ، ماصة الحجم المتبقي الذي يحتوي على الخلايا والبلازما المتبقية في كل أنبوب صعودا وهبوطا بلطف عدة مرات فوق وسط تدرج الكثافة.
  6. بعد التعليق ، ماصة محتويات الأنبوب المعاد تعليقها في أنبوب مخروطي 50 مل مسمى. كرر لجميع الأنابيب.
  7. صب المحلول 1 (متوسط RPMI) في أنبوب سعة 50 مل حتى يصل إلى خط 50 مل.
  8. كرر الخطوات من 1.4 إلى 1.7 لكل مريض أو حالة علاجية حسب الحاجة.
    ملاحظة: تأكد من عدم خلط العينات المختلفة واستخدم ماصة نقل جديدة لتجنب التلوث.
  9. جهاز طرد مركزي أنبوب 50 مل عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قد يتم إكمال بروتوكول جمع البلازما وبافي المفصل في القسم 2 خلال هذا الوقت.
  10. تخلص من أكبر قدر ممكن من المواد الطافية. اضغط حسب الحاجة لإزالة القطرات المتبقية.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، تحتوي الحبيبات على PBMCs ، وتحتوي المادة الطافية على الصفائح الدموية والبلازما المتبقية.
  11. صب أنبوب 15 مل من المحلول 2 (RPMI متوسط + 12.5٪ مصل بشري ألبومين + 1 ميكرومتر فلافوبيريدول) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على حبيبات PBMC. اقلب الأنبوب برفق لإعادة تعليق حبيبات الخلية.
  12. نضح 15 مل من المحلول 3 (RPMI متوسط + 11.25٪ مصل بشري ألبومين + 1 ميكرومتر فلافوبيريدول + 10٪ DMSO) باستخدام ماصة نقل. أضف قطرة قطرة إلى أنبوب 50 مل.
    ملاحظة: يحتوي المحلول 3 على DMSO ، وهو سام للخلايا في درجة حرارة الغرفة. لا تقم بإضافة الحل 3 حتى يصبح جاهزا للمعالجة على الفور.
  13. اقلب الأنبوب برفق 3 مرات للخلط.
  14. املأ كل كريوفيال مسمى مسبقا ومبرد مسبقا ب 1 مل من PBMCs باستخدام ماصة متعددة الاستغناء.
    ملاحظة: راجع الفيديو التكميلي 2 للحصول على عرض توضيحي لكيفية تشغيل ماصة متعددة التوزيعات.
  15. ضع الكريوفيال داخل وعاء تجميد مبرد مسبقا. ثم انقل الحاوية إلى فريزر -80 درجة مئوية.
  16. كرر الخطوات من 1.9 إلى 1.13 لكل مريض أو حالة علاج حسب الحاجة.
  17. احتفظ بالكريوفيال داخل حاوية التجميد لمدة لا تقل عن 12 ساعة ، ثم انقلها إلى صندوق تخزين ملصق عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بنقل المبردات المجمدة إلى النيتروجين السائل (<-135 درجة مئوية) للتخزين طويل الأجل.

2. معالجة معطف البلازما وبافي من أنابيب EDTA

  1. جهاز طرد مركزي عند 1800 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، تتكون الطبقة العليا من البلازما ، ويحتوي الجزء السفلي على كريات الدم الحمراء ، وستكون الواجهة هي طبقة بافي. انظر الشكل 1B للحصول على تصور.
  2. باستخدام ماصة نقل جديدة ، ارسم أكبر قدر ممكن من البلازما دون إزعاج طبقة معطف بافي. بعد ذلك ، قم بتوزيع 0.5 مل من القسامات في كريوفيال المسمى مسبقا. نضح طبقة معطف بافي ونقلها إلى cryovial المسمى بشكل مناسب.
    ملاحظة: قد تلوث بعض البلازما وكريات الدم الحمراء مجموعة معطف بافي.
  3. كرر الخطوة 2.2 لكل مريض أو حالة علاج حسب الحاجة.
  4. بعد التجميع ، قم بتخزين الكريوفيال في فريزر -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بتخزينها في النيتروجين السائل (<-135 درجة مئوية) للتخزين طويل الأجل.

