توليد وتحليل صور الأنسجة عالية المعلمات باستخدام قياس التدفق الخلوي

ملخص

الموصوفة هنا هي طريقة يمكن استخدامها لتصوير خمسة أو أكثر من المعلمات الفلورية بواسطة المجهر المناعي. تم تحديد خط أنابيب تحليل لاستخراج الخلايا المفردة من هذه الصور وإجراء تحليل الخلية الواحدة من خلال استراتيجيات بوابات تشبه قياس التدفق الخلوي ، والتي يمكنها تحديد مجموعات فرعية من الخلايا في أقسام الأنسجة.

الملخص

إن استخدام علم الأنسجة للتحقيق في تنوع الخلايا المناعية في أقسام الأنسجة مثل تلك المشتقة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) محدود للغاية بسبب عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها في وقت واحد. تم تعريف معظم المجموعات الفرعية للخلايا المناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي باستخدام مجموعات معقدة من علامات البروتين ، وغالبا ما تتطلب أربعة معلمات أو أكثر لتحديدها بشكل قاطع ، وهو ما يتجاوز قدرات معظم المجاهر التقليدية. نظرا لأن قياس التدفق الخلوي يفصل الأنسجة ويفقد المعلومات المكانية ، فهناك حاجة إلى تقنيات يمكنها الاحتفاظ بالمعلومات المكانية أثناء استجواب أدوار أنواع الخلايا المعقدة. تتم معالجة هذه القضايا هنا من خلال إنشاء طريقة لتوسيع عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها عن طريق جمع إشارات الفلوروفورات المتداخلة طيفيا واستخدام عدم الخلط الطيفي لفصل إشارات كل فلوروفور على حدة. ثم تتم معالجة هذه الصور باستخدام خط أنابيب تحليل لالتقاط صور الأنسجة عالية المعلمات واستخراج خلايا مفردة من هذه الصور بحيث يمكن تحليل خصائص الفلورسنت الفريدة لكل خلية على مستوى خلية واحدة. باستخدام استراتيجيات البوابات الشبيهة بقياس التدفق الخلوي ، يمكن بعد ذلك تحديد ملامح الخلايا في مجموعات فرعية وتعيينها مرة أخرى على أقسام الأنسجة ليس فقط لتحديد وفرتها ، ولكن أيضا لتحديد كيفية تفاعلها مع بيئة الأنسجة. بشكل عام ، تم إثبات بساطة وإمكانية استخدام قياس التدفق الخلوي النسيجي لدراسة مجموعات المناعة المعقدة في أقسام الأنسجة.

المقدمة

يمكن أن يساهم الالتهاب الناجم عن خلايا الجهاز المناعي والخلايا الدبقية في الاضطرابات المزمنة في الجهاز العصبي المركزي حيث يمكن لكل مجموعة تعزيز نشاط^1،2،3 الأخرى. إن فهم كيفية تفاعل الجهاز المناعي مع هذه العناصر من الجهاز العصبي المركزي لتعزيز التهاب الجهاز العصبي المركزي هو حاليا موضوع رئيسي للاهتمام وقد تم تسهيله إلى حد كبير من خلال التقنيات عالية المعلمات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، اكتشفنا أن هناك اتصالا مكثفا يحدث بين الخلايا الدبقية والجهاز المناعي في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي^4،5،6. إن فهم كيفية تأثير هذه التفاعلات على هذه الاضطرابات سيكون أمرا حاسما لتوضيح بيولوجيا هذه الأمراض.

تتمثل إحدى مشكلات تحليلات تسلسل الخلية الواحدة في أن هذه التقنيات تتطلب تعطيل الأنسجة للحصول على خلايا أو نوى مفردة ، مما يؤدي إلى فقدان كامل للمعلومات المكانية. إن معرفة مكان وجود الخلية في الأنسجة أمر بالغ الأهمية لفهم دور الخلية في تحفيز الالتهاب. على سبيل المثال ، يمكن للخلايا المناعية مثل الخلايا البائية التركيز في الجهاز العصبي المركزي أثناء الالتهاب العصبي. ومع ذلك ، نادرا ما تدخل حمة الجهاز العصبي المركزي وبدلا من ذلك تركز في حواجز الجهاز العصبي^{المركزي 7}. نظرا لتوطينها ، فمن غير المحتمل أن تساهم هذه الخلايا في التهاب الجهاز العصبي المركزي من خلال التفاعل جسديا مع الخلايا الدبقية في حمة الجهاز العصبي المركزي ، مما يشير إلى أن أي تفاعلات قد تكون مع الخلايا الدبقية ستحدث من خلال عوامل مفرزة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون لعلم الأمراض الذي يحدث في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي بنية ^8,9 بحيث يمكن لتوطين الخلية في الأنسجة أن يحدد بشكل حاسم ما إذا كانت تساهم بنشاط في الاضطراب أو أنها متفرج. وبالتالي ، فإن استخدام التوجه المكاني لتقييم دور الخلية في علم الأمراض أمر ضروري.

عادة ما يتم إنجاز دراسة الخلايا في الأنسجة باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية أو الفحص المجهري المناعي. تكمن مشكلة هذه التقنيات في أنها عادة ما يمكنها فقط تصوير ما يصل إلى أربعة معلمات في وقت واحد. وهذا قيد رئيسي على هذه التقنيات، كما نعلم من تحليلات قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أن العديد من مجموعات الخلايا تتطلب معلمتين أو أكثر لتحديدها؛ أيضا ، يزداد عدد المعلمات المطلوبة عادة عند البحث عن مجموعات فرعية محددة من نوع الخلية¹⁰. وبالتالي ، من غير العملي استخدام تقنيات التصوير القياسية لدراسة كيفية تفاعل مجموعات فرعية من الخلايا داخل الأنسجة.

تم التغلب على هذه المشكلة جزئيا من خلال طرق أحدث عالية المعلمات يمكنها الاحتفاظ بالمعلومات المكانية ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي المكاني¹¹ وتصوير قياس الكتلة^{الخلوية 12}. في حين أن هذه التقنيات ذات قيمة ، إلا أنها تواجه العديد من المشكلات ، مثل عدم توفرها على نطاق واسع ، وتقليل البيانات ثلاثية الأبعاد إلى بعدين ، وتتطلب خبرة كبيرة للتنفيذ. تقنية أخرى تعرف باسم التلوين المتسلسل ، حيث يتم تلطيخ الأنسجة بمجموعة واحدة من الأجسام المضادة متبوعة بتعطيل المجموعة السابقة من الأجسام المضادة قبل تلطيخها بمجموعة أخرى من الأجسام المضادة ، يمكن أن تحقق أنسجة عالية المعلمات دون الحاجة إلى معدات أو خبرة متخصصة^13،14،15. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التلوين المتسلسل كثيف العمالة ويتطلب قدرا كبيرا من وقت الفحص المجهري ، والذي قد يكون غير عملي للمختبرات التي لا تمتلك مجهرا شخصيا. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنيات يمكنها زيادة عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها في وقت واحد على المجاهر المتاحة على نطاق واسع وفي الوقت المناسب.

بمجرد الحصول على البيانات عالية المعلمات ، تنشأ مشكلة أخرى: من غير المرجح أن تقوم طرق تحليل الصور التقليدية بتحليل البيانات بنجاح. لا تكون تقنيات مثل العد اليدوي أو العتبة قابلة للتطبيق إلا إذا كان التحليل يتكون من معلمة واحدة أو إذا كانت العلامات المتعددة لها نفس التوطين حيث يتم حساب الإشارات المتداخلة فقط. هذا القيد يجعل التحليل التقليدي غير كاف للعمل مع مجموعات البيانات عالية المعلمات. تم تحقيق تحليل ناجح لمجموعات البيانات هذه من خلال تقسيم الخلايا المفردة من صور الأنسجة ثم إجراء استراتيجيات بوابات تشبه قياس التدفق الخلوي لتحديد أنواع الخلايا^16,17. ومع ذلك ، هناك مشكلة أخرى تؤثر على هذه التحليلات وهي أنها تعمل فقط مع مجموعات البيانات حيث يتم فصل جميع الخلايا ذات الأهمية ماديا عن بعضها البعض ، لأن هذه التقنيات لا تستخدم طرقا يمكنها فصل الخلايا التي هي على اتصال جسدي بدقة. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طريقة أحدث يمكنها إجراء تحليلات خلية واحدة على أقسام الأنسجة حتى لو كانت الخلايا على اتصال جسدي.

في هذه المقالة ، تم وصف بروتوكول بسيط يسمى قياس التدفق الخلوي النسيجي الذي تم تقديمه سابقا¹⁸ والذي يوسع عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها في وقت واحد باستخدام المجاهر المتاحة على نطاق واسع. يعمل هذا البروتوكول عن طريق تلطيخ الأنسجة بأصباغ متداخلة طيفيا ثم استخدام التعويض الطيفي لإزالة النزيف من القنوات المتداخلة للحصول على بقع مفردة واضحة. لتسهيل تحليل صور الأنسجة عالية المعلمات ، يتم وصف خط أنابيب تحليل مفصل يستخرج الخلايا المفردة من أقسام الأنسجة لغرض فرز الخلايا إلى مجموعات متميزة باستخدام استراتيجيات بوابات تشبه قياس التدفق الخلوي. يعمل هذا البروتوكول في الأنسجة التي توجد فيها الخلايا بشكل منتشر وفي الأنسجة التي تضغط فيها الخلايا معا بشكل وثيق، مما يجعل هذه التقنية متعددة الاستخدامات لدراسة الأنسجة مثل الجهاز العصبي المركزي في كل من الاتزان الداخلي والالتهاب العصبي. وبالتالي ، فإن قياس التدفق الخلوي النسيجي هو تقنية مفيدة لدراسة التفاعلات بين أنواع الخلايا المعقدة التي تتطلب علامات خلايا متعددة لتحديد الخلايا مع الحفاظ على المعلومات المكانية.

