مقالة منهجية

تحول الميتوكوندريا في بيكر

2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66856

⸱

يونيو 7, 2024

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يشرح هذا العمل كيفية تحويل ميتوكوندريا الخميرة باستخدام طريقة بيولوجية. نوضح أيضا كيفية اختيار وتنقية المحولات وكيفية إدخال الطفرة المطلوبة في الموضع المستهدف داخل جينوم الميتوكوندريا.

الملخص

تم استخدام خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae على نطاق واسع لفهم بيولوجيا الميتوكوندريا لعقود. قدم هذا النموذج المعرفة حول مسارات الميتوكوندريا الأساسية والمحفوظة بين حقيقيات النوى والفطريات أو المسارات الخاصة بالخميرة. واحدة من القدرات العديدة ل S. cerevisiae هي القدرة على التعامل مع جينوم الميتوكوندريا ، وهو أمر ممكن حتى الآن فقط في S. cerevisiae والطحالب أحادية الخلية Chlamydomonas reinhardtii. يسمح لنا التحول البيولوجي لميتوكوندريا الخميرة بإدخال طفرات موجهة للموقع ، وإعادة ترتيب الجينات ، وتقديم المراسلين. تستخدم هذه الأساليب بشكل أساسي لفهم آليات عمليتين منسقتين للغاية في الميتوكوندريا: الترجمة بواسطة mitoribosomes وتجميع المجمعات التنفسية و ATP synthase. ومع ذلك ، يمكن استخدام تحويل الميتوكوندريا لدراسة مسارات أخرى. في العمل الحالي ، نوضح كيفية تحويل ميتوكوندريا الخميرة عن طريق قصف المقذوفات الدقيقة عالية السرعة ، واختيار وتنقية المحول المقصود ، وإدخال الطفرة المطلوبة في جينوم الميتوكوندريا.

المقدمة

الخميرة Saccharomyces cerevisiae هو نموذج معترف به على نطاق واسع يستخدم لدراسة التكوين الحيوي للميتوكوندريا. نظرا لأن الخميرة كائن لاهوائي اختياري ، فمن الممكن إجراء دراسة واسعة النطاق لأسباب وعواقب إدخال طفرات تضعف التنفس. بالإضافة إلى ذلك ، يمتلك هذا الكائن أدوات وراثية وكيميائية حيوية صديقة لدراسة مسارات الميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن أحد أقوى الموارد لاستكشاف آليات تجميع مجمع الجهاز التنفسي وتخليق بروتين الميتوكوندريا هو القدرة على تحويل الميتوكوندريا وتعديل جينوم العضية. في السابق ، كان من المفيد إدخال طفرات في نقطة الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) أو عمليات حذف / إدراج صغيرة1،2،3،4،5 ، وحذف الجينات 6,7 ، وإعادة ترتيب الجينات 7,8 ، وإضافة حواتم إلى بروتينات الميتوكوندريا 9,10 ، ونقل الجينات من النواة إلى الميتوكوندريا11 ،12 ، وإدخال جينات المراسل مثل BarStar13 و GFP14,15 و luciferase16 والأكثر استخداما ARG8m 17,18. سمحت لنا تعديلات جينوم الميتوكوندريا بتشريح وتحديد الآليات التي كان من الصعب فهمها لولا ذلك. على سبيل المثال ، كان جين مراسل ARG8m الذي تم إدخاله في موضع COX1 في الحمض النووي للميتوكوندريا حاسما لفهم أن Mss51 له دور مزدوج في التكوين الحيوي Cox1. أولا ، إنه منشط متعدي ل COX1 mRNA ، وثانيا ، إنه مرافق تجميع لبروتين Cox1 المصنوع حديثا 7,19. يقدم هذا العمل طريقة مفصلة لتحويل S. cerevisiae الميتوكوندريا. على الرغم من نشر بروتوكول تحويل الميتوكوندريا في وقت سابق16،20،21،22،23 ، إلا أن النهج المرئي من خلال الفيديو ضروري لفهم المراحل والتفاصيل المختلفة للطريقة بدقة. تتكون الطريقة من خطوات مختلفة وتنقسم إلى أربع مراحل عامة:

مخطط عملية تحرير الجينات ؛ جزيئات التنغستن ، طلاء الحمض النووي ، خطوات تكامل جينوم الميتوكوندريا.
الشكل 1: نظرة عامة على إجراء تحويل الميتوكوندريا بواسطة قصف المقذوفات الدقيقة عالية السرعة: 1) يتم تعقيم جزيئات التنغستن وتحضيرها قبل طلاء الحمض النووي. 2) يتم ترسيب اثنين من البلازميدات المختلفة على سطح WPS. أحدهما عبارة عن بلازميد بكتيري يحتوي على البنية التي سيتم توجيهها إلى مصفوفة الميتوكوندريا. والآخر هو ناقل تعبير فطر الخميرة النووي الذي يحمل علامة التغذية الأكسجة. 3) تزرع سلالة خميرة مستقبلات تفتقر إلى الحمض النووي للميتوكوندريا (rho0) على مصدر كربون مخمر مثل الجالاكتوز أو رافينوز ، والذي لا يمارس أي قمع للجلوكوز للتعبير الجيني للميتوكوندريا34,35. تنتشر الثقافة على أطباق بتري التي تحتوي على وسط القصف. 4) يتم إطلاق WPs المغلفة بالبلازميدات على سلالة المستقبلات عن طريق قصف المقذوفات الدقيقة عالية السرعة. 5) يتم اختيار مستعمرات الرو الاصطناعية الإيجابية التي تحتوي على بلازميد الميتوكوندريا عن طريق التزاوج مع سلالة اختبار. 6) يتم دمج بنية الميتوكوندريا في جينوم الميتوكوندريا في الموضع المطلوب عن طريق تزاوج سلالة الرو الاصطناعية (المانحة) مع سلالة المستقبل من خلال عملية تعرف باسم duction الخلوي. 7) يتم اختيار المستقبل الإيجابي ، سلالة أحادية الصيغة الصبغية تحمل بنية الميتوكوندريا وتنقيتها في وسائط مختلفة. الاختصارات: WPs = جزيئات التنغستن. mtDNA = الحمض النووي للميتوكوندريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحول الخلايا ذات بنية الحمض النووي التي تهدف إلى الاندماج في جينوم الميتوكوندريا (الشكل 1 ، الخطوات 1-4)
على الرغم من أنه من الممكن تحويل الخميرة التي تحتوي على جينوم ميتوكوندريا كامل (rho +) مباشرة ، إلا أن التحول يكون أكثر كفاءة بمقدار 10-20 مرة إذا كانت الخلايا تفتقر إلى الحمض النووي للميتوكوندريا (rho0) 24. جزيئات التنغستن (WPs) مغلفة ببلازميدات مختلفة سيتم تحويلها بشكل مشترك. الأول هو ناقل تعبير μ الخميرة 2 يحمل علامة auxotrophy ، مثل LEU2 أو URA3 (على سبيل المثال ، YEp351 أو YEp352 ، على التوالي). إذا نجح الإدخال البيولوجي للحمض النووي في خلايا الخميرة ، فسوف تنمو المحولات على وسط التغذية الأوكسوجينية (أي وسط يفتقر إلى الليوسين أو اليوراسيل). هذا البلازميد مفيد في إجراء الاختيار الأول للخلايا التي اكتسبت البلازميد النووي. خلاف ذلك ، فإن عدد المستعمرات الناتجة سوف يشبع اللوحة. البلازميد الثاني هو بلازميد بكتيري (مثل pBluescript أو ما شابه) يحتوي على بنية الميتوكوندريا المراد دمجها في جينوم الميتوكوندريا. يجب أن يحتوي البناء على 100 nt على الأقل من تسلسلات الميتوكوندريا المحيطة ب 5 'و 3' لإعادة التركيب مع منطقة الميتوكوندريا ذات الأهمية. في تجربتنا ، من المرجح أن تتحد التسلسلات المرافقة الأكبر بنجاح مع الموضع المستهدف في جينوم الميتوكوندريا.

