مقالة منهجية

سير عمل على شبكة الإنترنت لاختيار المعززات الخاصة بالجينات والأنسجة

DOI:

10.3791/66840

⸱

يوليو 18, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 3Stem Cell Medicine Department, Murdoch Children's Research Institute, The Royal Children's Hospital, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine, reNEW Melbourne, Murdoch Children's Research Institute, 5Systems Biology Institute (SBI) Australia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم سير عمل خال من الترميز لعلماء الأحياء لتحديد المعززات الجينية الخاصة بالأنسجة باستخدام الأدوات المستندة إلى المتصفح فقط. يستفيد بروتوكولنا من علامات الهيستون العامة H3K4me1 / H3K27ac وبيانات Hi-C ، مما يمكن الباحثين الذين ليس لديهم خبرة في البرمجة من الوصول إلى العناصر التنظيمية المحتملة المرتبطة بجيناتهم التي تهمهم وتحليلها وتحديدها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعززات هي مناطق الحمض النووي التي تنظم التعبير الجيني. يمكن أن تؤدي الطفرات داخل المعززات إلى تنظيم جيني غير طبيعي يؤدي إلى المرض. لذلك ، فإن تحديد المعززات التي تنظم نشاط الجينات في أنسجة معينة أمر بالغ الأهمية لفهم الأساس الجيني للمرض. ومع ذلك ، يصعب تحديد المعززات لأنها لا تشفر البروتينات. في حين تتوفر العديد من مستودعات المحسن وأدوات تحديد الهوية ، فإن تعقيد هذه الأدوات يمكن أن يمثل تحديا لعلماء الأحياء. لتسهيل استخدام علماء الأحياء لهذه الموارد ، نقدم بروتوكولا صديقا لعلماء الأحياء (https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow) يستفيد من بيانات الجينوم الحالية المستندة إلى الويب مثل علامات هيستون H3K4me1 و H3K27ac وبيانات تحليل تشكل الكروماتين (Hi-C) لاكتشاف المعززات المرتبطة بالجين ذي الأهمية (GoI) في الأنسجة المستهدفة حيث يكون المحزن نشطا. يعتمد هذا البروتوكول بالكامل على الويب ولا يتطلب مهارات برمجة من المستخدمين النهائيين. لقد أظهرنا فائدة هذا النهج من خلال توصيف المعززات المرشحة التي تنظم TBX5 ، وهو جين بالغ الأهمية لنمو القلب. يسهل هذا البروتوكول تحديد المعززات المرتبطة بهذا الجين في البطين الأيسر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعززات هي مناطق الحمض النووي غير المشفرة التي تنظم نسخ الجينات وتطورها وتمايزها الخلوي1،2. يمكن أن تؤدي طفرة المعززات إلى أمراض مختلفة ، بما في ذلك اضطرابات النمو والسرطانات والحالات الوراثية الأخرى3،4،5،6. لذلك ، فإن فهم المعززات أمر بالغ الأهمية لفهم التعبير الجيني والطفرات والأمراض.

لفهم كيفية تفاعل المعززات مع جيناتها المستهدفة ، من المهم تحديد مواقعها داخل الجينوم. ومع ذلك ، فإن تحديد مواقع المحسن ليس دائما أمرا سهلا حيث يمكن وضع المعززات بالقرب من موقع بدء النسخ (TSS) وأبعد بكثير ، وتمتد من عشرات إلى مئات الكيلو قواعد2،7،8،9.

على الرغم من موقعها الجيني غير المتوقع ، تظهر المعززات توقيعات كيميائية حيوية وهيكلية مميزة ، مما يسمح بتتبعها بشكل منهجي. بشكل عام ، تميل المعززات إلى الإثراء في المناطق بين الجينات والمناطق الداخلية ، مع وجود عدد صغير داخل exons2،8. غالبا ما يتم تمييزها بتعديلات هيستون محددة وربط عامل النسخ ، والتي تحدد أدوارها التنظيمية وتحدد نشاطها المكاني والزماني عبر مراحل النمو والأنسجة المختلفة10،11.

يستخدم ChIP-seq لتحديد مواقع ربط عامل النسخ (TFBSs) وعلامات تعديل الهيستون ، مثل السمة المميزة للمعززات ، H3K4me1 ، علامات التحسين النشطة ، H3K27ac ، و H3K4me3 ، والتي يتم إثرائها في مناطق المروج1،12،13،14،15. تستخدم تقنيات التقاط تشكل الكروماتين (3C) ومشتقاتها ، مثل 4C و 5C و Hi-C و ChIA-PET ، لرسم خريطة للتفاعلات الفيزيائية بين المناطق الجينومية البعيدة. بينما يستهدف 3C تفاعلات محددة في أنسجة معينة ، يوفر Hi-C بنية على مستوى الجينوم عبر أنواع الخلايا16،17.

