Method Article

طرق لتمكين النسخ المكاني لأنسجة العظام

DOI:

10.3791/66850

⸱

May 3rd, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Periodontics and Preventive Dentistry, University of Pittsburgh School of Dental Medicine, 2Center for Craniofacial Regeneration, University of Pittsburgh School of Dental Medicine, 3UPMC Presbyterian, 4UPMC Shadyside, 5Musculoskeletal Oncology Laboratory, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6UPMC Hillman Cancer Center, 7Departments of Anatomic Pathology and General Surgical Oncology, University of Pittsburgh, 8Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 9University of Pittsburgh UPMC Hillman Cancer Center, 10McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف طريقة تسمح بإزالة الكلس من أنسجة العظام التي تم الحصول عليها حديثا والحفاظ على الحمض النووي الريبي عالي الجودة. كما تم توضيح طريقة لتقسيم عينات الفورمالين الثابتة من البارافين (FFPE) للعظام غير المنزوعة المعادن للحصول على نتائج جيدة النوعية إذا لم تكن الأنسجة الطازجة متوفرة أو لا يمكن جمعها.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فهم العلاقة بين الخلايا وموقعها داخل كل نسيج أمرا بالغ الأهمية للكشف عن العمليات البيولوجية المرتبطة بالتطور الطبيعي وأمراض الأمراض. النسخ المكاني هو طريقة قوية تمكن من تحليل النسخ بالكامل داخل عينات الأنسجة ، وبالتالي توفير معلومات حول التعبير الجيني الخلوي والسياق النسيجي الذي توجد فيه الخلايا. في حين تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع للعديد من الأنسجة الرخوة ، إلا أن تطبيقها لتحليل الأنسجة الصلبة مثل العظام كان صعبا. يكمن التحدي الرئيسي في عدم القدرة على الحفاظ على الحمض النووي الريبي عالي الجودة ومورفولوجيا الأنسجة أثناء معالجة عينات الأنسجة الصلبة للتقسيم. لذلك ، يتم وصف طريقة هنا لمعالجة عينات أنسجة العظام التي تم الحصول عليها حديثا لإنشاء بيانات النسخ المكاني بشكل فعال. تسمح هذه الطريقة بإزالة الكلس من العينات ، ومنح أقسام الأنسجة الناجحة مع الحفاظ على التفاصيل المورفولوجية مع تجنب تدهور الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير إرشادات مفصلة للعينات التي كانت في السابق مدمجة في البارافين ، دون إزالة المعادن ، مثل العينات التي تم جمعها من بنوك الأنسجة. باستخدام هذه الإرشادات ، يتم عرض بيانات النسخ المكاني عالية الجودة الناتجة عن عينات بنك الأنسجة للورم الأولي وورم خبيث في الرئة من ساركوما العظام العظمية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العظام هي نسيج ضام متخصص يتكون أساسا من ألياف الكولاجين من النوع 1 والأملاح غير العضوية1. نتيجة لذلك ، تكون العظام قوية وقاسية بشكل لا يصدق بينما تكون ، في نفس الوقت ، خفيفة ومقاومة للصدمات. القوة الكبيرة للعظام مستمدة من محتواها المعدني. في الواقع ، بالنسبة لأي زيادة معينة في النسبة المئوية للمحتوى المعدني ، تزداد الصلابة بمقدار خمسة أضعاف2. وبالتالي ، يواجه الباحثون مشاكل كبيرة عندما يحللون ، عن طريق التقسيم النسيجي ، بيولوجيا عينة العظام.

علم الأنسجة العظمي غير المكلس ممكن ومطلوب في بعض الأحيان ، اعتمادا على نوع التحقيق (على سبيل المثال ، لدراسة البنية الدقيقة للعظام) ؛ ومع ذلك ، فإنه يمثل تحديا كبيرا ، خاصة إذا كانت العينات كبيرة. في هذه الحالات ، تتطلب معالجة الأنسجة للأغراض النسيجية عدة تعديلات على البروتوكولات والتقنيات القياسية3. بشكل عام ، لإجراء التقييمات النسيجية الشائعة ، يتم إزالة الكلس من أنسجة العظام مباشرة بعد التثبيت ، وهي عملية قد تتطلب بضعة أيام إلى عدة أسابيع ، اعتمادا على حجم الأنسجة وعامل إزالة الكلس المستخدم4. غالبا ما تستخدم المقاطع منزوعة الكلس لفحص نخاع العظام ، وتشخيص الأورام ، إلخ. هناك ثلاثة أنواع رئيسية من عوامل إزالة الكلس: الأحماض القوية (مثل حمض النيتريك وحمض الهيدروكلوريك) والأحماض الضعيفة (مثل حمض الفورميك) وعوامل المخلب (على سبيل المثال ، حمض الإيثيلين ديامينيتريستيك أو EDTA)5. يمكن للأحماض القوية إزالة الكلس من العظام بسرعة كبيرة ، لكنها يمكن أن تلحق الضرر بالأنسجة. الأحماض الضعيفة شائعة جدا ومناسبة للإجراءات التشخيصية ؛ تعتبر العوامل المخلبية إلى حد بعيد الأكثر استخداما وملاءمة للتطبيق البحثي لأنه في هذه الحالة ، تكون عملية إزالة المعادن بطيئة ولطيفة ، مما يسمح بالاحتفاظ بالتشكل عالي الجودة والحفاظ على معلومات الجينات والبروتين ، كما هو مطلوب في العديد من الإجراءات (على سبيل المثال ، التهجين في الموقع ، التلوين المناعي). ومع ذلك ، عندما يحتاج النسخ بأكمله إلى الحفاظ عليه ، مثل تحليلات التعبير الجيني ، حتى إزالة المعادن البطيئة واللطيفة قد تكون ضارة. لذلك ، هناك حاجة إلى نهج وطرق أفضل عندما يحتاج التحليل المورفولوجي للأنسجة إلى الاقتران بتحليلات التعبير الجيني للخلايا.