يظهر مثال محدد في الشكل 225. في هذا المثال ، كان الهدف هو حذف منطقة ترميز جين الميتوكوندريا COX1 لآخر 15 حمضا أمينيا للبروتين المقابل (Cox1ΔC15) (الشكل 2A). احتوت البلازميد البكتيرية التي تحمل طفرة COX1ΔC15 على 395 nt و 990 nt من مناطق الجين غير المترجمة 5 'و 3' ، على التوالي. تم اشتقاق البلازميد من pBluescript (pXPM61) ، جنبا إلى جنب مع 2 μ البلازميد YEp352 ، تم نسخها على سطح WPs (الشكل 2B). ثم تم إدخال WPs عن طريق قصف المقذوفات الدقيقة في سلالة المتلقي المختارة (الشكل 2C). هذه السلالة ، المسماة NAB6926 ، هي سلالة MATa ، rho0 تحمل أليلات kar1-1 و ade2 (تتم مناقشة أهمية هذه الخصائص أدناه). تم طلاء الخلايا على وسائط قصف تفتقر إلى اليوراسيل لاختيار تلك التي اكتسبت بلازميد 2 μ (الشكل 2C). نمت الخلايا لمدة 5-7 ليال عند 30 درجة مئوية.

اختيار الخلايا التي اكتسبت البلازميد البكتيري الذي يحتوي على بنية الميتوكوندريا والبلازميد النووي 2 μ الذي يحمل علامة التغذية auxotrophy (الشكل 1 ، الخطوة 5)
ستحتفظ المستعمرات الموجبة بالعديد من نسخ البلازميد البكتيري في الميتوكوندريا22. نظرا لأن الخلايا المحولة هي في الأصل rho0 ، فلا توجد تسلسلات ميتوكوندريا تدعم ترجمة بنية الميتوكوندريا الموجودة في البلازميد. ومن ثم، لن يتم التعبير عن جين الميتوكوندريا المتحول. من الضروري تزاوج المحولات مع سلالة اختبار للكشف عن مستعمرات الخميرة التي اكتسبت بلازميد الميتوكوندريا. يحتوي جينوم الميتوكوندريا لسلالة الاختبار على نسخة متحولة غير وظيفية من الجين محل الاهتمام. بعد التزاوج ، سوف تندمج الميتوكوندريا ، وسوف يتحد تسلسل الميتوكوندريا المتضمن في البلازميد المحول مع جين الميتوكوندريا المتحور من سلالة المختبر. وبالتالي ، فإن استعادة جين WT سيعيد تشكيل الوظيفة. سيكون لثنائي الصبغيات الناتج نمط ظاهري إيجابي يمكن اكتشافه (عادة ما تكون القدرة على النمو في وسط تنفسي أو وسط يفتقر إلى الأرجينين). تسمى الخلايا الإيجابية التي تحمل البلازميد البكتيري في الميتوكوندريا "خلايا رو الاصطناعية". في المثال المحدد للشكل 2D ، كانت خلايا rho- الاصطناعية التي تحمل بنية COX1ΔC15 (المسماة XPM199) مطلية بنسخة طبق الأصل على وسط يفتقر إلى اليوراسيل (هذه هي اللوحة الرئيسية التي تم تنقية المستعمرات الإيجابية منها). كما تم طلاؤها على نسخة طبق الأصل على سلالة اختبار L4527 في الحديقة ، والتي تحتوي على الطفرة غير الوظيفية cox1D369N. بعد التزاوج لمدة ليلتين ، أعيد دمج جينوم الميتوكوندريا L45 و XPM199 ، مما أدى إلى جين COX1 وظيفي. لذلك ، استعادت ثنائيات الصبغيات القدرة على النمو على وسائط الجهاز التنفسي. من اللوحة الرئيسية ، اخترنا المستعمرات الإيجابية. تم تخطيطها على ألواح تفتقر إلى اليوراسيل ، وتكررت الاختبارات الانتقائية للحصول على خلايا رو اصطناعية نقية (الشكل 2E). من المهم ملاحظة أن لوحة الاختبار مخصصة فقط لتحديد مستعمرات الرو الاصطناعية ، ولا يمكن استرداد الطفرات من هذه اللوحات.

دمج البناء في جينوم الميتوكوندريا للسلالة المقصودة
يتم تحقيق هذه الخطوة من خلال عملية تسمى التحفيز الخلوي28,29 (الشكل 1 ، الخطوة 6). في هذا النهج ، يتم تزاوج سلالة rho- الاصطناعية (سلالة المانح) مع سلالة المستقبل المقصود من نوع التزاوج المعاكس. أحد المتطلبات الأساسية هو أن تحمل واحدة على الأقل من سلالتي التزاوج طفرة kar1-1 لإعاقة الاندماج النووي30. ومن ثم، ينتج عن تزاوج الخليتين زيجوت ثنائي النواة (الشكل 3). تندمج شبكة الميتوكوندريا من الخلايا الأبوية (المتبرع والمستقبل) وتتحد جزيئات الحمض النووي للميتوكوندريا. يتم تحضين/استعادة الزيجوت ثنائي النواة للسماح بالتبرعم، وهو ما ينتج خلايا أحادية الصيغة الصبغية. تحمل هذه الأحاديات الصيغة الصبغية الخلفية النووية لإحدى الخلايا الأبوية. وبالمثل ، يمكن أن تحمل الأحاديات الصيغة الصبغية الحمض النووي للميتوكوندريا من الخلية الأبوية أو الحمض النووي للميتوكوندريا المعاد تجميعه محل الاهتمام. ومع ذلك ، فإن طفرة kar1-1 ليست فعالة بنسبة 100٪ ، وسيتم تشكيل بعض ثنائيات الصيغة الصبغية الحقيقية أثناء التزاوج28,29. حملت سلالة rho الاصطناعية (المانحة ، XPM199) أليل kar1-1 في المثال. كعلامة انتقائية ، كان يحتوي على أليل ade2 ، مما يجعله تغذية أكسوفية للأدينين (الشكل 4). كانت سلالة المستقبل XPM10 ، وهي سلالة rho + تحمل بنية cox1Δ::ARG8m ، حيث حل المراسل ARG8m محل كودونات COX1 في جينوم الميتوكوندريا7. تمت إضافة خليط من كل من ثقافات الخلايا إلى لوحة YPD كقطرة للسماح بالتزاوج. بعد 3-5 ساعات ، تمت ملاحظة الخلايا تحت المجهر الضوئي للكشف عن تكوين شموس (الشكل 3 ب) ، وهو شكل خلية مرتبط بالتزاوج. بعد وقت الحضانة / الشفاء ، تم طلاء الزيجوت ثنائي النواة على وسط يفتقر إلى الأدينين لمنع نمو الخلايا المانحة.

اختيار السلالة الأحادية الصيغة الصبغية التي تحمل جينوم الميتوكوندريا محل الاهتمام (الشكل 1 ، الخطوة 7)
يوجد خليط من الخلايا المانحة والمستقبلة والخلايا الثنائية الصيغة الصبغية بعد الحث الخلوي. لذلك ، بعد حضانة / استعادة الزيجوت ثنائي النواة ، يجب أن تنمو الخلايا في وسائط انتقائية مختلفة لتحديد وتنقية الأحاديات الصيغة الصبغية ذات الأهمية. تعتمد الوسائط الانتقائية على الأنماط الجينية للمتبرع ، والسلالات المتقبلة ، وبناء الميتوكوندريا المقصود. ومع ذلك ، بشكل عام ، فإن سبب اختيار الوسائط الانتقائية هو: أ) بعد الحضانة / الشفاء ، يزرع مزيج التكاثر الخلوي على وسط انتقائي حيث لا يمكن أن تنمو سلالة الوالدين المتبرعين. في المثال المحدد في الشكل 4 أ ، ب ، يحمل المتبرع (سلالة rho الاصطناعية) أليل ade2 غير الوظيفي. وبالتالي ، يجب تحضين مزيج الخلوي على صفيحة متوسطة تفتقر إلى الأدينين. هذه هي اللوحة الرئيسية. ب) بمجرد نمو المستعمرات ، يتم تكرار الصفيحة الرئيسية مرة أخرى على وسط يفتقر إلى الأدينين (لتوليد صفيحة رئيسية جديدة حيث سيتم تنقية المستعمرات الإيجابية ذات الأهمية) ، وبعد ذلك ، على وسط حيث يمكن أن تنمو ثنائيات الصيغة الصبغية فقط. هذا ضروري لتجنب المزيد من التنقية غير المقصودة للمستعمرات ثنائية الصبغية. في حالة المثال من الشكل 4C ، يمكن أن تنمو ثنائيات الصيغة الصبغية فقط على الوسائط التي تفتقر إلى الليوسين. ج) يتم تكرار اللوحة الرئيسية أيضا على الوسائط حيث ستنمو فقط تلك الأحاديات الصبغية المتقبلة التي تضمنت الحمض النووي للميتوكوندريا محل الاهتمام. في مثال الشكل 4C ، تنمو الأحاديات الصيغة الصبغية على وسط تنفسي يحتوي على الإيثانول / الجلسرين كمصدر للكربون لأن بروتين Cox1ΔC15 يعمل. تم تسمية سلالة rho + الناتجة التي تحمل mtDNA محل الاهتمام XPM20925. السلالات المستخدمة في الشكل 2 والشكل 4 مذكورة في الجدول 1.

