مقالة منهجية

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة

2.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66866

⸱

يونيو 14, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Sciences, Aging + Cardiovascular Discovery Center, Temple University, Lewis Katz School of Medicine, 2Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Child and Adolescence Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia

في هذه المقالة

ملخص

تؤسس هذه الورقة خط أنابيب لمعلقات عالية الجودة للخلية المفردة والنوى لأجنة الفئران المعدة لتسلسل الخلايا المفردة والنوى.

الملخص

على مدى العقد الماضي ، أصبحت مناهج الخلية الواحدة المعيار الذهبي لدراسة ديناميكيات التعبير الجيني ، وعدم تجانس الخلايا ، وحالات الخلايا داخل العينات. قبل تقدم الخلية الواحدة ، كانت جدوى التقاط المشهد الخلوي الديناميكي والتحولات الخلوية السريعة أثناء التطور المبكر محدودة. في هذه الورقة ، تم تصميم خط أنابيب قوي لإجراء تحليل أحادي الخلية ونوى على أجنة الفئران من اليوم الجنيني E6.5 إلى E8 ، وهو ما يتوافق مع بداية واكتمال المعدة. المعدة هي عملية أساسية أثناء التطور تحدد الطبقات الجرثومية الثلاث: الأديم المتوسط ، والأديم الظاهر ، والأديم الباطن ، والتي تعتبر ضرورية لتكوين الأعضاء. تتوفر أدبيات واسعة النطاق حول omics أحادية الخلية المطبقة على الأجنة المحيطة بالمعدة من النوع البري. ومع ذلك ، لا يزال تحليل الخلية الواحدة للأجنة الطافرة نادرا وغالبا ما يقتصر على المجموعات التي تم فرزها بواسطة FACS. ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود التقنية المرتبطة بالحاجة إلى التنميط الجيني ، والحمل الموقوت ، وعدد الأجنة ذات الأنماط الجينية المرغوبة لكل حمل ، وعدد الخلايا لكل جنين في هذه المراحل. هنا ، يتم تقديم منهجية مصممة للتغلب على هذه القيود. تضع هذه الطريقة إرشادات للتكاثر والحمل الموقوت لتحقيق فرصة أكبر للحمل المتزامن مع الأنماط الجينية المرغوبة. تسمح خطوات التحسين في عملية عزل الجنين إلى جانب بروتوكول التنميط الجيني في نفس اليوم (3 ساعات) بإجراء خلية مفردة قائمة على القطرات الدقيقة في نفس اليوم ، مما يضمن قابلية عالية للبقاء ونتائج قوية. تتضمن هذه الطريقة أيضا إرشادات لعزل النوى الأمثل عن الأجنة. وبالتالي ، فإن هذه الأساليب تزيد من جدوى نهج الخلية الواحدة للأجنة الطافرة في مرحلة المعدة. نتوقع أن تسهل هذه الطريقة تحليل كيفية تشكيل الطفرات للمشهد الخلوي للمعدة.

المقدمة

المعدة هي عملية أساسية مطلوبة للتطور الطبيعي. تحدث هذه العملية السريعة والديناميكية عندما تنتقل الخلايا متعددة القدرات إلى سلائف خاصة بالنسب تحدد كيفية تكوين الأعضاء. لسنوات ، تم تعريف المعدة منذ فترة طويلة على أنها تكوين ثلاث مجموعات متجانسة إلى حد كبير: الأديم المتوسط ، والأديم الظاهر ، والأديم الباطن. ومع ذلك ، فإن التقنيات عالية الدقة والعدد الناشئ من نماذج الخلايا الجذعية الجنينية 1,2 تكشف النقاب عن عدم تجانس غير مسبوق بين طبقات الجراثيم المبكرة 3,4. هذا يشير إلى أنه لا يزال هناك الكثير الذي يجب الكشف عنه حول الآليات التي تنظم مجموعات الخلايا المتميزة في المعدة. كان التطور الجنيني للفأر أحد أفضل النماذج لدراسة قرارات مصير الخلية المبكرة أثناء المعدة 3,5. المعدة في الفئران سريعة ، حيث تحدث عملية المعدة بأكملها في غضون 48 ساعة ، من اليوم الجنيني E6.5 إلى E85.

مكنت التطورات الحديثة في تقنيات الخلية الواحدة من رسم خرائط مفصلة للتطور الجنيني للفأر من النوع البري ، مما يوفر نظرة عامة شاملة على المناظر الطبيعية الخلوية والجزيئية للأجنة أثناء عملية المعدة3،4،6،7،8. ومع ذلك ، فإن تحليل الأجنة الطافرة في هذه المراحل أقل شيوعا وغالبا ما يقتصر على المجموعات المصنفةمن قبل FACS 9,10. تعكس الأدبيات النادرة التحديات التقنية المرتبطة بالتلاعب وإعداد خلية واحدة للأجنة المعدة التي تتطلب التنميط الجيني. يمكن أن يشكل التقاط العملية الديناميكية للمعدة تحديات بسبب طبيعتها السريعة ، خاصة لفهم الأجنة الطافرة. يعد توقيت الحمل وتزامنه أمرا ضروريا ، حيث يمكن إساءة تفسير الاختلافات الطفيفة بين حالات الحمل الموقوتة على أنها نمط ظاهري تنموي ناتج عن الجين الطافر. يصبح هذا مهما بشكل خاص عندما يؤثر الجين الطافر على عملية المعدة13,14. في هذه الدراسة ، تم وضع مبادئ توجيهية للحصول على حالات الحمل المتزامن من خلال تصور المقابس المهبلية (أي كتلة السائل المنوي المتخثر المتشكل في مهبل الأنثى بعد التزاوج). بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم استراتيجية للحصول على بيانات قوية أحادية الخلية من أجنة المعدة الطافرة من E6.5 إلى E8. تم تصميم هذه الاستراتيجية للتغلب على القيود المرتبطة بانخفاض عدد الأجنة ذات النمط الجيني المرغوب فيه لكل حمل وانخفاض القدرة على البقاء الناجم عن تجميد الأجنة أو الخلايا.

تصف هذه الورقة منهجية محسنة من إنشاء حالات الحمل الموقوتة عبر سدادات المهبل إلى التسلسل النهائي للخلايا / النوى المفردة. تشرح هذه الطريقة كيفية زيادة عدد حالات الحمل المتزامن للحصول على عدد أكبر من الأجنة ذات النمط الجيني المطلوب ، وعزل الخلايا / النوى لتحسين صلاحية الخلايا ، وبروتوكول التنميط الجيني في نفس اليوم. تصف هذه المخطوطة أيضا عملية عزل الجنين في نقاط زمنية مختلفة للمعدة. تساعد المنهجية على زيادة عدد الخلايا / النوى الجنينية النهائية القابلة للحياة للتسلسل ، مما يضمن بيانات تسلسل عالية الجودة. لذلك ، ستفتح هذه الطريقة الأبواب أمام دراسات الخلية الواحدة للأجنة المعدية التي تتطلب التنميط الجيني.

البروتوكول

تمت الموافقة رسميا على هذا البروتوكول وجميع التجارب على الموصوفة ووفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة تمبل ، والتي تتبع المبادئ التوجيهية الدولية لجمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر. كانت جميع الفئران الموصوفة على سلالة الخلفية C57 / BL6N. لم يلاحظ أي مخاوف تتعلق بصحة في هذه الدراسات.