بفضل التحسينات الأخيرة في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) والنسخ المكاني ، أصبح من الممكن الآن دراسة التعبير الجيني لعينة الأنسجة حتى عند استخدام تضمين البارافين لتثبيت الفورمالين (FFPE) لتخزين عينات الأنسجة6،7،8. وقد فتحت هذه الفرصة الوصول إلى عدد أكبر من العينات، مثل تلك المخزنة في بنوك المناديل الورقية في جميع أنحاء العالم. إذا كان سيتم استخدام scRNA-seq ، فإن سلامة الحمض النووي الريبي هي أهم مطلب. ومع ذلك ، في حالة النسخ المكاني لعينات FFPE ، فإن كل من أقسام الأنسجة عالية الجودة والحمض النووي الريبي عالي الجودة ضروريان لتصور التعبير الجيني في السياق النسيجي لكل قسم من الأنسجة. في حين أن هذا قد تحقق بسهولة مع الأنسجة الرخوة ، لا يمكن قول الشيء نفسه عن الأنسجة الصلبة مثل العظام. في الواقع ، على حد علمنا ، لم يتم إجراء أي دراسة باستخدام النسخ المكاني على عينات عظام FFPE. هذا بسبب عدم وجود بروتوكولات يمكنها معالجة أنسجة العظام FFPE بشكل فعال مع الحفاظ على محتوى الحمض النووي الريبي الخاص بها. هنا ، يتم توفير طريقة لمعالجة وإزالة الكلس من عينات أنسجة العظام التي تم الحصول عليها حديثا مع تجنب تدهور الحمض النووي الريبي أولا. بعد ذلك ، إدراكا للحاجة إلى تحليل النسخ لعينات FFPE التي تم جمعها في بنوك الأنسجة في جميع أنحاء العالم ، يتم أيضا تقديم إرشادات مطورة للتعامل بشكل صحيح مع عينات FFPE من العظام غير المنزوعة المعادن.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة أدناه وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر في كلية طب الأسنان بجامعة بيتسبرغ.