عملية تحرير جينات الخميرة ، رسم تخطيطي مع mtDNA و COX1ΔC15 ، بلازميد URA3 ، سلالة rho⁻ الاصطناعية.
الشكل 2: شكل يصف مثالا محددا لتحول الميتوكوندريا واختيار خلايا الرو الموجبة. (أ) كان التعديل المقصود لجينوم الميتوكوندريا هو حذف ترميز المنطقة لآخر 15 حمضا أمينيا للوحدة الفرعية Cox1 (Cox1ΔC15). (ب) تم طلاء WPs ببلازميدين لتحويل خلايا فطر الخميرة. أحدهما كان 2 μ بلازميد Yep352 الذي تم توجيهه والتعبير عنه في النواة. والآخر كان البلازميد pXPM61 ، الذي يحتوي على أليل COX1ΔC15 بالإضافة إلى 395 nt و 990 nt من COX1 5 'و 3'-UTRs ، على التوالي. (ج) تم إدخال WPs في الخلايا من سلالة NAB69 ، التي تفتقر إلى الحمض النووي للميتوكوندريا (سلالة rho0). تم تكرار المستعمرات المحولة التي تم الحصول عليها من ألواح القصف على وسط يفتقر إلى اليوراسيل ، وهو علامة التغذية الذاتية للبلازميد النووي YEp352. (د) لتحديد مستعمرات الرو الموجبة، تضاعفت صفيحة -URA على وسط يفتقر إلى اليوراسيل. كانت هذه هي اللوحة الرئيسية التي تم اختيار المستعمرات الإيجابية منها وعزلها. كما تم تكراره على لوحات ذات وسائط غنية (YPD) وعشب من سلالة اختبار. أثناء التزاوج ، تم إعادة دمج الحمض النووي للميتوكوندريا الاصطناعية مع الحمض النووي للميتوكوندريا من سلالة الاختبار ، L4527 ، والتي تحمل طفرة في جين COX1 (D369N). احتوت ثنائيات الصيغة الصبغية التي نمت على وسائط الجهاز التنفسي على الحمض النووي المحول. تم اختيار المستعمرات المقابلة من اللوحة الرئيسية لإعادة تنقيتها وتنقيتها. للمساعدة في تحديد المستعمرات الموجبة في اللوحة الرئيسية في جميع أنحاء الطلاء المتماثل ، تم عمل علامات بعلامة دائمة على حواف الألواح (الخطوط الخضراء). (ه) تم إعادة تكوين المستعمرات الموجبة المختارة على وسط يفتقر إلى اليوراسيل. كانت هذه اللوحة الرئيسية الجديدة. كما هو الحال في D ، تم إجراء جولتين أخريين من الاختبارات لتنقية مستعمرات الرو الاصطناعية. الاختصارات: WPs = جزيئات التنغستن. mtDNA = الحمض النووي للميتوكوندريا. -URA / Sorb = تفتقر إلى اليوراسيل / المحتوي على السوربيتول ؛ WT = النوع البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عملية اندماج خلايا الخميرة. صورة الرسم البياني والمجهر ؛ نقل رو + مراحل التزاوج البيولوجيا الخلوية.
الشكل 3: شكل يصف إجراء التحفيز الخلوي. أ: نظرة عامة على كيفية تزاوج الخلايا أثناء التحفيز الخلوي. أثناء التحفيز الخلوي ، تندمج الميتوكوندريا من سلالات المتبرع والمستقبل بحيث يتحد الحمض النووي للميتوكوندريا من كلتا السلالتين. منذ انخفاض الاندماج النووي بسبب طفرة kar1-1 30 ، تتشكل زيجوت ثنائية النواة. بعد بعض وقت الحضانة / التعافي ، يتم اختيار برعم الزيجوت ثنائي النواة والمستقبلات أحادية الصيغة الصبغية التي تحتوي على طفرة الميتوكوندريا المقصودة. (ب) يسمح تزاوج سلالة الرو الاصطناعية (المانحة) والسلالة المستقبلة من خلال الاستقطاب الخلوي بتكوين شموس (الأسهم الحمراء) ، وهو شكل مميز لخميرة التزاوج. تم التقاط الصورة تحت المجهر الضوئي بهدف 100x. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط العبور الجيني للخميرة يوضح المتبرع XPM199 والمتقبل XPM10 ، مما يسلط الضوء على الطلاء الرئيسي ADE وعملية النمو المؤتلف لتكامل الحمض النووي.
الشكل 4: شكل يصف مثالا محددا للتحضير الخلوي لدمج الطفرة COX1ΔC15 في جينوم الميتوكوندريا. (أ) تم خلط الثقافات السائلة لسلالة الرو الاصطناعية (المانح ، XPM199) والسلالة محل الاهتمام (المستقبل ، XPM10) للتزاوج. بعد تشكيل shmoo ، تم استرداد المزيج في ثقافة سائلة لمدة 2-4 ساعات. بعد ذلك ، تم نشر مزيج التجويد الخلوي على طبق به وسط يفتقر إلى الأدينين لمنع نمو الخلايا المانحة. (ب) تمثيل تخطيطي لأحداث إعادة تركيب الحمض النووي للميتوكوندريا من المتبرع (XPM199) والمستقبل (XPM10) أثناء الاستنباط الخلوي. (ج) تضاعفت الصفيحة الرئيسية على وسائط انتقائية مختلفة لتحديد وتنقية تلك الأحاديات الصيغة الصبغية التي دمجت جين الميتوكوندريا المقصود في الحمض النووي للعضية (XPM209)25. الاختصارات: -ADE = تفتقر إلى الأدينين ؛ -LEU = نقص الليوسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البروتوكول

ملاحظة: نوصي بإجراء ستة تحويلات لكل بنية لأن كفاءة تحويل الميتوكوندريا عادة ما تكون منخفضة. ويبين الجدول 2 تكوين وسائط النمو المختلفة.

1. إعداد جزيئات التنغستن

  1. تزن 30 ملغ من جزيئات التنغستن 0.7 ميكرومتر (WPs ، الناقلات الدقيقة) في أنبوب صغير. أضف 1.5 مل من 70٪ إيثانول (EtOH) للتعقيم. دوامة WPs واتركها ترتاح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. أجهزة الطرد المركزي عند 13200 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل WPs بإضافة 1.5 مل من الماء المعقم إلى الجسيمات ، ودوامة لها ، والطرد المركزي عند 13200 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية.
  3. أضف 500 ميكرولتر من الجلسرين المعقم بنسبة 50٪ (التركيز النهائي هو 60 ميكروغرام من WPs / μL).
    ملاحظة: يمكن تخزين WPs في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل. من هذا المخزون ، خذ الكمية المطلوبة لستة تحويلات (100 ميكرولتر).