3. ذوبان PBMCs

  1. قبل يوم واحد من الذوبان ، اطبع قائمة مرجعية بالمواد والكواشف المدرجة في الجدول 3 وقم بإعدادها وتسميتها وفقا لذلك.
    ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لإذابة أنبوب واحد سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من PBMCs. ينتج كل أنبوب ما يقرب من 2 مليون PBMCs ، منها حوالي 50٪ و 20٪ ستكون خلايا ليمفاوية حية ووحيدات ، على التوالي. توسيع النطاق وفقا للاحتياجات التجريبية. لاحظ أن العدد المطلق للخلايا قد يختلف اختلافا كبيرا بين المرضى أو حالات العلاج.
  2. انقل PBMCs المجمدة من التخزين باستخدام الثلج الجاف وقم بالذوبان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، أو قبل آخر ذوبان لبلورة الجليد.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن أخذ حصة لعد الخلايا وقياسات الصلاحية ، كما هو مفصل في القسم 4.
  3. بعد الذوبان ، أضف 1 مل من المحلول 4 (PBS + 2 mM EDTA) إلى كل cryovial. بعد ذلك ، صب المحتويات في أنبوب 50 مل المسمى مسبقا يحتوي على 10 مل من المحلول 4 لكل أنبوب PBMC مذاب. انقر لإزالة القطرات المتبقية.
  4. ضع مصفاة الخلية على أنبوب فارغ سعة 50 مل ثم صب تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، انقر برفق لكسر التوتر السطحي.
  5. جهاز طرد مركزي يحتوي على كل أنبوب يحتوي على الخلايا المتوترة عند 400 × جم لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية التي تحتوي على DMSO. اضغط حسب الحاجة لإزالة القطرات المتبقية.
  7. أعد تعليق حبيبات الخلية في الوسط المطلوب المناسب للاحتياجات التجريبية النهائية (على سبيل المثال ، وسائط زراعة الخلايا ، وكوكتيل الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي ، وما إلى ذلك).

4. عد الخلايا وصلاحيتها

  1. مباشرة بعد إذابة PBMCs المجمدة في الخطوة 3.2 ، ماصة 20 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب 1.5 مل. أضف حجما متساويا من محلول Trypan Blue بنسبة 0.4٪ وماصة لأعلى ولأسفل برفق 3-4 مرات للخلط.
  2. باستخدام عداد الخلايا الآلي ، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لحساب عدد الخلايا وتقييم الصلاحية. تأكد من حساب عامل التخفيف 2.
    ملاحظة: كما هو موضح في مكان آخر ، يمكن استخدام مقياس الدم كطريقة بديلة لتقييم عدد الخلايا وصلاحيتها23.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد جمع PBMC والحفظ بالتبريد ، تم تقييم صلاحية PBMCs المذابة ، وحيدات ، والخلايا الليمفاوية من 56 عينة فريدة من خلال قياس التدفق الخلوي باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 4 باتباع تعليمات الشركات المصنعة (الشكل 2A-F). تم تحقيق متوسط ± قابلية SD ل PBMCs ، وحيدات ، والخلايا الليمفاوية من 94 ± 4.0٪ و 98 ± 1.1٪ و 93 ± 5.6٪ على التوالي (الشكل 2G). أسفر قياس الجدوى بواسطة استبعاد Trypan Blue عن متوسط صلاحية 88 ± 7.5٪ وعدد خلايا 2.3 × 106 ± 1.9 × 106. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أيضا أن الخلايا الوحيدة الحية تشكل 17 ± 5.9٪ والخلايا الليمفاوية تتكون من 53 ± 13.0٪ من إجمالي PBMCs.

بعد ذلك ، تم فرز الخلايا الوحيدة من PBMCs المذابة من 59 عينة فريدة عن طريق قياس التدفق الخلوي وتقديمها لإعداد المكتبة وتسلسل الحمض النووي الريبي كما هو موضح في مكان آخر24. تم تحقيق متوسط ± إجمالي عدد تسلسل SD يبلغ 18.0 ± 16.3 مليون مع محاذاة قراءة 93 ± 6.3٪ و 49.6 ± 1.4٪ محتوى GC (الشكل 3A-B). تم العثور على متوسط نسبة قراءات SD ± تم تعيينها بشكل فريد من 88 ± 3.6٪ مع مجموعة فرعية من 56 عينة فريدة. وتبين هذه المعلمات أن المشغلين الذين لديهم أي مستوى من التدريب المختبري باستخدام هذا البروتوكول يمكن الحصول على هذه البارامترات القابلة للتطبيق بدرجة عالية والمناسبة للتطبيقات النهائية، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الجودة.