بالإضافة إلى الأساليب الحالية ، تم تطوير مناهج متخصصة لتوصيف المعززات ، بما في ذلك قواعد بيانات المحسن المجمعة ، مثل EnhancerAtlas أو EnhancerFinder18،19. ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الأدوات من الباحثين دمج مجموعات بيانات متعددة للتحقيق في معززات متعددة عبر العديد من الأنسجة ، والتي يمكن أن تكون مربكة لعلماء الأحياء الذين ليس لديهم خبرة في المعلوماتية الحيوية واستخراج البيانات.

هنا ، نصف بروتوكولا سهل الاستخدام لتحديد المعززات ، استنادا بالكامل إلى أدوات الويب الحالية. يسمح هذا للباحثين بالاستعلام عن الجين المعني (GoI) واسترداد المعززات المقابلة. يختار البروتوكول هنا المعززات بناء على مجموعة محددة من المعايير: تعديلات هيستون ، وتفاعلات الكروماتين ، وخصوصية الأنسجة1،12،13،14،15،16،17،20،21. من المرجح أن تظهر المعززات الموجودة داخل الإنترونات نشاطا خاصا بالأنسجة مقارنة بالمعززات بين الجينات ، والتي يتم وضعها في المناطق الجينومية بين الجينات22. لضمان تغطية شاملة للمعززات النشطة المحتملة ، حددنا نطاق البحث بين اثنين من GoIs المتجاورين لزيادة احتمالية التقاط العناصر التنظيمية الموجودة خارج أجسام الجينات. استخدمنا السمة المميزة للجينة اللاجينية الخاصة بالمحسن ، H3K4me1 ، وعلامة محسن نشطة ، H3K27ac ، لإدراج المرشحين المحسنين. ثم تم تنقيح هؤلاء المرشحين بناء على بيانات Hi-C ، مع الاحتفاظ بالمعززات ذات التفاعلات المادية مع المروج المقابل. تم تصميم هذا البروتوكول لتوجيه علماء الأحياء خلال عملية تحديد المحسن باستخدام الأدوات المستندة إلى الويب المتاحة للجمهور فقط. من خلال دمج بيانات تفاعل الوراثة والكروماتين ، يقدم النهج الموصوف هنا إطارا عمليا لتوليد فرضيات حول المعززات المحتملة لمزيد من التحقق من صحة التجربة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تتوفر إرشادات تفصيلية خطوة بخطوة في https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow. يتم تلخيص البيانات المستخدمة في البروتوكول في الجدول 1 والجدول 2. تتوفر استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الملف التكميلي 1.

1. تحديد موقع الحكومة العراقية (الشكل 1)

  1. افتح متصفح الجينوم EnsEMBL (https://www.EnsEMBL.org).
  2. اختر مجموعة الجينوم المناسبة التي تتوافق مع الأنواع والإصدار.
  3. أدخل GoI في حقل البحث وانقر فوق انتقال.
  4. حدد الارتباط إلى معرف جين EnsEMBL المناسب.
  5. انقر فوق الارتباط إلى عارض علامة تبويب المنطقة في التفاصيل ، الموجود أسفل قسم الملخص، للتنقل في المنطقة المحيطة ب GoI.

2. تحديد منطقة الكشف عن المحسن (الشكل 2)

  1. حدد الجينين المجاورين لحكومة الهند لتحديد منطقة الكشف. استخدم مسار Gene Legend للبحث عن هذه الجينات ، والتي يتم شرحها كعناصر مرئية متعلقة ب EnsEMBL / Havana المدمجة في التعليقات التوضيحية الجينية الأساسية من مسار GENCODE . حدد اتجاه GoI من خلال علامات < و > على اسم الجين المناسب في مسار GENCODE.
  2. انقر واسحب لتحديد المنطقة بين الجينات بين هذه الجينات ، وانقر فوق الانتقال إلى المنطقة في المربع المنبثق لتصور المنطقة المحددة. أعد تعريف منطقة الاهتمام في أي وقت بتكرار هذه الخطوة.
  3. (اختياري) قم بتخصيص الشاشة عن طريق تحديد إضافة/إزالة المسارات في الجزء العلوي من عارض المسار. قم بتعديل مستوى التكبير/التصغير باستخدام عناصر التحكم في التكبير/التنقل/التنقل أعلى عارض المسار.