2. طلاء الحمض النووي WPs

  1. أضف 5 ميكروغرام من البلازميد 2 μ و 15 ميكروغرام من البلازميد البكتيري الذي يحتوي على تسلسل الميتوكوندريا إلى أنبوب دقيق على الجليد.
    ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الحجم النهائي 50 ميكرولتر لتجنب المزيد من تمييع الكواشف اللازمة لطلاء الحمض النووي.
  2. أضف 100 ميكرولتر من تعليق WP والدوامة لمدة 5 ثوان (6 مجم من WP).
  3. أضف 4 ميكرولتر من 1 م سبيرميدين. دوامة لفترة وجيزة.
  4. أضف 100 ميكرولتر من الثلج البارد 2.5 M CaCl2 ، دوامة لفترة وجيزة. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. دوامة لفترة وجيزة المزيج كل 3 دقائق.
    ملاحظة: يتم تعقيم محلول CaCl2 بالفلتر ويجب عدم تعقيمه.
  5. أجهزة الطرد المركزي WPs لمدة 30 ثانية عند 13200 × جم عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. اغسل الجسيمات عن طريق تعليقها برفق في 200 ميكرولتر من 100٪ EtOH عند -20 درجة مئوية.
  6. أجهزة الطرد المركزي WPs لمدة 30 ثانية عند 13200 × جم عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. كرر الغسيل.
  7. إعادة تعليق WPs في 60-70 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 100٪ EtOH باستخدام طرف ماصة ؛ لا دوامة.
    ملاحظة: لضمان جودة البلازميدات ، يجب إجراء طلاء الحمض النووي في نفس يوم التحول البيولوجي.

3. إعداد المواد البيولوجية

  1. قبل القصف ، قم بتعقيم ستة حاملات كبيرة (الشكل 5) في الأوتوكلاف وجففها تماما. بدلا من ذلك ، نقعها في EtOH وتعقيمها باستخدام اللهب بمساعدة الملقط. ضعها على صفيحة زجاجية معقمة.
  2. أثناء ترسيب الحمض النووي (حضانة لمدة 10 دقائق على الجليد في الخطوة 2.4) ، أدخل ستة ناقلات كبيرة (أو أقراص طائرة) في كل واحد من حاملي الناقلات الكبيرة الستة بمساعدة ملقط معقم.
    ملاحظة: لا تقم بتعقيم الناقلات الكبيرة.
  3. امزج WPs المغلفة بالحمض النووي مع الماصة. أضف 10 ميكرولتر من WPs إلى كل سطح ناقل كبير وقم بتوزيعه على السطح بأكمله باستخدام طرف الماصة. إذا لزم الأمر ، أضف بضعة ميكرولترات إضافية من 100٪ EtOH إلى سطح الناقل الكلي لعمل انتشار متساو ل WPS. دع التعليق يجف في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 20 دقيقة.

4. تحضير خلايا الخميرة وألواح القصف

  1. تلقيح سلالة مستقبلات rho0 على 2 مل من وسط YPR (الجدول 2). تنمو لليلة واحدة عند 30 درجة مئوية في عجلة دوارة.
  2. تمييع 300 ميكرولتر من الثقافة في 30 مل من وسط YPR الطازج. تنمو عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة على شاكر دوار لمدة ليلتين حتى تتشبع الثقافة.
  3. أجهزة الطرد المركزي خلايا الخميرة في 600 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق خلايا الخميرة في 600 ميكرولتر من وسط YPD (الجدول 2).
  4. باستخدام مقبض زجاجي معقم ، انشر 100 ميكرولتر من تعليق خلية الخميرة على صفيحة متوسطة للقصف الصلب.
    ملاحظة: يجب أن يفتقر وسط القصف إلى علامة اختيار البلازميد 2 μ الذي سيتم استخدامه للتحول.
  5. كرر الخطوة 4.4 للألواح الخمس الأخرى.
  6. احتضان لمدة 1-3 ساعات في درجة حرارة الغرفة قبل القصف لضمان امتصاص الوسط السائل بالكامل على سطح اللوحة.

5. توليد سلالة رو الاصطناعية عن طريق التحول البيولوجي

ملاحظة: قبل البدء ، تأكد من قراءة دليل المستخدم للمعدات الحيوية. سنصف بروتوكول المعدات المشار إليها (جدول المواد والشكل 5).

  1. نظف حجرة نظام توصيل الجسيمات البيولوجية بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع التلوث واتركها لمدة 10 دقائق على الأقل. قبل القصف مباشرة ، امسح السطح بمنشفة ورقية نظيفة.
  2. افتح صمامات خزان الهيليوم لضبط حوالي 2000 رطل / بوصة مربعة.
  3. قم بتشغيل الجهاز وتشغيل مصدر الفراغ.
  4. باستخدام الملقط ، ضع الناقل الكبير متجها لأسفل على حامل الناقل الكبير.
    ملاحظة: لا تستخدم شاشة التوقف المرفقة مع الجهاز.
  5. قم بربط غطاء الناقل الكبير أعلى الناقل الكبير. تشكل جميع الأجزاء معا نظام إطلاق الناقل الصغير (الشكل 5).
  6. ضع نظام إطلاق الناقل الصغير داخل غرفة التفريغ في المستوى الخامس من الأسفل.
  7. ضع إحدى اللوحات التي تحتوي على عشب سلالة rho0 في المستوى الثاني من أسفل الغرفة. تأكد من أن اللوحة متجهة لأعلى وبدون غطاء.
  8. باستخدام ملقط معقم ، ضع قرص تمزق واحد على غطاء الاحتفاظ. المسمار غطاء الاحتفاظ على أنبوب التسارع ؛ تأكد من أن غطاء الاحتفاظ محكم.
    ملاحظة: لا تعالج الأقراص الممزقة بالإيزوبروبانول كما هو مقترح في الدليل لأننا لاحظنا أن كفاءة التحويل تنخفض.
  9. أغلق باب غرفة التفريغ.
  10. ضع مفتاح VAC / VENT / HOLD في وضع VAC . عند الوصول إلى فراغ 25-28 بوصة زئبق ، قم بتغيير مفتاح VAC / VENT / HOLD إلى وضع HOLD .
    ملاحظة: اعلم أن الفراغ القابل للتحقيق يمكن أن يختلف وفقا لمستوى سطح البحر. وجدنا نجاحا يصل إلى 25 بوصة زئبقية.
  11. اضغط على مفتاح FIRE لتصوير WPS. انتظر حتى يتراكم الضغط في أنبوب التسارع حتى يصل إلى 1300 رطل لكل بوصة مربعة عندما ينكسر قرص التمزق ، مما يصدر صوتا فرقعة.
  12. مباشرة بعد كسر قرص التمزق ، يتم تحرير مفتاح FIRE والفراغ عن طريق تغيير مفتاح VAC / VENT / HOLD إلى وضع VENT .
  13. بعناية ، باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة أي حطام من قرص التمزق الموجود على سطح اللوحة وقم بتغطية اللوحة بغطاءها.
  14. كرر الإجراء للوحات الخمس المتبقية ، ووضع قرص تمزق جديد وناقل كبير في كل جولة.
  15. في النهاية ، أغلق الصمام الرئيسي لخزان الهيليوم.
  16. أغلق الحجرة وقم ببناء فراغ عن طريق أخذ مفتاح VAC / VENT / HOLD إلى وضع VAC . حرر النظام من أي ضغط هيليوم عن طريق الضغط على مفتاح FIRE وتحريره عدة مرات. كرر مع فتح الباب.
  17. قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ ومعدات القصف.
  18. قم بتنظيف نظام التوصيل بنسبة 70٪ EtOH. اغسل دعامات الناقل الكلي بمحلول SDS بنسبة 0.1٪ ؛ شطف بالماء المقطر المعقم و 100 ٪ EtOH.