مكونكثافةذكر
البلازما1.022 جم / مل إلى 1.026 جم / مل1
الصفائح الدمويه<1.061 جم / مل إلى >1.070 جم / مل2
PBMCs<1.077 جم / مل6
العدلات منخفضة الكثافة*<1.077 جم / مل3
الخلايا المحببة (العدلات * ، الخلايا القاعدية ، والحمضات)>1.077 جم / مل6
كريات الدم الحمراء1.11 جم / مل4

الجدول 1: مكونات الدم الكامل مدرجة حسب ترتيب تناقص الكثافة.

ريجانت / الموادالمبلغ (لكل 6 أنابيب CPT و 1 أنبوب EDTA)بقشيشبيانات تحذيرية
أنابيب CPT6التسمية وفقا لمعرف المريض أو العينة.
أنبوب EDTA1التسمية وفقا لمعرف المريض أو العينة.
أنبوب مخروطي سعة 50 مل2بالإضافة إلى معرف المريض أو العينة ، قم بتسمية أنبوب 1 ل PBMCs و 1 للنفايات.
كريوفيال39الملصق 30 ل PBMCs ، و 8 لبلازما EDTA ، و 1 للمعطف الفاخر. لا يمكن استخدام جميع المبردات.
السيد فروستي2املأ حتى منتصف الطريق بالإيزوبروبانول وقم بالتبريد المسبق طوال الليل عند -20 درجة مئوية.الأيزوبروبانول هو مهيج قابل للاشتعال. يحفظ بعيدا عن الشرر / اللهب. تجنب الاستنشاق والتعامل مع القفازات والعناية.
فلافوبيريدول100 ميكرولتر من مخزون 1000Xلتحضير مخزون 1000X فلافوبيريدول ، قم بتعليق 5 ملغ فلافوبيريدول في 1.14 مل من DMSO لتركيز 10 مللي مول. القسمة 200 ميكرولتر في حاويات فردية ثم تجميد. للاستخدام ، قم بإذابة القسامات الفردية وقم بتخفيف 1:10 في الماء المقطر الخالي من DNase / RNase ، ثم استخدمه كمحلول 1000X.فلافوبيريدول هو مصدر إزعاج. تعامل مع القفازات والعناية.
الحل 150 ملRPMI المتوسطة.
لصنع 50 مل من محلول المخزون ، استخدم 50 مل من RPMI Medium.
الحل 215 ملRPMI متوسط + 12.5٪ مصل بشري ألبومين + 1 ميكرومتر فلافوبيريدول.
لصنع 50 مل من محلول المخزون ، استخدم 25 مل RPMI متوسطة + 25 مل مصل بشري ألبومين + 50 ميكرولتر 1000X فلافوبيريدول.		فلافوبيريدول هو مصدر إزعاج. تعامل مع القفازات والعناية.
الحل 315 ملRPMI متوسط + 11.25٪ مصل بشري ألبومين + 1 ميكرومتر فلافوبيريدول + 10٪ DMSO.
لصنع 50 مل من محلول المخزون ، استخدم 22.5 مل RPMI متوسط + 22.5 مل HSA + 5 مل DMSO + 50 ميكرولتر 1000X فلافوبيريدول.		فلافوبيريدول مهيج و DMSO سام ويتم امتصاصه بسهولة من خلال الجلد. تعامل مع القفازات والعناية.

الجدول 2: قائمة مرجعية بالكواشف والمواد التي يجب تحضيرها ووضع العلامات عليها لجمع وحفظ PBMCs بالتبريد.