1. مستعمرة تربية والحمل الموقوت

  1. وقت الحمل عن طريق تصور سدادة مهبلية. يعتبر الظهر في يوم القابس E0.5.
  2. الفئران المنزلية في أقفاص مع مواد الفراش التي تحتوي على الفراش الخشب الصلب المتكسرة ومواد التعشيش الورقية.
    1. يحتوي كل قفص على تشاو الفأر والمياه العذبة وعنصر التخصيب (على سبيل المثال ، مواد النفق والتعشيش). تتبع وجمع معلومات المستعمرة يوميا أثناء التكاثر الموقوت.
    2. سجل جميع المعلومات مثل عمر الفأر ، وعدد حالات الحمل التي مرت بها أنثى الفأر ، وعدد المقابس التي وضعها ذكر الفأر ، ومرحلة الشهوة (الشكل 2) لإناث الفئران.
      ملاحظة: الإناث اللواتي أنجبن بالفعل 1-2 مرات سوف يلدن أحجام قمامة أكبر في حالات الحمل المستقبلية.
  3. قبل البدء في الحمل الموقوت ، قم بإيواء الفأر الذكر وحده في قفص قبل أسبوع من التكاثر. خلال أسبوع بدء التكاثر ، أدخل ما لا يقل عن 1 أنثى لكل ذكر في القفص.
    ملاحظة: اعتمادا على بروتوكول المعتمد ، قد يسمح بإضافة 2-3 إناث إلى قفص التربية ويفضل زيادة توليد القابس.
  4. قم بإعداد ما لا يقل عن 4 ثلاثيات تكاثر (2 إناث فئران إلى 1 ذكر) لزيادة فرص الحمل المتزامن عبر الأقفاص (ويعرف أيضا باسم المقابس المتعددة في نفس اليوم). سيؤدي ذلك إلى زيادة عدد الأجنة المعزولة في نفس المرحلة التنموية.
  5. رتب التزاوج المثالي في فترة ما بعد الظهر أو في المساء قبل الساعة 5 مساء ، ويتم وضع الإناث في قفص الذكور أو العكس. إذا لم يحدث التكاثر خلال 4-5 أيام ، ففكر في تبديل شركاء التزاوج كل يوم.
    ملاحظة: إذا لم تتمكن من التحقق من وجود سدادة مهبلية في صباح اليوم التالي ، فافصل زوج التكاثر في الليلة السابقة (أي عطلة نهاية الأسبوع / العطلات).
  6. تحقق من وجود سدادات مهبلية كل يوم في الصباح الباكر. قبل الساعة 9 صباحا هو المفضل.
    1. للتحقق من وجود سدادات مهبلية ، ارفع الفئران الإناث برفق من قاعدة الذيل وراقب فتحة المهبل. ابحث عن كتلة هلامية بيضاء أو كريمية اللون. في كثير من الأحيان ، يمكن أن تكون السدادة المهبلية واضحة ، ولكن إذا لم تكن واضحة ، خذ ملاقط وتحقق برفق من فتحة المهبل. ضع في اعتبارك فقط المقابس الأكثر وضوحا للعزل. راجع الشكل 2C.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان التحقق من وجود سدادات مهبلية في أقرب وقت ممكن في الصباح لتجنب فقدان الحمل المحتمل. يمكن أن تسقط المقابس أو تذوب بعد 12 ساعة.
      ملاحظة: حتى إذا لوحظ وجود سدادة ، فهذا لا يضمن أن أنثى الفأرة ستكون حاملا. إذا لوحظت سدادة جزئية أو معدومة ولكن كان هناك احمرار بالقرب من الفتحة المهبلية لإناث الفئران ، فلا تفكر في عزل هؤلاء الإناث لأن هناك فرصة أقل احتمالا لالتصاق القابس. يختلف احتمال الحمل بعد التزاوج بين سلالات الفئران ويعتمد على مرحلة الدورة الشحمية أثناء التزاوج (الشكل 2).
  7. بمجرد ملاحظة سدادة مهبلية ، سجل اليوم. يعتبر ظهر نفس اليوم الذي يتم فيه ملاحظة السدادة المهبلية E0.5. افصل الفئران الإناث عن قفص التكاثر وعزل الأجنة اعتمادا على مرحلة المعدة المطلوبة.
    ملاحظة: لا توفر هذه الطريقة توقيتا دقيقا للتزاوج. تقليديا ، يفترض أن يحدث التزاوج حوالي منتصف الليل في الليلة السابقة. وبالتالي ، تعتبر الأجنة نصف يوم من العمر (E0.5) بحلول ظهر اليوم الذي يتم فيه ملاحظة السدادة المهبلية.