3. تحليل علامة هيستون (الشكل 3)

  1. في الشريط الجانبي لعارض علامة التبويب المنطقة بالتفاصيل ، حدد تكوين هذه الصفحة.
  2. في الشريط الجانبي لشاشة علامة التبويب تكوين صورة المنطقة ، ضمن القائمة المنسدلة التنظيم ، حدد النشاط حسب الخلية/الأنسجة.
  3. استخدم شريط البحث في الخلية / الأنسجة للبحث عن الأنسجة التي تهمك وتحديدها. بدلا من ذلك ، استخدم شريط التنقل الأبجدي أسفل شريط البحث للعثور على الأنسجة ذات الأهمية.
  4. حدد علامة التبويب التجارب ، بجوار الخلية/الأنسجة.
  5. حدد H3K4me1 و H3K27ac كعلامة على المعززات ، و H3K4me3 كعلامة على المروجين.
  6. حدد تكوين عرض المسار.
  7. حدد عرض المسارات لتصور المناطق التي تحمل علامة H3K4me1 في منطقة اكتشاف المحسن والمناطق التي تحمل علامة H3K4me3 في مقدمة المنبع من GoI.
  8. بالنسبة للمرشحين للمحسن ، استرجع إحداثيات المناطق الجينومية المميزة ب H3K4me1 داخل مناطق الكشف المحددة من خلال النقر على العناصر المرئية / المربعة الملونة في مسارات H3K4me1 المضافة حديثا. يكشف هذا عن النافذة المنبثقة "Hists & Pols" ، والتي تحتوي على معلومات عن الموقع الجيني للعنصر في زوج القاعدة (bp).
    1. استرجع مرشحي المحسن النشط عن طريق اختيار مناطق H3K4me1 حيث تتداخل العناصر المرئية / الصندوقية الملونة لكل من H3K4me1 و H3K27ac. قد تؤثر دقة مستوى التكبير/التصغير على عدد مرشحي المحسن الموضحين في هذا المسار.
    2. بدلا من ذلك ، حدد يدويا مناطق الاهتمام لكل ميزة جينومية عن طريق النقر والسحب على المسار لتغليف قمم الرسم البياني تحت مسار H3K4me1 / H3K27ac. انسخ إحداثيات الموقع الجينومي في ملف نصي واحفظه بتنسيق .bed .
  9. وبالمثل، بالنسبة لمناطق المروج، قم بتكرار الخطوة 3.8 باستخدام مسار H3K4me3، مع التركيز على المنطقة الأولية من GoI.

4. تحليل التقاط تشكل الكروماتين (Hi-C) (الشكل 4)

  1. قم بالوصول إلى بوابة بيانات 4DN (https://data.4dnucleome.org/). في المخطط الشريطي الرئيسي المكدس للصفحة الرئيسية ل 4DN (الشكل 5)، تأكد من تحديد مجموعات التجارب كمحور Y ، ويتم تحديد نوع التجربة كمحور X ، ويتم تجميع المخطط حسب الكائن الحي.
  2. على طول المحور X للمخطط الشريطي الرئيسي ، أوجد شريط Hi-C في الموقع. انقر فوق جزء الشريط الذي تم تجميعه لمجموعات التجارب البشرية ثم انقر فوق الزر "استعراض" في النافذة المنبثقة. قم بتصفية مجموعات البيانات ذات الصلة باستخدام اللوحة الجانبية اليسرى.
  3. انقر فوق الرابط الموجود في عمود العنوان في العينة الحيوية ذات الصلة للأنسجة ذات الأهمية.
  4. انقر فوق استكشاف البيانات في علامة التبويب الملفات المعالجة لاستكشاف مجموعة بيانات Hi-C بمزيد من التفاصيل.
  5. أدخل إحداثيات المحفز المحدد في الأنسجة محل الاهتمام (من الخطوة 3.9) وحدد المنطقة أفقيا بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق خريطة الحرارة (الشكل 4). تضمن الخطوط المضافة تتبع منطقة المروج بصريا عبر خريطة التمثيل اللوني. قم بإزالة الخطوط العرضية بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الخط وتحديد القاعدة الأفقية/الرأسية وإغلاق السلسلة.
  6. أدخل إحداثيات جميع معززات التحكم التي تم التحقق من صحتهاتجريبيا 23 لحساب عتبة التفاعل بناء على الحد الأدنى لها. تم التأكيد مسبقا على تفاعل معززات التحكم هذه مع منطقة المروج ، وتعمل كمعايير لتحديد الحد الأدنى من التفاعل المهم.
  7. حدد عتبة المحفز والمحسن ، باستخدام معززات التحكم ، بناء على أدنى درجة تفاعل غير صفرية وفقا لمفتاح اللون على الجانب الأيمن من المصفوفة.
  8. أدخل الإحداثيات الجينومية لجميع المناطق المرتبطة ب H3K4me1 (من الخطوة 3.8) وقم بتمييزها عموديا على خريطة الحرارة Hi-C. يسمح هذا بنمط التحقق المتقاطع ، حيث يمكن فحص التقاطع بين المعززات التي تحمل علامة H3K4me1 (رأسيا) ومنطقة المروج (الأفقية) بحثا عن تفاعلات كبيرة.
    1. بعد ذلك ، قم بتصفية المناطق ذات التفاعل الضعيف من خلال مقارنة درجات التفاعل للمناطق التي تحمل علامة H3K4me3 مع عتبة التفاعل (الخطوة 4.6).
    2. حدد الإحداثيات الجينومية التي تظهر ترددات تفاعل أعلى من العتبة المحددة في خريطة الحرارة لبوابة 4DN. تظهر هذه المناطق كإشارات أكثر تركيزا (أكثر قتامة) في خريطة التمثيل اللوني، وحفظها بتنسيق BED.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوضيح استخدام البروتوكول المقدم ، قمنا بالتحقيق في جين TBX5 في قلب الإنسان ، واستكشاف المعززات المرتبطة ب TBX5 باستخدام سير العمل الشامل الذي يتضمن بيانات H3K4me1 و H3K27ac و Hi-C. TBX5 هو جين يساهم في نمو الأطراف والقلب ، بما في ذلك تكوين الغرف الأربع وفصل الحاجز24. الطفرة في هذا الجين هي السبب الرئيسي لمتلازمة هولت أورام (HOS) ، والتي تسبب تشوهات الأطراف وأمراض القلب الخلقية (CHD) ، بما في ذلك عيوب الحاجز24. قد تؤثر طفرة معززات القلب المرتبطة ب TBX5 بشكل حاسم على CHD24. اكتشفت دراسة سابقة ثلاثة معززات TBX5 معروفة في الأنسجة البشرية الخاصة بالقلب - وهي "Enhancer 2" و "Enhancer 9" و "Enhancer 16" (الملف التكميلي 2) ، والتي ثبت أن لها أنماطا ظاهرية مقارنة في الفئران المعدلةوراثيا 23.