1. طريقة تحضير كتل FFPE لعينات أنسجة العظام التي تتطلب إزالة المعادن

  1. تحضير الكواشف والمواد
    1. تحضير EDTA 20٪ درجة الحموضة 8.0. بالنسبة ل 1 لتر ، قم بإذابة 200 جم من EDTA في 800 مل من الماء عالي النقاء ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم 10 N وأخيرا ارفع الحجم إلى 1 لتر بماء عالي النقاء. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: استخدم دائما EDTA الطازج 20٪ pH 8.0. يتم تحضير هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) 10 N عن طريق إذابة 400 جم من هيدروكسيد الصوديوم في 1 لتر من الماء عالي النقاء.
    2. تحضير بارافورمالدهايد (PFA) 4٪ في غطاء دخان باستخدام 1x PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
      ملاحظة: قم بتعيين منطقة في غطاء الدخان للعمل مع محاليل بارافورمالدهايد المركزة ، أو المواد الصلبة بارافورمالدهايد ، وقم بتسميتها على هذا النحو. لتجنب التعرض ، احتفظ بالحاويات مغلقة قدر الإمكان. استخدم بأصغر الكميات العملية اللازمة للتجربة التي يتم إجراؤها. إذا كان وزن مسحوق بارافورمالدهايد وميزان الوزن لا يمكن استخدامهما في غطاء الدخان ، فاخذ أولا وعاءا ، ثم أضف مسحوق PFA في الغطاء وقم بتغطيته قبل العودة إلى الميزان لوزن المسحوق. استخدم دائما 4٪ PFA طازجة.
    3. استخدم حاوية مناسبة لكل عينة.
      ملاحظة: على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 1 ملغ من أنسجة العظام ، استخدم وعاءا يسمح بملامسة 1 مل على الأقل من أي محلول للعظام.
    4. تعقيم جميع المعدات الجراحية اللازمة للتشريح.
    5. نظف جميع المناطق بمحلول تطهير لإزالة RNases.
    6. اجمع المواد التجريبية المتبقية ، بما في ذلك حاويات الثلج ، ورذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ ، والوصول إلى شاكر المداري.
  2. عزل عينات الأنسجة العظمية من الفئران
    1. القتل الرحيم للفأر عن طريق التعرض CO2 ، ثم إجراء خلع عنق الرحم ووضعه على ظهره. رش جلد الفأر بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.
    2. باستخدام مقص تشريح معقم ، افتح الجلد وفضح عضلة الساق. اقطع العضلة بجانب الساق للحصول على رؤية واضحة لموضع العظم ، وقم بفك العظم برفق لإزالته دون ضرر.
      ملاحظة: ليس من الضروري إزالة كل العضلات المرتبطة بالعظم بالكامل. حاول أن تكون بأسرع ما يمكن للحد من تدهور الحمض النووي الريبي.
    3. ضع عينة العظام على الفور في أنبوب يحتوي على 4٪ PFA وضع الأنبوب على الثلج.
    4. كرر الإجراء لجمع عينات العظام الأخرى حسب الرغبة.
    5. ضع عينات تحتوي على 4٪ PFA في حالة تحريض على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل للسماح بالتثبيت المناسب.
  3. إزالة الكلمة من عينات الأنسجة العظمية
    1. استرجع الأنسجة العظمية من شاكر الحجاج بعد التثبيت.
    2. اغسل الأنسجة العظمية 2 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 3 دقائق على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة لإزالة أي PFA متبقي.
    3. باستخدام مقص تشريح معقم ، قم بإزالة أي عضلات متبقية لا تزال متصلة بالعظام.
    4. اغسل أنسجة العظام مرة أخرى باستخدام 1x PBS لمدة 3 دقائق.
    5. ضع النسيج العظمي في وعاء جديد يحتوي على 20٪ EDTA pH 8.0. بعد ذلك ، ضع الحاوية على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    6. تخلص من المحلول ، وأضف 20٪ EDTA pH 8.0 في الحاوية ، وضعه على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في RT.
    7. كرر الخطوة 1.3.6 10 مرات.
    8. تخلص من المحلول ، وأضف 20٪ EDTA pH 8.0 في الحاوية ، وضعها عند 4 درجات مئوية في غرفة باردة على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة طوال الليل.
  4. جفاف عينات أنسجة العظام
    1. استرجع عينة الأنسجة العظمية من الحاوية.
    2. افحص الأنسجة وتحقق من كفاءة إزالة الكلس عن طريق تدوير العظم ولفه برفق. بدلا من ذلك ، قم بإجراء أشعة سينية للعظام باستخدام جهاز الأشعة السينية.
      ملاحظة: إذا انثنت العينة بسهولة ، فقد تم تحقيق درجة جيدة من إزالة الكلس. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيجب زيادة معلمات إزالة الكلس (الوقت ، سرعة التحريض ، حجم 20٪ EDTA pH 8.0. المستخدمة ، إلخ).
    3. اغسل أنسجة العظام 2 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 3 دقائق لإزالة بقايا EDTA.
    4. ضع أنسجة العظام في وعاء جديد وابدأ الجفاف بنسبة 70٪ من الإيثانول. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.
    5. تخلص من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ ، وضع العينة في محلول إيثانول بنسبة 90٪ ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.
    6. تخلص من محلول الإيثانول بنسبة 90٪ ، وضع العينة في إيثانول 100٪ ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.
    7. تخلص من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وضع العينة في إيثانول جديد بنسبة 100٪ ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.
    8. تخلص من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وضع العينة في إيثانول جديد بنسبة 100٪ ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.
    9. تخلص من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وضع العينة في إيثانول جديد بنسبة 100٪ ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.
    10. تخلص من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وضع العينة في إيثانول جديد بنسبة 100٪ ، واحتضانها لمدة 45 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الجفاف باستخدام معالج تلقائي. في هذه الحالة ، قم بإعداد البرنامج بنفس الشروط التي تم الإبلاغ عنها للجفاف اليدوي. الظروف المبلغ عنها هي لعينات لا يزيد سمكها عن 4 مم (أي عينات أنسجة العظام التي تم الحصول عليها من الفئران). بالنسبة للعينات التي يزيد سمكها عن 4 مم ، يجب تحديد توقيت الجفاف تجريبيا.
  5. مسح عينات الأنسجة العظمية
    1. ضع عينة الأنسجة العظمية في وعاء جديد وابدأ عملية المقاصة باستخدام الزيلين. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.
    2. تخلص من الزيلين المستخدم ، وأضف زيلين جديد ، واحتضنه لمدة 20 دقيقة إضافية عند 140 دورة في الدقيقة.
    3. تخلصي من الزيلين المستخدم ، وأضيفي زيلين جديد ، واحتضنيه لمدة 45 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: يمكن أيضا إجراء المسح باستخدام معالج تلقائي. في هذه الحالة ، قم بإعداد البرنامج بنفس الشروط التي تم الإبلاغ عنها للمسح اليدوي. الظروف المبلغ عنها هي لعينات لا يزيد سمكها عن 4 مم (أي عينات أنسجة العظام التي تم الحصول عليها من الفئران). بالنسبة للعينات التي يزيد سمكها عن 4 مم ، يجب تحديد التوقيت تجريبيا.
  6. تسلل وتضمين عينات أنسجة العظام
    1. استرجع عينة الأنسجة العظمية من الهزاز المداري / المعالج التلقائي بعد التطهير.
    2. ضع عينة الأنسجة العظمية في شريط تضمين وابدأ التسلل بالشمع (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 30 دقيقة على 60 درجة مئوية.
    3. تخلصي من الشمع المستخدم وأضيفي شمعا جديدا واحتضنوه لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية.
    4. تخلصي من الشمع المستخدم وأضيفي شمعا جديدا واحتضنوه لمدة 45 دقيقة عند 60 درجة مئوية.
    5. ضع بعناية عينة الأنسجة العظمية في قالب بالاتجاه المطلوب.
    6. اسمح لكتلة العينة بالتصلب على سطح بارد.
    7. قم بتخزين FFPE الذي تم الحصول عليه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا لبدء التقطيع.
      ملاحظة: يمكن تخزين كتلة FFPE لسنوات عديدة قبل إجراء التقسيم.

