مقالة منهجية

النمذجة في المختبر لترسب الدهون في مرض الكبد الدهني المرتبط بالخلل الأيضي

DOI:

10.3791/66810

⸱

يوليو 19, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة استخدام خلايا HepG2 التي يسببها حمض الأوليك كنموذج لمرض الكبد الدهني المرتبط بالخلل الأيضي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ارتفع معدل انتشار مرض الكبد الدهني المرتبط بالخلل الأيضي (MASLD) بسبب التغيرات في الأنماط الاقتصادية ونمط الحياة ، مما أدى إلى تحديات صحية كبيرة. وقد درست التقارير السابقة إنشاء نماذج حيوانية وخلوية ل MASLD ، مع تسليط الضوء على الاختلافات بينهما. في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج خلوي عن طريق تحفيز تراكم الدهون في MASLD. تم تحفيز خلايا HepG2 بحمض الأوليك غير المشبع بتركيزات مختلفة (0.125 mM ، 0.25 mM ، 0.5 mM ، 1 mM) لمحاكاة MASLD. تم تقييم فعالية النموذج باستخدام مقايسات مجموعة عد الخلايا -8 ، وتلطيخ Oil Red O ، وتحليل محتوى الدهون. تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء نموذج خلوي سهل التشغيل لخلايا MASLD. أظهرت نتائج فحوصات مجموعة عد الخلايا -8 أن بقاء خلايا HepG2 كان يعتمد على تركيز حمض الأوليك ، مع GI50 من 1.875 mM. كانت صلاحية الخلية في مجموعات 0.5 mM و 1 mM أقل بكثير من تلك الموجودة في المجموعة الضابطة (P < 0.05). علاوة على ذلك ، فحص تلطيخ الزيت الأحمر O وتحليل محتوى الدهون ترسب الدهون بتركيزات متفاوتة من حمض الأوليك (0.125 مللي مول ، 0.25 مللي مول ، 0.5 مللي مول ، 1 مللي مول) على خلايا HepG2. كان محتوى الدهون في مجموعات 0.25 mM و 0.5 mM و 1 mM أعلى بكثير من محتوى المجموعة الضابطة (P < 0.05). بالإضافة إلى ذلك ، كانت مستويات الدهون الثلاثية في مجموعات الزراعة العضوية أعلى بكثير من تلك الموجودة في المجموعة الضابطة (P < 0.05).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشمل مرض الكبد الدهني المرتبط بالخلل الأيضي (MASLD) مجموعة من الحالات ، بما في ذلك التنكس الدهني البسيط ، والتهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) ، وتليف الكبد ، وسرطان الخلايا الكبدية1،2،3،4،5،6 ، وكلها تعزى إلى عوامل أخرى غير تكوين الكحول7. MASLD هو مرض الكبد الأكثر انتشارا الناجم عن إصابة الكبد الأيضية ، حيث يؤثر على ما يقرب من ربع سكان العالم8،9،10،11،12. في حين أن التسبب الدقيق في MASLD لم يتم توضيحه بعد ، تحاول نظريات مختلفة شرح تطوره. تشير إحدى الأفكار السائدة إلى الخروج عن نظرية "الضربتين" الكلاسيكية نحو نموذج "متعدد الضربات"1. محور هذه الفرضيات هو دور مقاومة الأنسولين ، والتي يعتقد أنها محورية في التسبب في MASLD13. تشير الأبحاث إلى أن مقاومة الأنسولين في خلايا الكبد تؤدي إلى زيادة مستويات الأحماض الدهنية الحرة ، وبالتالي تكوين الدهون الثلاثية المخزنة داخل الكبد14,15.

استخدم الباحثون كلا من النماذج في الجسم الحي وفي المختبر لمحاكاة ترسب الدهون في MASLD. ومع ذلك ، فإن تكرار آليتها المرضية بالكامل لا يزال يمثل تحديا. على الرغم من هذا القيد ، كانت هذه النماذج مفيدة في دراسة الأهداف العلاجية المحتملة ل MASLD. ومع ذلك ، فإن تطوير نموذج مستقر ل MASLD أمر بالغ الأهمية. في حين أن النماذج الحيوانية فعالة ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا ومكلفة ، مما يسلط الضوء على الاهتمام المتزايد بالنماذج الخلوية في المختبر . غالبا ما تستخدم هذه النماذج أحماض دهنية حرة مفردة أو متعددة مثل حمض الأوليك (OA) وحمض البالمتيك لإعادة إنشاء MASLD الناجم عن النظام الغذائي. من بين هذه ، غالبا ما يستخدم خط خلايا الورم الأرومي الكبدي البشري HepG2 لإنشاء نماذج خلوية في المختبر من MASLD.