2. عزل أجنة الفئران أثناء المعدة

  1. قبل البدء في عزل الجنين ، قم بإعداد جميع الكواشف والمعدات المطلوبة.
    1. نظف المنطقة جيدا باستخدام 70٪ إيثانول. تأكد من غسل وتعقيم جميع أدوات التشريح (الملقط والمقص). احصل على 5 مل معقمة من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) / 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 20 مل DPBS-/- وضعه على الثلج.
    2. قم بإجراء جميع عمليات العزل باستخدام مجهر مجسم مع مرحلة ضوئية مرسلة وكاميرا للمساعدة في التنميط الظاهري التنموي الإجمالي.
  2. القتل الرحيم لسد الفأر الحامل وبدء العزل على الفور.
    1. ضع السد الحامل في غرفة CO2 مع تعديل معدل تدفق CO2 لإزاحة 20٪ من حجم القفص في الدقيقة. راقب الماوس عن كثب وتأكد من الموت من خلال ملاحظة عدم وجود حركات التنفس.
    2. الحفاظ على تدفق CO2 لمدة دقيقتين إضافيتين بعد غياب حركات التنفس. تأكيد القتل الرحيم عن طريق إجراء خلع عنق الرحم.
    3. ضع الفئران في وضع الوقوف الطبيعي على سطح مستو صلب. ثم ، مع الإبهام والإصبع الأول من يد واحدة على الجزء الخلفي من الرقبة عند قاعدة الجمجمة ، ادفع للأمام ولأسفل أثناء السحب للخلف مع اليد الأخرى التي تمسك قاعدة الذيل.
    4. تحقق من فعالية الخلع من خلال الشعور بفصل فقرات عنق الرحم. عندما يتم قطع الحبل الشوكي ، ستكون مساحة 2-4 مم واضحة بين اللقمات القذالية والفقرة العنقية الأولى.
      ملاحظة: لا تقم بالقتل الرحيم لعدة سدود حامل في وقت واحد ، حيث ستتأثر صلاحية الخلية. يمكن استخدام الأيزوفلوران كعامل مخدر بديل إذا تمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) أو هيئة مماثلة.
  3. ضع السد الحامل على ظهره وعقم المنطقة القريبة من فتحة المهبل بالإيثانول.
    1. باستخدام مقص التشريح والملاقط ، ارفع طية الجلد بالقرب من فتحة المهبل وقم بعمل قطع صغير على شكل حرف V ، وكشف ببطء عن رحم السد الحامل (الشكل 3 [السهم الأصفر]).
    2. تشريح القرن الرحمي للسد الحامل عن طريق إمساك أحد طرفيه بملاقط وقطعه ، مع التأكد من إزالة عنق الرحم. ضع قرن الرحم في طبق بتري 10 سم يحتوي على DPBS-/- على الجليد (الشكل 3).
      ملاحظة: اعتمادا على مرحلة عزل الجنين ، سيشبه الرحم مواقع زرع أصغر أو أكبر (أي "لآلئ" على خيط).
  4. باستخدام مقص التشريح والملاقط ، قم بقطع كل موقع زرع ("لآلئ") يحتوي على التورمات العشرية بالداخل ووضعه في DPBS الطازج - / - في طبق بتري 6 سم على الجليد (الشكل 3).
    ملاحظة: سيحتوي السد الحامل المتوسط على حوالي 6-8 أجنة مزروعة.
  5. خذ موقع زرع واحد وضعه على طبق بتري جديد 6 سم أعلى مرحلة المجهر المجسم وأضف 500 ميكرولتر من DPBS-/- فوقه. اضبط تركيز المجهر ومصدر الضوء (الشكل 3).
    ملاحظة: اعتمادا على حجم موقع الزرع ، قد تختلف كمية DPBS ؛ الهدف هو الحصول على ما يكفي من DPBS بحيث يتم غمر موقع الزرع.
  6. باستخدام ملاقط تشريح دقيقة ، قم بإزالة عضلة الرحم من موقع الزرع. اضغط باستمرار على موقع الزرع بمجموعة واحدة من الملقط في يد واحدة وأدخل ببطء زوجا آخر من الملقط باليد الأخرى في نهاية موقع الزرع المقطوع من قرن الرحم ، وكشف ببطء عن تورم النفضية (الشكل 3).
    ملاحظة: لا تسحب أو تشد بشدة على سطح الرحم ، لأنه يمكن أن يؤدي إلى تمزق التورم العشري أو حتى تحلل الجنين.
  7. بعد عزل التورم العشري ، تابع الكشف عن الجنين.
    1. امسك الطرف المضاد للانتفاخ العشري بزوج واحد من الملقط ، ومع الزوج الآخر ، قم بعمل قطع أفقي ببطء حوالي 1/4 حجم التورم العشري من الطرف المتوسط (أي غالبا ما تكون النهاية المدببة للتورم العشري).
    2. الآن ، باستخدام كلا الملقطين ، ادفع ببطء من الطرف المضاد للانتفاخ العشري ، وسيخرج الجنين من الطرف المقطوع حديثا (الشكل 3).
      ملاحظة: لا تمزق التورم العشري ، لأن هذا سيكسر الجنين. إذا لزم الأمر ، قم بعمل جروح أصغر على طول الطرف المتوسط للتورم اللبني.
  8. بمجرد الكشف عن الجنين ، قم بإزالة أي أنسجة خارج الجنين متصلة.
    1. قد يخرج كيس الأديم الباطن الجداري ومخروط المشيمة الخارجية تلقائيا من الجنين أثناء عملية الكشف ، ولكن إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستخدم زوجا من الملقط وقم بإزالته مع أي دم أم مرتبط به. ثم ، باستخدام ملقطين ، اضغط باستمرار على الجنين بزوج واحد وقشر ببطء كيس الصفار الحشوي من الجنين باستخدام المجموعة الأخرى.
    2. باستخدام ماصة P20 ، ضع كيس الصفار مع ما لا يزيد عن 10 ميكرولتر من DPBS-/- من الطبق في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المكون من 8 شرائط على الجليد ، حيث سيتم استخدام هذا للتنميط الجيني في نفس اليوم.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان ألا تكون عينة كيس الصفار ملوثة بأنسجة من السد الحامل. قد يؤدي التلوث إلى تعيين النمط الجيني غير الصحيح للجنين.
  9. التقط صورا ميدانية مشرقة للأجنة المعزولة حديثا لضمان تشابه مرحلة رفقاء القمامة. باستخدام ماصة P200 ، قم بسحب الجنين ببطء باستخدام 50 ميكرولتر من DMEM / 10٪ FBS وضعه في أنبوب سعة 1.5 مل على الثلج. دع الأجنة تبقى على الجليد حتى يتم تأكيد الأنماط الجينية.
    ملاحظة: تم الاحتفاظ بالأجنة على الجليد لمدة 3-4 ساعات دون أي تدهور واضح ، ولكن لا تتجاوز هذا الوقت ، حيث سيحدث انخفاض في صلاحية الخلية. قم بتسمية الأجنة وأنابيب التنميط الجيني وفقا لذلك. يتم تشجيع التقاط صور ميدانية ساطعة لتحديد الاختلافات الظاهرية الإجمالية بين الأجنة والتعليق عليها.
  10. كرر هذه الخطوات لجميع التورمات اللبنية المتبقية. نظف جميع أدوات التشريح واستخدم مواد بلاستيكية جديدة لكل عزل لضمان عدم التلوث من العزلات السابقة.
    ملاحظة: تأكد من أن إجراءات التشريح تقتصر على 1 ساعة من لحظة جمع موقع الزرع من السد الحامل.
  11. المضي قدما في عزل الأجنة من السد الحامل التالي (إذا تم تحديد حالات حمل متزامنة متعددة) قبل الانتقال إلى خطوة التنميط الجيني في نفس اليوم.

3. التنميط الجيني في نفس اليوم (الشكل 4)

  1. هضم كل كيس صفار حشوي في أنبوب PCR من 8 أشرطة. باستخدام ماصة P20 ، أضف 19.3 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي لقالب تفاعل البوليميراز المتسلسل و 0.7 ميكرولتر من 0.2 ميكروغرام / مل بروتيناز K إلى كل عينة كيس صفار.
  2. دوامة العينة لمدة 10 ثوان وتدور لأسفل لوضع العينات في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام جهاز طرد مركزي صغير مع محول شريطي عند 1000 × جم لمدة 10 ثوان. ضع أنبوب PCR المكون من 8 شرائط في كتلة حرارة 85 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ودوامة لمدة 5 ثوان كل 5 دقائق.
    ملاحظة: من المهم أخذ عينات دوامة أثناء الهضم لزيادة تحلل الخلايا إلى أقصى حد في 45 دقيقة.
  3. بعد 45 دقيقة ، قم بتدوير شريط الأنبوب لأسفل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير مع محول شريطي عند 1000 × جم لمدة 10 ثوان ، وتابع تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد الهوية الجينية المطلوبة. كمرجع ، يتم توفير نموذج بروتوكول لنظام Cre-lox. فيما يلي مثال على شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل للتنميط الجيني Cre. صمم مواد أولية لتضخيم المناطق 5 و 3 من موقع Cre المستهدف.
  4. لإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل للتنميط الجيني Cre ، قم بإعداد مزيج رئيسي PCR لكل أنبوب PCR مكون من 8 شرائط لكل كيس صفار يحتوي على 10 ميكرولتر من مزيج بوليميراز Taq DNA ، و 0.5 ميكرولتر من 0.5 ميكرومتر إلى الأمام Cre التمهيدي ، و 0.5 ميكرولتر من 0.5 ميكرومتر التمهيدي Cre العكسي ، و 5 ميكرولتر من الماء المعتمد من PCR ، و 4 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني لكيس الصفار.
    ملاحظة: في حالة استخدام بروتوكول تم تحسينه للتنميط الجيني لذيل الفأر ، أضف ضعف كمية الحمض النووي المستخدمة عادة للحصول على نتائج أنظف.
  5. بمجرد إجراء المزيج الرئيسي PCR ، قم بتشغيل برنامج تضخيم الدورة الحرارية PCR. بالنسبة للتنميط الجيني Cre ، تكون الدورة كما يلي: (1) 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، (2) 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (3) 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (4) 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، الخطوة المتكررة 2-4 لمدة 34 دورة ، (5) 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، (6) 4 درجات مئوية. قم بتشغيل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على جل أغاروز 1٪ لاستخلاص استنتاجات التنميط الجيني.
    ملاحظة: إذا كان هناك أكثر من تفاعل البوليميراز المتسلسل ضروريا لتحديد الهوية الجينية ، فقم بتشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في وقت واحد لتحسين التوقيت. لتسريع العملية ، قم بإعداد هلام الأغاروز قبل يوم من يوم التجربة وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. لا تفكر في أي عينات بدون أنماط وراثية واضحة. ضع في اعتبارك كلا من النمط الوراثي ومرحلة النمو للعينات ، حيث يمكن أن يكون زملاء القمامة في مراحل مختلفة من المعدة ويحتمل أن تكون النتائج منحرفة. عند إجراء التنميط الجيني لأليلات LoxP ، قد تختلف نطاقات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوقعة في الجل اعتمادا على برنامج تشغيل Cre المستخدم. على سبيل المثال ، إذا تم التعبير عن برنامج تشغيل Cre في كيس الصفار الحشوي ، فسيظهر شريط Loxp متغيرا في أجنة Cre-positive (Cre +) ، مقارنة ب Cre-negative (Cre-). ومع ذلك ، إذا لم يتم التعبير عن Cre في كيس الصفار الحشوي ، فسيكون حجم شريط Loxp بنفس الحجم في Cre + و Cre- embryos (أي أن أليلات Loxp لن تتخبط في سلالة كيس الصفار). يعتبر الجنين الذي يحمل أليل Cre + واحد واثنين من أليلات Loxp جنينا KO مشروطا. ومع ذلك ، لتأكيد حذف الجين المتخبط ، يوصى بإجراء تأكيد لضربة قاضية الجين على الخلايا التي تعبر عن محرك Cre ، إما عن طريق تكرار بروتوكول التنميط الجيني أو عن طريق تحليل qPCR لمستويات mRNA للجين المتخبط (الشكل 4D ، E).
  6. قم بتخزين عينات كيس الصفار المهضومة المتبقية في الفريزر -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