6. اختيار مستعمرة رو الاصطناعية

  1. احتضان لوحات القصف لمدة 5-7 ليال عند 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المهم فحص الألواح يوميا بحثا عن التلوث. إذا لزم الأمر ، يمكن قطع المنطقة الملوثة بملعقة معقمة لتجنب المزيد من التلوث.
  2. قم بتلقيح سلالة الاختبار من نوع التزاوج المعاكس في 2 مل من وسط YPD طوال الليل (انظر المثال المحدد في الشكل 2D ، E).
  3. تلقيح 150 ميكرولتر من مزرعة سلالة الاختبار على لوحة YPD. باستخدام مقبض زجاجي معقم ، انشر جهاز الاختبار بالتساوي على سطح اللوحة. اترك الطبق يجف لمدة 5 دقائق على الأقل.
  4. اصنع نسخا طبق الأصل من ألواح القصف باستخدام وسادات تكرار مخملية وختم مكرر.
    1. قم بالتكرار على صفيحة متوسطة منسدلة تتوافق مع علامة التغذية الأوكسومية البلازميدية المحولة 2 μ. يستغرق النمو حضانة واحدة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية. بعد ذلك ، يخزن على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. هذه اللوحة هي اللوحة الرئيسية.
    2. قم بالتكرار على لوحة YPD التي تحتوي على حديقة المختبر من الخطوة 6.3. احتضان في 30 درجة مئوية لمدة ليلتين. بعد ذلك ، قم بتكرار هذه اللوحة على الوسط الانتقائي للكشف عن وجود جين الميتوكوندريا محل الاهتمام ، على سبيل المثال ، وسط تنفسي أو وسط يفتقر إلى الأرجينين ، واحتضانه طوال الليل عند 30 درجة مئوية. فقط الخلايا التي تحتوي على البلازميد البكتيري الاصطناعي في الميتوكوندريا ستنمو على الوسط الانتقائي بعد التزاوج مع سلالة الاختبار.
  5. حدد على اللوحة الرئيسية (الخطوة 6.4.1) المستعمرات المقابلة التي نمت في الخطوة 6.4.2.
    ملاحظة: نظرا لأن لوحة القصف (وبالتالي اللوحة الرئيسية) مزدحمة بمستعمرات التحويل ، فقد يكون من الصعب تحديد تلك المستعمرات الإيجابية التي لوحظت على لوحة تزاوج المختبر. لهذا السبب ، يوصى بشدة برسم خطين صغيرين على كل جانب من جميع اللوحات بعلامة دائمة. ارسم خطوطا مماثلة على حلقة ختم النسخ المتماثل. ستكون هذه الخطوط مفيدة في توجيه وتحديد موقع المستعمرات الموجبة على اللوحة الرئيسية (انظر المثال في الشكل 2D).
  6. تنقية المستعمرات الموجبة عن طريق ربطها من اللوحة الرئيسية إلى لوحة تسرب انتقائية ثانية ، كما في الخطوة 6.4.1. احتضان لمدة ليلتين عند 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: من الضروري أن يسمح الخط بنمو مستعمرات مفردة لضمان سلالة نقية.
  7. كرر عملية الاختيار (الخطوات 6.2-6.5) للتأكد من وجود البلازميد البكتيري في الميتوكوندريا.
    ملاحظة: عادة ، يمكن تكرار هذه العملية مرتين أخريين لاختيار سلالات rho الاصطناعية المستقرة.
  8. بمجرد أن تحافظ سلالة الرو الاصطناعية بثبات على الحمض النووي البلازميد في الميتوكوندريا ، حدد 3-5 مستعمرات إيجابية مختلفة وقم بتلقيحها في 2 مل من YPD. استخدم هذه المزرعة لتحضير مخزون كريوفيال (عن طريق خلط 600 ميكرولتر من الثقافة و 600 ميكرولتر من 50٪ من الجلسرين للحفاظ على -70 درجة مئوية) ولإدخال تسلسل البلازميد في mtDNA محل الاهتمام عن طريق التحفيز الخلوي (الخطوة 6.7).
    ملاحظة: نظرا لعدم وجود ضغط انتقائي للحفاظ على البلازميد المحول في الميتوكوندريا من سلالة الرو الاصطناعية ، يمكن فقدان البلازميد بسهولة. لذلك ، نوصي بإجراء التحفيز الخلوي في أسرع وقت ممكن.

7. دمج البناء الموجود في سلالة الرو الاصطناعية في الموقع المستهدف في جينوم الميتوكوندريا عن طريق التحفيز الخلوي

  1. تلقيح أنبوبين ب 3 مل من وسائط YPD ، أحدهما بالخلايا المانحة (الخلايا الاصطناعية rho) والآخر بالخلايا المستقبلة (خلية الخميرة حيث يتوقع البناء النهائي). احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  2. امزج 750 ميكرولتر من سلالة المتبرع و 250 ميكرولتر من سلالة المستقبلات في أنبوب دقيق معقم (نسبة 3: 1).
  3. الطرد المركزي الخليط لمدة 1 دقيقة في 13200 × غرام ؛ تخلص من المادة الطافية. باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل مع قطع النهاية ، خذ قطرة واحدة من حبيبات الخلية وضعها على لوحة YPD. احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعات.
    ملاحظة: لتجنب التلوث المتبادل ، لا تضع أكثر من معلقين خلويتين في لوحة واحدة (انظر المثال في الشكل 4A).
  4. خذ كمية صغيرة من خليط الخلية ، وأعد تعليقه في 15 ميكرولتر من الماء المعقم على شريحة ، وضع زلة غطاء. تحقق تحت المجهر الضوئي لوجود شموس بهدف 40x أو 100x ؛ يظهر هذا الشكل المميز عند وجود نوعين من التزاوج (الشكل 3 ب).
  5. في حالة وجود شموس ، أعد تعليق كمية صغيرة (~ 0.5 مم3) من كتلة الخلية في 2 مل من وسط YPD. احتضان لمدة 2 ساعة عند 30 درجة مئوية في عجلة دوارة للسماح للزيجوت ثنائي النواة بالتعافي.
  6. دوامة المزيج وتخفيف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في 990 ميكرولتر من الماء المعقم (1: 100 تخفيف). استخدم حبات زجاجية أو مقبض زجاجي معقم لنشر 100 ميكرولتر من تخفيف الخلية على وسط تسرب حيث تنمو فقط سلالة المستقبل (وثنائيات الصبغيات المتفرقة). احتضان لمدة 2-3 ليال عند 30 درجة مئوية.
  7. قم بتكرار المستعمرات الناتجة على الوسائط الانتقائية اللازمة كما هو موضح في المقدمة (المرحلة 4 ؛ انظر الشكل 4C للحصول على مثال محدد).
  8. بعد تحديد المستعمرات الإيجابية ، أعد تشغيلها على نفس الوسائط الانتقائية لتنقية السلالة الأحادية الصيغة الصبغية التي تحمل mtDNA محل الاهتمام.
  9. حدد مستعمرتين موجبة على الأقل وقم بزراعتهما على 2 مل من وسط YPD عند 30 درجة مئوية طوال الليل. قم بعمل نسخة احتياطية مبردة عن طريق خلط 600 ميكرولتر من 50٪ جلسرين مع 600 ميكرولتر من ثقافة YPD المشبعة. يحفظ في درجة حرارة -70 درجة مئوية.
  10. عزل الحمض النووي للسلالات الناتجة31,32. تضخيم المنطقة المرغوبة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل والتسلسل لتأكيد وجود طفرة الميتوكوندريا.
    ملاحظة: كل مستعمرة موجبة هي نسخة تقنية متماثلة يجب تأكيدها بشكل مستقل لضمان التسلسل الصحيح في جينوم الميتوكوندريا.

النتائج

يقدم هذا القسم بعض النتائج التمثيلية من المراحل المختلفة لتحول الميتوكوندريا. يوضح الشكل 6 إجراء القصف. حملت خلايا الرو الاصطناعية بلازميدا بكتيريا مع الجين المراسل ARG8m ، والذي سيحل محل تسلسل الترميز لجين الميتوكوندريا (الشكل 6 أ). بعد القصف ، تم تكرار اللوحة على وسط يفتقر إلى اليوراسيل (-URA) ؛ هذه هي اللوحة الرئيسية (الشكل 6 ب). تحتوي المستعمرات النامية على ناقل تعبير الخميرة مع علامة التغذية auxotrophy URA3 . وفقا لقسم البروتوكول 6 ، تم أيضا تكرار لوحة القصف على وسط YPD يحتوي على عشب من سلالة الاختبار. في هذه الحالة ، كانت سلالة الاختبار تؤوي أليلا معيبا من جين ARG8m في جينوم الميتوكوندريا (ARG8m-1) 1. بعد 2 ليال من الحضانة ، تزاوج العشب اختبار والخلايا المحولة ، واندمجت الميتوكوندريا. تم تكرار هذه اللوحة على وسط يفتقر إلى الأرجينين. فقط تلك الثنائيات الصيغة الصبغية التي تحتوي على بلازميد الميتوكوندريا كانت قادرة على النمو على هذا الوسط الانتقائي لأن جين ARG8m الموجود في سلالة rho- الاصطناعية حل محل ARG8m-1 المعيب من جينوم الميتوكوندريا لسلالة الاختبار.