يحفز تحريض الزراعة العضوية خلايا HepG2 لتكرار الترسيب الدهني المشابه ل MASLD ، وهي طريقة ذات تاريخ راسخ. كان الهدف من هذه الدراسة هو إثبات الجدوى ، وتلطيخ الزيت الأحمر O (ORO) ، ومحتوى الدهون ، ومستوى الدهون الثلاثية (TG) لخلايا HepG2 المعالجة ب 0.25 mM OA. كان الهدف من هذه التجربة هو تقديم مزيد من الأدلة لتطوير دراسات نمذجة MAFLD.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. ثقافة الخلية

  1. خلايا HepG2 المستزرعة في قوارير الثقافة التي تحتوي على وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) (يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين). الحفاظ على قوارير الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.

2. تأثير حمض الأوليك على صلاحية الخلية كما تم قياسه بواسطة مجموعة عد الخلايا -8

  1. قم بإذابة حجم معين من الزراعة العضوية في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لتحقيق تركيز 200 مللي مول. قم بتخزين المحلول في -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
  2. خلايا البذور HepG2 في صفيحة 96 بئرا بكثافة خلية 6 × 103 خلايا لكل بئر. أضف 100 ميكرولتر من DMEM إلى كل بئر. احتضان وزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ لمدة 24 ساعة. قسم خلايا HepG2 إلى مجموعتين:
    1. المجموعة الضابطة: إضافة وسط زراعة الخلية.
    2. مجموعة الزراعة العضوية: أضف الزراعة العضوية إلى وسط زراعة الخلايا لتحقيق تركيزات نهائية تبلغ 0.125 مللي مول و 0.25 مللي مول و 0.5 مللي مول و 1 مللي مول.
  3. بعد 24 ساعة من الحضانة الأولية ، تخلص من المادة الطافية من كل بئر وأضف الزراعة العضوية وفقا للتجميع المحدد ، مضيفا 100 ميكرولتر لكل بئر. بالنسبة للمجموعة الضابطة ، أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر. استمر في احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى.
    ملاحظة: تأكد من أن كل مجموعة لديها ستة آبار مكررة. لمنع التبخر ، أضف 100 ميكرولتر من المياه المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS) إلى الحلقة الخارجية للآبار في لوحة 96 بئرا.
  4. بعد 24 ساعة من الحضانة ، أضف 10 ميكرولتر من مجموعة عد الخلايا -8 (CCK-8) إلى كل بئر ، واخلطها برفق ، واحتضانها لمدة 2 ساعة في الظلام. قم بإزالة لوحة 96 بئرا من الحاضنة ، وضعها في قارئ الصفيحة الدقيقة ، وقم بقياس قيمة الامتصاص عند 450 نانومتر (A450). تم حساب قيم GI50 وفقا ل OD.