4. تفكك الخلايا للأجنة وصلاحية الخلية

  1. بمجرد تأكيد الأنماط الجينية ، خذ ماصة P200 وماصة 50 ميكرولتر من DMEM / 10٪ FBS. اجمع الأجنة التي لها نفس النمط الجيني في أنبوب جديد سعة 1.5 مل وضع الأنبوب على الجليد.
    ملاحظة: لا تتابع التجربة إذا لم يكن هناك ما لا يقل عن 5 أجنة لكل مجموعة (E7-E7.5) أو 3 (E7.75-E8) ، حيث سينخفض عدد الخلايا وصلاحيتها بشكل كبير.
  2. بعد تجميع الأجنة بناء على الأنماط الجينية ، اسمح لها بالاستقرار في قاع الأنبوب. اغسل الأجنة المجمعة بإضافة 50 ميكرولتر من DPBS-/- ، ثم انتظر حتى تستقر الأجنة قبل إزالة أكبر قدر ممكن من DPBS-/- دون إزالة الأجنة من الأنبوب. كرر هذه الخطوة مرتين.
    ملاحظة: إن تثبيت الأنبوب سعة 1.5 مل لأعلى إلى مصدر ضوء أو باتجاه النافذة سيجعل من السهل رؤية الأجنة تستقر في قاع الأنبوب.
  3. أضف 100 ميكرولتر من التربسين إلى الأجنة المجمعة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة 5 دقائق. حرك الأنابيب سعة 1.5 مل برفق كل 30 ثانية لمساعدة الخلايا على الانفصال.
    ملاحظة: لا تستخدم دوامة أو ماصة أثناء عملية التربسين، لأنها تلحق الضرر بالخلايا. إذا تم تجميع أكثر من 5 أجنة (E7-E7.5) أو 3 أجنة (E7.75-E8) ، فقم بإجراء هضم التربسين في أنبوب آخر بكمية مكافئة من التربسين (~ 20 ميكرولتر لكل 1 جنين). استخدم ~ 20 ميكرولتر من التربسين لكل جنين (E6.5-E7.5) ، 35 ميكرولتر لكل جنين (E7.75) ، و 40 ميكرولتر للجنين (E8).
  4. بعد 5 دقائق، قم بتحييد التربسين باستخدام 300 ميكرولتر من DMEM/10٪ FBS. الطرد المركزي للأجنة المجمعة عند 100 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد الطرد المركزي ، ستظهر حبيبات صغيرة لجميع العينات. أعد تعليق الكريات في 40 ميكرولتر من DMEM / 10٪ FBS وضعها على الثلج.
    ملاحظة: سيختلف حجم الحبيبات حسب عدد الأجنة المجمعة. من الممكن أن تكون الحبيبات غير مرئية ولكن تابع الخطوة التالية. تعتمد كمية DMEM / 10٪ FBS المطلوبة لتحييد التربسين على كمية التربسين المضافة. أضف 3 أضعاف كمية DMEM / 10٪ إلى كمية التربسين.
  5. حدد تركيز الخلايا المعاد تعليقها (40 ميكرولتر) باستخدام عداد الخلايا الآلي. امزج 5 ميكرولتر من الخلايا مع 5 ميكرولتر من التريبان الأزرق في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. تخلط الماصة جيدا وماصة على شريحة لتحديد رقم الخلية وصلاحيتها. التركيز الأمثل للخلايا هو 700-1200 خلية / ميكرولتر ، وصلاحية الخلية 90٪ أو أعلى.
    ملاحظة: إذا كان التركيز أقل من 200 خلية / ميكرولتر وكانت الصلاحية أقل من 50٪ ، فلا تستمر في التجربة. إذا كان تركيز الخلية مرتفعا جدا ، فقم بتخفيف تعليق الخلية وإعادة فرز الخلايا مرة أخرى. إذا لوحظت كتل الخلايا ، فاستخدم مصفاة خلية لضمان تعليق خلية واحدة.
  6. انتقل إلى تقسيم الخلية الواحدة باستخدام شريحة الموائع الدقيقة واتبع البروتوكول من الشركات المصنعة لرقائق الموائع الدقيقة11.