ريجانت / الموادالمبلغ (لكل 1 مل من قسمة PBMCs المجمدة)بقشيشبيانات تحذيرية
الحل 410 ملبرنامج تلفزيوني + 2 مللي متر EDTA

لصنع 50 مل من محلول المخزون ، استخدم 5 مل 10X PBS + 200 ميكرولتر 0.5M EDTA + 44.8 مل ماء مقطر خال من DNase / RNase
أنبوب مخروطي سعة 50 مل3بالإضافة إلى معرف المريض أو العينة ، قم بتسمية أنبوب واحد ل PBMCs المجهدة مسبقا ، و 1 ل PBMCs بعد الإجهاد ، و 1 للنفايات. املأ الأنبوب المسمى ب PBMCs الملطخة مسبقا ب 9 مل من المحلول 4 لكل مل من PBMCs المجمدة
أنبوب 1.5 مل1لعد الخلايا. تسمية مع المريض أو معرف العينة
0.4٪ محلول تريبان الأزرق20 ميكرولترلعد الخلايا. يمكن إضافته إلى أنبوب 1.5 مل في وقت مبكر من اليوم السابق.تريبان بلو مادة مسرطنة. تعامل مع القفازات والعناية.

الجدول 3: قائمة مرجعية بالكواشف والمواد التي يجب تحضيرها ووضع العلامات عليها لإذابة وحساب PBMCs.

الكاشف / الموادالمبلغ (لكل مليون خلية)
بقعة حية ميتة5 ميكرولتر
الثقة البشرية FcX5 ميكرولتر
الأجسام المضادة CD35 ميكرولتر
الأجسام المضادة CD195 ميكرولتر
الأجسام المضادة CD565 ميكرولتر
الأجسام المضادة CD66b5 ميكرولتر
الأجسام المضادة HLA-DR5 ميكرولتر
الأجسام المضادة CD145 ميكرولتر
الأجسام المضادة CD162.5 ميكرولتر
الحمض النووي الريبي100 الوحدات

الجدول 4: جدول الكواشف لعزل الخلايا الوحيدة من PBMCs عن طريق قياس التدفق الخلوي.

فصل مكونات الدم في مخطط الطرد المركزي المتدرج الكثافة. البلازما ، PBMCs ، طبقات معطف بافي.
الشكل 1: مكونات الدم الكامل كما يفصلها الطرد المركزي في أنابيب الطرد المركزي المتدرجة الكثافة أو أنابيب EDTA. (أ) يؤدي الطرد المركزي للدم الكامل في أنابيب الطرد المركزي المتدرجة الكثافة إلى فصل البلازما والصفائح الدموية و PBMCs فوق وسط تدرج الكثافة مع كريات الدم الحمراء متعددة النوى أسفل وسط تدرج الكثافة. (ب) ينتج عن الطرد المركزي للدم الكامل في أنابيب EDTA فصل البلازما في الطبقة العليا ، وكريات الدم الحمراء في الطبقة السفلية ، والغلاف المنتفخ في الواجهة. تم إنشاؤها باستخدام Biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخططات مبعثر قياس التدفق الخلوي. PBMCs ، الخلايا الوحيدة ، الخلايا الليمفاوية. تحليل الجدوى ، الرسم البياني لنوع الخلية.
الشكل 2: تم تقييم صلاحية PBMCs المذابة المحفوظة بالتبريد عن طريق تلطيخ التدفق الحي / الميت وقياس التدفق الخلوي. (أ) يستبعد الحطام، الذي يشار إليه بعلامة نجمية*، من PBMCs بواسطة بوابات التشتت الأمامية والجانبية. (ب) التحليل الحي / الميت التمثيلي ل PBMCs الكاملة (ج) يتم إغلاق الوحيدات الشاملة على أنها HLA-DR موجبة وسالبة للمستضدات السطحية التالية التي تحمل علامة FITC: CD3 و CD19 و CD56 و CD66b. (د) التحليل التمثيلي الحي / الميت للوحيدات. ه: الخلايا الليمفاوية المسورة بواسطة مولدات الضد السطحية التالية المسماة FITC: CD3 و CD19 و CD56 و CD 66b. (F) التحليل التمثيلي الحي / الميت للخلايا الليمفاوية. (ز) النسبة المئوية لصلاحية كل نوع من الخلايا التي تم قياسها كميا من 56 عينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرسوم البيانية لتحليل بيانات FastQC ؛ مليون تسلسل مقابل محاذاة ، توزيع محتوى GC.
الشكل 3: جودة تسلسل الحمض النووي الريبي للوحيدات المصنفة من PBMCs المحفوظة بالتبريد. تم تسلسل 56 عينة فريدة وتم إنشاء متوسط ± SD 18.0 ± 16.3 مليون تسلسل إجمالي. (أ) كانت المحاذاة عالية ، حيث تتوافق 92.5٪ ± 6.3٪ من التسلسلات مع الجينوم المرجعي. (ب) كان محتوى GC لهذه التسلسلات 49.6 ± 1.4٪. تم إنشاؤها باستخدام FastQC25. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو تكميلي 1: عرض توضيحي لكيفية استخدام أجهزة الطرد المركزي الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو تكميلي 2: عرض توضيحي لكيفية تشغيل ماصة متعددة الموزعات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ هذا البروتوكول لجمع PBMC والحفظ بالتبريد بنجاح من قبل الأفراد الذين لديهم أو بدون تدريب مختبري بحثي سابق. في تطبيقنا ، أدى تسلسل FACS و RNA للوحيدات القابلة للحياة للغاية والمنقاة من PBMCs المخزنة إلى تسلسلات عالية الجودة.

تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية لهذا البروتوكول في إمكانية الوصول إليه. تستخدم التقنية المقدمة في البروتوكول أنابيب معبأة مسبقا بوسط تدرج الكثافة الصلبة. نتيجة لذلك ، يمكن جمع الدم الكامل مباشرة في الأنبوب ثم معالجته على الفور لعزل PBMCs. هناك حاجة إلى عدد صغير نسبيا من الحلول الجاهزة والمعدات المتخصصة ، مما يسهل التعاون بين مختبر الأبحاث ، حيث يمكن تحضير الكواشف ، والمختبر السريري ، حيث يتم جمع العينات ومعالجتها. البروتوكولات المكتوبة والفيديو موجهة نحو المشغلين في أي مستوى من التدريب.

في حين أن هذا البروتوكول يستخدم الدم الكامل الطازج لعزل PBMCs ، وبالتالي ، لديه عائد متوقع مرتفع نسبيا ونقاوة تبلغ >90٪ ، فقد لا يكون مناسبا للتطبيقات التي تتطلب نقاوة عالية بشكل استثنائي تبلغ >98٪ 26,27. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون الحصول على أنابيب الطرد المركزي ذات الكثافة المتدرجة مكلفا ، خاصة إذا كانت هناك حاجة إلى جمع عدد كبير من العينات.

تشمل الطرق البديلة لجمع PBMC استخدام وسط تدرج الكثافة السائلة أو استنفاد المغناطيسية المناعية28,29. باختصار ، يتضمن الأول وضع طبقات من وسط تدرج الكثافة مسبق الصنع تحت الدم الكامل الهيبارين متبوعا بالطرد المركزي. يستخدم هذا الأخير الأجسام المضادة الموسومة مغناطيسيا لتسمية غير PBMCs ، والتي يتم الاحتفاظ بها بعد ذلك في عمود مغناطيسي بينما تمر PBMCs غير المسماة دون أن تتأثر.

بالنسبة للبروتوكول المقدم ، فإن استخدام وسيط تدرج الكثافة السائلة أقل تكلفة ويتطلب مواد أقل بكثير بسبب نقص أنابيب الطرد المركزي المتدرجة الكثافة ؛ يمكن إجراء عزل PBMC في أنبوب قياسي سعة 50 مل8. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية أكثر تفصيلا ، ولها وقت معالجة أطول ، وقد تكون عرضة لخطر أكبر لخطأ المستخدم. يجب إضافة الهيبارين بدقة لتجنب الإفراط في التخفيف ويجب وضع وسط تدرج الكثافة بعناية بالكميات الصحيحة لضمان فصل PBMC الجيد26.

بالنسبة إلى البروتوكول المقدم ، فإن استخدام النضوب المغناطيسي المناعي يوفر عائدا ونقاء أعلى ، ومناولة أقل بسبب نقص الطرد المركزي ، ووقت معالجة أسرع ، ويتطلب مواد أقل بكثير30،31،32. ومع ذلك ، فإن الجانب السلبي الرئيسي هو أن هذه الطريقة هي الأكثر تكلفة من بين الطرق الثلاث الموصوفة ، خاصة على نطاق واسع.