3. تلطيخ الزيت الأحمر O لمراقبة تكوين قطرات الدهون داخل الخلايا

  1. خلايا البذور HepG2 في ألواح استزراع الخلايا المكونة من 6 آبار بكثافة 5 × 105 خلايا لكل بئر وزراعة الألواح في حاضنة ذات درجة حرارة ثابتة لمدة 24 ساعة. ارجع إلى الشكل 1 للحصول على تمثيل مرئي للخطوات الموصوفة.
  2. بعد 24 ساعة من زراعة الخلايا ، أضف 2 مل من وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على الزراعة العضوية إلى كل بئر ، وتحقيق تركيزات نهائية تبلغ 0.125 مللي مول و 0.25 مللي متر و 0.5 مللي مول و 1 مللي مول. بعد 24 ساعة إضافية ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من كل بئر واغسله مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 1 مل من مثبت ORO إلى كل بئر واحتضانها لمدة 30 دقيقة.
  3. تحضير محلول تلطيخ ORO عن طريق خلط محلول التلوين A مع محلول التلوين B بنسبة 3: 2. اترك الخليط يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم قم بترشيحه مرة واحدة من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. قم بتخزين المحلول المصفى في أنبوب طرد مركزي محمي من الضوء حتى الاستخدام.
  4. تخلص من المثبت واغسله مرتين بالماء المقطر. أضف 1 مل من الأيزوبروبانول بنسبة 60٪ إلى كل بئر واحتضانها لمدة 30 ثانية. تخلص من 60٪ من محلول الأيزوبروبانول وأضف 1 مل من محلول البقع ORO الطازج إلى كل بئر قبل الحضانة لمدة 20 دقيقة. تخلص من محلول تلطيخ ORO ، وأضف 1 مل من 60٪ إيزوبروبانول إلى كل بئر ، واحتضن لمدة 30 ثانية. اغسل 5 مرات بالماء لإزالة الصبغة الزائدة.
  5. قم بتغطية الخلايا بالماء المقطر ولاحظها تحت المجهر. بمجرد جمع الصور ، تخلص من السائل الموجود في اللوحة واتركه حتى يجف. ثم أضف 2 مل من الأيزوبروبانول إلى كل بئر وهز اللوحة على شاكر مداري لمدة 10 دقائق. نقل السائل إلى صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا ، مع 16 بئرا في كل مجموعة ، مع إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر. احسب محتوى الدهون عن طريق قياس الكثافة الضوئية (OD) لكل بئر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة عند 510 نانومتر (A510).

4. تأثير تركيزات مختلفة من حمض الأوليك على الدهون الثلاثية الكلية في طاف خلية HepG2

  1. قم بموازنة المجموعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة وقم بإعداد اللوحات المطلوبة للتجربة.
  2. جمع طافد الخلية وأجهزة الطرد المركزي في 1570 × غرام لمدة 10 دقائق. تعيين الآبار القياسية واختبار آبار العينات. أضف 50 ميكرولتر من التركيز القياسي ([S0 → S5] متبوعا ب: 0 ، 0.5 ، 1 ، 2 ، 4 ، 8 مليمول / لتر) إلى الآبار القياسية. بالإضافة إلى الآبار الفارغة والقياسية ، أضف 10 ميكرولتر من العينات المختلفة إلى آبار العينات ، متبوعة بإضافة 40 ميكرولتر من مخفف العينة إلى كل بئر. أضف 100 ميكرولتر من بيروكسيديز الأجسام المضادة والفجل للكشف إلى كل بئر ، وأغلقها بغشاء صفيحة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في فرن بدرجة حرارة ثابتة.
  3. تخلص من المادة الطافية ، وجففها على ورق خال من الغبار ، واغسل كل بئر بمحلول غسيل 1x. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. كرر عملية الغسيل 5x.
  4. أضف 50 ميكرولتر من الركيزة A و 50 ميكرولتر من الركيزة B إلى كل بئر. تخلط برفق وتحتضن لمدة 15 دقيقة على حرارة 37 درجة مئوية. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإنهاء إلى كل بئر وقم بقياس قيمة OD لكل بئر عند 450 نانومتر (A450) في غضون 15 دقيقة.
  5. ارسم تركيز المعيار على طول المحور السيني وقيمة الامتصاص المقابلة (OD) على طول المحور ص لإجراء الانحدار الخطي واشتقاق معادلة المنحنى لحساب قيمة تركيز كل عينة.

5. التحليل الإحصائي

  1. تحديد الاختلافات ذات الدلالة الدلالة في البيانات الكمية.
  2. احسب متوسط الانحراف المعياري (SD) ± وتمثيل البيانات بيانيا. اعتبر P < 0.05 ذا دلالة إحصائية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تأثير حمض الأوليك على صلاحية الخلية
تعرضت خلايا HepG2 لتركيزات متفاوتة من الزراعة العضوية (0 mM ، 0.125 mM ، 0.25 mM ، 0.5 mM ، 1 mM) ، مما أدى إلى انخفاض في معدلات بقاء الخلايا عند 0.125 mM و 0.25 mM و 0.5 mM و 1 mM مقارنة ب 0 mM. لوحظت دلالة إحصائية عند 0.5 mM (P < 0.05) و 1 mM (P < 0.05) عند مقارنتها ب 0 mM. تظهر نتائج تأثير الزراعة العضوية على صلاحية الخلية ، كما تم تقييمها بواسطة مجموعة CCK-8 ، في الشكل 2. تم حساب قيمة GI50 لخلايا HepG2 المعالجة ب OA على أنها 1.875 mM.

