يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

2.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66921

⸱

مايو 24, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Case Western Reserve University, 2Division of Infectious Diseases and HIV Medicine, Department of Medicine, Case Western Reserve University, 3Cole Eye Institute, Ophthalmic Research, Cleveland Clinic

في هذه المقالة

ملخص

تعمل ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) كحاجز حاسم بين المشيمية والشبكية ، مما يعزز صحة ووظيفة أنواع خلايا الشبكية ، مثل المستقبلات الضوئية. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا وفعالا لعزل وزراعة الفئران البالغة RPE.

الملخص

الخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) ضرورية للوظيفة المناسبة للشبكية. يشارك خلل RPE في التسبب في أمراض الشبكية المهمة ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والتهاب الشبكية الصباغي ، واعتلال الشبكية السكري. نقدم نهجا مبسطا لعزل RPE عن عيون البالغين الفئران. على عكس الأساليب المبلغ عنها سابقا ، يتيح هذا النهج عزل وزراعة RPE عالي النقاء من الفئران البالغة. لا تتطلب هذه الطريقة البسيطة والسريعة مهارة تقنية واسعة ويمكن تحقيقها باستخدام الأدوات والكواشف العلمية الأساسية. يتم عزل RPE الأولي من الفئران الخلفية C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 3 إلى 14 أسبوعا عن طريق استئصال العين متبوعا بإزالة الجزء الأمامي. يتم استخدام التربسين الأنزيمي والطرد المركزي لفصل وعزل RPE عن فنجان العين. في الختام ، يقدم هذا النهج بروتوكولا سريعا وفعالا لاستخدام RPE في دراسة وظيفة الشبكية ومرضها.

المقدمة

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية الخلية متخصصة تبطن غشاء بروخ وتقع بين المستقبلات الضوئية والمشيمية1. تلعب خلايا RPE دورا مهما في الوظيفة المناسبة للشبكية. تنقل خلايا RPE الجلوكوز وفيتامين أ إلى المستقبلات الضوئية ، وتعزز الرؤية عن طريق إعادة إيزوميرة الشبكية العابرة بالكامل إلى شبكية 11 رابطة الدول المستقلة وتحافظ على الأجزاء الخارجية من المستقبلات الضوئية من خلال البلعمة للأجزاء الخارجية المتساقطة ، وإزالة الماء من الفضاء تحت الشبكية ، وتشكيل الحاجز الدموي الشبكي الخارجي من خلال وجود تقاطعات ضيقة وإفراز عوامل النمو العصبية (مثل عامل الصباغ المشتق من الظهارة ، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي) التي تدعم المستقبلات الضوئية2. يشارك خلل خلايا RPE في التسبب في اعتلالات الشبكية المختلفة ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والتهاب الشبكية الصباغي ، واعتلال الشبكية السكري3،4،5. تعد الدراسات المختبرية التي تستخدم خلايا RPE ضرورية لتحسين فهمنا للتسبب في هذه الأمراض. تفضل خلايا RPE الأولية كثيرا لهذه الدراسات نظرا لأن خطوط خلايا RPE ، رغم توفرها بسهولة ، تفتقر إلى الخصائص الرئيسية لخلايا RPE الأولية.

في حين تم استخدام أنواع مختلفة كمصادر لخلايا RPE الأولية ، تتمتع الفئران بميزة استخدام التعديلات الجينية للمساعدة في فهم التسبب في اعتلال الشبكية. تتطلب البروتوكولات الموصوفة سابقا لعزل خلايا RPE عن القوارض إما استخدام الوليدية ، أو طويلة ، أو تتطلب مهارة فنية ، أو غير مناسبة للاستزراع6،7،8،9،10،11،12. وصفنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل خلايا RPE عن الفئران البالغة التي تنتج ثقافات عالية النقاء لهذه الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على استخدام الموضوعات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة كيس ويسترن ريزيرف.

1. إعداد الكواشف

  1. قم بإعداد وسط عازل للغسيل عن طريق استكمال محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم ، بدون فينول أحمر بمحلول عازل HEPES 10 mM. احفظ المحلول على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. قم بإعداد وسط RPE عن طريق استكمال وسط النسر المعدل من Dulbecco ب 4.5 جم / لتر من الجلوكوز ، و 1.25x مكمل GlutaMAX (تركيز المخزون 100x أو 200 mM ؛ التركيز النهائي 2.5 mM L-glutamine) ، مع مصل بقري جنيني 10٪ ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 1x محلول أحماض أمينية غير أساسية MEM (100x). قبل الاستخدام ، قم بتسخين الوسائط مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.