لقد حققنا في المناطق المخصبة ب H3K4me1- و H3K27ac بين RBM19 و TBX3 ، وهما جينان مرافقان في اتجاه مجرى النهر وأعلى TBX5 في الإنسان ، لاسترداد المعززات المفترضة في موضع TBX5 (الشكل 1 والشكل 2). لتحديد المعززات الخاصة بالقلب ، تم اختيار خلايا عضلة القلب. تم استرداد مناطق محسن القلب TBX5 المفترضة كإحداثيات (chr12: البداية والنهاية) ، وتم تحديد 22 منطقة مرتبطة ب H3K4me1- و H3K27ac (الشكل 3 والملف التكميلي 3). تم استرداد معززات القلب المفترضة TBX5 من قاعدة بيانات الجينوم EnsEMBL للرجوع إلى بيانات Hi-C المحفوظة في قاعدة بيانات 4DNucleome (الشكل 4). تم ذلك لقياس التفاعلات المحتملة بين المعززات المحتملة ومحفز القلب TBX5 . باتباع البروتوكول الموضح هنا ، تم تأكيد تفاعل 21 من أصل 22 منطقة جينومية مع محفز TBX5 (chr12: 114400143-114410103) في خلايا عضلة القلب (الملف التكميلي 4). كانت هناك منطقة واحدة لم يكن لها تفاعل جسدي مع المروج (الشكل 4 ، الخطوة 4.8). أخيرا ، قارنا هذا البروتوكول مع هذه المعززات التي تم التحقق من صحتها بيولوجيا وقاعدة البيانات القياسية الذهبية الحالية لمحسنات القلب ، متصفح VISTA Cardiac Enhancers ، وكشفنا عن معززات إضافية لم يتم التقاطها حاليا بواسطة قاعدة البيانات25.

