مقالة منهجية

تطبيق الترميز الشريطي للحمض النووي لتحديد النباتات الطبية

2.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66925

⸱

نوفمبر 1, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Herbgenomics, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول الحالي استخدام تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي لمصادقة المواد الطبية النباتية ، والنبات الطبي Angelica sinensis (Oliv.) تم تحديد Diels كمثال.

الملخص

تعتبر النباتات الطبية موارد قيمة على مستوى العالم وتستخدم في جميع أنحاء العالم للحفاظ على الصحة وعلاج الأمراض. ومع ذلك ، فإن وجود الغش يعيق تطورها. يسهل الترميز الشريطي للحمض النووي ، وهو تقنية لتحديد الأنواع من خلال مناطق الحمض النووي القياسية ، التعرف الفوري والدقيق على النباتات الطبية التقليدية. تستلزم عملية الترميز الشريطي للحمض النووي ست خطوات أساسية: 1) معالجة النباتات الطبية ، 2) استخراج الحمض النووي الكلي عالي الجودة من النباتات الطبية باستخدام طريقة عمود الطرد المركزي ، 3) تضخيم فاصل الحمض النووي الداخلي المنسوخ لمنطقة الحمض النووي المستهدفة 2 (ITS2) باستخدام بادئات عالمية للنباتات وإجراء تسلسل سانجر ، 4) الربط والمحاذاة للحصول على التسلسل المستهدف ، 5) مطابقة تسلسل الباركود مع مكتبة الباركود لتحديد الهوية ، 6) محاذاة التسلسل ، ومقارنة التباين غير المحدد وبين الأنواع ، وبناء شجرة الانضمام إلى الجيران النشوء والتطور. كما هو موضح في النتائج ، يمكن للبرايمر العالمي تضخيم المنطقة المستهدفة. توضح أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST) أن النسبة المئوية المحددة كانت 100٪، وتوضح الشجرة المنضمة إلى الجار أن تسلسلات الربط تم تجميعها مع A. sinensis OR879715.1 clade، وقيمة دعم الكليد هي 100. يوفر هذا البروتوكول مرجعا لتطبيق تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي كطريقة فعالة لتحديد النباتات الطبية والمواد المغلفة.

المقدمة

للنباتات الطبية مجموعة واسعة من التأثيرات الدوائية وهي مواد مهمة لعلاج الأمراض والوقاية منها. طلب السوق على النباتات الطبية في الأدوية العشبية والمنتجات الصيدلانية ضخم ولا يزال في ازدياد. مع تزايد سوق النباتات الطبية ، أعاقت مشكلة الغش نمو النباتات الطبية. حاليا ، يعاني غش النباتات الطبية من هذه الأسباب: 1) التشكل المماثل للنباتات الطبية يجعل من الصعب التعرف عليها واستخدامها بشكل صحيح1،2،3،4،5 ، 2) أدى الطلب المتزايد على النباتات الطبية إلى عدم كفاية العرض في السوق6،7، 3) النباتات الطبية باهظة الثمن ولها أسعار متقلبة ، وقد أدى استخدام الأعشاب الرخيصة بدلا من المواد ذات القيمة الاقتصادية إلى الغش والتربح من السوق8،9. لحل مشاكل التحديد الصحيح للنباتات الطبية واستخدامها ، هناك حاجة إلى تقنية تسمح لغير المتخصصين بتحديد المصدر10.