2. استخراج عين الماوس

  1. القتل الرحيم للفأر ، ويفضل أن يتراوح عمره من 3 إلى 14 أسبوعا ، باستخدام طريقة القتل الرحيم المعتمدة من IACUC (خلع عنق الرحم تحت التخدير باستخدام كوكتيل الكيتامين / الزيلازين عند 0.1 مل لكل 20 جم من الفئران [87.5 مجم / كجم من الكيتامين و 12.5 مجم / كجم من الزيلازين] كانت الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة).
    ملاحظة: ستسهل العيون التي تم جمعها من الفئران الأصغر سنا زيادة إنتاج الخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين بمرور الوقت وتوسيع القدرة على الممرات المتتالية.
  2. ضع الماوس بشكل مسطح على جانبه مع توجيه العين لأعلى.
  3. ضع السبابة والإبهام فوق وتحت العين ، على التوالي. اضغط برفق على بنية العظام المحيطة بالعين للحث على بروز مقلة العين.
  4. أدخل طرف المقص المفتوح قليلا أسفل العين وقم بتدوير المعصم برفق بعيدا عن العين 90 درجة حتى تنفصل العين عن التجويف.
    ملاحظة: لا تغلق المقص لقطع العين أو العصب البصري ، لأنه سيجعل تشريح فنجان العين أكثر صعوبة.
  5. ضع العين وتدحرجها على الفور في 70٪ إيثانول لمدة لا تزيد عن 5 ثوان قبل نقلها إلى وسط عازل للغسيل يحفظ على الثلج.
  6. تحت مجهر تشريح ، انقل عين واحدة في كل مرة إلى طبق بتري مملوء بمحلول غسيل وشرائط من الشاش المنقوع.
  7. تثبيت العين عن طريق عقد العصب البصري مع ملاقط. قم بعمل شق برفق على مستوى ora serrata باستخدام سكين جراحي 3.00 مم 45 درجة أو شفرة حلاقة 0.009 بوصة.
  8. باستخدام مقص Vannas ، أدخل المقص برفق في الشق واقطع حول محيط ora serrata حتى يمكن إزالة الجزء الأمامي والجسم الزجاجي والتخلص منه.
  9. انزع شبكية العين برفق من فنجان العين باستخدام ملقط مربوط ، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة RPE.
    ملاحظة: لتسهيل إزالة الشبكية ، املأ ماصة النقل بوسط عازل للغسيل وضعه بعناية على حواف فنجان العين لرفع الشبكية برفق.
  10. أخيرا ، قم بإزالة العصب البصري والأنسجة الضامة الزائدة من فنجان العين باستخدام المقص. احرص على عدم ثقب فنجان العين.

3. عزل RPE الأساسي

  1. انقل فنجان العين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من 0.25٪ تربسين + 0.02٪ EDTA.
    ملاحظة: يمكن إضافة فنجان للعين إلى حصة واحدة من Trypsin-EDTA لزيادة إنتاجية RPE القابلة للزراعة.
  2. نقل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة إلى حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 10 دقائق. كل 2 دقيقة ، قم بإزالة الأنابيب من حمام مائي واضغط بقوة على الجزء السفلي من الأنبوب 40 مرة على سطح العمل.
  3. بعد 10 دقائق ، قم بتعطيل فنجان العين برفق ميكانيكيا باستخدام ماصة مصلية P1000 أو 2 مل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل لا يزيد عن 3 مرات.
    ملاحظة: يعد تجزئة أوراق RPE أمرا ضروريا لأن الأوراق الكبيرة لن تلتصق بشكل صحيح.
  4. قم بتحييد التربسين على الفور عن طريق وضع صفائح RPE المنفصلة ، ولكن ليس فنجان العين ، على 0.5 مل من مصل الجنين البقري (FBS) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  5. علاوة على ذلك ، قم بتخفيف التربسين عن طريق وضع 3 مل من وسائط RPE بالتنقيط على طبقات أوراق FBS و RPE.
  6. أجهزة الطرد المركزي RPE في 340 × ز لمدة 3 دقائق.
  7. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في كمية مناسبة من وسائط RPE إما للوحة 24 بئرا (1.9 سم2 / بئر) أو لوحة 48 بئر (0.75 سم2 / بئر).
    ملاحظة: يمكن طلاء RPE على ألواح جيدة مغلفة ببروتينات مصفوفة خارج الخلية ، وتحديدا اللامينين أو الكولاجين الوريدي أو الفبرونيكتين ، لزيادة الالتصاق11. يمكن أيضا إعادة تعليق RPE في 1 مل من وسائط RPE ووضعها في طبقات على تدرج فصل كثافة بنسبة 40٪ لزيادة عزل خلايا RPE النقية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي تدوير اللوحة عند 340 × جم لمدة 3-5 دقائق إلى زيادة التصاق الخلية13.
  8. احتضان عند 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2.