2. مبادئ توجيهية لتقسيم عينات FFPE غير المنزوعة المعادن

ملاحظة: توفر الإرشادات التالية نصائح وإرشادات قيمة مفيدة لتحسين جودة أقسام الأنسجة بشكل كبير مع تجنب تدهور الحمض النووي الريبي خاصة في حالات عينات العظام الصغيرة غير المتكلسة. يمكن أيضا تطبيق هذه الإرشادات على عينات العظام منزوعة الكلس عند توفرها. بالنسبة لعينات الأنسجة العظمية الأكبر حجما ، يجب إجراء إزالة المعادن للحصول على أقسام ذات جودة أفضل ؛ في مثل هذه الحالات ، يجب اتباع الطريقة المذكورة أعلاه ، ويجب تعديل المعلمات (التوقيت ، وأحجام الحلول ، وما إلى ذلك) وفقا لذلك. الإرشادات التالية مناسبة إما عندما تتم معالجة أنسجة عظام FFPE بالفعل (على سبيل المثال ، كتلة FFPE التي تم جمعها من بنوك الأنسجة أو المختبرات الأخرى) أو عندما يتم استخدام الأقسام التي تم جمعها لإجراء أي نوع من التحليل الذي يتطلب RNA عالي الجودة أو أقسام أنسجة عالية الجودة أو كليهما.

  1. إعداد المعدات
    1. رش جميع أسطح العمل والأدوات بمحلول تطهير لإزالة RNases.
    2. تحضير حمام مائي بالماء المقطر المزدوج وضبط درجة الحرارة على 42 درجة مئوية.
    3. خذ شفرة ميكروتوم ، ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول لإزالة بقايا الزيت ، ثم رشها بمحلول تطهير لإزالة RNases.
    4. تأمين شفرة على microtome. تأكد من ضبط زاوية الخلوص على 10 درجات.
      ملاحظة: استخدم دائما شفرات جديدة للتقسيم.
    5. تحضير دلاء من الجليد.
    6. احصل على ملاقط وفرش ومجسات ، ورشها بمحلول تطهير لإزالة RNases ، وضعها في أحد دلاء الثلج.
    7. قم بإعداد حمام جليدي عن طريق إضافة الماء المقطر المزدوج إلى دلو الثلج الآخر.
      ملاحظة: يجب ألا تطفو كتلة FFPE في الماء المضاف ؛ لذلك ، يجب أن تكون كمية الماء المضافة إلى دلو الثلج كافية للسماح للعينة بالبلل دون أن تطفو.
  2. التقسيم
    1. استرجع كتلة FFPE من التخزين عند 4 درجات مئوية وضعها على الميكروتوم. اضبط الأمر على Trim أو على 14 ميكرومتر من سمك التمرير ، وابدأ في قص العينة حتى يتم كشف المنديل.
      ملاحظة: إذا تم بالفعل قطع كتلة FFPE وكان النسيج مكشوفا بالفعل ، فتخط الخطوة 2.2.1. تحقق من أن الكتلة خالية من الثقوب والشقوق. إذا كان الأمر كذلك، فانتقل مباشرة إلى الخطوة 2.2.2. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بقص بعض الأقسام لتسطيح السطح وتجنب الثقوب والشقوق ، ثم انتقل إلى الخطوة 2.2.2.
    2. ضع كتلة FFPE على حمام الثلج لترطيب العينة. يجب تحديد وقت الترطيب تجريبيا.
      1. ابدأ ب 2 دقيقة وقم بزيادة الوقت إذا لم يكن الترطيب كافيا. لا تتجاوز 10 دقائق. سوف يوسع الترطيب الأنسجة ويقلل من تكوين "الستائر الفينيسية" والخطوط. يمكن أن تتسبب أوقات الترطيب الأطول في حدوث تشققات في كتلة البارافين ، وربما انفصال الأنسجة.
      2. إذا كانت 10 دقائق غير كافية لترطيب العينة ، فقم بإجراء دورات ترطيب لا تزيد عن 10 دقائق وحاول التقسيم مرة أخرى.
      3. إذا لم يكن سطح الكتلة أملسا ونظيفا بسبب الشقوق أو الجروح ، ففكر في إعادة تضمين العينة. لن تتأثر جودة الحمض النووي الريبي بعملية إعادة التضمين.
    3. ضع العينة في مشبك عينة الميكروتوم ، وقم بمحاذاتها مع الشفرة ، وابدأ في التقسيم. اضبط سمك التمرير على 5 ميكرومتر.
    4. اجمع القسم وضعه في حمام مائي على حرارة 42 درجة مئوية باستخدام ملاقط وفرش باردة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، إذا تم إجراء عزل الحمض النووي الريبي لأقسام الأنسجة ، فقم بجمع الأقسام في أنبوب طرد مركزي واتبع مواصفات التصنيع لإعداد الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
    5. احتضان القسم في حمام مائي لتمديد الأنسجة والقضاء على أي تجاعيد وطيات متبقية.
      ملاحظة: يجب تحديد وقت الطفو في حمام مائي لكل قسم تجريبيا. ضع في اعتبارك ترك أقسام العظام دقيقة إضافية في حالة حدوث مشاكل في انفصال الأنسجة. لا تترك القسم عائما لفترة طويلة لأن أوقات الطفو الطويلة قد تلحق الضرر بالأنسجة.
    6. ضع القسم على شريحة زجاجية ، ثم احتضنه لمدة 3 ساعات عند 42 درجة مئوية.
    7. ضع الشريحة الزجاجية في مجفف أو فرن طوال الليل في RT للتجفيف المناسب.
    8. قم بتخزين الشريحة الزجاجية مع القسم المرفق في RT في صندوق شرائح.
      ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح لسنوات عديدة في RT. إذا كان سيتم إجراء النسخ المكاني ، بدلا من شريحة زجاجية ، ضع القسم على شريحة التعبير الجيني المكاني المقدمة من الشركة المصنعة واتبع التوصيات المبلغ عنها (انظر جدول المواد).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف الطريقة المعروضة هنا كيفية معالجة العظام المعزولة حديثا للحصول على عينات FFPE منزوعة المعادن والتي يمكن تقسيمها بسهولة باستخدام ميكروتوم مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي (الشكل 1). تم استخدام الطريقة بنجاح على عظم الفخذ ولكن يمكن اتباعها لعينات أنسجة العظام الأخرى ذات الأبعاد المماثلة ، أو يمكن تكييفها لعينات العظام الأكبر (مثل العينات البشرية) عن طريق زيادة جميع المعلمات (التوقيت ، أحجام المحاليل ، إلخ).