أجرينا مقارنة بين 21 محسنات TBX5 التي تم استردادها بواسطة البروتوكول المقدم هنا مع قواعد البيانات الموجودة. استرجعنا 4 معززات TBX5 من متصفح VISTA Cardiac Enhancer (ملف تكميلي 5) 25. من بين 4 معززات للقلب التي تم تحديدها بواسطة VISTA ، تداخلت 3 معززات ، hs2329 و mm1282 و m370 مع المناطق التي حددها بروتوكول الكشف عن المحسن المستند إلى الويب (الشكل 5). شارك كل من المعززات المتوقعة أيضا المناطق الجينومية مع المعززات التي تم التحقق من صحتها تجريبيا مسبقا من Smemo et al.23 ، Enhancer 2 (chr12: 114025907-114026275 ، GRCh38) ، و Enhancer 16 (chr12: 114415466-114420433 ، GRCh38) ، بينما لم تظهر تداخلا مع Enhancer 9 (chr12: 114263402-114266886 ، GRCh38). أحد المعززات التي تم تحديدها بواسطة VISTA ، لم يتداخل hs498 مع أي معززات متوقعة بواسطة هذا البروتوكول أو معززات Smemo et al. التي تم التحقق من صحتها تجريبيا23 (الشكل 5) ، على الرغم من أن المنطقة أظهرت تداخلا جزئيا مع علامات H34Kme1 (الشكل 5). وبالمثل ، لم يتداخل المحسن 9 مع المعززات المتوقعة بواسطة خط الأنابيب هذا ولكنه ارتبط بعلامات H3K4me1 (الشكل 5).