تلطيخ الزيت الأحمر O لمراقبة تكوين قطرات الدهون داخل الخلايا
تلطيخ ORO هو طريقة شائعة الاستخدام لتصور الدهون16,17. وبالتالي ، لوحظ تكوين قطرات الدهون في خلايا HepG2 المحتضنة مع OA لمدة 24 ساعة تحت المجهر بعد تلطيخ ORO. كما هو موضح في الشكل 3 والشكل 4 ، كانت شدة التلوين الأحمر في الخلايا المعالجة بهشاشة العظام أعلى منها في الخلايا غير المعالجة. كانت قطرات الدهون الحمراء موجودة في بلازما خلايا HepG2 بعد معالجة الزراعة العضوية ، مع زيادة كميات قطرات الدهون والدهون مع ارتفاع تركيزات الزراعة العضوية (الشكل 5).

تأثير تركيزات مختلفة من حمض الأوليك على الدهون الثلاثية الكلية في طاف خلية HepG2
كشفت النتائج التجريبية ، كما هو موضح في الشكل 6 ، أنه بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، فإن معالجة خلايا HepG2 بتركيزات متفاوتة من OA (0.125 mM ، 0.25 mM ، 0.5 mM ، 1 mM) أدت إلى زيادة كبيرة في محتوى TG للخلية الطافية في مجموعة OA (P < 0.05).

figure-results-1
الشكل 1: مخطط التدفق لتلطيخ الزيت الأحمر O. الاختصارات: الزراعة العضوية = حمض الأوليك. OD = الكثافة الضوئية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تأثير حمض الأوليك على صلاحية الخلية ، تم تقييمه باستخدام مقايسة مجموعة عد الخلايا -8. يمثل كل شريط متوسط ± SD (n = 6). * P < 0.05. اختصار: الزراعة العضوية = حمض الأوليك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: صور تلطيخ Oil Red O لنقاط زمنية متعددة (اتجاهات الساعة 3 و 6 و 9 و 12). تم الكشف عن تكوين قطرات الدهون باستخدام مجهر مقلوب لزراعة الخلايا عند تكبير 40x. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تأثير حمض الأوليك على قطرات الدهون في الخلايا ، تم تقييمه من خلال تلطيخ Oil Red O. تم الكشف عن تكوين قطرات الدهون باستخدام مجهر مقلوب لزراعة الخلايا عند تكبير 40x. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تأثير حمض الأوليك على محتوى الدهون في الخلايا، مقيسا بقيمة الكثافة الضوئية. يتم عرض تغييرات الطيات النسبية في قيم الكثافة الضوئية في مجموعات مختلفة. يمثل كل عمود متوسط ± SD (n = 16). * P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تأثيرات التركيزات المختلفة لحمض الأوليك على مستويات الدهون الثلاثية الكلية في طاف خلية HepG2. يتم عرض تغييرات أضعاف النسبية في قيمة مستويات الدهون الثلاثية في مجموعات مختلفة. يمثل كل عمود متوسط ± SD (n = 3). * P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MASLD هي متلازمة سريرية مرضية تتميز بترسب الدهون المفرط داخل الخلايا في خلايا الكبد بسبب عوامل تتجاوز الكحول وغيرها من العوامل الضارة بالكبد18. يرتبط MASLD بشكل معقد بإصابة الكبد بالإجهاد الأيضي المكتسب ، ولا سيما المرتبطة بمقاومة الأنسولين والقابلية الوراثية. لدراسة الأدوية وفحصها بشكل فعال ل MASLD ، من الأهمية بمكان اختيار نموذج تجريبي مناسب. يعد إنشاء نموذج خلوي أمرا حيويا بشكل خاص في أبحاث MASLD ، مما يسهل فهما أعمق للآليات المرضية وتقييم تأثيرات الأدوية الجديدة.