figure-results-1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول. رسم تخطيطي لطريقة الحصول على كتل FFPE من أنسجة العظام منزوعة الكلس مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي (النقطتان 1 و 2). رسم تخطيطي للمبادئ التوجيهية لقسم كتل FFPE (النقطة 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

للتحقق من صحة التوقيت الصحيح لإزالة الكلس ، تم إجراء دورة زمنية تمت فيها مقارنة عظم الفخذ غير المكلس ، وعظم الفخذ منزوع الكلس لمدة 3 ساعات (حيث تم تغيير EDTA كل 30 دقيقة لما مجموعه 6 مرات) ، وعظم الفخذ منزوع الكلس لمدة 24 ساعة (حيث تم تغيير EDTA كل 30 دقيقة لما مجموعه 10 مرات ثم تركه في EDTA طوال الليل) (الشكل 2). ثم تم تقسيم كتل FFPE التي تم الحصول عليها وفقا للإرشادات المذكورة أعلاه ، وتم التحقق من الجودة النسيجية وسلامة الحمض النووي الريبي للأقسام التي تم الحصول عليها. للقيام بذلك ، تم تقييم السلامة الهيكلية ومورفولوجيا أقسام الأنسجة عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H&E) متبوعا بالفحص المجهري (الشكل 2A ، C ، E) ، بينما تم تقييم جودة الحمض النووي الريبي من خلال تقييم قيمة توزيع شظايا الحمض النووي الريبي بحجم أعلى من 200 نيوكليوتيدات (200 nt) (المعروفة باسم درجة DV200)4 (الشكل 2B ، D,F). أظهرت صور H&E أن أقسام عظم الفخذ غير المتكلسة و 3 ساعات منزوعة الكلس قدمت مع العديد من الكسور والثقوب والأضرار (الشكل 2A ، C ،) ، بينما أظهرت أقسام عظم الفخذ منزوع الكلس لمدة 24 ساعة جودة نسيجية جيدة (الشكل 2E). جميع العينات المقدمة DV200 درجات أعلى من 50 ٪ ، والتي تعتبر الحد الأدنى للقيمة لإجراء scRNA-seq أو تحليلات النسخ المكاني4. كما تم اختبار أوقات حضانة أطول مع التغيرات اليومية ل EDTA ، عند 4 درجات مئوية ، مع تحريك أكثر اعتدالا في حاويات أصغر ، ولا يوصى بها لأنه ، باستخدام هذه الظروف ، تنخفض سلامة الحمض النووي الريبي للعينات بشكل كبير (الشكل 2H). لذلك ، تم تقليل وقت الحضانة إلى 24 ساعة بينما تم زيادة التردد والإثارة وأحجام إزالة الكلس لتعزيز إزالة الكلس.