البروتوكول

لا يغطي هذا البروتوكول تقسيم الأنسجة للأنسجة. يرجى الاطلاع على Jain et ^al.18 أو¹⁹ للحصول على أوصاف لكيفية تقسيم الأنسجة للأنسجة. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع أي مناديل مقسمة على شرائح زجاجية. تستخدم هذه المقالة الغدد الليمفاوية الأربية المعزولة من محصن كما هو موضح سابقا¹⁸. يتم تلخيص الإجراء والجدول الزمني لهذا البروتوكول في الشكل 1. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تلطيخ أقسام الأنسجة

ملاحظة: بالإضافة إلى تلطيخ الأنسجة بجميع ملصقات الأجسام المضادة التي يهتم بها الباحث ، يجب على الباحث أيضا إعداد عناصر تحكم أحادية اللون (واحدة لكل معلمة فلورية مخصصة للاستخدام) على شرائح الأنسجة المجاورة أو المتطابقة حيث يتم تلطيخ كل عنصر تحكم في اللون بالكواشف المطلوبة لإنتاج إشارة معلمة فلورية واحدة.

1. تحضير بيرم ومنع العازلة وبيرم وتلطيخ العازلة (انظر الجدول 1 للتكوين).
2. قم بإذابة أقسام الأنسجة على الشرائح الزجاجية في درجة حرارة الغرفة وامسح التكثيف باستخدام مسح. استخدم علامة كارهة للماء لتحديد حدود الأنسجة (الأنسجة) التي يجب تلطيخها وترك العلامات تجف.
3. إعادة ترطيب الأنسجة عن طريق نقع أقسام الأنسجة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 1 دقيقة. تخلص من برنامج تلفزيوني واستخدم منديلا لإزالة PBS الزائد دون لمس الأنسجة مباشرة.
4. إصلاح الأنسجة عن طريق إضافة ما يكفي من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) لتغطية الأنسجة تماما. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
   تنبيه: يمكن أن يكون PFA ساما ويجب التعامل معه داخل غطاء الدخان.
   ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة فقط للأنسجة الطازجة المجمدة. إذا تم إصلاح الأنسجة بالفعل ، فتجاهل هذه الخطوة. يتم وصف تثبيت PFA هنا ، ولكن يمكن إصلاح الأنسجة باستخدام طرق أخرى حسب احتياجات التجربة.
5. اغسل المناديل في حمام PBS لمدة 1 دقيقة مع هزاز لطيف ، ثم قم بإزالة الشريحة من الحمام. استبدل برنامج تلفزيوني وكرر الغسيل 3 مرات أكثر.
6. تخلص من PBS الزائد واستخدم منديلا لإزالة PBS الزائد دون لمس الأنسجة مباشرة.
7. حدد الأجسام المضادة الثانوية التي يجب استخدامها في الخطوة 1.12 من البروتوكول وأنواع التي تشتق منها الأجسام المضادة الثانوية. قم بتقوية بيرم ومنع العازلة عن طريق إضافة مصل من هذه إلى بيرم ومنع المخزن المؤقت إلى تركيز نهائي بنسبة 5٪ لكل نوع.
   ملاحظة: يساعد استخدام الأجسام المضادة الثانوية على تضخيم شدة الإشارة. وبالتالي ، يوصى بإقران الأجسام المضادة الأولية التي تنتج إشارات ضعيفة بأجسام مضادة ثانوية لتضخيم إشاراتها. إذا كانت جميع أهداف الأجسام المضادة التي يتم تلطيخها ساطعة بما يكفي بحيث لا تتطلب أجساما مضادة ثانوية ، فيمكن تخطي الخطوات 1.7-1.12 والخطوة 1.15.
8. منع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة عن طريق إضافة ما يكفي من بيرم المحصنة ومنع العازلة لتغطية كل نسيج. احتضان الشرائح لمدة 1-8 ساعات في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة محمية من الضوء.
9. أضف أجساما مضادة أولية غير مقترنة إلى بيرم وعازل تلطيخ عند التخفيفات المحددة تجريبيا (يجب أن تكون الأنواع أو الأنماط المتماثلة للغلوبولين المناعي للأجسام المضادة الأولية مختلفة ويمكن تمييزها بواسطة الأجسام المضادة الثانوية التي ينوي الباحث استخدامها في الخطوة 1.12).
10. قم بتفريغ Perm وحظر المخزن المؤقت واستخدم منديلا لإزالة المخزن المؤقت الزائد دون لمس الأنسجة مباشرة. أضف ما يكفي من بيرم وعازل تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية إلى الأنسجة لتغطيتها واحتضان الشريحة عند 4 درجات مئوية لمدة 12-48 ساعة.
    ملاحظة: سيحتاج الباحث إلى تحديد الوقت الأمثل لحضانة الأجسام المضادة.
11. إعداد العازلة حجب وتلطيخ العازلة (الجدول 1).
12. أضف أجساما مضادة ثانوية إلى المخزن المؤقت للتلطيخ المعد في الخطوة 1.11 عند التخفيفات المحددة تجريبيا. يجب أن تستهدف الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة نفس الأنواع أو الأنماط المتماثلة للأجسام المضادة التي تم استخدامها في الخطوة 1.9.
13. تحضير المخزن المؤقت للتبريد (كما في الجدول 1).
    ملاحظة: تساعد هذه الخطوة في تقليل التألق الذاتي من الأنسجة. إذا لم تكن هناك حاجة إلى ذلك ، فيمكن تخطي الخطوتين 1.13 و 1.14.
14. اغسل المناديل كما هو موضح في الخطوات 1.5-1.6. ثم أضف ما يكفي من مخزن التبريد لتغطية الأنسجة على الشرائح واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة.
15. اغسل المنديل كما هو موضح في الخطوات 1.5-1.6. بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة الثانوية المخففة في المخزن المؤقت للتلطيخ المحضر في الخطوة 1.12 إلى الأنسجة بحيث يتم تغطية الأنسجة بالكامل في المخزن المؤقت للتلطيخ. احتضان الشرائح عند 4 درجات مئوية لمدة 2-8 ساعات.
16. قم بإعداد محلول الحجب عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من المصل العادي من أي نوع من الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها في الخطوة 1.18 (5٪ من كل نوع) إلى المخزن المؤقت للحجب المعد في الخطوة 1.11.
17. اغسل المناديل كما هو موضح في الخطوات 1.5-1.6. ثم ، أضف محلول الحجب مع المصل العادي المحضر في الخطوة 1.16 إلى الأنسجة بحيث يتم تغطيتها بالكامل في محلول تلطيخ. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-8 ساعات.
18. قم بإعداد محلول التلوين عن طريق إضافة أجسام مضادة أولية مترافقة بالفلوروفور عند التخفيفات المحددة تجريبيا إلى المخزن المؤقت للتلطيخ المعد في الخطوة 1.11. أضف أيضا بقعة نووية ، مثل الأصفر النووي ، إلى محلول التلوين عند تخفيف محدد تجريبيا.
    ملاحظة: الخطوات 1.18-1.19 مطلوبة فقط إذا احتاج الباحث إلى استخدام ملصقات إضافية للأجسام المضادة لن تتطلب أجساما مضادة ثانوية لتضخيم الإشارة. في حالة عدم استخدام الأجسام المضادة المقترنة الأولية ، يمكن إضافة بقع النوى في الخطوة 1.12.
19. تخلص من المخزن المؤقت المانع واستخدم منديلا لإزالة المخزن المؤقت الزائد دون لمس الأنسجة مباشرة. أضف ما يكفي من محلول التلوين المحضر في الخطوة 1.18 إلى الأنسجة لتغطيته واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 12-48 ساعة.
20. اغسل المناديل كما هو موضح في الخطوات 1.5-1.6. أضف 5 قطرات من الحامل إلى كل شريحة دون إدخال فقاعات ، وقم بتوجيه غطاء زجاجي برفق وببطء فوق المنديل لتغطية الأنسجة تماما في الحامل واستبعاد جميع فقاعات الهواء. قم بتخزين الشرائح على حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى تصبح جاهزة للتصوير.

2. تصوير أقسام الأنسجة

ملاحظة: في هذه المرحلة ، يتم تلطيخ أقسام الأنسجة بجميع الأجسام المضادة ذات الأهمية لجميع الحالات التي يقصد تصويرها ، ويتم تلطيخ عناصر التحكم أحادية اللون بمعلمة فلورية واحدة في كل قسم. يجب أن يتم التصوير على مجهر يحتوي على كاشفات متعددة يمكن ضبطها للكشف عن نطاقات معينة من الضوء ، ومن الناحية المثالية ، يجب أن يكون لديه إمكانية الوصول إلى أكبر عدد ممكن من خطوط الليزر للإثارة.