figure-results-1
الشكل 1: دليل خطوة بخطوة لتحديد موقع GoI في متصفح الجينوم EnsEMBL. يفتح المستخدم أولا صفحة EnsEMBL الرئيسية (1.1) ، ويختار الأنواع (الإنسان) ، ويدخل الجين في شريط البحث (1.2-1.3). من قائمة النتائج ، يتم تحديد معرف الجين المناسب (1.4) ، والذي يفتح صفحة ملخص الجينات. ثم ينقر المستخدم على الارتباط التشعبي للمنطقة بالتفصيل (1.5) لتصور المنطقة الجينومية المحيطة ب GoI، بما في ذلك العناصر المجاورة والميزات التنظيمية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحديد منطقة الكشف عن المحسن حول GoI باستخدام متصفح الجينوم EnsEMBL. لتحديد منطقة الكشف عن المحسن ، حدد الجينات المجاورة التي تحيط ب GoI باستخدام التعليقات التوضيحية الجينية الأساسية من مسار GENCODE ، حيث تظهر الجينات على شكل كتل صفراء داكنة مصنفة بشروح EnsEMBL / Havana المدمجة. يشار إلى اتجاه النسخ لكل جين بواسطة رؤوس الأسهم (< أو >) بجوار اسم الجين (2.1). لتحديد المنطقة بين الجينات بين الجينات المجاورة ، انقر واسحب عبر منطقة الاهتمام ، ثم اختر الانتقال إلى المنطقة في المربع المنبثق للتكبير (2.2). لإضافة تعليقات توضيحية تنظيمية أو متعلقة بالمحسن، انقر فوق إضافة/إزالة المسارات (2.3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تكوين مسارات تعديل الهيستون في منطقة الكشف عن المحسن باستخدام متصفح الجينوم EnsEMBL. في شريط الأدوات الأيسر، انقر فوق تكوين هذه الصفحة (3.1) للوصول إلى لوحة تكوين المسار والانتقال إلى "النشاط حسب الخلية/الأنسجة" ضمن قسم التنظيم (3.2). في علامة التبويب المفتوحة ، حدد قسم "التجارب" (3.3) ، واستخدم شريط البحث عن الخلية / الأنسجة لتحديد موقع الأنسجة التي تهمك (خلية عضلة القلب) وتحديدها (3.4). في لوحة علامة هيستون (3.5) ، قم بتمكين H3K4me1 و H3K27ac كعلامات تحسين نشطة و H3K4me3 كعلامة مروج ثم انقر فوق "تكوين عرض المسار" (3.6). بعد تأكيد تحديدات المسار ، انقر فوق "عرض المسارات" (3.7) للعودة إلى عارض الجينوم. تظهر قمم علامة الهيستون الآن في منطقة الكشف (3.8) ككتل ملونة تحت ملصق الأنسجة المقابل (الأصفر: H3K4me1 ، الأزرق: H3K27ac ، والبرتقالي: H3K4me3). النافذة المنبثقة "Hists & Pols" التي تحتوي على الإحداثيات الجينومية للمنطقة في أزواج القواعد (chr: start-end) ، والتي يمكن نسخها وحفظها لتحليلها في اتجاه المصب. تظهر نافذة منبثقة "Hists & Pols" بعد النقر على العناصر الملونة في المسار. تحتوي النافذة المنبثقة على الإحداثيات الجينومية للمنطقة في أزواج أساسية (على سبيل المثال ، chr12: 11443450-114451611 لمنطقة المروج) ، والتي يمكن نسخها وحفظها لتحليل المصب (3.8). وبالمثل ، لاستخراج معززات المرشح ، حدد أولويات المناطق التي تتداخل فيها قمم H3K4me1 و H3K27ac ، كما هو موضح في المحاذاة الرأسية للقمم والمربعات عبر المسارات (3.9). يمكن تحديد المناطق المتداخلة مباشرة عن طريق النقر فوق مربعاتها أو عن طريق النقر يدويا عبر القمم المحاذاة لتحديد منطقة (على سبيل المثال، chr12:114400143-114410103 لمنطقة مرشحة نشطة). يجب حفظ الإحداثيات الموضحة في النافذة المنبثقة بتنسيق BED للتحقق من صحة البيانات النهائية أو المرئيات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تصور تفاعلات الكروماتين المحفز باستخدام خرائط حرارية Hi-C من بوابة بيانات 4D Nucleome. تعرض الصفحة الرئيسية لمدخل بيانات 4D Nucleome مخططا شريطيا مكدسا يلخص أنواع التجارب المتوفرة حسب الكائن الحي. يتم تحديد مجموعة بيانات "في الموقع Hi-C" للعينات البشرية بالنقر فوق القسم المقابل من الشريط (4.1). يتم عرض قائمة تمت تصفيتها لمجموعات البيانات ذات الصلة ؛ يتم تحديد مجموعة بيانات Hi-C المشتقة من خلايا H9 المتمايزة إلى أرومات عضلية قلبية (4.2). يتم فتح مجموعة البيانات المحددة (4.3) في متصفح HiGlass عبر زر استكشاف البيانات (4.4). يتم إدخال المنطقة الجينومية ذات الاهتمام في مربع الإحداثيات (4.5) ، ويتم تقديم مصفوفة الاتصال كخريطة حرارية ذات حجم الألوان. تشير الألوان الداكنة (الأحمر الغامق إلى الأسود) إلى تردد تلامس أقوى للكروماتين ، بينما تمثل الألوان الفاتحة (الأبيض إلى البرتقالي) تفاعلات أضعف. يتم وضع قاعدة أفقية عند إحداثيات المروج ، ويتم رسم القواعد الرأسية في مواضع ثلاثة معززات تحكم تم التحقق من صحتها تجريبيا (4.6). تستخدم هذه التقاطعات لتحديد عتبة تفاعل صارمة ، يتم تحديدها بواسطة أقوى إشارة مرئية (أغمق لون) بين جهات اتصال المحفز والمحسن (4.7). يتم رسم قواعد رأسية إضافية في مواقع المعززات المرشحة H3K27ac و H3K4me1 (من الخطوة 3.8). يتم الاحتفاظ بالمرشحين الذين تكون تقاطعاتهم بين المحفز والمحسن مساوية أو أغمق من العتبة ، بينما يتم استبعاد أولئك الذين لديهم إشارات أضعف (مربعات ألوان أفتح) (4.8). يتم استخراج الإحداثيات المحتجزة يدويا وحفظها بنسق BED لتحليلات المصب. (أ. المحسن 2 ، ب. المحسن 9 ، ج. المحسن 16) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: عرض المتصفح الجينومي لمعززات TBX5 المتوقعة مقارنة بمعززات القلب ومعززات التحكم التي تم التحقق من صحتها من VISTA. تعرض لقطات متصفح الجينوم نطاق البحث عن المحسن (الخطوة 2) مقارنة المعززات المتوقعة التي تم استردادها بواسطة البروتوكول المستند إلى الويب (أسفل) مع المعززات التي تم التحقق من صحتها من قبل VISTA (أعلى) ومعززات التحكم التي تم التحقق من صحتها تجريبيا (الوسط). تظهر اللوحة الرئيسية الموضع الجيني الكامل مع العناصر التنظيمية المشروحة ، بما في ذلك قمم H3K4me1 الخاصة بخلايا عضلة القلب (أصفر) و H3K27ac (أزرق) و H3K4me3 (برتقالي). تلتقط ثلاثة أشكال مكبرة المحاذاة بين البروتوكول و Vista ومحسنات التحكم. يتم تحديد التداخل مع معززات التحكم بمربعات حمراء. يتم عرض الإحداثيات لكل منطقة فرعية في لوحات المتصفح السفلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: البيانات المستخدمة في الدراسة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: الأدوات المستندة إلى الويب المستخدمة في الدراسة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمتصفح الجينوم EnsEMBL. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: ملف BED بتنسيق GRCh38 ، معززات التحكم في القلب TBX5 التي تم التحقق من صحتها تجريبيا 23. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: ملف BED بتنسيق GRCh38 ، معززات القلب TBX5 التي تم استردادها بواسطة STEP3 من EnsEMBL. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: ملف BED بتنسيق GRCh38 ، معززات القلب TBX5 التي تم استردادها بواسطة STEP4 من EnsEMBL. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف تكميلي 5: ملف BED بتنسيق GRCh38 ، معززات القلب TBX5 التي تم استردادها من متصفح محسن القلب VISTA25. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعمل البروتوكول المستند إلى الويب الموصوف هنا كسير عمل لاسترداد المحسن، بدلا من التنبؤ بالمحسن. من خلال الاستفادة من مجموعات البيانات الخاصة بالأنسجة المتاحة للجمهور ، وتعديلات الهيستون (H3K4me1 و H3K27ac) ، وبيانات تفاعل Hi-C ، فإنه يضيق نطاق المعززات المحتملة المرتبطة ب GoI. على عكس أدوات التنبؤ الحسابي التي تعتمد على التعلم الآلي أو النماذج القائمة على التسلسل ، يركز نهجنا على استرداد المعززات بناء على البيانات التجريبية فقط. يتم توفير إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمتصفح الجينوم EnsEMBL في الملف التكميلي 1.