هناك قيود على تحديد النباتات الطبية واستخدامها بشكل صحيح من خلال المظهر والرائحة وحدهما11. لتحديد أكثر دقة ومراقبة الجودة ، يتم استخدام الطرق الفيزيائية والكيميائية12. كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) ، على سبيل المثال ، هي طريقة سريعة لتحديد الأعشاب الطبية وهي مدرجة في دستور الأدوية الصيني. ومع ذلك ، فإنه يتطلب معايير مرجعية لتحديد النباتات13. يمكن للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إجراء اختبارات نوعية وكمية ، مما يجعلها مناسبة لاختبار جودة الأدوية. ومع ذلك ، فإن هذه الأداة باهظة الثمن وتتطلب معرفة متخصصةلتشغيلها 14،15. تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي هي تقنية سريعة ودقيقة لتحديد الأنواع تحدد الأنواع باستخدام تسلسل الحمض النووي المستقر للتمييز بين النباتات ذات التشكل المماثل. اقترح Hebert et al. تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي لتحديد الأنواع ، والتي تستخدم تسلسل DNA معترف به وقصير نسبيا داخل الجينوم16 ، اقترح Chen et al. ITS2 كتسلسل عالمي للتحديد الجزيئي للنباتات الطبية وحدد أكثر من 6600 نبات ووجد قدرة عالية على تحديدالهوية 17. أظهرت دراسة النباتات الطبية القائمة على شظايا جين ITS2 والبلاستيدات الخضراء القدرة على تمييز الأنواع على مستوى الأنواع ، مع تطبيقات في مجالات حماية الموارد وتنظيم السوق والتجارة الدولية17 ، 18 ، 19. يمكن أن يتغلب تطبيق الترميز الشريطي للحمض النووي على قيود طرق تحديد الهوية التقليدية ، وهو أمر مفيد في ضمان جودة وسلامة النباتات الطبية ، ومنع إساءة استخدام الموارد والارتباك20. لقد أثبت أنه مفيد لدراسة النباتات الطبية ، ودعم نمو صناعة الأعشاب بطريقة مستدامة ، وتوفير ضمان أن المستهلك يستخدم الدواء الصحيح21،22،23،24.

تحدد الورقة بروتوكولات لكيفية تطبيق الترميز الشريطي للحمض النووي لتحديد النباتات الطبية باستخدام A. sinensis كمثال. يستخدم الترميز الشريطي للحمض النووي واحدا أو أكثر من العلامات الجينية القصيرة الموحدة في الحمض النووي للكائن الحي للتعرف عليه على أنه ينتمي إلى نوع معين. الطرق الحالية لتحديد النباتات الطبية لها قيود معينة. يعتمد التحديد المورفولوجي التقليدي بشكل كبير على خبرة الخبراء الواسعة ، والتي يمكن أن تتأثر بالعوامل البشرية ، في حين أن التحديد الكيميائي عرضة لقضايا مثل غش المركبات الرئيسية. في المقابل ، يوفر الترميز الشريطي للحمض النووي وسيلة أكثر دقة لتحديد الأنواع ، مما يوفر مزايا مثل السرعة وقابلية التكاثر العالية والاستقرار. علاوة على ذلك ، تتيح هذه التكنولوجيا الإدارة المركزية ومشاركة بيانات تسلسل الأنواع الحالية من خلال الإنترنت ومنصات المعلومات ، مما يحسن بشكل كبير من كفاءة وموثوقية تحديد الأنواع11،12. نظرا لتشابهها في مورفولوجيتها وأجزائها الطبية ، غالبا ما يتم الخلط بين A. sinensis والأنواع الأخرى وكثيرا ما يساء استخدامها أو يتم استبدالها عمدا في السوق25. حدد يانغ وآخرون A. الشذوذ باستخدام الترميز الشريطي للحمض النووي لتمييزه عن الأدوية الكاذبة26. يوان وآخرون جمع 23 نوعا من حشيشة الملاك واستخدموا الترميز الشريطي للحمض النووي للتمييز بين الأنواع المختلفة27. باتباع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول ، سيتمكن المستخدمون من مصادقة المواد الطبية النباتية من المعالجة المسبقة إلى مطابقة تسلسل الترميز الشريطي في النهاية مع قاعدة بيانات الباركود (الشكل 1).

البروتوكول

1. تحضير العينة

  1. استخدمت الدراسة الحالية A . sinensis البالغ من العمر عامين مع درجة حرارة منخفضة وأشعة الشمس الطويلة على ارتفاع 2800 متر من مقاطعة مين بمقاطعة قانسو كمواد تجريبية. تم اختيار ثلاثة نباتات تم اختيار أكثر من ثلاثة جذور منها للتجريب. اشطف الجذور أولا بالماء المعقم ثم نظفها باستخدام بخاخ الكحول أو مسحات الكحول لمنع التلوث الذي قد يؤثر على دقة النتائج التجريبية. قطع الجذور إلى قطع أصغر من 5 مم باستخدام مشرط معقم وتخلط لمزيد من التحليل. (الشكل 2).
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، ضع الجذور في النيتروجين السائل حتى تنضج ، مما يسهل كسرها اعتمادا على شكل النباتات الطبية وصلابتها وخصائصها الأخرى ، استخدم الأدوات للتعامل معها.
  2. إعداد ثلاثة أنابيب من العينات التجريبية للتجارب المتوازية. قم بتسمية كل عينة على أنها AS-1 و AS-2 و AS-3. خذ حوالي 100 مجم من المناديل الطازجة أو 20 ملغ من الوزن الجاف (المجففة بالهواء) وضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.
  3. ضع حبتين من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 5 مم في أنابيب الطرد المركزي سعة 2 مل. انقل الأنابيب إلى مطحنة مناديل عالية الإنتاجية تعمل بسرعة 60 هرتز لمدة 60 ثانية.