1. أدخل إحدى الشرائح الملطخة بالكامل في المجهر وقم بإعداد المجهر لتصوير القسم باستخدام الهدف المراد استخدامه لجمع البيانات.
2. بناء على الفلوروفورات التي تلطخ بها الأنسجة ، حدد خطوط ليزر الإثارة اللازمة لتحفيز تلك الفلوروفورات وحدد نطاقات الانبعاث لكل فلوروفور تحتوي على أكبر قدر من الإشارة.
   ملاحظة: يمكن أن تكون أدوات عرض أطياف التألق عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، انظر جدول المواد) مفيدة لتحديد الأطوال الموجية المثلى للإثارة للفلوروفورات وتحديد النطاقات المثلى للكشف عن الفلوروفور. يجب اختيار الفلوروفورات المستخدمة في قياس التدفق الخلوي النسيجي بحيث يختلف كل فلوروفور في خط الليزر الأمثل الذي يتم تحفيز الفلوروفور به أو يختلف عن النطاق الأمثل لأطوال موجات الانبعاث. سيكون من الصعب فصل الفلوروفورات التي لها أطوال موجية أقرب للإثارة / الانبعاث. يتم تفصيل الفلوروفورات المستخدمة في هذه الدراسة في قسم النتائج.
3. افتح البرنامج 1 (انظر جدول المواد) في مجهر متحد البؤر وحدد علامة تبويب التكوين في الأعلى. ثم حدد زر الجهاز على الجانب الأيسر وقم بتغيير عمق البت إلى 16 بت.
   ملاحظة: يوصى باستخدام أعماق بتات أعلى، مثل بيانات 16 بت، لجمع البيانات، لأن ذلك سيحسن دقة التعويض الطيفي. بالإضافة إلى ذلك ، ستعمل كثافات البكسل الأعلى ، والأرقام الأكبر لمتوسطات الخطوط ، والمزيد من الخطوات في z-stack على تحسين جودة الفصل الطيفي.
4. حدد علامة التبويب اكتساب في الجزء العلوي من الشاشة وأدخل إعداد التنسيق لتضمين كثافة البكسل للصورة (عادة ما تنتج الدقة الأعلى نتائج أفضل).
5. إذا كان ذلك متاحا ، فحدد اكتساب X ثنائي الاتجاه لتسريع وقت التصوير ، بشرط أن تكون هذه الميزة قد تمت معايرتها بشكل مناسب.
6. اختر قيمة الثقب للمجهر متحد البؤر (عادة ما بين 400-600 نانومتر) حيث تنتج القيم الأصغر عادة نتائج قياس خلوي عالي الجودة للتدفق النسيجي ، على الرغم من أن قيم الثقب الأصغر ستجعل من الصعب الحصول على الصور وقد تتطلب وقت تصوير إضافي أو شدة إثارة أعلى لإنتاج الصور.
7. حدد إظهار لوحة المسح المتسلسل في أعلى القائمة اليسرى لفتح خيار الفحص المتسلسل. استخدم علامة "+" لإعداد تسلسلات إضافية ، حيث سيحتوي كل تسلسل على طول موجي واحد للإثارة تم تحديده في الخطوة 2.2.
8. قم بتشغيل جميع أجهزة الليزر المطلوبة من خلال النقر على أزرار التشغيل المرتبطة بالليزر ذي الأهمية في وسط الشاشة لتحويلها إلى حالة تشغيل. انتقل إلى كل تسلسل محدد وقم بزيادة طاقة الليزر في وسط الشاشة إلى أي قيمة مرغوبة ، حيث سيكون لكل تسلسل طول موجي واحد للإثارة يتم استخدامه.
9. قم بتشغيل العديد من أجهزة الكشف حسب الحاجة في الجزء السفلي من الشاشة في كل تسلسل لتصوير جميع الفلوروفورات التي سيتم تصويرها على خط الليزر هذا. اضبط نطاقات أجهزة الكشف عن طريق النقر المزدوج على نطاقاتها وإدخال النطاقات العلوية والسفلية للأطوال الموجية التي يجب جمعها.
   ملاحظة: يوصى باستخدام أجهزة الكشف عالية الحساسية حيثما أمكن ، ومن الناحية المثالية ، يجب جمع جميع القنوات على نفس أنواع أجهزة الكشف ، على الرغم من أن هذا غير مطلوب.
10. اضغط على الزر المباشر ، ثم ركز على العينة. استخدم زر Auto Scale الموجود على يسار الصورة في البرنامج لتقييم ما إذا كانت القنوات مشبعة بشكل كاف بالإشارة. يجب على المستخدم ضبط قيم الكسب وشدة الليزر في كل تسلسل حتى لا يصل القياس التلقائي إلى القيمة القصوى (65535 لبيانات 16 بت) ولكنه قريب جدا من التشبع لجميع القنوات.
    ملاحظة: نظرا لأن الفلوروفورات المختلفة يمكن أن تختلف في سطوعها ويمكن أن تختلف أهداف الأجسام المضادة المختلفة في وفرتها ، فستحتاج حساسية الكاشفات إلى التعديل لتكون ذات حساسية منخفضة للإشارات الساطعة وحساسية عالية للإشارات الخافتة إذا تم تحفيز كلا الفلوروفورين بواسطة نفس الليزر (لا يمكن أن تتغير شدة الليزر في هذا السيناريو حيث سيتأثر كلا الفلوروفور). للحصول على أفضل النتائج ، يجب موازنة إشارة التألق من كل قناة في التجربة بحيث تحتوي كل قناة على كميات مكافئة تقريبا من الإشارة ، مما يقلل من النزيف الطيفي إلى قنوات أخرى ويؤدي إلى إشارات أقوى. نظرا لأن العينات المختلفة قد تختلف في وفرة العلامات المثيرة للاهتمام الملطخة ، فمن المستحسن اختبار إعدادات المجهر في ظروف تجريبية متعددة للتأكد من أن التبييض لا يحدث في ظل أي من الظروف التجريبية.
11. بمجرد الانتهاء من إعدادات المجهر ، قم بتحميل المجهر بشرائح التحكم في اللون الفردي وابحث عن تلطيخ تمثيلي لكل فلوروفور. قم بإعداد مكدس Z من خلال التركيز أسفل العينة والضغط على زر البدء في قائمة مكدس z ، ثم التركيز فوق العينة والضغط على زر النهاية .
12. اختر عدد الخطوات والمسافة بين الخطوات (واستخدم نفس عدد الخطوات والمعلمات مثل كثافة البكسل وعمق البت التي سيتم استخدامها لتصوير الشرائح الملطخة بالكامل) ، ثم اضغط على زر البدء.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن تتضمن هذه الصور ألمع الإشارات من تلطيخ حقيقي يمكن العثور عليه على الشريحة.
13. بعد تصوير عناصر التحكم أحادية اللون ، تابع استخدام نفس إعدادات المجهر لتصوير جميع العينات الملطخة بالكامل.

3. تعويض مضان

1. افتح ملفات .lif في البرنامج 1 وانقر فوق علامة تبويب العملية.
2. اختر وحدة فصل الصبغة ثم اختر خيار فصل الصبغة التلقائي . حدد الطريقة اليدوية لفصل الصبغة واختر عدم إعادة القياس.
3. افتح إحدى صور التحكم أحادية اللون. افحص يدويا عناصر التحكم أحادية اللون بحثا عن التسييل الطيفي من قناة إلى أخرى من خلال مراقبة النوافذ ذات التدرج الرمادي لكل قناة بحثا عن دليل على وجود إشارة في قنوات غير مناسبة. استخدم زر القياس الآلي إذا لزم الأمر لرؤية التسييل الضعيف.
4. ابدأ في إزالة التسييل عن طريق إدخال الأرقام يدويا (عادة 0-1 ، حيث يمثل 0 عدم حدوث تسييل و 1 يمثل تسييل 100٪) في المصفوفة على الشاشة ، ثم الضغط على تطبيق لاختبار ما إذا كان قد تمت إزالة التسييل بشكل كاف. يجب تكرار هذا حتى يتم تخفيض الإشارات في جميع القنوات الأخرى باستثناء قناة الاهتمام إلى مستويات الخلفية.
   ملاحظة: سيؤدي التعويض الزائد إلى نتائج غير دقيقة ، لذلك يجب تقليل التألق إلى مستويات الخلفية ولكن ليس أقل منها. ستظهر البيانات ذات التعويض الزائد كقناة واحدة بها إشارة وقنوات أخرى يبدو أنها بها ثقوب سوداء حيث تكون إشارة الاهتمام (الشكل 2).
5. بمجرد اكتمال أحد عناصر التحكم أحادية اللون، قم بتسجيل القيم في المصفوفة ثم أعد تعيين المصفوفة، وانتقل إلى عنصر التحكم أحادي اللون التالي. كرر هذه العملية لكل عنصر تحكم بالألوان.
   ملاحظة: ستكون الصبغة الأولى في صف الصبغة 1 ، وستكون كمية التألق التي يجب إزالتها من الصبغة 1 في الأعمدة المجاورة.
6. قم بتجميع جميع القيم المكتسبة من كل عنصر تحكم في مصفوفة واحدة وقم بتطبيق هذه المصفوفة على عينة ملطخة بالكامل. إذا كان الفصل يبدو دقيقا، قم بتطبيق الإعدادات على كل الصور في التجربة، وإلا، أعد تقييم عناصر التحكم أحادية اللون.
   ملاحظة: يجب أن يزيل التعويض الفعال معظم النزيف عبر القنوات ، كما هو ملخص وموضح في الشكل 3.
7. احفظ جميع الملفات التي تم تعويضها في ملف .lif منفصل.