5. أجنة فأر عزل النوى (خيار لنقاط زمنية جنينية أكبر من E8 فصاعدا)

  1. تحضير تحلل طازج وغسل المخازن المؤقتة الموضحة في الجدول 1 ، ووضعها على الجليد.
    ملاحظة: يمكن إجراء عزل النوى على عينات طازجة أو مجمدة. إذا تم تجميد العينات ، اتركها تذوب لمدة 2-5 دقائق على الجليد.
  2. قبل بدء التجربة ، تأكد من جميع الأنماط الجينية واجمع فقط الأجنة ذات الأنماط الجينية الواضحة.
  3. باستخدام ماصة P200 ، أضف 50 ميكرولتر من محلول تحلل النوى إلى الأجنة المجمعة في أنبوب سعة 1.5 مل ، بهدف الحصول على 3 أجنة على الأقل لكل مجموعة متحولة. اترك العينات تجلس على الجليد مع مخزن التحلل لمدة 5 دقائق ودوامة كل 30 ثانية.
  4. بعد 5 دقائق من الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. باستخدام ماصة P200 ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من محلول الغسيل. بمجرد إعادة الإرسال ، أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 40 ميكرولتر من DPBS-/-. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي. امزج 5 ميكرولتر من النوى مع 5 ميكرولتر من التريبان الأزرق في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. ماصة الخليط جيدا وتحميله على شريحة لتحديد رقم الخلية وصلاحيتها.
    ملاحظة: الغشاء النووي هو نفاذية إلى تريبان الأزرق. لذلك ، فإن صبغة النوى المعزولة موجبة ل Tripan Blue. في عداد الخلايا الآلي ، يتم استخدام النسبة المئوية للخلايا الميتة لتقدير النسبة المئوية للنوى المعزولة (الشكل 5 أ).
  6. إذا كانت النسبة المئوية للنوى السليمة أكبر من 90٪ (مما يعني أن 90٪ على الأقل من النوى ملطخة باللون الأزرق المثقب وتظهر شكلا دائريا وجانبا منتفخا ؛ راجع الشكل 5B ، C) ، تابع استخدام شريحة الموائع الدقيقة واتبع البروتوكول من مصنعي رقائق الموائع الدقيقة11.

6. تقسيم الخلية الواحدة (بما في ذلك تضخيم cDNA وبناء المكتبة)

  1. تابع على الفور بروتوكول تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة لشريحة الموائع الدقيقة11 للحصول على أفضل النتائج. اضبط استرداد الخلية المستهدفة على 6000 خلية أو أكبر.

7. التسلسل

  1. بعد إنشاء المكتبات ، قم بقياس توزيع حجم الشظايا وتركيزات العينات باستخدام محلل كهربائي آلي.
    ملاحظة: تتراوح توزيعات حجم الشظايا المثلى بين 300-1000 نقطة أساس.
  2. العينات جاهزة للتحميل في جهاز التسلسل. تجمع المكتبات من عينات مختلفة معا. تركيز التحميل النهائي للمكتبات المجمعة هو 750 pM في حجم إجمالي قدره 24 ميكرولتر. قم بتحميل المكتبات المجمعة في خرطوشة الكاشف ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة للتسلسل12.
  3. قم بتسلسل المكتبات التي تم تحميلها في خلية التدفق والخرطوشة المجمعة مسبقا وفقا لعمق التسلسل المطلوب مع الفهرسة المزدوجة ذات النهاية الزوجية. يقرأ التسلسل الملتزم بالبروتوكول الذي حدده مصنعو رقائق الموائع الدقيقة على النحو التالي11: اقرأ 1: 28 دورة ، مؤشر i7: 10 دورات ، مؤشر i5: 10 دورات ، وقراءة 2: 90 دورة. بعد الانتهاء من التسلسل ، تخضع البيانات لتحليل المعلوماتية الحيوية.
  4. استخدام أساليب المعلوماتية الحيوية لأداء ضوابط الجودة. يتضمن ذلك تقييم عدد الخلايا المتسلسلة ، والقراءات لكل خلية ، وعدد الجينات المعينة لكل خلية.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، يبلغ عدد الخلايا المتسلسلة 80٪ على الأقل من الخلايا المستهدفة. يوصى بأن يكون عدد القراءات لكل خلية 30000 على الأقل ، وعدد الجينات المكتشفة أعلى من 3000 (لعينات الفئران).

النتائج

تهدف المنهجية المصممة في هذه الورقة على وجه التحديد إلى تعزيز تحضير عينات الأجنة لأوميكس وحيد الخلية من E6.5 إلى E8. يتكون خط الأنابيب القوي هذا من خمس خطوات رئيسية: الحمل المتزامن ، وعزل الأجنة ، والتنميط الجيني في نفس اليوم ، وتفكك الخلايا ، وتقييم صلاحية الخلية (الشكل 1 أ). بينما تركز البيانات المقدمة على النقاط الزمنية من E7 إلى E7.5 ، يمكن تطبيقها على الأجنة حتى E8 (الشكل 1B) مع اختلافات صغيرة في الإجراء (المشار إليها في الملاحظات في جميع أنحاء البروتوكول). تم تحقيق الحمل المتزامن عن طريق وضع اثنين من الفئران الإناث في قفص مع ذكر الفأر. تم فحص المقابس المهبلية كل صباح قبل الساعة 10 صباحا ، وإذا لوحظت سدادة ، فقد تم اعتبارها E0.5 بحلول ظهر ذلك اليوم (الشكل 2 أ). في هذه الدراسة ، تطلبت الظروف المثلى للمقابس إقران أنثى فأر في مرحلة الشبق أو الشبق مع ذكر له تاريخ في وضع العديد من المقابس بنجاح أثناء التكاثر السابق (الشكل 2 ب). تم النظر فقط في المقابس الواضحة لعزل الجنين (الشكل 2C).

تم تقدير توقيت النمو وفقا للجدول الزمني في الشكل 2 أ. بالنسبة ل E7.5 ، بدأ تشريح الجنين في الساعة 12 ظهرافي اليوم السابع التالي ليوم اكتشاف القابس. يوضح الشكل 3 عزلا ناجحا للجنين عند E7.5. بعد القتل الرحيم للسد الحامل ، تم تشريح قرن الرحم ، وتم قطع التورم النفضي بشكل فردي ، وكشف الجنين ، وتم عزل كيس الصفار للتنميط الجيني (الشكل 3).

تم إجراء التنميط الجيني في نفس اليوم في غضون 3 ساعات من عزل الجنين باتباع الخطوات الواردة في الشكل 4 أ. تم الاحتفاظ بالأجنة على الجليد أثناء عملية التنميط الجيني للحفاظ على سلامتها. لا تجمد الأجنة ، لأنها ستقلل من عدد الخلايا القابلة للحياة لكل جنين. يوضح الشكل 4B ، C كيس الصفار الحشوي ، وكيس الأديم الباطن الجداري ، ومخروط المشيمة الخارجية مع دم الأم المرتبط. تم استخدام كيس الصفار الحشوي للتنميط الجيني (الشكل 4C). بعد هضم كيس الصفار ، تم تحضير مزيج PCR ، وتم تشغيل تفاعل PCR. ثم تم فصل منتج PCR الناتج على هلام الأغاروز. يوضح الشكل 4D أحجام الشظايا المتوقعة ل LoxP والأليلات من النوع البري (597 bp و 498 bp ، على التوالي) وأليل Cre (650 bp). في الشكل 4E ، يتم تقديم مثال على التنميط الجيني لكيس الصفار من 6 أجنة تم الحصول عليها من أزواج التكاثر التي تحمل أليلات Cre و LoxP (flox). تصور المواد الهلامية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لأليلات Cre و LoxP في 6 أجنة تم تحليلها. الأجنة رقم 2 ورقم 5 تحمل 2 أليل فلوكس و 1 أليل كري. لذلك ، فهي تعتبر أجنة KO مشروطة (الشكل 4E ، النقاط الحمراء). يحتوي الأجنة 1 و 3 على 2 أليلات فلوكس ولكنهما سلبيان ل Cre. لذلك ، فهي تعتبر ضوابط FLOX. يحتوي الجنين 4 على 2 أليلات فلوكس وشريط خافت لأليل Cre ، مما يؤدي إلى نمط وراثي "غير واضح". لم تتم معالجة هذا الجنين مرة أخرى (بدلا من ذلك ، قد يفكر التجريبيون في تكرار التنميط الجيني أو إجراء تحقق ثانوي من KO الشرطي باستخدام الخلايا التي تعبر عن Cre). من المهم ملاحظة أن برنامج تشغيل Cre المستخدم في هذه التجربة لا يتم التعبير عنه في كيس الصفار الحشوي15 ؛ وبالتالي ، لا تظهر أليلات LoxP متحولة على هلام الأجنة الإيجابية Cre مقارنة بالأجنة السلبية Cre.