4. زراعة RPE

  1. لا تعطل RPE المعزول لمدة 3 أيام على الأقل. بعد 72 ساعة ، قم بإزالة الوسط القديم برفق واستبدله بوسائط جديدة تم تسخينها مسبقا.
  2. قم بتغيير الوسيط كل 48 ساعة بعد أول 3 أيام.
  3. بمجرد وصول الخلايا إلى نقطة التقاء ، قم بتمرير الخلايا باستخدام 0.25٪ تربسين + 0.02٪ EDTA وقم بتقليل FBS في وسائط RPE إلى 2٪.
    ملاحظة: تم الإبلاغ سابقا عن RPE الأساسي لبدء إزالة التمايز بعد 5-7 مقاطع وسيبدأ في فقدان شكله السداسي وتصبغه14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام البروتوكول الموصوف على الفئران الخلفية C57BL / 6. لا يبدو أن الجنس يغير القدرة على ثقافة RPE. تنتج الفئران التي تقل أعمارها عن 6 أسابيع صفائح RPE محدودة مقارنة بالفئران الأكبر سنا ، وقد تكون هناك حاجة إلى مزيد من العيون للوصول إلى الالتقاء الأمثل. بعد العزلة ، تستغرق خلايا RPE حوالي 3 أيام لتستقر وتلتصق بلوحة زراعة الخلية. بعد حوالي 24 ساعة من العزل ، بدأت الخلايا المستديرة المصطبغة التي تظهر غير قابلة للاستئصال في الاستقرار ولكنها لم تلتصق تماما باللوحة (الشكل 1 أ). خلال 48-72 سا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه المقالة ، حددنا بروتوكولا مبسطا لعزل وثقافة ظهارة الصباغ الشبكي الفئران. عبرت خلايا RPE المعزولة من عيون الفئران البالغة عن علامة خاصة ب RPE ، RPE65 ، وعلامة تقاطع بين الخلايا ، ZO-1. بالإضافة إلى ذلك ، تطورت الخلايا المستزرعة إلى صفائح سداسية مصطبغة في الثقافة.

تم نشر عدة طرق لعزل RPE في القوارض سابقا6،7،8،9،10،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا توجد إفصاحات مالية أو غير مالية ذات صلة.

شكر وتقدير

تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل NIH Grants R01EY018341 و R01EY019250 (CSS) و NIH Grant F31EY035156 (A.H.) و P30 EY011373. لم يكن للمنظمة الممولة أي دور في تصميم أو إجراء هذا البحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.009 شفرات أحادية الحافة RDPersonna941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVمع 4.5 جم / لتر جلوكوز ، L-جلوتامين ، بيروفات الصوديوم
مصل الأبقار الجنينيCorning35010CV
GlutaMAX ، 100xGibco35050061
Hank's Balanced SaltSolution Gibco14175095خال من الكالسيوم ، لا المغنيسيوم ، لا
عازلة HEPES أحمر الفينول (1 متر) أحماضمن جيبكو15630106
MEM ، سكين 100xGibco11140050
Micro-UnitomeBVI Beaver377546
محلول البنسلين والستربتومايسين ، 100xCorning30-002-CI
البوليسترينفالكون08-772-124 بئر أو 48 بئر
مصل بقري للجنينالعادي Corning35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25٪)25200056 جيبكوفاناس أحمر الفينول
أدوات العلوم الدقيقة10091-12
محلول أمينية غير أساسية ألواح الدقيقة مع مقص

المراجع

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
  3. Lambros, M. L., Plafker, S. M. Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).
  4. Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  5. Xia, T., Rizzolo, L. J. Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium. Vision Res. 139, 72-81 (2017).
  6. Edwards, R. B. Culture of rat retinal pigment epithelium. In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).
  7. Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).
  8. Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina. Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).
  9. Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).
  10. Sakagami, K., et al. A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs. Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).
  11. Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 9, 449(2015).
  12. Shen, J., He, J., Wang, F. Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor. Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).
  13. Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protoc. 3 (4), 101758(2022).
  14. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight Junctions of the outer blood retina barrier. Int J Mol Sci. 21 (1), 211(2019).
  15. Ban, B., Rizzolo, L. J. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Mol Vis. 3, 18(1997).
  16. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  17. Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Front Pharmacol. 12, 727870(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

ظهارة صبغ الشبكيةعزل ظهارة صبغ الشبكيةظهارة صبغ الشبكية للفئران البالغةزراعة ظهارة صبغ الشبكيةأمراض الشبكيةطريقة التربسينتفكيك الخلاياخلايا ظهارة صبغ الشبكية الأوليةسلامة الموصلات المحكمةتقنية استئصال العين
طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.