4. تحديد النوى والخلايا باستخدام الإيلاستيك

1. افتح ملفات .lif المعوضة في FIJI²⁰. قم بتمكين عرض الحزم المكدسة في مكدس فائق وحدد صورة.
2. (اختياري) استخدم أداة تحديد مثل أداة المستطيل لتضمين أجزاء الصورة التي سيتم تحليلها واستبعاد المساحات التي لن يتم تحليلها. اقتصاص الصورة باستخدام الصورة > وظيفة الاقتصاص.
   ملاحظة: يعد تقليل حجم الصورة مفيدا في الخطوات اللاحقة لتقليل استهلاك ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) وزيادة سرعة المعالجة.
3. احفظ الصورة كملف .tif. أيضا ، احفظ الصورة كملف hdf5 باستخدام المكون الإضافي ilastik ل FIJI بالنقر فوق المكونات الإضافية > ilastik > Export hdf5. احفظ الملف ك "اسم الاختيار" .h5 مع ضغط 0.
4. افتح Ilastik²¹ وقم بعمل مشروع تصنيف بكسل. استخدم وظيفة إضافة > جديد إضافة صور منفصلة لإضافة 3 صور تمثيلية على الأقل بالانتقال إلى إضافة بيانات إدخال جديدة.
5. انقر بزر الماوس الأيمن فوق إحدى الصور ، وحدد تحرير الخصائص ، وقم بتغيير وضع العرض إلى تدرج الرمادي.
6. على يمين الشاشة، حدد علامة التبويب تحديد الميزة . انقر فوق تحديد الميزات وحدد جميع الميزات حتى أعلى قيمة سيجما التي سيسمح لك البرنامج باستخدامها ، ثم اضغط على موافق.
7. الآن حدد علامة التبويب التدريب. استخدم أداة فرشاة الرسم (أثناء تحديد التسمية الأولى ) لتمييز الخلايا الفردية (الشكل 4) ذات الأهمية بحيث يتم تضمين الجزء الداخلي (السيتوبلازم والنواة) وغشاء الخلية في التمييز.
8. كرر هذا عبر جميع عينات التدريب حيث يتم اختيار جميع أنواع الخلايا ذات الأهمية ، ويجب اختيار خلايا متعددة متفاوتة الشدة والتشكل والتوطينات في الأنسجة من كل عينة.
   ملاحظة: اعتمادا على العلامات المختارة لمجموعة فردية من البقع ، قد تكون هناك أو لا توجد بقع داخل الخلايا أو بقع غشاء الخلية للخلايا ذات الأهمية. مهما كانت العلامات المستخدمة ، تأكد من أن التمييز يشمل البقعة الخارجية على الخلايا ذات الاهتمام ويتضمن داخل الخلية بغض النظر عما إذا كان يتم استخدام بقعة داخل الخلايا.
9. بعد ذلك ، استخدم التسمية الثانية لتمييز كل شيء ليس خلايا الاهتمام (الشكل 4). يمكن أن يشمل ذلك مساحة فارغة أو نوى غير مسماة أو أنسجة لا تحتوي على علامات اهتمام. تأكد من تضمين المساحة المجاورة مباشرة للخلايا ذات الأهمية لتعزيز تعلم حدود الخلايا الدقيقة.
10. استخدم وظيفة Live Update لتقييم جودة التدريب على الصور ذات الأهمية. إذا كان التدريب غير كاف ، فتابع التدريب في الخطوات من 4.7 إلى 4.9. خلاف ذلك ، إذا كان مرضيا ، انقر فوق علامة التبويب تصدير التنبؤ .
11. قم بتعيين المصدر ليكون احتمالات. انقر فوق الزر اختيار تصدير إعدادات الصورة ، ثم قم بتعيين المعلمة c للتصدير 0-1 (بافتراض أن التسمية 1 تسلط الضوء على المعلمات ذات الأهمية).
12. قم بتحويل نوع البيانات إلى عدد صحيح 16 بت ، وقم بتصديره كملف hdf5 إلى دليل الاهتمام باسم الاهتمام (نوصي باستخدام {nickname} mask.h5) ، ثم اضغط على موافق.
13. انقر فوق علامة التبويب معالجة الدفعات . اضغط على الزر تحديد ملفات البيانات الأولية ، وحدد كافة ملفات .h5 ذات الأهمية التي تتطلب معالجة، ثم اضغط على فتح. انقر فوق معالجة جميع الملفات.
14. كرر الخطوات من 4.4 إلى 4.13 ، باستثناء بدلا من تحديد الخلايا ، حدد الآن النوى واستبعد كل شيء آخر (الشكل 4). تصدير هذا كتنبؤ منفصل لتحديد نوى الخلية.
15. افتح Ilastik وأنشئ مشروع تحويل بيانات جديد. أضف ملف hdf5 تمثيليا إلى علامة التبويب بيانات الإدخال باستخدام وظيفة إضافة > جديد إضافة صورة منفصلة .
16. انقر فوق علامة التبويب تصدير البيانات واختر زر اختيار إعدادات تصدير الصورة مع تعيين المصدر على الإدخال. قم بتغيير التنسيق إلى tiff متعدد الصفحات ، واختر موقع حفظ باستخدام وظيفة التحديد ، وقم بتعيين اسم الملف إلى {nickname}. اضغط على موافق.
17. انقر فوق علامة التبويب معالجة الدفعات وحدد جميع ملفات hdf5 الخاصة بك باستخدام ملف حدد ملفات بيانات الإدخال زر واضغط على معالجة جميع الملفات زر.
18. افتح البرنامج 2 (انظر جدول المواد) وأضف جميع ملفات tif/tiff التي تم إنشاؤها في الخطوتين 4.3 و4.17 باستخدام الزر إضافة ملفات . اختر موقعا لمخرجات الملفات واضغط على الزر Start All لتحويل كافة الملفات إلى ملفات .ims. الملفات جاهزة الآن للتحليل في البرنامج 3 (انظر جدول المواد).

5. التحليل في البرنامج 3

1. افتح إحدى الصور التي تحتوي على جميع بقع الفلورسنت. حدد تحرير-> إضافة قنوات وأضف ملفات .ims المقابلة للأقنعة المصنوعة على أجسام النوى والخلايا. كرر هذا لجميع العينات.
2. حدد الزر إضافة خلايا جديدة . حدد خيار الكشف عن النواة والخلية والمضي قدما.
3. حدد القناع فوق النوى ليكون قناة المصدر للكشف عن النوى وحدد الخيار المتقدم لتقسيم النوى بنقاط البذور. اختر قيمة لقطر النواة) والمضي قدما.
   ملاحظة: يجب اختبار القيمة المثلى لقطر النواة عن طريق تشغيل المحاكاة والتقييم اليدوي لما إذا كان البرنامج لا يقسم نوى كافية (يتم تجميع نوى متعددة معا) أو ما إذا كان هناك انقسام زائد (يتم تقسيم نواة واحدة إلى أكثر من واحدة).
4. اختر قيمة لتقييم الجودة، ثم تابع. عادة ما يكون من الأفضل تضمين جميع النوى ، لأن إغفال النوى يمكن أن يؤدي إلى اندماج خلايا متعددة في خلية واحدة.
5. اختر قيمة عتبة لإنشاء أسطح نووية ثم تابع. تأكد من أن جميع النوى ، حتى تلك التي تكون باهتة ، لا تزال مدرجة في العتبة. لا تجعل العتبة منخفضة للغاية ، لأن هذا قد يبالغ في تقدير حجم النوى أو يحتمل أن يشمل الحطام على أنه تلطيخ نووي.
6. حدد قيمة لعدد الحد الأدنى لعدد Voxels لكل نواة وتابع. عادة ، من الأفضل الاحتفاظ بكل شيء ما لم يكن من الممكن استبعاد الحطام أو غير النوى باستخدام هذه المعلمة.
7. اختر خيار حدود الخلية والسيتوبلازم ، وحدد القناع فوق الخلايا ليكون القناة المصدر لاكتشاف أجسام الخلايا ، ثم تابع.
8. اختر عتبة خلية تلتقط بدقة جميع الخلايا ذات الأهمية ولكنها ليست منخفضة جدا بحيث تتضمن الخلفية أو أي اكتشاف غير محدد للخلايا. حدد خيار تقسيم الخلايا الملامسة بحيث توجد نواة واحدة لكل خلية ، ويتم فصلها بالمسافة من النوى. اختر أيضا توسيع الخلايا على النوى ثم تابع.
9. حدد قيمة للحد الأدنى لعدد voxels لكل خلية وتابع. عادة ، من الأفضل الاحتفاظ بكل شيء ما لم يكن من الممكن استبعاد الحطام أو غير الخلايا باستخدام هذه المعلمة.
10. قم بتقييم ما إذا كانت الأسطح التي تم إنشاؤها فوق الخلايا دقيقة من خلال النظر فيما إذا كانت خلايا متعددة قد تم دمجها معا أو إذا كانت الخلايا مفقودة. إذا كانت الأسطح غير كافية ، فارجع إلى الخطوة 5.2 وجرب معلمات جديدة حتى يتم تحديد الإعدادات المثلى.
11. بمجرد إنشاء أفضل الإعدادات ، انقر فوق كائن الخلايا التي تم إنشاؤها في القائمة اليسرى ، وانقر فوق علامة التبويب إنشاء ، وانقر فوق زر تخزين المعلمات للدفعة لحفظ الإعدادات المستخدمة.
12. افتح نوافذ متعددة من البرنامج 3 وافتح صورا منفصلة في كل نافذة. اضغط على زر الخلايا الجديد في كل نافذة ، واختر الإعدادات المحفوظة في قائمة معلمات الإنشاء المفضلة ، واطلب من كل نافذة أن تعمل حتى الانتهاء. كرر هذا عدة مرات حسب الحاجة حتى يتم تحليل جميع العينات.
    ملاحظة: سيؤدي تشغيل مثيلات متعددة من البرنامج 3 إلى متابعة هذا التحليل بشكل أسرع، ولكن سيعتمد عدد الإطارات التي يمكن تشغيلها بالتوازي على سرعة معالجة وحدة المعالجة المركزية (CPU) ومقدار ذاكرة الوصول العشوائي التي يتم تشغيل الكمبيوتر الذي يتم تشغيل التحليل عليه.
13. بمجرد اكتمال جميع العينات ، انقر فوق كائن الخلايا التي تم إنشاؤها في القائمة اليسرى في كل صورة وانقر فوق علامة التبويب إحصائيات. انقر فوق الزر تكوين قائمة قيم الإحصائيات المرئية ، وقم بإلغاء تحديد كافة الإحصائيات باستثناء قيمة "متوسط كثافة الخلية"، ثم اضغط على موافق.
14. لكل صورة تحتاج إلى تحليل ، انقر فوق تصدير جميع الإحصائيات إلى ملف زر في علامة التبويب إحصائيات واحفظ الملفات في موقع.