يصف هذا البروتوكول نموذجا في المختبر ل MASLD تم إنشاؤه من خلال خلايا HepG2 المستحثة بهشاشة العظام. يعمل تلطيخ ORO وتحليل محتوى الدهون كطرق مهمة لإنشاء هذا النموذج. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تقييم صلاحية الخلية ومحتوى TG الكلي في طافات الخلايا أمرا ضروريا لتقييم تركيز الزراعة العضوية المناسب. يتضمن المعيار التشخيصي ل MASLD وجود أكثر من 5٪ TG مخزنة في خلايا الكبد19,20. تعتمد نماذج خلايا MASLD بشكل أساسي على خلايا HepG221،22،23،24،25،26،27،28 ، والمعروفة باستخدامها الناجح في بناء نماذج تنكس الكبد الدهني في مختلف الدراسات المحلية والدولية. على الرغم من نشأتها من خلايا الورم الكبدي ، تشترك خلايا HepG2 في العديد من الخصائص المظهرية مع خلايا الكبد ويمكن زراعتها ونشرها بسهولة29,30. تقدم اختبارات مثل مجموعة CCK-8 ، وتلطيخ ORO ، ومحتوى الدهون ، وقياسات TG الكلية طرقا بسيطة وموضوعية ومعقولة لتقييم صلاحية الخلية وتراكم الدهون ومحتوى الدهون في موضوعات الدراسة. في هذا السياق ، يتماشى الزراعة العضوية مع التسبب في MASLD31 ، حيث يتم تخزين الطاقة الزائدة في شكل دهون عندما يتجاوز استهلاك الطاقة الاستهلاك.

استخدم الباحثون OA23،28،31،32،33 ، وحمض البالمتيك34،35 ، ومجموعات من حمض الأوليك / النخيل26،36 لتكرار نموذج MASLD. يساهم كل من حمض النخيل و OA في تنكس الكبد الدهني وتراكم TG. يظهر حمض البالمتيك ، وهو أكثر الأحماض الدهنية المشبعة وفرة في جسم الإنسان ، سمية دهنية كبيرة ، مما يؤدي إلى تراكم الدهون في خلايا الكبد ، وزيادة جذور الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، وموت الخلايا أو نخرها37. على العكس من ذلك ، يؤدي الزراعة العضوية إلى ترسب TG داخل الخلايا بشكل أكثر وضوحا (الشكل 6) وتعديل خلوي أقل38. وبالتالي ، غالبا ما يستخدم الباحثون خلايا HepG2 التي يسببها OA لإنشاء نماذج MASLD في المختبر . كما هو موضح في خطوة البروتوكول 2.2.2 ، من الضروري تسخين محلول الزراعة العضوية عند إضافته. في هذه الدراسة ، استند تلطيخ ORO وتحليل محتوى الدهون إلى ترسب الدهون لخلايا HepG2 ، مما يدعم بشكل فعال استكشاف النماذج المختبرية ل MASLD بآليات معقدة وتقليل الوقت والتكلفة اللازمين للبحث.

يرتبط ORO بسهولة ب TG في شكل قطرة ، مما ينتج عنه تلطيخ برتقالي إلى أحمر يدل على الدهون ، مع كثافة اللون اعتمادا على تركيز الدهون. ومع ذلك ، فإن محلول تلطيخ ORO غير مستقر وعرضة لهطول الأمطار ، مما يجعله غير مناسب للتحضير مسبقا. لذلك ، تم تحضير محلول تلطيخ ORO بعد الخطوة 3.2 من البروتوكول ، مع اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب التعرض للضوء أثناء التحضير والحضانة (خطوات البروتوكول 3.2 ، 3.3). في الخطوة 3.5 من البروتوكول ، يمثل تحديد الصور في نقاط زمنية متعددة (اتجاهات الساعة 3 و 6 و 9 و 12) تعديلا رئيسيا للتجربة وهو أمر ضروري لتحسين دقة النتائج. على الرغم من أن تركيزات الزراعة العضوية المرتفعة تؤثر على بقاء الخلية ، مما يمثل قيودا على هذه الطريقة ، فقد ثبت أن تركيز الزراعة العضوية المناسب يضمن بقاء الخلية.