figure-results-2
الشكل 2. مراقبة جودة سلامة المقاطع والحمض النووي الريبي (QC) لعظم الفخذ الفأر البالغ من العمر 8 أسابيع بعد إزالة الكلس. تم تشريح عظم الفخذ من الفئران لمدة 8 أسابيع حديثا وتثبيته وإزالة الكلس بنسبة 20٪ EDTA pH 8.0. في نقاط زمنية مختلفة ، مضمنة في البارافين باستخدام الطريقة الموصوفة ، ومقسمة باتباع الإرشادات المبلغ عنها. ثم تم إجراء مراقبة الجودة النسيجية للأقسام التي تم الحصول عليها عن طريق تلطيخ H&E ، بينما تم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي من خلال تقييم قيمة توزيع شظايا الحمض النووي الريبي بحجم أكبر من 200 نيوكليوتيدات (200 nt) (DV200). (أ) تلطيخ H&E يظهر أقسام عظم الفخذ للفأر بعمر 8 أسابيع بعد عدم إزالة الكلس. تظهر الصورة اليمنى تكبيرا أعلى للمنطقة المحاصرة. (ب) RNA QC لأقسام عظم الفخذ الفأر البالغة من العمر 8 أسابيع بعد عدم إزالة الكلس. (C) تلطيخ H&E يظهر أقسام عظم الفخذ للفأر البالغ من العمر 8 أسابيع بعد 3 ساعات من إزالة الكلس. تظهر الصورة اليمنى تكبيرا أعلى للمنطقة المحاصرة. (د) RNA QC لأقسام عظم الفخذ الفأر البالغة من العمر 8 أسابيع بعد 3 ساعات من إزالة الكلس. (ه) تلطيخ H&E يظهر أقسام عظم الفخذ للفأر البالغ من العمر 8 أسابيع بعد 24 ساعة من إزالة الكلس. تظهر الصورة اليمنى تكبيرا أعلى للمنطقة المحاصرة. (F) RNA QC لأقسام عظم الفخذ البالغة من العمر 8 أسابيع بعد 24 ساعة من إزالة الكلس. (G) يظهر تلطيخ H&E مقاطع عظم الفخذ البالغة من العمر 8 أسابيع بعد 72 ساعة من إزالة الكلس. تظهر الصورة اليمنى تكبيرا أعلى للمنطقة المحاصرة. (H) RNA QC لأقسام عظم الفخذ البالغة من العمر 8 أسابيع بعد 72 ساعة من إزالة الكلس. الاختصارات: H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. DV200 (٪) = ٪ من قيمة توزيع الأجزاء > 200 nt ؛ nt = النيوكليوتيدات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لاختبار فعالية المبادئ التوجيهية المبلغ عنها للتعامل مع عينات FFPE غير منزوعة المعادن ، تم جمع كتل FFPE من الساركوما العظمية الأولية البشرية غير المنزوعة المعادن ونقائل الساركوما العظمية الرئوية التي تم الحصول عليها من سجل أورام الأورام العضلية الهيكلية وبنك الأنسجة (MOTOR) ، وتم إجراء تحليل النسخ المكاني (الشكل 3). قبل الشروع في تحليل النسخ المكاني ، تم إعادة تضمين كتل FFPE في البارافين للحصول على سطح بدء أملس. بعد ذلك ، تم تقييم الحمض النووي الريبي والجودة النسيجية للأقسام (البيانات غير معروضة). كانت خطوات الترطيب حاسمة لأن عينات الساركوما العظمية الأولية لا يمكن تقسيمها دون ترطيب مناسب. على النقيض من ذلك ، لم تتطلب نقائل الرئة أي خطوات ترطيب. بعد التقسيم ، تم وضع الأنسجة على شريحة نسخية مكانية (الشكل 3 أ) ، ملطخة ب H& E (الشكل 3D) ، وتم إجراء تحليل النسخ المكاني وفقا لمواصفات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). تم تسلسل مكتبات cDNA التي تم الحصول عليها ، وتم تصور البيانات المعالجة باستخدام Space Ranger لمراقبة الجودة5 (الشكل 3B). أظهر ناتج Space Ranger درجات عالية جدا (حوالي 100٪) للرموز الشريطية الصالحة ، والمعرفات الجزيئية الفريدة الصالحة (UMIs) ، وقواعد Q30 ، ومتوسط الجينات المكتشفة لكل بقعة (بين 1700 و 5000) ، مما يدل على متانة وصلابة البيانات التي تم الحصول عليها (الشكل 3B). من خلال التحليل العنقودي غير المتحيز القائم على الرسم البياني ، تم تحديد 12 مجموعة رئيسية ، بما في ذلك مجموعات من الخلايا العظمية والمناعية والظهارية والبطانية ، وكذلك الخلايا الشحمية (الشكل 3E). وتجدر الإشارة إلى أن حدود المجموعات تتداخل مع حواف المناطق النسيجية التي حددها أخصائي علم الأمراض (الشكل 3D). كما تم تلطيخ أقسام إضافية من نفس العينات ب Goldner's Trichrome لتصور المناطق المعدنية (الشكل 3C).