6. تحليل قياس التدفق الخلوي النسيجي ورسم خرائط السكان على أقسام الأنسجة

1. افتح أناكوندا وجوبيتر لاب داخل أناكوندا. بعد ذلك ، افتح البرنامج النصي المقدم في ملف الترميز التكميلي 1. قم بتشغيل التعليمة البرمجية باستخدام قائمة التشغيل وحدد تشغيل كافة الخلايا ، أو قم بتشغيل الخلايا بشكل فردي بالترتيب عن طريق تحديد تشغيل الخلايا المحددة.
2. عند مطالبتك بإدخال الملف المصدر، أدخل دليل الملف لقيم الفلورسنت المصدرة التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.14. يمكن الحصول على دليل الملف من خلال النظر في خصائص أحد ملفات .csv المصدرة ونسخ مسار الملف إلى المطالبة.
3. بعد ذلك ، سيطلب البرنامج موقع إخراج للملفات المعالجة. أدخل دليل الملف لأي موقع مناسب لحفظ الملفات التي تمت معالجتها. سيكتشف البرنامج تلقائيا عدد قنوات الفلورسنت الموجودة في المجلد.
4. قم بتشغيل القسم التالي من التعليمات البرمجية لإضافة تعليقات توضيحية إلى البيانات بأسماء كل قناة. يمكن تعديل هذا الرمز حسب الحاجة لتغيير المعلمة "numberOfChannels" لمطابقة عدد القنوات المكتشفة في الخطوة 6.3. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل أسماء القنوات لأي عدد ممكن من القنوات حسب الحاجة عن طريق تكرار سطر "ChX": "Marker" عدة مرات حسب الحاجة وتعديل أسماء العلامات.
5. سيؤدي تشغيل السطر التالي من التعليمات البرمجية إلى إنشاء ملف .csv في الموقع المحدد الذي يتم التعليق عليه ويحتوي على جميع معلمات الفلورسنت في مجموعة البيانات. كرر الخطوات من 6.1 إلى 6.5 لكل مجموعة من عمليات تصدير البرامج 3 لإنشاء ملفات .csv لكافة البيانات.
6. قم بتحويل ملفات .csv إلى ملفات .fcs عن طريق فتح البرنامج 4 (انظر جدول المواد) وسحب ملفات .csv إلى نافذة البرنامج. سيبدأ البرنامج 4 تلقائيا في تحويل الملفات إلى ملفات .fcs.
7. انقر نقرا مزدوجا فوق إحدى العينات الموجودة في البرنامج 4 لفتح نافذة على تلك العينة. استخدم أدوات البوابات في البرنامج 4 لإنشاء استراتيجية بوابة. يوصى بالبدء ببوابة على علامة تعريف النسب تحتوي على جميع الخلايا ذات الأهمية ، ثم الانتقال إلى البوابات التي تزيل المجموعات الفرعية النادرة أولا ، ثم الانتهاء من أنواع الخلايا الأكثر وفرة.
8. بمجرد إنشاء استراتيجية البوابات ، اختبر دقة البوابة بالنقر بزر الماوس الأيمن على تلك المجموعة في القائمة واختيار تصدير. تصدير جميع المعلمات كملف .csv مع تضمين الرؤوس.
9. افتح JupyterLab في أناكوندا. بعد ذلك ، افتح البرنامج النصي المقدم في ملف الترميز التكميلي 2 ، وقم بتشغيل الكود. عند مطالبتك بإدخال موقع ملف Software 4 ، أدخل دليل الملف لملف .csv الذي تم تصديره والذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. يمكن الحصول على دليل الملف من خلال النظر في خصائص ملف .csv المصدر ونسخ مسار الملف إلى المطالبة.
10. عند مطالبتك بإضافة موقع الإخراج ، اختر أي دليل ملف من اختيارك ، وتأكد من أن دليل الملف يتضمن اسم الملف في النهاية ('دليل الملف' \ filename.txt). قم بتشغيل بقية التعليمات البرمجية.
11. انسخ النص في ملف .txt وافتح ملف .ims المقابل في البرنامج 3 لنفس العينة التي تستند إليها البيانات المصدرة. انقر فوق كائن الخلية في الملف ، وقم بالتبديل إلى علامة التبويب الإحصائيات ، والصق النص في شريط البحث ، وابدأ البحث. سيتم تسليط الضوء على جميع الخلايا ذات الاهتمام.
12. تحقق يدويا مما إذا كانت جميع الخلايا ذات الاهتمام قد تم التقاطها باستخدام استراتيجية البوابة. إذا تم التقليل من عدد الخلايا أو المبالغة في تقديرها (الأمثلة الموضحة في الشكل 5) ، فارجع إلى الخطوة 6.7 ، واضبط البوابة ، وأعد تقييم ما إذا كانت الخلايا قد تم التقاطها بدقة باستخدام البوابة الجديدة. كرر هذا مع جميع البوابات في استراتيجية البوابة وقم بتقييم البوابة على عينات متعددة.
13. عندما يتم التحقق من صحة جميع البوابات ، قم بتصدير البيانات من البرنامج 4 باستخدام وظيفة محرر الجدول وتحليل البيانات باستخدام طريقة التحليل المفضلة.
    ملاحظة: يمكن تعيين مجموعات الخلايا مرة أخرى على أقسام الأنسجة في البرنامج 3 عن طريق تحديد السكان المسورة كما في الخطوات 6.8-6.11 ثم إنشاء سطح بناء على الخلايا المحددة. يمكن القيام بذلك لكل مجموعة مسورة ، كما هو موضح في الشكل 6 والشكل 7.

النتائج

الشكل 1: سير عمل قياس التدفق الخلوي للنسيج. أقسام الأنسجة ملطخة بأصباغ متداخلة طيفيا (الخطوة 1). يتم جمع الصور عبر ليزر الإثارة الفردي المقترن بمرشحات تمرير النطاق القابلة للضبط لتقليل النزيف الطيفي بين الفلوروفورات (الخطوة 2). يتم تصحيح التسييل الطيفي بين القنوات بناء على مصفوفة تعويض تم إنشاؤها باستخدام عناصر تحكم الأنسجة الملطخة بلون واحد (الخطوة 3). ثم يتم تحديد النوى والخلايا في الصور باستخدام ilastik (الخطوة 4) وتقسيمها إلى خلايا مفردة في البرنامج 3 (الخطوة 5). يتم دمج معلمات إضافية قبل تصدير جميع البيانات من البرنامج 3 إلى البرنامج 4 لإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. ثم يتم تصدير هويات الخلايا من البرنامج 4 وتعيينها مرة أخرى إلى معرفات الخلايا في الأنسجة الأصلية لحل التوطين المكاني للخلايا في أقسام الأنسجة (الخطوة 6). تمثل علامات النقود البرامج التجارية التي تتطلب الشراء ، وتمثل علامات الكمبيوتر البرمجيات الحرة. يشار إلى الوقت التقريبي لكل خطوة بجانب الساعة الرملية. يتم سرد البرامج التجارية في جدول المواد. هذا الرقم مقتبس من Jain et ^al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في الشكل 3 ، تم تلطيخ أنسجة العقدة الليمفاوية بجسم مضاد للفأر CD138 للفئران مقترنا بجسم مضاد ثانوي للحمار Dylight 405 ، الأصفر النووي ، جسم مضاد CD4 مضاد للفأر للفئران مترافق مع Alexa Fluor 488 ، وهو جسم مضاد IgD مضاد للفأر للفئران مقترن ب PerCP-eF710 ، وهو جسم مضاد Iba1 مضاد للأرانب للأرانب مقترن بجسم مضاد ثانوي للحمار Alexa Fluor 546 ، جسم مضاد للفأر CD3ε مقترن ب PE-eF610 ، وجسم مضاد للفأر B220 مترافق مع Alexa Fluor 647 ، وجسم مضاد CD45 مضاد للفأر مقترن ب APC-R700. تم استخدام ليزر بنفسجي 405 نانومتر لتحفيز الأصباغ الصفراء Dylight 405 و Nuclear ، وتم الكشف عن انبعاثاتها في نطاقات 408-438 نانومتر و 460-530 نانومتر على التوالي. تم استخدام ليزر أخضر 488 نانومتر لتحفيز أصباغ Alexa Fluor 488 و PerCP-eF710 ، وتم اكتشاف انبعاثاتها في نطاقات 495-545 نانومتر و 682-750 نانومتر على التوالي. تم استخدام ليزر أصفر أخضر 552 نانومتر لتحفيز أصباغ Alexa Fluor 546 و PE-eF610 ، وتم اكتشاف انبعاثاتها في نطاقات 557-600 نانومتر و 615-652 نانومتر على التوالي. تم استخدام ليزر أحمر 640 نانومتر لتحفيز أصباغ Alexa Fluor 647 و APC-R700 ، وتم اكتشاف انبعاثاتها في نطاقات 647-682 نانومتر و 700-750 نانومتر على التوالي.

الشكل 2: أمثلة على التعويض الرديء والجودة. تم تلطيخ الخرز بجسم مضاد مقترن ب PE-eFluor 610 وتم تصويره في القنوات المقابلة لقنوات PE-eFluor 610 (PE-eF610) و Alexa Fluor 546 (A546). تم تطبيق درجات مختلفة من التعويض على نفس الصورة في قناة A546 (تخفيض بنسبة 10٪ للتعويض الناقص ، وتخفيض بنسبة 28٪ للتعويض الصحيح ، وتخفيض بنسبة 60٪ للتعويض الزائد) لإزالة النزيف من فلوروفور PE-eF610 ، مما أدى إلى درجات مختلفة من الفصل. لتصور درجات التعويض بشكل أفضل ، يتم توفير نسخة ساطعة من صور التسييل. يشير السهم الأصفر إلى نفس المنطقة في كل صورة تقابل منطقة يوجد بها تلطيخ حقيقي في قناة PE-eF610. قضبان المقياس: 4 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تعويض التألق باستخدام أقسام الأنسجة الملطخة. (أ-ج) تم تلطيخ أقسام أنسجة العقدة الليمفاوية بعضلات بطن مفردة مترافقة مع الفلوروفورات المدرجة. ثم تم تصوير عينات أحادية اللون غير معوضة عبر جميع القنوات (A ، أعلى) ، وتم تطبيق التعويض على عناصر التحكم أحادية اللون (A ، أسفل). (ب) تم تحديد كمية النزف بين القنوات في (أ) (متوسط شدة التألق للصورة الحالية مقسوما على متوسط شدة التألق لقناة الفلوروفور الحالي) وعرض في خرائط حرارية. تمثل المربعات البيضاء القيم التي تتجاوز التسييل بنسبة 100٪. (ج) يتم تقييم التداخل الطيفي في ظروف التعويض غير المعوضة والقائمة على الخلايا من خلال مقارنة الفصل الطيفي ل Iba1-A546 و CD3-PEeF610 في عينات ملطخة بالكامل. قضبان المقياس: 30 ميكرومتر. هذا الرقم مقتبس من Jain et ^al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

باتباع هذا البروتوكول (الملخص في الشكل 1) ، يجب فصل الأصباغ الفلورية المتداخلة طيفيا بشكل فعال ، كما هو موضح في الشكل 3 أ ، ب. في حين أن الفصل الكامل للأصباغ قد لا يكون ممكنا ، يجب أن يكون الفصل كافيا للتمييز بوضوح بين أنواع الخلايا المختلفة (الشكل 3C). إذا كانت لا تزال هناك ظلال لخلايا متداخلة طيفيا في قناة أخرى ، فقد يشير ذلك إلى أنه لا يزال هناك نزيف يحدث ، وقد تحتاج الصور إلى إعادة المعالجة (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، سيكون التعويض الزائد واضحا إذا انخفضت المنطقة المعوضة عن مستويات التألق المرتبطة بتلطيخ الخلفية وستظهر كمناطق سوداء حيث كان النزيف مرة واحدة (الشكل 2). يمكن أن يؤدي التعويض الزائد إلى فقدان إشارة حقيقية في القناة التي تم تطبيق التعويض عليها ويجب تجنبها. ومع ذلك ، إذا تم اتباع هذا البروتوكول بشكل صحيح ، فلا ينبغي أن تكون هناك مشاكل في التعويض ، وبالتالي ، يجب على الباحث النظر فيما إذا كان أي نزيف واضح مصطنعا أو جزءا من البيولوجيا.