مطلوب عدد الخلايا والجدوى الجيدة لتجربة خلية واحدة ناجحة. المعلقات ذات الصلاحية المنخفضة للخلية ، أو نسبة عالية من الخلايا الميتة ، أو التكتل ، أو الحطام الكبير غير مناسبة لمزيد من المعالجة. الظروف المثلى هي 700-1200 خلية حية لكل ميكرولتر و >90٪ قابلة للحياة. يقدم الشكل 5 أ لوحة توضح كلا من صلاحية الخلية الجيدة ودون المستوى الأمثل. يمكن أيضا تطبيق نفس المعايير على عزل النوى، كما هو موضح في الشكل 5B. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان ملاحظة أن تقييم المثقب الأزرق يختلف عن الخلايا والنوى: الخلايا القابلة للحياة لا تتضمن المثقب الأزرق ، في حين أن النوى القابلة للحياة تفعل ذلك. إذا كان تعليق الخلايا / النوى هو الأمثل (>90٪ قابلية للحياة) ، فتابع تقسيم الخلية المفردة باستخدام شريحة الموائع الدقيقة باتباع إجراءات الشركة المصنعة11. يتم توفير خيارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمعلقات حيث تتراوح صلاحية الخلية / النوى بين 60٪ -89٪ ، كما هو موضح في الشكل 5C. إذا كانت الجدوى ، بغض النظر عن العدد الإجمالي للخلايا ، أقل من 60٪ ، ففكر في إيقاف التجربة.

يستغرق خط الأنابيب بأكمله من إعدام السد الحامل إلى بناء المكتبة ما مجموعه 8 ساعات في نفس اليوم (على سبيل المثال ، يجب تنفيذ خطوات البروتوكول من 2 إلى 6 في نفس اليوم). باتباع الإجراءات التي حددتها إجراءات الشركات المصنعة للخليةالواحدة 11 ، تم إعداد إنشاءات المكتبة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية باستخدام الخلايا التي تم الحصول عليها من أجنة E7 ، مع بقاء الخلية تتراوح من الظروف دون المستوى الأمثل إلى الظروف المثلى ، بهدف استعادة الهدف المقدر ل 2000 خلية (الشكل 6). يصور الشكل 6A توزيعا تمثيليا لحجم الجزء لمكتبات scRNAseq لكل من الظروف دون المستوى الأمثل والأمثل ، مما يشير إلى أن صلاحية الخلية لا تؤثر بشكل كبير على عملية تقسيم الخلية الواحدة بأكملها. تراوح توزيع حجم الشظايا بين 400-500 نقطة أساس. يشير هذا إلى أن الظروف دون المستوى الأمثل لا تؤثر على عملية إعداد المكتبة. يوضح الشكل 6B نتائج كل من تجارب RNAseq أحادية الخلية الناجحة ودون المستوى الأمثل. بعد التسلسل ، أجريت فحوصات مراقبة الجودة على العينات ولاحظت أنه في الحالات التي كانت فيها صلاحية الخلية دون المستوى الأمثل ، تم تسلسل 10٪ فقط من الخلايا بنجاح. في المقابل ، أظهرت العينات المثلى نسبة أعلى ، حيث تم تسلسل 91٪ من إجمالي الخلايا. تم إثبات ذلك أيضا من خلال مخططات الباركود ، مما يشير إلى أن الظروف دون المستوى الأمثل لها ضوضاء خلفية أكبر مقارنة بالظروف المثلى. تم إجراء تحليل التجميع لكلتا التجربتين وكشف عن 9 مجموعات في الظروف المثلى و 4 في دون المستوى الأمثل. كشف شرح المجموعات باستخدام العلاماتالمعروفة 3 عن أنواع الخلايا المتوقعة في أجنة E7 ، بما في ذلك الأرومة والخط البدائي (الشكل 6B). لم تكن التعليقات التوضيحية العنقودية في التجربة دون المستوى الأمثل ممكنة بسبب عدم الإثراء في العلامات المعروفة لكل مجموعة. هذا يسلط الضوء على أهمية الخلايا عالية الجودة المطلوبة للتمثيل الصحيح للبيانات خلال مراحل التطوير هذه.