2 استخراج الحمض النووي من العينة

ملاحظة: تستخدم هذه الدراسة مجموعة استخراج الحمض النووي الجيني النباتي ، والتي تعتمد على طريقة CTAB. يتم إجراء استخراج الحمض النووي باتباع دليل التعليمات مع بعض التعديلات ، بما في ذلك إضافة عازل عزل نووي فريد (NIB). يعمل البروتوكول على تحسين نقاء الحمض النووي عن طريق فصل الملوثات أولا عن الأنسجة ثم إضافة خطوة عزل النوىالأولية 28،29،30.

  1. أضف 800 ميكرولتر من NIB المبرد مسبقا وضع العينة على خلاط دوامة ، واهتز لمدة 5 دقائق.
  2. ضعها في جهاز طرد مركزي وقم بمعالجتها على حرارة 13,780 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية.
  3. كرر الخطوات 2.1-2.2 لمدة 3 جولات إضافية.
    ملاحظة: يستخرج NIB الحمض النووي عالي الجودة ، ويحتوي تحضيره على بعض المواد الكيميائية الخطرة التي يجب التعامل معها في غطاء الدخان ، مما يجعل من الصعب على المبتدئين التعامل معها. ومع ذلك ، فإن هذه الخطوة ليست إلزامية. يمكن للمستخدمين اختيار اتباع هذه التوصية أو تخطي هذه الخطوات. صياغته التفصيلية في الجدول 1.
  4. أضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت P1 و 5 ميكرولتر من RNase A (10 مجم / مل). ضع العينة على خلاط دوامة ودوامة للخلط. احتضان العينات في حمام مائي عند 65 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة ، مع قلب الأنابيب 2x-3x أثناء الحضانة.
  5. أضف 200 ميكرولتر من Buffer P2 ، واخلطها جيدا ، وضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 13,780 × جم لمدة 10 دقائق.
  6. قم بشفط المادة الطافية بعناية على عمود مرشح AF ، وجهاز طرد مركزي عند 13,780 × جم لمدة دقيقتين ، وانقل المرشح السفلي الذي تم جمعه في أنبوب التجميع إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
  7. احسب حجم الترشيح ، وأضف 1.5 ضعف حجم P3 ، ورجها على الفور للحصول على محلول مختلط.
  8. يضاف 650 ميكرولتر من الخليط المحضر إلى عمود امتصاص عمود ماص (AC) ويحتضنه لمدة 5 دقائق ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 13,780 × جم لمدة 30-60 ثانية.
  9. أضف المرشح الذي تم الحصول عليه من الخطوة 2.8 إلى التيار المتردد مرة أخرى ، وجهاز الطرد المركزي ، وتخلص من سائل النفايات. كرر الإجراء مع المحلول المختلط المتبقي من الخطوة 2.7.
  10. أضف 600 ميكرولتر من محلول الشطف WB ، وجهاز الطرد المركزي عند 13,780 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من محلول النفايات ، وكرر الإجراء 1x.
  11. ضع عمود التيار المتردد مرة أخرى في أنبوب التجميع الفارغ ، وجهاز الطرد المركزي عند 13،780 × جم لمدة دقيقتين ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لإزالة الإيثانول المتبقي.
  12. خذ التيار المتردد للعمود الممتز وضعه في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل. أضف 45 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات المعقم (ddH2O) إلى منتصف الغشاء الممتز ، الذي تم تسخينه إلى 65 درجة مئوية. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 13,780 × جم لمدة دقيقتين.
  13. أضف المحلول الناتج مرة أخرى إلى العمود وجهاز الطرد المركزي عند 13,780 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
  14. اجمع المحلول الذي تمت تصفيته. استخدام مقياس الطيف الضوئي لتحديد تركيز الحمض النووي. يمثل OD260 امتصاص الأحماض النووية. استخدم المعايير التالية لمعيار تحديد جودة الحمض النووي: OD260 / OD280 = 1.80-2.00 ، المعدل الطبيعي ؛ OD260/OD280>2.00; هناك كمية كبيرة من تلوث الحمض النووي الريبي ؛ OD260 / OD280<1.80 ، هناك بروتينات وفينولات وملوثات أخرى.