الشكل 4: مثال على اكتشاف النواة والخلايا القائمة على الإيلاستيك. تم استخدام التلوين الأصفر النووي (أعلى اليسار) لتحديد النوى (أعلى اليمين باللون الأصفر) وما هو ليس نواة (باللون الأزرق). يستخدم تلطيخ CD45 التمثيلي (الموضح في أسفل اليسار) لتحديد الخلايا (أسفل اليمين باللون الأصفر) وما هو ليس خلية (باللون الأزرق). هذا الرقم مقتبس من Jain et ^al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بمجرد فصل الأصباغ بدقة ، يعد تقسيم الأنسجة إلى خلايا فردية أمرا ضروريا لإجراء تحليلات الخلية الواحدة. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا التعلم الآلي المعرف من قبل المستخدم (الشكل 4) لفصل الخلايا حتى عندما تكون مضغوطة معا بشكل وثيق ، كما هو موضح في العقد الليمفاوية الموضحة في الشكل 6.

الشكل 5: تقييم ما إذا كانت البوابة قد تم ضبطها بشكل صحيح. يظهر تلطيخ CD138 التمثيلي (الملون باللون السماوي) في العقدة الليمفاوية ، وتم عمل ثلاث بوابات منفصلة (الرسم النقطي إلى اليسار) لتحديد خلايا CD138 ⁺ في الأنسجة. يظهر تقدير متحفظ للغاية لخلايا CD138 ⁺ على أنها البوابة الزرقاء ويتم تعيينها للأنسجة باللون الأزرق. يظهر تقدير متوازن لخلايا CD138 ⁺ كبوابة خضراء ويتم تعيينه للأنسجة باللون الأخضر. يظهر تقدير مفرط في التساهل لخلايا CD138 ⁺ كبوابة حمراء ويتم تعيينه للأنسجة باللون الأحمر. تحدد الدائرة الصفراء منطقة لا يتم فيها تحديد خلايا CD138 ⁺ بواسطة البوابة المحافظة بشكل مفرط ، وتحدد الدائرة الأرجواني منطقة لا تحتوي على خلايا CD138 + ، والتي يزعم أنها تحتوي على خلايا CD138 ⁺ بواسطة البوابة المتساهلة بشكل مفرط. قضبان المقياس: 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يجب توخي الحذر عند تحديد المواضع الدقيقة للبوابات في تحليل قياس التدفق الخلوي (الموضح في الشكل 5) للتأكد من أن هذه البوابات لا تبالغ في تقدير وفرة الخلايا أو تقلل من شأنها. يجب تحديد ذلك عن طريق تعيين الخلايا مرة أخرى إلى الأنسجة ، كما في الشكل 5 ، لمعرفة ما إذا كانت الخلايا التي تعبر عن علامات اهتمامك يتم التقاطها في التحليل. إذا تم تحديد عدد كبير جدا من الخلايا (على سبيل المثال ، يتم تحديد الخلايا التي لا تعبر عن CD138 على أنها CD138 ⁺) ، فيجب إزاحة البوابات لتكون أقل تساهلا ، وإذا تم تحديد عدد قليل جدا من الخلايا ، فيجب جعل البوابات أكثر تساهلا. يجب تحسين البوابات من أجل الانتقائية بحيث يتم تحسين بوابات المنبع أولا ، ثم يتم تحسين كل بوابة لاحقة في السلسلة بعد ذلك. في النهاية ، يجب أن يكون التحسين الفعال لاستراتيجية البوابات قادرا على حل المجموعات الفرعية للخلايا ذات الأهمية (الشكل 6 والشكل 7).

الشكل 6: تحديد الخلايا في أقسام الأنسجة استنادا إلى قياس التدفق الخلوي. (أ) تم تحليل القيم الفلورية المصدرة من خلايا مفردة من البرنامج 3 في أقسام العقدة الليمفاوية في البرنامج 4 لتحديد مجموعات الخلايا المذكورة بناء على استراتيجية البوابة الموضحة. (ب) تم تعيين المجموعات السكانية المحددة في البرنامج 4 مرة أخرى على نفس قسم الأنسجة ، وتم إنشاء الأسطح لكل تجمع. لا تظهر بقعة CD45. شريط المقياس: 30 ميكرومتر. هذا الرقم مقتبس من Jain et ^al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: تفصيل البقع الفردية والمجموعات في العقد الليمفاوية للفئران. تظهر البقع الفردية لعلامات الخلايا المناعية في اللوحات العلوية ، ويظهر السكان المرتبطون بها المحددون في الشكل 6 أ أسفل كل بقعة على حدة. شريط المقياس: 30 ميكرومتر ، كما هو موضح في اللوحة العلوية اليسرى. هذا الرقم مقتبس من Jain et ^al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم استخدام هذه التقنية سابقا¹⁸ لتوصيف تسلل الخلايا المناعية إلى الحبل الشوكي أثناء الالتهاب العصبي والتحقق من صحة وجود نسب مكافئة من الخلايا المناعية المتسللة باستخدام قياس التدفق الخلوي وقياس التدفق الخلوي. كما تم التحقق من صحة هذه التقنية ، مما يدل على أنها تعمل في طحال الفئران وأدمغتها ويمكنها تحديد الاختلافات بين حالات العلاج ، والتي تم استنساخها في تجارب قياس التدفق الخلوي المتطابقة (غير المنشورة). كما تم استخدام هذه التقنية لتحليل الحبال الشوكية للفئران التي تتلقى الحقن التجسيمية لنماذج الجهاز العصبي المركزي.

الشكل 8: فصل 8 صبغات في قسم اللوزتين البشريتين. تم تلطيخ أقسام اللوزتين البشرية ب CD20 لتحديد الخلايا البائية و IgM و IgA و IgG لتحديد خلايا البلازما. تم دمج بقع Blimp1 و CD38 لمزيد من التحقق من هويات خلايا البلازما ، و Ki67 لتحديد الخلايا المتكاثرة. لا تظهر البقعة الصفراء النووية في الصورة المدمجة. شريط المقياس: 22 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية لتحليل أقسام الأنسجة البشرية. كمثال على التلوين داخل الأنسجة البشرية ، تم تلطيخ أقسام اللوزتين البشرية بمجموعة مختارة من 8 علامات: جسم مضاد IgM مضاد للماعز مقترن ب Dylight 405 ، الأصفر النووي ، جسم مضاد IgA مضاد للماعز مقترن ب Alexa Fluor 488 ، جسم مضاد CD20 مضاد للفأر للفأر مقترن بشظية F (ab') 2 مضادة للماعز مقترنة ب PerCP-eFluor 710 ، ماعز مضاد للإنسان IgG مقترن ب Cy3 ، وهو جسم مضاد للأرانب Ki67 مقترن بجسم مضاد للأرانب مضاد للأرانب مقترن ب PE-Alexa Fluor 610 ، وجسم مضاد Blimp1 مضاد للفئران مقترن بجسم مضاد للحمار مقترن ب Alexa Fluor 647 ، وجسم مضاد CD38 مضاد للفأر مقترن ب APC-R700. بعد التعويض ، يمكن رؤية فصل هذه العلامات في قسم اللوزتين (الشكل 8). هذا يدل على فائدة هذه التقنية في الأنسجة والأنواع المختلفة.

اسم الحل	تكوين		كيف تصنع
حظر المخزن المؤقت	10٪ مصل الحصان ، 1٪ BSA ، و 0.1٪ جيلاتين بقع السمك البارد في برنامج تلفزيوني		أضف 5 مل من مصل الحصان ، 0.5 جم من BSA ، 50 ميكرولتر من جيلاتين بقع السمك البارد إلى 45 مل من PBS. قم بتقسيم هذه المحلول إلى أنابيب سعة 15 مل وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
بيرم ومنع العازلة	10٪ مصل الحصان ، 1٪ BSA ، 0.1٪ جيلاتين بقع السمك البارد ، 0.1٪ Triton X-100 ، 0.05٪ Tween-20 في PBS		أضف 5 مل من مصل الحصان ، 0.5 جم من BSA ، 50 ميكرولتر من جيلاتين بقع السمك البارد ، 50 ميكرولتر Triton X-100 ، و 25 ميكرولتر Tween-20 إلى 45 مل من PBS. قم بتقسيم هذه المحلول إلى أنابيب سعة 15 مل وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
بيرم وتلطيخ العازلة	1٪ BSA ، 0.1٪ جيلاتين ملطخ بالسمك البارد ، 0.5٪ Triton X-100 في PBS		أضف 0.5 جم من BSA ، و 50 ميكرولتر من الجيلاتين المصطب على السمك البارد ، و 250 ميكرولتر Triton X-100 إلى 50 مل من PBS. قم بتقسيم هذه المحلول إلى أنابيب سعة 15 مل وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
تبريد المخزن المؤقت	5٪ تروبلاك ، 66.5٪ إيثانول ، 28.5٪ ماء		سخني محلول تروبلاك على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم أضف 50 ميكرولتر من Trueblack إلى 950 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ لعمل مخزن Trueblack المؤقت. اجعل هذا طازجا في كل مرة. ستحتاج ~ 500 ميكرولتر لكل شريحة على الرغم من أن الكميات المحددة ستعتمد على طبيعة أنسجتك.
تلطيخ العازلة	1٪ BSA و 0.1٪ جيلاتين بقع السمك البارد في برنامج تلفزيوني		أضف 0.5 جم من BSA و 50 ميكرولتر من الجيلاتين الملون للأسماك الباردة إلى 50 مل من PBS. قم بتقسيم هذه المحلول إلى أنابيب سعة 15 مل وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية لحين الحاجة.