يختلف عدد المستعمرات الموجبة بشكل عام من صفر إلى 20 لكل لوحة. في المثال الحالي ، تم الحصول على أربع مستعمرات اصطناعية إيجابية ، والتي تم تنقيتها عن طريق وضعها على وسط يفتقر إلى اليوراسيل. في الجولة الأولى من التنقية ، تم الحصول على العديد من المستعمرات السلبية جنبا إلى جنب مع المستعمرات الإيجابية. ومع ذلك ، بعد جولتين أو ثلاث جولات من التنقية ، من الممكن الحصول على سلالة rho الاصطناعية الإيجابية النقية. في الشكل 6C ، أظهرنا بضع مستعمرات رو اصطناعية إيجابية بعد ثلاث جولات من التنقية والاختبار. معظم المستعمرات من اللوحة الرئيسية -URA إيجابية لمسبار الاختبار. ومن المثير للاهتمام ، لا تحتوي جميع خلايا المستعمرة الإيجابية على بلازميد الميتوكوندريا ، مما يشير إلى أن البلازميد المحول قد فقد في مجموعة من سكان المستعمرة. هذه النتيجة متوقعة لأنه لا يوجد ضغط انتقائي للحفاظ على بلازميد الميتوكوندريا ، مما يجعله غير مستقر. ومع ذلك ، يمكن نقل سلالة rho الاصطناعية مثل تلك الموضحة في الشكل 6C إلى الخطوة التالية ، وهي الإخراج الخلوي (قسم البروتوكول 7) ، واستخدامها لإعداد المخزون ليتم تخزينه عند -70 درجة مئوية. يوضح الشكل 6D أيضا الجولة الثالثة من تنقية سلالة rho الاصطناعية. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، نظرا لأن المحولات كانت غير قادرة عمليا على الحفاظ على بلازميد الميتوكوندريا ، فقد تم التخلص منها.

وصفنا استراتيجية عامة واحدة لاختيار مستعمرات الرو الاصطناعية الإيجابية ، والتي يتم تقديمها في الشكل 7 أ. في هذه الحالة ، يحتوي بناء الميتوكوندريا الموجود في خلايا rho الاصطناعية على عدة مئات من النيوكليوتيدات لإعادة الاتحاد مع الحمض النووي للميتوكوندريا من سلالة الاختبار (على سبيل المثال ، يعاد دمج بنية COX1ΔC15 في سلالة rho الاصطناعية مع الجين المتحور cox1D369N على الحمض النووي للميتوكوندريا للمختبر (الشكل 2D) ؛ أو بناء cox1Δ::ARG8m في سلالة rho- الاصطناعية مع الجين المتحور ARG8m-1 في الحمض النووي للميتوكوندريا للمختبر (الشكل 6 أ). ومع ذلك ، إذا لم يكن هناك توافر لسلالة اختبار لاختيار خلايا الرو الاصطناعية الإيجابية ذات الأهمية ، فهناك نهج غير مباشر لاختيارها33. في هذه الحالة ، يجب أن يحتوي البلازميد البكتيري أيضا على جزء من جين الميتوكوندريا ، مثل COX2 أو COX3. تحتوي سلالة المختبر على نسخة غير وظيفية من جين cox2 أو cox3 للميتوكوندريا. في المثال المعطى ، يمكن أن يكمل تسلسل جزء cox3 الموجود في البلازميد البكتيري تسلسل cox3 الموجود في الميتوكوندريا الخاصة بالمختبر ، وبعد إعادة التركيب ، يوفر جين COX3 وظيفيا. بعد عبور خلايا rho الاصطناعية مع سلالة الاختبار ، يمكن أن تتنفس ثنائيات الصبغيات فقط إذا كانت خلايا rho الاصطناعية تحتوي على البلازميد البكتيري داخل الميتوكوندريا (الشكل 7B).

يوضح الشكل 8 عملية التحفيز الخلوي. تحتوي سلالات المتبرع والمتلقي على تغذية الليوسين والأدينين ، على التوالي. ومن ثم ، بعد الاستقطاب الخلوي ، تم طلاء المزيج على وسط يفتقر إلى الليوسين ، مما يمنع نمو الخلايا المانحة. هذه هي اللوحة الرئيسية. عند هذه النقطة ، ستنمو فقط أحاديات الصيغة الصبغية ذات الخلفية النووية لسلالة المستقبل وثنائيات الصبغيات المتفرقة. لاستبعاد ثنائيات الصيغة الصبغية ، تم تكرار اللوحة الرئيسية على الوسائط التي تفتقر إلى الأدينين ، حيث يمكن أن تنمو ثنائيات الصبغيات فقط. في هذا المثال ، يتم تحور الحمض النووي للميتوكوندريا الناتج بعد التحفيز الخلوي ، ولا يمكن أن تنمو الأحاديات الصيغة الصبغية المقصودة على الوسط التنفسي للإيثانول / الجلسرين. لذلك ، يجب تكرار اللوحة الرئيسية على ألواح YPD مع عشب من سلالة اختبار. يشير موضع ثنائيات التنفس الإيجابية إلى المستعمرات التي يجب تنقيتها من اللوحة الرئيسية. جولتان من التنقية ضروريتان للحصول على السلالة النهائية النقية. عادة ما يتم تأكيد تكامل الميتوكوندريا من خلال تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للمنطقة المحيطة ذات الاهتمام والتسلسل.

وأخيرا، يمكن إدخال الجينات في الموضع المحدد في جينوم الميتوكوندريا. على سبيل المثال ، يمكن إدخال جينات المراسل في نهاية 3 'من تسلسل ترميز جين الميتوكوندريا أو استبدال منطقة ترميز جين الميتوكوندريا ، من بين خيارات أخرى (الشكل 9 أ). ومع ذلك ، يمكن أيضا إدخال الجينات في المواقع خارج الرحم داخل المناطق غير المشفرة لجينوم الميتوكوندريا. الموقع الشائع الاستخدام هو 295 nt المنبع من كودون البدء لجين COX2 . التغيير في هذه المنطقة غير المشفرة غير ضار13. للتعبير بنجاح عن الجين في الموقع خارج الرحم ، يجب أن يكون محاطا بمروج الميتوكوندريا والمنهي. تسلسلات COX2 المرافقة هي الأكثر مثالية لأن COX2 هو جين الميتوكوندريا مع أقصر تسلسلات غير مترجمة 5 'و 3' (73 nt من 5' UTR و 119 nt من 3' UTR) (الشكل 9B). لهذا البناء ، يتميز البلازميد البكتيري بالخصائص التالية: القالب عبارة عن بلازميد يحتوي على منطقة ترميز COX2 ، مع 1120 nt في اتجاه مجرى كودون التوقف و 670 nt في اتجاه المنبع من كودون بدء AUG ، المسمى pXPM5025. تم تصميم الجين محل الاهتمام ليكون محاطا ب 73 nt من COX2 5'-UTR و 119 nt من COX2 3'-UTR. بعد ذلك ، تم إدخاله ، كما هو موضح سابقا ، عند 295 nt المنبع من كودون بدء COX2 AUG ، وهي منطقة غير مشفرة (الشكل 9B). لاحظ أن هذا البلازميد ، وبالتالي ، في جينوم الميتوكوندريا الناتج ، يتم تكرار COX2 5 'و 3' UTRs. بعد قصف هذا البلازميد ، يتم تزاوج خلايا الرو الاصطناعية من أجل التكاثر الخلوي مع سلالة مستقبلات لها حذف واسع النطاق لمنطقة COX2 (أليل cox2-62 )1. أثناء الاستنتاج الخلوي ، يتحد بلازميد الميتوكوندريا لسلالة الرو الاصطناعية مع الحمض النووي للميتوكوندريا من المستقبل. يحتوي جينوم الميتوكوندريا الناتج على بنية خارج الرحم وجين WT COX2 . لذلك ، ستكون المستعمرات الإيجابية قادرة على النمو في وسط تنفسي (الشكل 9 ب).