figure-results-1
الشكل 1: تحسين أجنة الفئران الكاملة المعدة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. (أ) تخطيط سير العمل للحصول على خلايا و / أو نوى عالية الجودة من أجنة المعدة. (ب) صور ميدانية ساطعة تمثيلية ومخطط3 معدل لأجنة الفئران أثناء المعدة من E7 إلى E8. شريط المقياس: 125 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: استراتيجية الحمل المتزامن الفعال لعزل الأجنة أثناء المعدة. (أ) رسم تخطيطي يشير إلى خط أنابيب الحمل الموقوت وجدول زمني يصف الأوقات من اكتشاف السدادة إلى عزل الجنين لتحليل مراحل محددة من المعدة. (ب) صور تمثيلية لمراحل دورة الشبق لإناث الفئران. يشار إلى المراحل الأكثر تقبلا للتكاثر. (ج) رسم تخطيطي يوضح كيفية التحقق من وجود سدادات مهبلية وأمثلة على الفتحات المهبلية التي لا تحتوي على سدادة أو سدادة جزئية أو سدادة جيدة يجب مراعاتها لعزل الجنين. يتم تكبير الفتحات المهبلية أسفل كل صورة. يتم تمييز السدادة (السائل المنوي المتخثر في فتحة المهبل) بسهم أحمر يشير إليها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تشريح أجنة E7.5 والتنميط الجيني لتسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية. مخططات تخطيطية وصور لعملية عزل أجنة E7.5 وتشريح كيس الصفار الحشوي. يشير السهم الأصفر إلى رحم السد الحامل ، وتحدد الدائرة الصفراء المتقطعة موقع الجنين. تمثل الخطوط المتقطعة المناطق التي تم قطعها أثناء التشريح. يشير الحرف "M" إلى النهاية الوسيطة ، بينما يشير الحرف "AM" إلى النهاية المضادة للميزومتريال. أشرطة المقياس في صور المجسمة هي 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: التنميط الجيني في نفس اليوم لأكياس الصفار من أجنة الفئران المعدة. (أ) مخطط سير العمل للتنميط الجيني لأكياس الصفار في نفس اليوم. ب: صورة تمثيلية لكيس الأديم الباطن الجداري ومخروط المشيمة الخارجية مع دم الأم المرتبط به. (ج) كيس الصفار الحشوي في أجنة E7.5 التي يبرزها الخط المتقطع. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. (د) المواد الهلامية التمثيلية من النوع البري (+/+) ، والزيجوتة غير المتجانسة (Flox / +) ، والفلوكس متماثل الزيجوت (Flox / Flox) ، والتنميط الجيني Cre (Mesp1cre15) مع أحجام شظايا الحمض النووي المرصودة. (ه) يتم توفير نتائج التنميط الجيني في نفس اليوم لأليلات Cre و flox من أكياس صفار 6 أجنة (1-6). الجنينان اللذان يحتويان على التنميط الجيني flox / flox و Cre السلبي (-) هما عناصر تحكم في flox (نقاط زرقاء) ، في حين أن تلك التي تحتوي على flox / flox و Cre موجب (+) هي KOs مشروطة (نقاط حمراء). الجنين 4 ليس مثاليا بسبب شريط Cre الخافت (flox / flox و Cre-unclear) وبالتالي يتم استبعاده من المعالجة الإضافية. يتم تجميع الأجنة التي لها نفس النمط الجيني ومعالجتها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. لاحظ أن وجود أليل Cre في كيس الصفار لا يؤثر على حجم نطاقات flox ، حيث لا يتم التعبير عن Cre المستخدم (Mesp1cre) في كيس الصفار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تقييم جودة الخلية وصلاحية النوى. (أ) صور تمثيلية لظروف بقاء الخلية المثلى ودون المثلى من أجنة E7.5. (ب) صور تمثيلية لظروف بقاء النوى المثلى ودون المثلى من أجنة E8 (ج) مخطط استكشاف الأخطاء وإصلاحها الذي يشير إلى الحلول المحتملة للمساعدة في زيادة صلاحية الخلايا قبل البدء في تقسيم الخلية الواحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية لأجنة فأر E7. (أ) تتبع تمثيلي لتوزيع حجم الشظايا لمكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من أجنة الفئران E7 لكل من الظروف دون المستوى الأمثل والأمثل لصلاحية الخلية ، مع الذروة الرئيسية بالقرب من 400-500 bp. لاحظ أن عمليات التتبع متشابهة بين هذه الشروط ، مما يشير إلى أن صلاحية الخلية لا تؤثر على ضوابط الجودة في المكتبة. (ب) تحليل نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران E7 في ظل ظروف دون المستوى الأمثل والأمثل مع إظهار استعادة الهدف المرصودة ، وترتيب الباركود ، وتجميع أنواع الخلايا من خلال تقريب وإسقاط مشعب موحد (UMAP). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحلل العازلة
اسم الكاشفتركيز المخزونالتركيز النهائيالحجم الكلي 1 مل
تريس هيدروكلورايد (Ph7)1 م10 مللي متر10 ميكرولتر
كلوريد الصوديوم5 م10 مللي متر2 ميكرولتر
إم جي سي إل20.1 م3 مللي متر3 ميكرولتر
توين -2020%0.10%5 ميكرولتر
نونديد P4010%0.10%10 ميكرولتر
ديجيتونين5%0.01%2 ميكرولتر
دي تي تي1 م1 مللي متر1 ميكرولتر
مثبطات RNase40 وحدة / ميكرولتر1 وحدة / ميكرولتر25 ميكرولتر
ماء خال من النيوكلياز----924 ميكرولتر
غسل العازلة
اسم الكاشفتركيز المخزونالتركيز النهائيالحجم الكلي 1 مل
BSA في برنامج تلفزيوني10%1%100 ميكرولتر
برنامج تلفزيوني----900 ميكرولتر

الجدول 1: المخزن المؤقت لتحلل عزل النوى وتكوين المخزن المؤقت للغسيل.

المناقشة

يتم تقديم خط أنابيب قوي في هذه الورقة للحصول على معلقات عالية الجودة للخلية الواحدة والنوى من أجنة الفئران المعدة ، المصممة خصيصا لتسهيل الدراسات حول آليات تحديد مصير الخلية في التطور المبكر. تعالج هذه الطريقة فجوة حاسمة في مجال المعدة من خلال تحسين تحليل الأجنة التي تتطلب أنماطا وراثية ، مثل الجينات الجنسية أو الجسدية. من خلال استخدام نماذج فأر الطفرة الجينية واستخدام تسلسل خلية واحدة عالي الدقة على أجنة الفئران الكاملة ، يمكن لخط الأنابيب هذا أن يعزز فهم ملفات تعريف التعبير الجيني لمعدية الفأر المبكرة. توضح هذه الطريقة جدوى استخدام نموذج فأر طفرة جينية بواسطة نظام Cre recombinase للحصول على خلايا ونوى عالية الجودة في نقاط زمنية مبكرة للنمو لأوميكس أحادي الخلية. تطورت هذه الطريقة من خلال محاولات متعددة ، لم تستوف خلالها العينات معايير الجودة المطلوبة لإعداد المكتبة وتسلسلها. تولد المنهجية الموضحة خلايا / نوى كافية من الأجنة الأصغر من E8 من خلال تحسين ثلاث خطوات حاسمة: (1) الحمل المتزامن الموقوت لزيادة عدد الأجنة ، (2) التنميط الجيني في نفس اليوم لتجنب التجمد / الذوبان ، و (3) تقييم صلاحية الخلية / النوى لتجنب تسلسل الخلايا المحتضرة. يقدم هذا البروتوكول نتائج ناجحة باستخدام RNASeq أحادي الخلية ، ولكن يمكن معالجة معلقات الخلية أو النوى التي تم الحصول عليها في هذا البروتوكول في منصات تسلسل أخرى ، حيث تكون صلاحية الخلية هي العامل المحدد ، مثل smart-seq و drop-seq و cel-seq16.

في الجنين E7 ، يمكن أن يختلف عدد الخلايا اعتمادا على السلالة والنمط الجيني الطافر. عادة ، يمكن أن يتراوح جنين E7 من مئات إلى بضعة آلاف من الخلايا ، والحصول على أجنة ذات النمط الجيني المطلوب يمثل تحديا ، حيث يفي 1 أو 2 أجنة فقط لكل سد حامل بالمعايير. يسمح هذا البروتوكول بالتقاط حوالي 300 خلية قابلة للحياة لكل جنين E7 لتحليل خلية واحدة. أثبتت محاولات زيادة حجم تجمع الأجنة عن طريق تجميد الأجنة المفاجئ من السدود الحوامل في أيام مختلفة فشلها ، حيث تعرضت صلاحية الخلية للخطر الشديد بعد الذوبان ، حتى مع إضافة عوامل الحفظ بالتبريد. ولمواجهة هذا التحدي، تم تحسين استراتيجية التكاثر وتزامن السدود الحامل. لزيادة فرص العزلة المتعددة ، يوصى باستخدام إناث الفئران التي أنجبت 1-2 مرات قبل التكاثر للعزل ، حيث من المرجح أن يكون لها أحجام أكبر من القمامة. مراقبة دورة الأنثى الشحمية أمر بالغ الأهمية. من المرجح أن يحدث التزاوج خلال مراحل الشبق والشبق. إذا ظهرت صعوبات في التكاثر ، فإن تبديل شركاء التربية بعد أربعة أيام سيساعد أيضا في حالة عدم إنتاج قابس.

من المهم ملاحظة أن هذه الطريقة لها قيود: فهي تعتمد على المقابس المرصودة ، وحتى إذا لوحظت سدادة ، فإنها لا تضمن الحمل ولكنها تشير فقط إلى النشاط الجنسي. لذلك ، فإن زيادة عدد المقابس المرصودة في اليوم ستزيد من احتمال وجود أكثر من سد حامل واحد في اليوم وأنماط وراثية أكثر إيجابية. أظهر هذا البروتوكول جدوى استخدام المراحل الجنينية التي تتراوح من E7 إلى E7.75 كدليل على المفهوم أثناء المعدة. ومع ذلك ، يمكن تطبيق خط الأنابيب هذا من أجنة E6.5 إلى E8. بالنسبة لأجنة E6.5 ، يوصى بزيادة عدد حالات الحمل المتزامن للحصول على 7 أجنة على الأقل مع النمط الجيني المطلوب لتجميعها. بدلا من ذلك ، بالنسبة لأجنة E8 ، قم بزيادة كمية التربسين المستخدمة لفصل كل جنين إلى ~ 40 ميكرولتر بدلا من 20 ميكرولتر. الهدف هو الحصول على تعليق خلية / نوى في نطاق تركيز 700-1200 خلية لكل ميكرولتر قبل الشروع في التقسيم.