الجدول 1: قائمة المحاليل وتركيباتها اللازمة لتلطيخ أقسام الأنسجة.

ملف الترميز التكميلي 1: برنامج نصي Python يجمع قيم التألق من كل قناة وينشئ ملف ملخص واحد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 2: برنامج نصي Python يقوم بإنشاء قائمة بجميع أرقام معرفات الخلايا المسورة في ملف نصي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

هنا ، يتم وصف استخدام قياس التدفق الخلوي النسيجي ، وهي تقنية تم التحقق من صحتها سابقا¹⁸. ثبت أنه عند تلطيخ أقسام الأنسجة بأصباغ متداخلة طيفيا ، يمكن إزالة هذا النزيف عبر القنوات باستخدام التعويض الطيفي ، مما يؤدي إلى حل عدد أكبر من معلمات الفلورسنت بوضوح أكثر مما هو ممكن عادة من خلال الطرق التقليدية. نظرا لصعوبة تحليل صور الأنسجة عالية المعلمات باستخدام الطرق التقليدية ، يتم توفير خط أنابيب تحليل لتقسيم الخلايا الفردية من هذه الصور. من خلال تصدير التوقيعات الفلورية من هذه الخلايا الفردية ، ثبت أن تحليلات الخلية الواحدة مثل تلك التي أجريت في قياس التدفق الخلوي يمكن تطبيقها بالمثل على صور الأنسجة. في حين أن قياس التدفق الخلوي لا يشمل التحليل المكاني ، فقد ثبت أن قياس التدفق الخلوي النسيجي يمكن أن يرسم خريطة للسكان الذين تم تحديدهم بواسطة استراتيجيات البوابات مرة أخرى على أقسام الأنسجة لتقييم توطينها المكاني. بشكل عام ، ثبت أن قياس التدفق الخلوي النسيجي يجمع بين نقاط القوة في قياس التدفق الخلوي وعلم الأنسجة.

في حين أن قياس التدفق الخلوي النسيجي له فائدة الاحتفاظ بالمعلومات المكانية ، إلا أنه يحتوي أيضا على العديد من القيود نفسها التي يمتلكها علم الأنسجة التقليدي. في حين أن قياس التدفق الخلوي رائع لقياس الخلايا عبر نسيج كامل ، يتم إجراء الأنسجة عادة عن طريق تحليل عينة صغيرة من أقسام الأنسجة التي تؤخذ لتكون ممثلة للنسيج. لكي يحدد علم الأنسجة بدقة عدد الخلايا في الأنسجة ، سيحتاج المرء إلى تصوير كل شريحة نسيج مأخوذة من الأنسجة وتحديد عدد الخلايا في كل منها ، وهو أمر غير عملي. مشكلة أخرى هي أن بعض الخلايا ستنقسم إلى نصفين أثناء تقسيم الأنسجة ، ولا توجد طريقة لإعادة بناء هذه الخلايا. في الواقع ، أحد قيود البروتوكول المدرج هنا هو أنه لا يتضمن أي طرق لاستبعاد الخلايا الموجودة على حواف النسيج. على الرغم من هذه القيود ، فإن إحدى مزايا قياس التدفق الخلوي النسيجي على قياس التدفق الخلوي هي أنه لا توجد حاجة لفصل الأنسجة إلى معلقات أحادية الخلية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى تحيزات في المجموعات المعزولة أو التي يتم التقاطها بشكل غير كاف²². وبالتالي ، في حين أن قياس التدفق الخلوي النسيجي له العديد من المزايا مقارنة بقياس التدفق الخلوي التقليدي ، فإن الحصول على قياسات عبر الأنسجة بأكملها سيظل يمثل تحديا.

هنا ، تم إثبات أنه يمكن فصل ثمانية معلمات فلورية متداخلة طيفيا ؛ ومع ذلك ، نجح آخرون في فصل 13 صبغة فلورية¹⁷. يعتمد عدد الأصباغ التي يمكن فصلها على خصائص المجهر الذي يتم فيه جمع البيانات. تختلف الأصباغ الفلورية فيما يتعلق بأطوال موجات الإثارة المثلى وفي الأطوال الموجية الأكثر شيوعا للانبعاثات. المجاهر التي تستفيد من هذه الخصائص باستخدام مجموعة واسعة من الأطوال الموجية للإثارة لمطابقة الأطوال الموجية المثلى للإثارة بشكل أكثر دقة للفلوروفورات وعن طريق ضبط كاشفات الانبعاثات لتتناسب بدقة مع الأطوال الموجية الأكثر انبعاثا ستزيد من فصل الأصباغ الفلورية. يعد تقليل التداخل الطيفي أمرا ضروريا لتوليد بيانات عالية الجودة لأن التعويض عن النزيف عبر القنوات يمكن أن يؤثر على النطاق الديناميكي للكشف عن تفاعل الفلوروفورات مع بعضها البعض ، وبالتالي ، فإن الفصل على أساس الانبعاث والإثارة هو خطوة أولى حاسمة في فصل الفلوروفورات. اعتمادا على خصائص المجهر الخاص بك وعدد المعلمات الفلورية التي تحتاج إلى تصوير ، قد تكون هناك حاجة لوضع العديد من الفلوروفورات التي تشترك في نفس الأطوال الموجية للإثارة ولكنها تختلف في أطوال موجات الانبعاث على نفس خطوط الليزر. يتم تحقيق ذلك عادة باستخدام أصباغ الفلورسنت الأساسية مع الأصباغ الفلورية المترافقة ، حيث تنبعث الأصباغ المترافقة بأطوال موجية أطول وبالتالي يمكن تمييزها بناء على أطوال موجات الانبعاثات. بشكل عام ، يجب تمييز الأصباغ إما عن طريق الإثارة أو ترددات الانبعاث للفصل الفعال.

الحصول على تعويض مثالي معقد بسبب عدة عوامل ، بما في ذلك الجانب المكاني للتعويض. أولا ، ما إذا كان الفلوروفور ينبعث منه فوتون يعتمد جزئيا على الصدفة²³ ، حيث تكون الفوتونات المجمعة في كل صورة متحيزة نحو مواقع التلوين الكثيف. ومع ذلك ، قد تنبعث المناطق الأقل كثافة ، عن طريق الصدفة ، من فوتون يظهر في إحدى القنوات المتداخلة ولكن ليس في القناة الرئيسية. وبما أن التعويض يطبق على أساس كل فوكسل، فلن تتم إزالة التداخل الطيفي أثناء التعويض بسبب عدم وجود تمركز مكاني. يمكن ملاحظة ذلك في الشكل 2 ، حيث ينتج عن التعويض تقليل مواقع التلوين الكثيف (حواف الخرزات) ولكن ليس مركز الخرز ، حيث يوجد حد أدنى من التلوين والتداخل الضعيف مع القنوات ذات النزيف. من المحتمل أن يكون هذا التلوين في مركز الخرز بسبب مشكلة أخرى يمكن أن تؤثر على التعويض ، وهي أن الفوتونات المنتجة خارج المستوى البؤري قد تظهر في voxels في المستوى البؤري والتي من غير المحتمل أن يتم استنساخها في كل من القناة الرئيسية والقناة التي تحتاج إلى تعويض²⁴. نتيجة لذلك ، لن تتم إزالة هذا "الضوضاء" بشكل فعال عن طريق التعويض دون إدخال تعويض زائد. يمكن معالجة هذه المشكلات جزئيا باستخدام متوسط الخط ، وقياس قيم الفلورسنت لفوكسل واحد عدة مرات ، واستخدام المتوسط للحد من تأثير أحداث الصدفة العشوائية. في حالة استخدام مجهر متحد البؤر ، يمكن أيضا تقليل حجم الثقب لاستبعاد الفوتونات خارج التركيز من دمجها في الصور^25,26. يأتي استخدام هذه الإصلاحات على حساب أوقات الحصول على التصوير الإضافية ، والتي يمكن أن تصبح واسعة النطاق.

بينما تم تطوير هذه التقنية باستخدام الصور المأخوذة من مجهر متحد البؤر ، فإنها ستعمل مع أنواع أخرى من المجاهر. قام آخرون يستخدمون طرقا مماثلة بتطبيق هذه المنهجيات على الصور المأخوذة من مجاهر ثنائية الفوتون¹⁷ بنجاح كبير. بينما يمكن تطبيق هذه التقنية على الصور المأخوذة من المجاهر واسعة المجال ، إلا أن هناك العديد من المزايا المرتبطة بالمجاهر متحدة البؤر التي تعمل على تحسين تحديد ما إذا كان الفوتون قد نشأ داخل المستوى البؤري. نظرا لأن الدقة الدقيقة لموقع الفوتونات (أي التقسيم البصري) تحسن جودة التعويض ، فمن المتوقع أن تكون جودة التعويض رديئة نسبيا. يمكن معالجة ذلك باستخدام إزالة الالتفاف لإزالة الفوتونات خارج التركيز البؤري لتحسين دقة الصور واسعة المجال²⁷. أحد التحذيرات المهمة التي ستحدد ما إذا كان الالتفاف متوافقا مع هذا البروتوكول هو ما إذا كانت قيم التألق في كل قناة تظل متناسبة مع بعضها البعض عبر جميع الصور التي تم تحليلها. إذا أصبحت قيم التألق بعد إزالة الالتفاف تعسفية ، فمن غير المرجح أن يتم تطبيق نفس مصفوفة التعويض التي تم إنشاؤها على صورة واحدة بنجاح على الصور الأخرى. بشكل عام ، فإن العامل الأكثر أهمية الذي يحدد ما إذا كان بإمكان المجهر استخدام سير العمل هذا هو ما إذا كان هذا المجهر يحتوي على كاشفات يمكن ضبط نطاق الكشف الخاص بها بمرونة. إذا كان هذا متاحا ، فيمكن حل الفلوروفورات المتعددة التي يتم تحفيزها من خلال نفس الإثارة من خلال الكشف عن أطياف انبعاثها داخل نوافذ الكشف المختلفة.