استخدمت هذه الدراسة نهجا شاملا ، باستخدام مجموعة CCK-8 ، وتلطيخ ORO ، وتحليل محتوى الدهون ، وقياس TG الكلي لإنشاء نموذج MASLD والتحقق من صحته. تم استخدام مجموعة CCK-8 لتقييم تأثير الأدوية على صلاحية الخلية ، حيث كانت بمثابة خطوة تحقق حاسمة. في المستقبل ، يحمل هذا النموذج وعدا لفحص الأدوية وأبحاث الآلية التي تهدف إلى فهم التسبب في MASLD وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة. لمزيد من ضمان جودة موثوقية التحقق ، سيتم تحليل مستويات التعبير للبروتينات المستهدفة المتضمنة في النموذج باستخدام النشاف الغربي وتحليلات تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم منح الدراسة الحالية من قبل "دراسة حول القضايا الرئيسية للتأثير العلاجي ل Koumiss على الأمراض الإقليمية للطب المنغولي" في عام 2018 المشروع المدعوم لبرنامج العلوم والتكنولوجيا التابع لقسم العلوم والتكنولوجيا في منطقة منغوليا الداخلية ذاتية الحكم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 وميكرو ؛ مرشح مميليكس
0.25٪ تريبسين-EDTA (1x) Trypsin-EDTAGibco25200-056
0.45 & micro ؛ م فلترميليكس
2 مل قوارير مبردةكورنينج430659
25 سم < سوب > 2 < / سوب> قارورة ثقافة الخليةكورنينج430639
لوحة ثقافة الخلايا 6 آباركورنينج3516
لوحة ثقافة الخلايا 96 بئركورنينج3599
لوحة تعداد الدمشنغهاي جينغ جينغ كاشف الكيمياء الحيوية & شركة الصكوك02270113
فحوصات مجموعة عد الخلايا -8Beijing Solarbio Science & شركة التكنولوجيا المحدودة CA1210-1000T
CO2< / sub> حاضنةNUAIRENU-5710E
& nbsp ؛ DMSO ثنائي ميثيل سلفوكسيد   ;بكين سولاربيو للعلوم & شركة التكنولوجيا المحدودة D8371
وضع العلامات على الإنزيم
Fetal Bovine المصل ، خطGibco10099141
HepG2المؤهل ، معهد أبحاث التكنولوجيا الحيوية Chuanglian بكين شمال الصين (BNCC)221031
تعليماتمعهد نانجينغ جياتشنغ للهندسة الحيوية20170301
مجهر مقلوب لثقافة الخليةLeicaDMi1 & nbsp ؛
الأيزوبروبانولتيانجين Zhiyuan الكاشف الكيميائي المحدودة2021030141
طقم البقع الحمراء للزيت ، للخلايا المستنبتة BeijingSolarbio Science & شركة التكنولوجيا المحدودة G1262
حمض الأوليك  سانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA502071
البنسلين ستربتومايسينجيبكو15140122
SPSS 24.0الإحصاء
معدات 8122691 النسر المتوسط المعدل من Dulbecco مصل Tecan Spark خلايا الدهون الثلاثية البشرية (TG) ELISA برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).
  2. Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).
  3. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).
  4. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  5. European Association for the Study of the Liver (EASL); European Association for the Study of Diabetes (EASD); European Association for the Study of Obesity (EASO). EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).
  6. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  7. Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).
  8. Cotter, T. G., Rinella, M. Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease. Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).
  9. Lonardo, A., et al. Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation. Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).
  10. Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts. Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).
  11. Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide. Nutrients. 9 (10), 1072(2017).
  12. Wieckowska, A., Feldstein, A. E. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).
  13. Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status. Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).
  14. Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  15. Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).
  16. Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution. Adipocyte. 12 (1), 2179334(2023).
  17. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).
  18. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  19. Watkins, P. A., Ellis, J. M. Peroxisomal acyl-CoA synthetases. Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).
  20. Heeren, J., Scheja, L. Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism. Mol Metab. 50, 101238(2021).
  21. Kim, S. H., et al. Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Molecules. 28 (3), 1476(2023).
  22. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  23. Li, J., et al. Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD. Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).
  24. Li, Y., et al. Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway. Biomed Pharmacother. 160, 114319(2023).
  25. Liu, H., et al. Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287(2023).
  26. Mun, J., et al. Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 11 (10), 2536(2019).
  27. Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Nutrients. 11 (3), 494(2019).
  28. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomed Pharmacother. 118, 109287(2019).
  29. Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. Exp Ther Med. 11 (2), 1487-1492 (2016).
  30. Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells. Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).
  31. Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15489(2022).
  32. Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function. Nutrients. 11 (3), 541(2019).
  33. Tie, F., et al. Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells. Int J Mol Sci. 22 (16), 8847(2021).
  34. Fang, K., et al. Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells. BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255(2019).
  35. Wu, X., et al. MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis. J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).
  36. Scavo, M. P., et al. The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway. Cell Death Dis. 14 (9), 635(2023).
  37. Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol. 12, 20(2012).
  38. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HepG2Oil Red O

مقالات ذات صلة