figure-results-3
الشكل 3. تحليل النسخ المكاني لزوجين من الساركوما العظمية الأولية غير المتكلسة (OS) ونقائل الرئة. تم جمع كتل FFPE من زوجين متطابقين من الساركوما العظمية الأولية البشرية غير المنزوعة المعادن وورم خبيث في الرئة من بنك الأنسجة الحركية الخاص بنا. تم تقسيم العينات باستخدام الإرشادات المبلغ عنها وتم وضعها على شريحة التعبير الجيني المكاني Visium لعينات FFPE لإجراء تحليل النسخ المكاني. (أ) شريحة التعبير الجيني المكاني Visium لعينات FFPE مع الأقسام المرفقة. (ب) ناتج Space Ranger الذي يبين البارامترات المشتركة المستخدمة لتقييم جودة البيانات التي تم الحصول عليها لجميع العينات. (ج) صبغة جولدنر ثلاثية الألوان توضح توطين أنسجة العظام المعدنية والعظمية. (د) صبغة H&E توضح التعليق التوضيحي لأخصائي علم الأمراض. ه: تحليل عنقودي يوضح توطين تجمعات الخلايا المقيمة في الأنسجة. الاختصارات: FFPE = فورمالين ثابت ومضمن في البارافين ؛ MOCs = الخلايا العظمية الخبيثة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم توفير طريقة مفصلة لإعداد كتل FFPE من العظام منزوعة الكلس والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي للتسلسل (أي تسلسل الجيل التالي (NGS)) أو للتقنيات الأخرى المتعلقة بالحمض النووي الريبي (أي التهجين في الموقع ، تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) ، إلخ).

تستخدم الطريقة EDTA لإزالة الكلس من عينات أنسجة العظام. تسمح حضانة EDTA بإزالة المعادن البطيئة ولكن الدقيقة للعينات ، وبالتالي الحفاظ على السمات النسيجية للأنسجة في أفضل حالاتها. عادة ، يتم إجراء إزالة الكلس العظام باستخدام 10 ٪ EDTA درجة الحموضة 7.0 لمدة 2 أسابيع على الأقل عن طريق تحديث الحل كل يوم4. ومع ذلك ، فإن الأوقات الطويلة من إزالة الكلس تساهم بشكل كبير في تدهور الحمض النووي الريبي6،7،8. للتغلب على هذه المشكلة ، تم زيادة تركيز EDTA إلى 20 ٪ ، وتم رفع الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 ، وتم زيادة وتيرة استبدال المحلول إلى كل 30 دقيقة. هذه الظروف ، جنبا إلى جنب مع الكمية الكبيرة من المحلول الذي تتعرض له الأنسجة ، والإثارة القوية ، ونسبة حجم الحاوية / الأنسجة العالية ، تزيد من إزالة الكلس وتقليل أوقات العلاج ، مما يسمح بإزالة المعادن بلطف ولكن بسرعة. من الجدير بالذكر أنه من المهم الإشارة إلى أنه عند استخدام عينات الأنسجة العظمية لتسلسل النسخ ، قد لا يكون من الضروري إزالة الكلس منها تماما. في هذه الحالة ، يمكن العثور على النسبة المثلى بين إزالة المعادن الكافية والحفاظ الجيد على الحمض النووي الريبي. شيء آخر مهم يجب ذكره هو أنه بغض النظر عن كيفية معالجة العينات إذا تم إصلاحها ، تجزئة الحمض النووي الريبي الخاص بها. تسمح الطريقة المذكورة هنا بالاحتفاظ بشظايا الحمض النووي الريبي بحجم أعلى من 200 نيوكليوتيدات (٪ DV200) (الشكل 2F) ، مما يشير إلى جودة عالية للحمض النووي الريبي 9,11.

تقدم هذه الطريقة بعض القيود. أولا ، نظرا لأن الفئران كانت المصدر الوحيد لعينات الأنسجة العظمية ، فقد تم التحقق من صحة الطريقة فقط على عظام الفئران ، وهي صغيرة نسبيا. علاوة على ذلك ، من غير المعروف ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة للفئران الأكبر أو الأصغر من 8 أسابيع منذ اختبارها على الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع فقط. اخترنا الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع لأنها ناضجة هيكليا. نظرا لأن الشيخوخة تعدل المحتوى المعدني للعظام ، فقد يتعين تنفيذ تغييرات على هذا النهج.

بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن إرشادات للمساعدة في تحسين جودة أقسام الأنسجة عند استخدام عينات FFPE من عينات العظام الصغيرة غير المتكلسة ، على سبيل المثال ، عندما يتم جمعها مباشرة من بنوك الأنسجة. في هذه الحالات ، لا يمكن فعل أي شيء إذا تدهور الحمض النووي الريبي ، ولكن يمكن تحسين جودة القسم. من ناحية أخرى ، بالنسبة للعينات ذات المحتوى الجيد من الحمض النووي الريبي ، مثل تلك الموضحة هنا ، يمكن إجراء تحليل النسخ المكاني إذا تم اتباع الإرشادات المقدمة. من الجدير بالذكر ، في عينات الساركوما العظمية الأولية ، يمكن تغيير بنية العظام من خلال وجود كتلة الورم ، مما يجعل العينات الفعلية أضعف وهشة ، مما قد يسهل التقسيم. لذلك ، تم استخدام تلطيخ Goldner's Trichrome لتقييم ما إذا كان هذا هو الحال حيث يمكن تحديد المناطق المعدنية وغير المعدنية باستخدام تقنية التلوين هذه (الشكل 3C).