يعد وجود قابلية جيدة للخلية أمرا ضروريا لنجاح تسلسل الخلية الواحدة. في تصميم رقاقة الموائع الدقيقة التي توفرها الشركات المصنعة ، يتم تقسيم الخلايا المفردة إلى حبات هلامية في مستحلب (GEMs) داخل شريحة تحتوي على حبات هلام معروفة بالباركود11. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الملحوظة لهذه العملية هو أنه يمكن تقسيم كل من الخلايا المفردة عالية الجودة وذات الجودة الرديئة. حتى مع وجود عدد كاف من الخلايا الحية (أي 1000 خلية / ميكرولتر) ، إذا كانت صلاحية التعليق منخفضة (أي 1000 خلية حية و 1000 خلية ميتة ، مما يؤدي إلى بقاء 50٪) ، فمن المحتمل أن تفشل تجربة التسلسل. للحصول على أفضل النتائج ، يوصى باستهداف الجدوى بنسبة 90٪ تقريبا. إذا كانت صلاحية الخلية تتراوح بين حوالي 60٪ -89٪ ، فيمكن اتخاذ تدابير محددة لتعزيز جدوى التجربة. ومع ذلك ، إذا كانت صلاحية الخلية أقل من 60٪ ، ينصح بشدة بعدم الاستمرار في التجربة. والسبب في ذلك هو أنه سيتم "التقاط" الخلايا المحتضرة في هلام التقسيم ، وسيمر إعداد المكتبة اللاحقة وضوابط الجودة دون مشاكل ملحوظة. ومع ذلك ، قد تفشل تجربة التسلسل الفعلية تماما ، حيث أن معظم قراءات التسلسل سترسم خريطة لجينات الميتوكوندريا أو الريبوسومية أو موت الخلايا المبرمج ، مما يشير إلى علامات ضعف صلاحية الخلية منذ البداية. توضح البيانات المقدمة في هذه الورقة خط أنابيب لتسلسل الخلية الواحدة لأجنة الفئران المعدة بخلايا عالية الجودة. يمكن تطبيق هذه المنهجية لفهم العديد من نماذج فأر الطفرات الجينية المختلفة أثناء التطوير.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نحن نعترف بمركز الجينوم الأساسي في مركز فوكس تشيس للسرطان وأعضاء مختبر الدكتور جوناثان ويتستين زاك جراي وماديسون هونر وبنيامين فيرمان للدعم الفني لتجارب التسلسل. نحن نعترف بأعضاء المختبر للدكتور إستاراس وأليكس موريس ، وهو طالب دراسات عليا مناوب ساهم في التحليل الأولي لدراسات الخلية الواحدة. يتم تمويل هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01HD106969 و R56HL163146 إلى Conchi Estaras. بالإضافة إلى ذلك ، تم دعم إليزابيث أبراهام من خلال منحة تدريب T32 5T32HL091804-12.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق بتري 10 سمجينيسي Scientific25-202
1000 & L الوصول إلى طرف حاجزجينيسي العلمي23-430
20 & L الوصول إلى طرف حاجزجينيسي Scientific24-404
300 & L الوصول إلى حاجز تلميحجينيسي العلمية24-415
37 & مايكرو ؛ م مصفاة قابلة للانعكاس ،خلية جذعية27215
طبق بتري 6 سمGenesee Scientific25-260
أنابيب PCR ذات 8 شرائطGenesee Scientific27-125U
AgaroseApex Bioresearch Product20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry BathGenesee31-437
المعيار العلمي Z216-MK Z216MK Hermle أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردةجينيسي33-759R
ألبومين مصل الأبقار (BSA) وحدةSigma-AldrichA2153
10XPN-1000127
الكروم التالي GEM أحادي الخلية 3 أطقم كاشف v3.110XPN-1000269
الكونتيسة 3 عداد الخلايا الآليInvitrogenAMQAX2000
شرائح غرفة كونتينج خلية الكونتيسةInvitrogenC10283
D1000 الكواشفAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
DigitoninThermoFisher ScientificBN2006
DirectPCR صفار الكيسViagen201-Y
Dithiothreitol ( DTT)ThermoFisher ScientificR0861
DNA LoBind Tube 1.5 ملEppendorf22431021
Dubecco لوسط النسر (DMEM ، 1x)CORNING10-013-CV
Dulbecco's PBSGenClone25-508
Dumont # 5 Fine FulpsFine Science Tools11254-20
Dumont #5SF أدوات العلوم الدقيقة من الملقط11252-00
نظام التصوير الإيثانولKoptecV1401
EVOS M7000مقص InvitrogenAMF7000
أدوات العلوم الدقيقةمن شارب14060-11
GoTaq G2 Green Master MixPromegaM7823
Graefe ملقطأدوات العلوم الدقيقة11049-10
MgCl2< / sub>ThermoFisher ScientificAC223211000
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834
NaClFisher ChemicalS271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Recodes (100 دورة) v3Illumina20046811
NextSeq2000Illumina
نيكون SMZ 1000 مجهر ستيريونيكون
Nondiedt P40سيجما ألدريتش74385
مائي خال من NucleaseGenClone25-511
أنبوب بصري 8x قطاع (401428)Agilent401428
8x شريط (401425)Agilent401425
بوسيدون 31-511 ، جهاز طرد مركزي دقيق HS24 ، مع دوار 24 × 1.5 / 2.0 مل ، 1 جهاز طرد مركزي / وحدةجينيسي31-511
بروتيناز Kسيجما-ألدريتشP6556
كيوبيت dsDNA أطقم الفحص الكميInvitrogenQ32851
Qubit Flex 3مثبط Invitrogen
RNaseفيشر Scientific12-141-368
ملقط النمطالقياسي أدوات العلوم الدقيقة11000-12
تحميل محطة الشريطAgilent5067-5598
Tapestation 4150AgilentG2992AA
Tris-HCL (Ph7)الجودة البيولوجية351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4٪Theromo Fisher ScientificT10282
Tryple ExpressGibco12604-021
Tween-20Bio-Rad1662404
خلاط دوامة IKA MS3 مع محول لوحة عينة 96 بئرIKA3617000
صغيرة تحكم الكروم تعديل Fine - غطاء أنبوب بصري نصائح

المراجع

  1. Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
  2. Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond. Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).
  3. Pijuan-Sala, B., et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).
  4. Mittnenzweig, M., et al. A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation. Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).
  5. Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate. Mech Dev. 163, 103617(2020).
  6. Argelaguet, R., et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).
  7. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  8. Mohammed, H., et al. Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation. Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).
  9. Lescroart, F., et al. Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq. Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).
  10. Scialdone, A., et al. Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling. Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).
  11. Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2024).
  12. NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm (2024).
  13. Dai, H. Q., et al. TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling. Nature. 538, 528-532 (2016).
  14. Li, Q., et al. editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).
  15. Saga, Y., et al. MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube. Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.