مخطط نظام إطلاق الناقلات الصغيرة ، إعداد ضغط الهيليوم ، لوحة العينة ، أنبوب التسارع.
الشكل 5: تمثيل تخطيطي لمعدات قصف المقذوفات الدقيقة عالية السرعة. يستخدم مختبرنا نظام توصيل الجسيمات Biolistic-PDS-1000 / He (جدول المواد). اختصار: WPs = جزيئات التنغستن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط تحويل الخميرة ونتائج طبق بتري توضح وظائف جين ARG في mtDNA الاصطناعي.
الشكل 6: مثال على لوحة تحويل مقذوفات مجهرية عالية السرعة. (أ ، ب) بعد القصف ، تم تحضين الألواح لمدة 5-7 ليال عند 30 درجة مئوية. إذا نمت ملوثة (يشار إليها بسهم أزرق) ، فيمكن قطعها باستخدام ملعقة معقمة. بعد تكرار الألواح على وسيط علامة الاختيار (-URA في هذه الحالة) ، تم اختبار اللوحة الرئيسية أيضا لوجود بلازميد الميتوكوندريا عن طريق التزاوج مع سلالة اختبار. في هذه الحالة ، تحتوي سلالة الاختبار على أليل غير وظيفي ARG8m-1 1. بعد التزاوج لمدة 2 ليال وتكرار اللوحة على وسط يفتقر إلى الأرجينين (-ARG) ، نشأت أربع مستعمرات إيجابية (يشار إليها بأسهم حمراء). (ج) تم تنقية مستعمرات الرو الاصطناعية الإيجابية عن طريق إعادة تشكيلها على وسط -URA ، وتم إجراء اختبار النسخ المتماثلة كما هو موضح سابقا. تمثل هذه اللوحات الجولة الثالثة من التنقية. (د) فقدت بعض مستعمرات الرو الاصطناعية الإيجابية بنية الميتوكوندريا. الاختصارات: mtDNA = الحمض النووي للميتوكوندريا. -URA = تفتقر إلى اليوراسيل ؛ -ARG = نقص الأرجينين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط عملية تكامل البلازميد البكتيري ؛ نقل الجينات إلى mtDNA ؛ مفهوم الهندسة الوراثية.
الشكل 7: شكل يوضح كيفية اختيار مستعمرات الرو الاصطناعية الموجبة بعد القصف. أ: تحتوي البلازميدات البكتيرية على نسخة متحولة غير وظيفية من جين الميتوكوندريا. للكشف ، يتم تزاوج مستعمرات الرو الاصطناعية مع سلالة اختبار تحتوي على طفرة غير وظيفية مختلفة لنفس الجين في الحمض النووي للميتوكوندريا. بعد التزاوج ، تتحد mtDNAs الطافرة ، ويمكن استعادة الجين الوظيفي عن طريق التكميل. هنا ، ينمو ثنائي الصبغيات على وسط انتقائي حيث لا يمكن أن تنمو سلالة rho الاصطناعية ولا المختبر. ب: في هذه الحالة، يحتوي البلازميد على تتابع إضافي لجين الميتوكوندريا (أي قطعة من COX3). بعد التحول ، يتم اختيار سلالة rho الاصطناعية من خلال قدرتها على استكمال طفرة COX3 في سلالة الاختبار ، لذلك يمكن أن تنمو ثنائيات الصبغيات فقط على وسط انتقائي (أي وسط تنفسي). هذه الطريقة مفيدة إذا كانت سلالة اختبار الجين محل الاهتمام غير متوفرة. الكشف عن مستعمرات rho- الاصطناعية الإيجابية في هذه الحالة غير مباشر. اختصار: mtDNA = الحمض النووي للميتوكوندريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تجربة طبق بتري. عملية التنشئة الخلوية مراقبة نمو الخميرة تقييم النقل الجيني.
الشكل 8: مثال على التحفيز الخلوي لدمج تركيب في الموضع المستهدف في الحمض النووي للميتوكوندريا. بعد التزاوج والشفاء ، تم طلاء الخلايا المختلطة والزيجوت ثنائي النواة على وسط يفتقر إلى الليوسين. في هذه الحالة ، نظرا لأن سلالة المتبرع تحتوي على أليل leu2،3-112 ، فإن هذه الوسيلة تمنع نمو المتبرع. تم تكرار هذه اللوحة على نفس الوسط (اللوحة الرئيسية) ، في وسط حيث يمكن أن تنمو ثنائيات الصبغيات فقط (-ADE) وفي وسط حيث يمكن أن ينمو المستقبل مع الطفرة المقصودة (الأسهم الحمراء). في هذه الحالة ، لا يمكن أن تنمو خلايا المتبرع ولا المستقبلات على وسائط الجهاز التنفسي. فقط ثنائي الصبغيات الناتج بعد التزاوج مع العشب من سلالة اختبار يمكن أن تنمو على وسط الجهاز التنفسي. هذه المستعمرات ثنائية الصيغة الصبغية التنفسية هي دليل لاختيار وتنقية المستعمرات الموجبة من اللوحة الرئيسية. الاختصارات: -LEU = تفتقر إلى الليوسين. -ADE = تفتقر إلى الأدينين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط نقل الجينات في الميتوكوندريا مع عملية مانح rho الاصطناعي إلى متقبل mtDNA.
الشكل 9: شكل يوضح كيفية دمج بنية الميتوكوندريا الطافرة (الموجودة في سلالة rho الاصطناعية) في سلالة المستقبل. (أ) في هذا المثال، تحمل السلالة المستقبلة جين مراسل ARG8m الذي يحل محل الكودونات من الجين محل الاهتمام. يحتوي الحمض النووي (DNA) الاصطناعي على نسخة متحولة من هذا الجين. يعاد دمج الحمض النووي للبلازميد والميتوكوندريا من خلال المناطق الجانبية 5 و 3 ، ويتم استبدال مراسل ARG8m بالتسلسل المتحور للجين محل الاهتمام. (ب) يمكن إدخال جينات غريبة خارجيا في مناطق محددة من جينوم الميتوكوندريا7،13،36. في هذا المثال ، يمكن إدخال جين في موضع 295 nt في المنبع من جين COX2. هذه منطقة غير مشفرة من mtDNA. يحيط بجين أجنبي مثير للاهتمام 73 nt و 119 nt من COX2 5' UTR و 3' UTR ، على التوالي. يتم إدخال هذا البناء في بلازميد يحتوي على جين COX2 بالإضافة إلى 670 nt و 1120 nt من مناطق UTR 5 'و 3' . تحمل سلالة الرو الاصطناعية (المانحة) هذا البناء في الميتوكوندريا. في هذه الحالة ، تحتوي سلالة المستقبل (XPM13)7 على حذف كبير لجين cox2 (أليل cox2-62)1. بعد التحفيز الخلوي ، يتحد الحمض النووي للميتوكوندريا من المتبرع والمستقبل. يتم استعادة جين COX2 ، ويتم إدخال الجين محل الاهتمام في الموقع خارج الرحم (295 nt المنبع من جين COX2). الاختصارات: mtDNA = الحمض النووي للميتوكوندريا. nt = النيوكليوتيدات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

سلالة الخميرةالجينيالرقم المرجعي
قبض 69ماتا ، ade2-101 ، arg8-دلتا :: hisG ، ura3-52 ، kar1-1 (rho0)1
إن بي 71Matα ، ade2-101 ، ura3-52 ، leu2-delta ، arg8-delta :: URA3 ، kar1-1 ، (cox3Δ: ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)7
XPM209Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
XPM199ماتا ، ade2-101 ، arg8-delta :: hisG ، ura3-52 ، kar1-1 (rho- ، pXPM61)26
XPM13Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
إل45Matα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N)28

الجدول 1: أمثلة سلالة الخميرة المستخدمة في التحول الحيوي و cytoduction.