في الختام ، تمثل الطريقة المبلغ عنها طريقة قابلة للتطبيق بسهولة لإزالة الكلس من عينات أنسجة العظام والحصول على أقسام FFPE التي يمكن استخدامها بشكل فعال ل NGS أو غيرها من التقنيات التي تتطلب سلامة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير إرشادات لتقسيم العينات التي ربما لم يتم إزالة المعادن منها قبل تضمين البارافين ، مثل العينات التي تم الحصول عليها من بنوك الأنسجة. نظرا للتطور السريع لتحليلات النسخ المكاني ، قد تكون الطريقة والمبادئ التوجيهية المقترحة مفيدة جدا في أبحاث العظام بشكل عام وفي أبحاث سرطان العظام أيضا.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بأموال من بيتسبرغ لعلاج الساركوما (PCS) ومعهد الساركوما العظمية (OSI).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
شاكر مداري متقدمVWR76683-470يستخدم لإبقاء الأنسجة تحت التحريض أثناء الحضانة كما هو مذكور في تعليمات الطريقة.
فرش شعر الإبلتيد بيلا11859تستخدم للتعامل مع أقسام FFPE كما هو مذكور في الإرشادات.
مجموعة الفهرس المزدوج TS مجموعة 96 rxns10X الجينومPN-1000251تستخدم لأداء النسخ المكانية.
الإيثانول 200 ProofDecon Labs Inc2701استخدم لإجراء جفاف الأنسجة كما هو مذكور في تعليمات الطريقة.
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ، ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم (EDTA) ثيرموفيشر العلميS312-500يستخدم لتحضير EDTA 20٪ درجة الحموضة 8.0.
ملقط Fisherbrand Curved Medium Point للأغراض العامةFisher Scientific16-100-110استخدم للتعامل مع أقسام FFPE كما هو مذكور في الإرشادات.
Fisherbrand Fine Precision ProbeFisher Scientific12-000-153استخدم للتعامل مع أقسام FFPE كما هو مذكور في الإرشادات.
Fisherbrand  شرائح مجهر Superfrost Plusفيشر Scientific12-550-15استخدم لإرفاق اللفائف المقسمة كما هو مذكور في الإرشادات.
شفرات الماس الدقيقة عاليةCL SturkeyD554DDاستخدم لتقسيم كتل FFPE كما هو مذكور في الإرشادات.
Novaseq 150PEنوفوجينN / Aالتسلسل
بارافورمالدهيد (PFA) 32٪ محلول مائي EMالمجهر الإلكترونيمن الدرجة 15714-Sتمييع إلى التركيز النهائي بنسبة 4٪ مع 1x PBS & nbsp ؛ لإجراء تثبيت الأنسجة.
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-049جاهز للاستخدام. استخدميه لتخفيف حمض PFA وإجراء عمليات الغسيل كما هو مذكور في تعليمات الطريقة.
Premiere الأنسجة الحمام العائم  A84600061يستخدم فيشر العلميلإزالة التجاعيد من أقسام FFPE كما هو مذكور في الإرشادات.
RNase AWAY التطهير السطحيالمزيل للتلوث الحراري فيشر العلمي7002استخدم لتنظيف جميع الأسطح كما هو مذكور في تعليمات الطريقة.
RNeasy DSP FFPE KitQiagen73604استخدم لعزل الحمض النووي الريبي من أقسام FFPE بمجرد إنشائها كما هو مذكور في الإرشادات.
تستخدم الأنظمة الحيوية الدقيقة الدوارة شبه الآليةLeicaBiosystems RM2245لقسم كتل FFPE كما هو مذكور في الإرشادات.
هيدروكسيد الصوديومMillipore SigmaS8045-500تحضير محلول 10 N عن طريق إذابة 400 جم ببطء في 1 لتر من ماء Milli-Q.
Space Ranger10X Genomics2.0.1تستخدم لمعالجة إخراج بيانات التسلسل.
39601006 الجراحي ParaplastLeica Biosystemsلإجراء تضخيم الأنسجة وتضمينها كما هو مذكور في تعليمات الطريقة.
مجموعة ملحقات Visium10X GenomicsPN-1000194تستخدم لإجراء تجارب النسخ المكانية.
طقم مسبار النسخ البشري Visium صغير   ؛10X GenomicsPN-1000363تستخدم لإجراء تجارب النسخ المكاني.
مجموعة شرائح التعبير الجيني المكاني Visium 4 rxns 10X GenomicsPN-1000188استخدم لوضع الأقسام في حالة إجراء تجارب النسخ المكاني.
3803665تستخدم XyleneLeica Biosystemsلإجراء إزالة الأنسجة كما هو مذكور في تعليمات الطريقة.
المستوى علوم يستخدم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baig, M. A., Bacha, D. Histology. Bone. , StatPearls Publishing. (2024).
  2. Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
  3. Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707(2010).
  4. Wallington, E. A. Histological Methods for Bone. , Butterworths. London. (1972).
  5. Callis, G. M., Sterchi, D. L. Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology. J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).
  6. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies. Int J Genomics. 2017, 1926304(2017).
  7. Trinks, A., et al. Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue. Cell Oncol (Dordr). , (2024).
  8. Xu, Z., et al. High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq. Nat Commun. 14 (1), 2734(2023).
  9. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE - User Guide., Document Number C CG000407 Rev C. 10x Genomics. , (2021).
  10. 10x Genomics. Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A. 10x Genomics. , (2022).
  11. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D. 10x Genomics. , (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsBone TissueDecalcification ProtocolRNA PreservationFFPE SectioningOsteosarcoma MetastasisTissue MorphologyH E StainingRNA IntegrityMicrotome Sectioning

Related Articles