يمكن زيادة عدد المعلمات الفلورية بشكل أكبر إذا تم دمجها مع تقنيات تلطيخ نفس الأنسجة بشكل متسلسل عدة مرات¹³ ، مثل IBEX^14,15. باستخدام التلوين التسلسلي ، يمكن قياس أعداد غير محدودة من المعلمات بشكل فعال ؛ ومع ذلك ، يمكن أن يستغرق هذا وقتا طويلا للغاية. يمكن أن يؤدي استخدام مجموعة من طرق التعويض التي تمت مناقشتها هنا والتلوين التسلسلي إلى تقليل الوقت اللازم لالتقاط هذه الصور بشكل كبير ، حيث يمكن تصوير المزيد من القنوات في وقت واحد لكل جولة من التلطيخ. سيتوسع خط أنابيب التحليل الموصوف هنا لأكبر عدد ممكن من العلامات حسب الرغبة ويكون متوافقا مع أقسام الأنسجة الملطخة بشكل متسلسل.

الخطوة الحاسمة في خط أنابيب التحليل هذا هي تجزئة الخلايا المفردة من صور الأنسجة. يعد إيجاد استراتيجيات فعالة لتقسيم الخلايا بدقة من صور الأنسجة مشكلة شائعة²⁸ ، ويتم تطوير طرق أحدث باستمرار. في حين أن هذه الطريقة يمكن أن تفصل الخلايا المفردة بشكل فعال عن الخلايا المعبأة بشكل وثيق ، إلا أن الحدود الدقيقة للخلايا غالبا ما تكون غير كاملة. لذلك يوصى بأن يقصر المستخدمون التحليل على مجموعات الخلايا التي يهتمون بها فقط ، حيث أنه كلما قل عدد الخلايا التي تحتاج إلى الفصل ، زادت دقة حدود الخلايا. يمكن للمستخدمين أيضا تحقيق فصل أفضل للخلايا من خلال تحديد مجموعات سكانية متعددة في ilastik ، مما يسمح للبرنامج بتقسيم مجموعات الخلايا المختلفة. ومع ذلك ، فإن إحدى المشكلات في هذا النهج هي أن الخلايا المعرفة بهذه الطريقة لا يمكن دمجها في نفس كائن "الخلية" في البرنامج 3 ويمكن أن تؤدي إلى مضاعفة عدد الخلايا. ومع ذلك ، إذا كانت حدود الخلايا الأكثر دقة ضرورية للتجربة ، فيمكن استخدام هذا النهج. من المستحسن أن يقوم المستخدمون بتجربة خوارزميات تجزئة أحدث عند تطويرها ودمجها في خط الأنابيب هذا للحصول على نتائج أفضل.

يمكن أن تنشأ العديد من المشكلات عند تطوير لوحة قياس خلوي جديدة للتدفق النسيجي. أولا ، من الأهمية بمكان أن تنتج علامات الفلورسنت المختلفة كميات مماثلة تقريبا من التألق. إذا كان أحد الفلوروفور أكثر إشراقا من الآخر ، فقد يكون ذلك مشكلة إذا كان هذا الفلوروفور ينزف إلى فلوروفور آخر ، حيث قد يتجاوز النزيف من خلال التلوين الحقيقي في تلك القناة. يظهر هذا في الشكل 3 ، حيث ينزف Alexa Fluor 546 إلى PE-eFluor 610 بشدة. في حين أن التعويض لا يزال بإمكانه إزالة هذا النزيف ، إلا أنه سيظل هناك في كثير من الأحيان بعض التألق المستمر بسبب عدم إزالة الضوء خارج التركيز البؤري ، مما قد يجعل التعويض غير مكتمل. علاوة على ذلك ، فإن معظم أجهزة الكشف المستخدمة في المجاهر لا تحتوي على نطاقات ديناميكية واسعة مثل تلك الموجودة على أجهزة قياس التدفق الخلوي. نتيجة لذلك ، مع زيادة النزيف في القناة ، سيتم تشبع المزيد من النطاق الديناميكي في هذا الكاشف بإشارات من الفلوروفورات الأخرى وأقل من الفلوروفور محل الاهتمام. عندما تتم إزالة التعويض من هذه القناة مع نزيف واسع النطاق ، يمكن حل الإشارة الحقيقية ؛ ومع ذلك ، فإن الفرق بين الخلايا الموجبة لهذه العلامة وتلك السلبية لها سيصبح أصغر وقد يؤدي إلى عدم القدرة على حل الحالات الوسيطة أو حتى حل الإيجابيات من السلبيات. وبالتالي ، ينبغي تجنب التداخل بين القنوات. ثانيا ، يمكن أن يتغير سطوع العلامات بين الأنسجة المختلفة. على سبيل المثال ، قد لا تعمل لوحة من العلامات التي تعمل على الغدد الليمفاوية عند استخدامها على الطحال أو الجهاز العصبي المركزي لأن العلامة قد تصبح ساطعة جدا أو خافتة ، مما يؤدي إلى نزيف تلك القناة كثيرا في قنوات أخرى أو أن تطغى عليها النزيف من القنوات الأخرى. في مثل هذه الحالة ، قد يكون من الضروري تبديل الفلوروفورات على العلامات أو تبديل استخدام الأجسام المضادة المترافقة الأولية إلى استخدام الأجسام المضادة الثانوية. أخيرا ، قد يكون من المفيد الاستفادة من الاختلافات في توطين العلامات عندما يكون هناك تداخل مفرط بين القنوات. إذا تداخلت قناتان بشكل كبير مع بعضهما البعض ، لكن إحداهما علامة نووية ، والأخرى علامة سطح الخلية ، فإن التداخل الطيفي سيؤثر على بعضهما البعض إلى الحد الأدنى لأن التعويض لن يؤثر على نفس الفوكسل. إذا أمكن ، يجب تصميم اللوحات لضمان اختلاف القنوات المتداخلة في توطينها أو التعبير عن العلامات في خلايا منفصلة.

بشكل عام ، ثبت أن قياس التدفق الخلوي النسيجي هو تقنية متعددة الاستخدامات لتحليل صور الأنسجة على مستوى خلية واحدة. في حين أن التقنيات القديمة يمكن أن تقتصر على تحليل الخلايا التي لا تلامس الخلية بشكل مباشر ، يمكن لخط أنابيب التحليل هذا فصل الخلايا الملامسة ، مما يجعله مناسبا لدراسة الخلايا في الأنسجة في الاتزان الداخلي أو أثناء الالتهاب عندما تتجمع الخلايا المناعية في مواقع التلف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
100٪ إيثانول	سيجما	676829-1L
4٪ PFA	علوم المجهر الإلكتروني	157-4
Anaconda	N / A	N / A
مصل الأبقار الألبومين	Sigma	A4503-50G
جيلاتين بقعة السمك البارد   ؛	Sigma	G7765
تجميع البيانات متعددة القنوات من البرنامج النصي Imaris.ipynb	N / A	/ A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-تحويل
إخراج FlowJo إلى ملف txt لاختيار الخلية في البرنامج النصي Imaris.ipynb	N / A	N / A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Donkey
المضاد للفئران Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 تركيز
حمار مضاد للفئران DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 تركيز
مصل الحمار	جاكسونImmunoResearch	017-000-001
F (ab') 2-Goat Anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 تركيز
فيجي	N / A	N / A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluorescence spectraviewer			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
أقسام اللوزتين البشرية المجمدة الطازجة	amsbio	HF-707
غطاء زجاجي	VWR	48393 106
الماعز المضاد للإنسان IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1: 400 تركيز
الماعز المضاد للإنسان IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1: 400 تركيز
الماعز المضاد للإنسان IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 تركيز
الماعز المضاد للأرانب A546	ثيرمو فيشر Scientific	A-11035	1:250 تركيز
الماعز المضاد للأرانب IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 تركيز
مصل الحصان	Sigma	H1138
Ilastik	N / A	N / A
Ilastik FIJI البرنامج المساعد	N / A	N /
Imaris محول الملفات	Oxford Instruments		Software 2
Imaris مع وحدة الخلية	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science Software	Leica		Software 1
Mouse Anti-Human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 تركيز
الماوس المضاد للإنسان CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	تركيز 1:20
مصل الماعز العادي	جاكسونImmunoResearch	005-000-001
مصل الفأر العادي	JacksonImmunoResearch	015-000-001
مصل الأرانب العادي	جاكسونImmunoResearch	011-000-001
مصل الفئران العادي	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Abcam الأصفر النووي		ab138903	في DMSO بتركيز 2 مجم / مل ويخزن عند 4 درجات ؛ C في الظلام
قلم PAP	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
أرنب مضاد للإنسان Ki67	Abcam	ab15580	1:500 تركيز
أرنب مضاد للفأر Iba1	واكو	019-19741	1:500 تركيز
الفئران المضادة للإنسان Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	تركيز 1:40
الفئران المضادة للفأر B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	تركيز 1:250
الفئران المضادة للفأر CD138	Biolegend	142502	تركيز 1: 200
الفئران المضادة للفأر CD3 PE-eFluor 610	ثيرمو فيشر العلمي	61-0032-82	تركيز 1:40
تركيز الفئران المضادة للفأر CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	تركيز 1:200
الفئران المضادة للفأر CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	تركيز 1:50
الفئران المضادة للفأر IgD PerCP-eFluor 710	ثيرمو فيشر العلمي	46-5993-82	1:50 تركيز
SP8 مجهر متحد البؤر	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	سيجما	P7949-500 مل
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42