يدمج سير العمل هذا العناصر الرئيسية مثل علامات الهيستون وبيانات تفاعل الكروماتين ، على غرار الأساليب المتقدمة مثل ChIA-PET و PLAC-seq ، والتي ترسم تفاعلات المحزن والمروج بدقة أعلى10،11. ومع ذلك ، تكون هذه الطريقة مفيدة عندما تكون التقنيات التجريبية عالية الدقة غير مجدية ، حيث يكون البروتوكول أقل كثافة في استخدام الموارد ويوفر وقتا كبيرا.

يتمثل القيد الأساسي للنهج المعروض أعلاه في اعتماده على توافر وجودة مجموعات البيانات الحالية ، مما قد يؤثر على دقة التفاعلات المسترجعة. يتطلب التحقيق في نشاط المحسن أثناء تطور القلب في سياق الطفرات الجينية المرتبطة ب TBX5 حلا خاصا بالأنسجة. لمثل هذا التحليل ، سيكون نسيج القلب الجنيني هو الأنسب نظرا لأهميته للتنظيم التنموي. ومع ذلك ، لم تتضمن أي مجموعات بيانات جنينية بيانات تعديل الهيستون كانت متاحة للجمهور في وقت التحليل. لحساب ذلك ، يمكن لدمج الموارد البديلة مثل ENCODE أو Enhancer Atlas 2.0 أو EnhancerFinder توسيع فائدة خط الأنابيب من خلال توفير مجموعات بيانات إضافية لتحديد المحسن والتحقق من صحته18،19.

في TBX5 REPFIX ، كشف التحليل المستند إلى H3K4me1 عن 22 معززا مفترضا كنقطة انطلاق لمزيد من التحقيق. أظهر تحليل Hi-C اللاحق أن 21 من أصل 22 مرشحا محسن بناء على علامات تعديل هيستون السابقة تفاعلت مع محفز TBX5 في خلايا عضلة القلب (الشكل 5). هذا يدعم موثوقية النهج القائم على علامات تعديل الهيستون في التنبؤ بمناطق الاهتمام.

اخترنا عدم إعطاء الأولوية للحفاظ على التسلسل عبر الأنواع في هذا البروتوكول ، على الرغم من أنه معيار شائع لتحديد المعززات. كما ثبت سابقا أنه أقل فعالية للأنسجة أو المعززات الخاصة بالأنواع ، والتي لا يتم الحفاظ على الكثير منها بقوة أثناء التطور26. بالنظر إلى ذلك ، اخترنا التركيز على العلامات القائمة على الكروماتين والتي تشير بشكل مباشر إلى نشاط المحسن الوظيفي. ومع ذلك ، قد لا يزال الحفاظ على التسلسل يحمل قيمة في سياقات محددة ، مثل دراسة المعززات ذات الأهمية التطورية. في هذه الحالة ، يمكن إضافته كخطوة اختيارية للمستخدمين المهتمين بالعناصر التنظيمية المحفوظة.

أثبت البروتوكول فعاليته في استرجاع 21 معززا خاصا بالقلب لجين TBX5 من موقع EnsEMBL ، والذي كان قد استعصى سابقا على تحديد الهوية من خلال منصة موجودة ، متصفح VISTA Cardiac Enhancers. على الرغم من أن البروتوكول الموصوف هنا لم يتمكن من استرداد أحد المعززات ، hs498 ، مما يشير إلى إمكانية التقييد في الكشف ، إلا أن النهج كشف عن بعض المعززات التي لم يتم اكتشافها بواسطة متصفح VISTA Cardiac Enhancers. ومع ذلك ، من الضروري إجراء مزيد من التحقق من صحة المعززات المستردة ، حيث ينتج عن البروتوكول عددا أكبر من المناطق المفترضة مقارنة بقواعد بيانات VISTA المنسقة. يزيد هذا العدد المرتفع من خطر الإيجابيات الكاذبة، ولا يشير عدد أكبر من المعززات المتوقعة بالضرورة إلى تحسين الخصوصية أو الأهمية الوظيفية. سيكون دمج مجموعات بيانات تجريبية إضافية أو فحوصات وظيفية مثل تحليل التعبير الجيني أو اضطراب كريسبر أو فحوصات المراسل أمرا بالغ الأهمية لتأكيد الصلاحية البيولوجية لهؤلاء المرشحين كما تم إجراؤها في Smemoet al. دراسة23.