في حين أن هذا البروتوكول قوي ، قد تتطلب بعض الخطوات الحاسمة اهتماما إضافيا. في جميع أنحاء البروتوكول ، تأكد من عدم خلط العينات ووضعها في الأنابيب ذات العلامات المناسبة ، خاصة عند العمل مع العديد من المرضى أو الحالات في وقت واحد. بالنسبة للخطوة 1.4 ، تأكد من عدم تجاهل PBMCs ؛ لن تؤدي البلازما الزائدة إلا إلى تقليل تركيز PBMCs ، وهو أمر أقل أهمية في الحفاظ على صلاحية العينة وجودتها. بشكل منفصل ، يشير وجود الرواسب في PBMCs المجمعة إلى أن قطعا من وسط تدرج الكثافة قد تم إزاحتها. ماصة بلطف أكثر في الخطوة 1.5 لمنع هذه المشكلة. في الخطوتين 1.10 و 3.6, تأكد من عدم التخلص من حبيبات خلية الطرد المركزي. يعد العمل السريع أمرا بالغ الأهمية للخطوتين 1.12 و 3.3 حيث يحتوي المحلول 3 على DMSO ، وهو سام للخلايا في درجة حرارةالغرفة 33. من المهم أيضا ملاحظة أن تخزين PBMCs في النيتروجين السائل موصى به على التخزين عند -80 درجة مئوية. ارتبط التخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية بانخفاض صلاحية الخلية وتغيير التعبير الجيني34,35.

يمكن تكييف هذا البروتوكول وفقا للاحتياجات التجريبية. تهدف إضافة فلافوبيريدول ، وهو مثبط لبوليميراز الحمض النووي الريبي وتوليف الحمض النووي الريبي المرسال ، في المحلولين 2 و 3 إلى منع أي معالجة وضغط ناتج عن قطعة أثرية باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي36. ومع ذلك ، قد يتم حذف فلافوبيريدول إذا كانت الدراسات الوظيفية أو خارج الجسم الحي باستخدام PBMCs مطلوبة.

سوف تصبح البلازما التي يتم جمعها من أنابيب EDTA ملوثة ب EDTA ، وهو عامل مخلبي. نتيجة لذلك ، فإن بلازما EDTA غير مناسبة للمقايسات التي تنطوي على التخثر أو أيونات الكالسيوم 37,38. إذا رغبت في ذلك ، يمكن بدلا من ذلك جمع طبقة البلازما في الأنابيب المتوسطة المتدرجة الكثافة بعد الطرد المركزي في الخطوة 1.4. تحتوي هذه الأنابيب على هيبارين الصوديوم كمضاد للتخثر يمكن إزالته بإضافة الهيباريناز39. والجدير بالذكر أن الهيبارين يثبط النسخ العكسي وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يجعل البلازما المجمعة غير مناسبة لتجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل دون إضافة عامل مانعللهيبارين 40.

لا يتم تخزين معطف بافي الذي تم جمعه من أنابيب EDTA في محلول يحتوي على DMSO أو فلافوبيريدول. DMSO مهم في الحد من تكوين بلورات الجليد وموت الخلايا41. فلافوبيريدول مهم لتثبيط تخليق الحمض النووي الريبي36. وبالتالي ، فإن معطف بافي غير مناسب للتحليلات خارج الجسم الحي والترانسكوبي. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تنفيذ الخطوات من 1.6 إلى 1.15 باستخدام معطف بافي الذي تم جمعه من أجل زيادة صلاحية الخلية إلى أقصى حد ومنع تخليق الحمض النووي الريبي.