وسائط النمومكونات
ي ب د2٪ جلوكوز ، 2٪ باكتوبتون ، 1٪ مستخلص خميرة
YPR2٪ رافينوز ، 2٪ باكتوبتون ، 1٪ مستخلص الخميرة
يبيغ*3٪ جلسرين ، 3٪ إيثانول * 1 ، 2٪ باكتوبتون ، 1٪ مستخلص خميرة
وسائل الإعلام المنسحبة2٪ جلوكوز ، 6.8٪ قاعدة نيتروجين خميرة مع (NH4) 2SO4 ، مزيج الأحماض الأمينية المتسرب * 2
قصف وسائل الإعلام5٪ جلوكوز ، 6.8٪ خميرة قاعدة نيتروجين مع (NH4) 2SO4 ، 1 M سوربيتول ، مزيج من الأحماض الأمينية المتسربة * 2,3.
*1 أضف الإيثانول بعد التعقيم عندما تكون الوسائط دافئة.
*2 قد تختلف كمية مزيج الأحماض الأمينية وفقا للمخزون المتاح، أو الكمية المحددة من قبل الشركة المصنعة.
* 3 بالنسبة لوسائط القصف ، أضف الأحماض الأمينية وقواعد النيتروجين حسب الحاجة اعتمادا على سلالة الخميرة. تأكد من أن التركيبة خاصة بالتغذية auxotrophy على البلازميد 2 ميكرولتر المستخدم في الاختيار.

الجدول 2: وسائط نمو الخميرة المستخدمة في هذا البروتوكول.

المناقشة

وصف العمل الحالي كيفية تحويل الميتوكوندريا من الخميرة S. cerevisiae بنجاح. تستغرق العملية ، من قصف المقذوفات الدقيقة عالية السرعة حتى تنقية سلالة الخميرة المقصودة ، ~ 8-12 أسبوعا ، اعتمادا على عدد جولات تنقية سلالة الرو الاصطناعية اللازمة. بعض الخطوات الحاسمة للطريقة هي كما يلي. أولا ، كلما زادت المناطق المحيطة المضافة حول موقع الطفرة في بنية جين الميتوكوندريا ، زاد احتمال التكامل الناجح للطفرة المستهدفة. الحد الأدنى لحجم المناطق المرافقة هو ~ 100 nt ؛ ومع ذلك ، يوصى بشدة باستخدام أكثر من 500 NT على كل جانب من جوانب الطفرة. ثانيا ، عند اختيار مستعمرات الرو الاصطناعية بعد التحول ، يوصى بعدم إجراء أكثر من 3-4 جولات من التنقية ؛ خلاف ذلك ، هناك خطر كبير من فقدان بنية الميتوكوندريا في النهاية ، حيث لا يوجد ضغط انتقائي للحفاظ على البلازميد في الميتوكوندريا. ثالثا ، لتجنب إيذاء المستخدم أو الجهاز ، يجب عليك قراءة دليل آلة القصف بعناية قبل البدء في الإجراء. هذه المعدات حساسة وتستخدم الضغط العالي والفراغ.

أحد قيود هذا الإجراء هو أنه حتى الآن ، فقط الخميرة والطحالب الخضراء C. reinhardtii هي المرشحة لتحويل الميتوكوندريا بهذه الطريقة. سيكون من المناسب إذا تمكنا من إدخال طفرات موجهة للموقع على جينوم الميتوكوندريا من الكائنات الحية الأخرى. هناك قيد آخر وهو أنه من الصعب تحويل العديد من التركيبات المختلفة في نفس الجلسة. يوصى بإجراء ستة تحويلات لكل بناء ، يجب اختبار كل منها واختياره وتنقيته. ينتج عن هذا أكثر من 50 صفيحة من الوسائط فقط للحصول على مستعمرات رو نقية من طفرة ميتوكوندريا واحدة.

على الرغم من هذه القيود ، ساهمت القدرة على التعامل مع جينوم الخميرة الميتوكوندريا بشكل كبير في فهم العديد من مسارات التكون الحيوي للمجمعات التنفسية. يمكن استخدام هذا النهج لإدخال جينات المراسل لمراقبة وقياس ترجمة الميتوكوندريا1،7،36،37 ، مقاطعة جينات الميتوكوندريا38 ، تحديد مرافقي التجميع للمجمعات التنفسية39 ، فهم أفضل لآليات ترجمة الميتوكوندريا المقترنة وتجميعها7،11،12،36، وابحث عن مثبطات عند اتباع التعبير عن جين الميتوكوندريا المتحور40. حتى الآن ، على الرغم من الإبلاغ عن طرق معينة للتلاعب بجينوم الميتوكوندريا في الثدييات في وقت سابق41 ، لا توجد طريقة واسعة الانتشار لتحويل الحمض النووي للميتوكوندريا لهذه الكائنات الحية.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا المنشور من قبل برنامج دعم مشاريع البحث والابتكار التكنولوجي (PAPIIT) ، UNAM [IN223623 إلى XP-M]. UPD هو زميل CONAHCYT (CVU: 883299). نود أن نشكر الدكتور أريان ميندوزا مارتينيز على المساعدة الفنية في صور المجهر الضوئي. تراخيص Bionder: DU26OMVLUU (الشكل 2) ؛ BK26TH9GXH (الشكل 3) ؛ GD26TH80R5 (الشكل 4) ؛ PU26THARYD (الشكل 7) ؛ ML26THAIFG (الشكل 9).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل أطراف ماصةAxygenT-1000-B
1.5 مل MicrotubeAxygenMCT-150-C
10 & mu ؛ نصائح الماصة LAxygenT-10-C
15 مل أنبوب سفلي مخروطي  أكسايجنSCT-25ML-25-S
200 & L أطراف ماصةAxygenT-200-Y
50 مل قاع مخروطي الشكل   أنبوبAxygenSCT-50ML-25-S
AfiIIنيو إنجلاند BioLabsR0520S
AgaroseSeaKem50004
التوازن التحليليOHAUSARA520
الأوتوكلافTOMYES-315
باكتو أجارBD214010
بكتو الببتونBD211677
حامل Biolisitic Macrocarrier  BIO-RAD1652322
شعلة بنسنVWR89038-528
كلوريد الكالسيومفيشر ScientificC79-500
CSM -ADEفورميدDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormediumDCS0169
قارورة زجاجية للثقافةKIMAX KIMBLE25615
أنبوب زجاجي للثقافةPyrex9820
سكر العنبBD215520
EthanolJT Baker  9000
ملقطMillipore620006
الخرز الزجاجيSigmaZ265926
مقبض زجاجيSigmaS4647
GlycerolJT BAKER2136-01
خزان الهيليوم الصف 5 (99.99٪)-
HSTaq & nbsp ؛ كيتPCR BIO
MicrocentrifugueEppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
شاكر مدارينيو برونزويك العلميNB-G25
أنابيب PCRAxygenPCR-02-C
PDS-1000 / He TM نظام توصيل الجسيمات الحيويةBIO-RAD165-2257
أطباق بتري (100 × 10)ديناربحريني 252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
RaffinoseFormediumRAF03
طبق الأصل طبق الأصلسلاترZ363391
أقراص تمزق 1350 رطل لكل بوصة مربعةBIO-RAD1652330
سوربيتولسيجماS7547
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseThermo ScientificEL0011
دوار ثقافة الأنسجةالحرارية العلمية88882015
التنغستن الناقلات الدقيقة M10BIO-RAD1652266
مضخة فراغ بسعة 100 لتر / دقيقة-
منصات مخمليةبيل آرتH37848-0002
Vortex Scientifc IndustriesSI-0236
عصا قضيب الخشبPROMA1820060
مستخلص الخميرةBD212750
قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينوديةBD 291920

المراجع

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965(2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359(2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), 4146(2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory manual. 2000 ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. : a. Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. 2015 edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144, Pt 1 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Saccharomyces Cerevisiae

مقالات ذات صلة