أظهرت المقارنة المتبادلة مع ثلاثة معززات تم التحقق من صحتها تجريبيا تداخلا جزئيا مع المناطق المتوقعة (الشكل 5). تم وضع المحسن المتوقع "e1" على نطاق أوسع من المحسن 2 الذي تم التحقق من صحته ، بينما أظهر "e18" تداخلا جزئيا مع المحسن 16 (الشكل 5). تشير هذه النتائج إلى أن هذا النهج يحدد بنجاح المناطق ذات النشاط التنظيمي المعروف ، على الرغم من أن النطاق الأوسع للمعززات المتوقعة قد يعكس المرونة في حدود المحسن. غالبا ما تعمل المعززات كعناصر معيارية ، ويمكن أن يعتمد نشاطها على سياق الكروماتين ونوع الخلية وتوقيت النمو2،27. لذلك ، قد تشمل المناطق المتوقعة المواقع النشطة الأساسية ذات التسلسلات المجاورة التي تساهم في الوظيفة التنظيمية ، على الرغم من الحاجة إلى التحقق التجريبي لتحديد أجزاء هذه التنبؤات الأوسع نشطة وظيفيا في سياق خاص بالأنسجة أو التنمو. بينما حدد متصفح VISTA Cardiac Enhancer أربع مناطق ضمن النطاق المحدد ، فإن محسن واحد فقط ، mm370 ، يتداخل جزئيا مع محسن تم التحقق من صحته تجريبيا ، Enhancer 16 ، وتحديدا في المنطقة التي تم تمييزها بواسطة H3K4me1 (الشكل 5) 23. قد يشير الجزء المتبقي من mm370 ، الذي لا يتداخل مع المحسن 16 ، إلى منطقة فرعية غير وظيفية أو غير نشطة للمحسن28،29.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أفاد المؤلفون بعدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء مختبر Ramialison (النسخ والمعلوماتية الحيوية ، مركز المعلوماتية الحيوية reNEW) على المناقشات المفيدة. يتم دعم MR و HTN من خلال منحة أفكار NHMRC (APP1180905). نشكر ريتشارد سافيري على الدعم. يتم تمويل MR من قبل زمالة قائد المستقبل لمؤسسة القلب (107328). تم توفير تمويل إضافي للبنية التحتية لمعهد مردوخ لأبحاث الأطفال من قبل مخطط دعم البنية التحتية لمعهد البحوث المستقل التابع للحكومة الأسترالية للمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية. يتم دعم المعهد الأسترالي للطب التجديدي بمنح من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية. يتم دعم مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية من قبل منح مؤسسة نوفو نورديسك (NNF21CC0073729).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محطة عمل الكمبيوترغير متاحغير متاحكمبيوتر قادر على متصفح الويب ، نظام التشغيل Windows / Mac / Linux
بوابة بيانات 4DNبوابة بيانات 4DNhttps://data.4dnucleome.org/
مجرةمجرةhttps://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
جيثبجيثبhttps://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
فيستا متصفح VISTA Cardiac Enhancerhttps://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barral, A., Déjardin, J. The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation. Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).
  3. Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease. Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).
  4. Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. Enhancer redundancy in development and disease. Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).
  5. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  6. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  7. Panigrahi, A., O'Malley, B. W. Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown. Genome Biol. 22 (1), 108(2021).
  8. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  9. Krivega, I., Dean, A. Enhancer and promoter interactions-long distance calls. Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations. Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).
  11. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  12. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  13. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  14. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  15. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  16. Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  17. de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).
  18. Gao, T., Qian, J. EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).
  19. Erwin, G. D., et al. Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction. PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).
  20. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  21. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  22. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  23. Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease. Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).
  24. Boogerd, C. J., Evans, S. M. TBX5 and NuRD divide the heart. Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).
  25. Dickel, D. E., et al. Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers. Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).
  26. Pennacchio, L. A., Visel, A. Limits of sequence and functional conservation. Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).
  27. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  28. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  29. Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers. Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Enhancer IdentificationGene RegulationH3K4me1 MarkerH3K27ac MarkerChromatin ConformationHi C DataEnsembl Genome BrowserHeart Development

مقالات ذات صلة