بينما تم تصميم هذا البروتوكول لتسلسل الحمض النووي الريبي ، فإن التطبيقات المحتملة الإضافية ل PBMCs التي تم جمعها وحفظها بالتبريد باستخدام هذا البروتوكول تشمل زراعة الخلايا ، وتحرير الجينات ، والدراسات الوظيفية خارج الجسم الحي ، وتحليلات الخلية المفردة ، والتنميط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي أو قياس الخلايا حسب وقت الرحلة ، وعزل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي أو البروتينات ، والشرائح للكيمياء المناعية ، من بين أمور أخرى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي مصالح مالية أو غير مالية ذات صلة للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر المرضى الذين تطوعوا بموافقتهم ووقتهم وتبرعهم بعينات الدم. كما نعرب عن تقديرنا للدكتور باتريك موريارتي وجولي آن داتون ومارك ماكليلين في المركز الطبي بجامعة كانساس لتعاونهم ولتنفيذ هذا البروتوكول في موقع بعيد. تلقت CY دعما بحثيا من منحة المعاهد الوطنية للصحة 1K08HL150271.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1000 & ميكرو; L نصائحجيلسونF174501ما يقرب من 3 نصائح مطلوبة لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
15 مل أنبوبBiopioneeerCNT-15لعقد الحلول 2/3
2 مطلوبة لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
2 مل CryovialsGlobe Scientific3012ما يقرب من 40 مبردة مطلوبة لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
20 & micro ؛ L نصائحجيلسونF174201للاستخدام في عد الخلايا ؛ يعتمد الحجم المطلوب على طريقة عد الخلايا المستخدمة. هناك حاجة إلى طرف واحد لكل 1 مل من PBMCs المجمدة غير المجمعة ليتم إذابة
الجليد 50 مل أنبوب مخروطيCEM Corporation50-187-76832 مطلوب لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
3 مطلوب لكل 1 مل من PBMCs المجمدة غير المجمعة ليتم إذابة
CD14 AntibodyBiolegend325621
CD16 الأجسام المضادةBiolegend360723
CD19 الأجسام المضادةBiolegend363007
CD3 الأجسام المضادةBiolegend300405
CD56 الأجسام المضادةBiolegend318303
CD66b الأجسام المضادةBiolegend305103
مصفاة الخليةBiopioneeerDGN2583671 مطلوب لكل 1 مل من PBMCs المجمدة غير المجمعة ليتم إذابة
CPT أنبوب تحضير الخلايا أحادية النواةBD Biosciences3627536 أنابيب مطلوبة لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
Cryo Freezer BoxLabwareSB2CC-81يحمل 81 أنبوبا
1 مطلوب لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
Cryotube RackFisherbrand05-669-45يحمل ما يصل إلى 50 مبردا
DMSOInvitrogen15575020ما يقرب من 2.5 مل مطلوب لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
DNase / RNase10977015ما يقرب من 2 مل لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
ما يقرب من 9 مل مطلوب لكل 1 مل من PBMCs المجمدة لإزالة الجليد
أنابيب EDTABD Biosciences3666431 أنبوب مطلوب لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR الأجسام المضادةBiolegend307609
مصل البشري الألبومينGeminiBio800-120ما يقرب من 25 مل مطلوب لكل مريض أو حالة علاج لمجموعة PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-Kللاستخدام في
طابعة الملصقاتفروستي PhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001يحمل ما يصل إلى 18 أنبوبا.
2 السيد Frostys المطلوب لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
Multidisdispense PipetteBrandtech705110
Multidispense PipetteTips Brandtech705744ما يقرب من 3 نصائح مطلوبة لكل مريض / حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 PipetteGilsonF144056Mللاستخدام في عد الخلايا ؛ يعتمد الحجم المطلوب على طريقة عد الخلايا المستخدمة.
ملصقات الطابعةPhomemoPM-M110-3020ما يقرب من 45 ملصقا مطلوبا لكل مريض / حالة علاج لمجموعة PBMC / Plasma / Buffy Coat Collection
ما يقرب من 5 ملصقات مطلوبة لكل 1 مل من PBMCs المجمدة غير المجمعة ليتم إذابة الجليد
EDTA الخالية من RNase (0.5 م)InvitrogenAM9260Gحوالي 40 & micro ؛ L مطلوب لكل 1 مل من PBMCs المجمدة ليتم إذابة
PBS خال من RNase (10X)InvitrogenAM9625ما يقرب من 1 مل مطلوب لكل 1 مل من PBMCs المجمدة ليتم إذابة
الجليد RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVما يقرب من 80 مل مطلوب لكل مريض أو حالة علاج ل PBMC / Plasma / Buffy Coat
Collection Transfer PipettesFisherbrand13-711-7Mما يقرب من 5 مطلوب لكل مريض / حالة علاج لحامل أنبوب جمع PBMC / Plasma / Buffy Coat
Endicott-Seymour14-781-15يحمل ما يصل إلى 80 أنابيب CPT / EDTA
الجليد الجليد Southern السيد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EDTA

مقالات ذات صلة