3 تضخيم الجزء المستهدف واكتشافه

ملاحظة: حدد بادئات التضخيم المناسبة بناء على مناطق الترميز الشريطي للحمض النووي المقترحة للنبات ؛ يتم عرض ظروف التفاعل في الجدول 2.

  1. قم بإعداد ظروف التفاعل المقابلة لتضخيم التمهيدي. استخدم أنابيب الطرد المركزي سعة 0.2 مل مملوءة ب 9.5 ميكرولتر من ddH2O ، و 12.5 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix ، و 1 ميكرولتر لكل من التمهيدي الأمامي ، والتمهيدي العكسي ، وقالب الحمض النووي لحجم إجمالي يبلغ 25 ميكرولتر. قم بإعداد عنصر تحكم سلبي ، واستبدل القالب بالماء.
  2. أضف 20 مل من 1x Tris Acetate-EDTA (TEA) و 0.2 جم من الاغاروز للتسخين وتحضير هلام الاغاروز بنسبة 1٪ ، ثم أضف 2 ميكرولتر من صبغة هلام الحمض النووي (10،000x) واخلطها جيدا. يسكب المزيج في صينية صب الجل ويترك ليتصلب للحصول على جل الاغاروز. أضف 3 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل و 2 ميكرولتر من علامة الحمض النووي 5000 نقطة أساس إلى الجل.
  3. اضبط الجهد على 120 فولت ، والتيار عند 400 مللي أمبير ، والرحلان الكهربائي لمدة 40 دقيقة. استخدم نظام تحليل صور هلامي متعدد الاستخدامات لعرض المواد الهلامية والتحقق من النتائج.

4. جمع البيانات وتحليلها

ملاحظة: هناك مجموعة واسعة من برامج تجميع وتحليل التسلسل. نستخدم كود Codon Aligner V11.0.1 و MEGA11 كأمثلة للتوضيح.

  1. استخدم التقويم لفتح ملف التسلسل لمراقبة خريطة الذروة ولصق ملفات خريطة ذروة التسلسل ثنائي الاتجاه.
    1. حدد إنشاء مشروع جديد وانقر فوق موافق للانتقال إلى الصفحة الرئيسية للبرنامج. حدد إضافة عينات ضمن القائمة ملف، وحدد الملف المراد معالجته كتنسيق تتبع تسلسل، واستيراده مباشرة إلى البرنامج كملف مستورد في عينات غير مجمعة.
    2. اختر Contig، ثم في القسم، اختر تجميع متقدم، ثم اختر تجميع في مجموعات. سيرى المستخدمون لأول مرة، بعد تحديد التجميع في المجموعات، مربع الحوار هذا: اختر تحديد الأسماء. قم بتعديل أجزاء اسم العينة وفقا لاسم الملف وانقر فوق تجميع. سيتم عرض التسلسل المحاذاة.
    3. استرجع تسلسلات ITS2 الكاملة وفقا لتحليل النموذج المستند إلى نموذج ماركوف المخفي (HMM). استخدم تسلسلات 5.8 ثانية (CGAGGGCACCCTGCCTGGGCGTCA) و 28 ثانية (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC)31 للبحث في التسلسل المحاذاة من البداية لإزالة مناطق 5.8 ثانية و 28 ثانية.
    4. حدد Go ، ثم ، في القسم ، حدد Search Sequence وانقر فوق OK للحصول على التسلسل المطابق. اختر Contig ، واختر حذف في القسم لإزالة مناطق 5.8 ثانية و 28 ثانية والتسلسلات منخفضة الجودة ، ثم سيقوم البرنامج بإخراج تسلسلات الربط للمطابقة.
  2. استخدم تسلسلات التضفير التي تم الحصول عليها من الخطوات التجريبية الثلاث المتوازية لتحديد الهوية ، وحدد بحث BLAST باستخدام قاعدة بيانات النيوكليوتيدات في المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) ، وحدد أداة تحديد الأنواع والتمهيدي المحدد ITS2 المقابلة في قاعدة بيانات جينوم دستور الأدوية العالمية (GPGD).
    ملاحظة: يتضمن NCBI32 و GPGD33 تسلسل النيوكليوتيدات للنباتات الطبية ويتم التعرف عليهما كقواعد بيانات موثوقة. طرقهم الرئيسية لتحديد الهوية هي الطرق القائمة على مقارنة التسلسل34 (BLAST). يتم استخدام الهوية المئوية من نتائج الهوية لتحديد ما إذا كانت الأنواع ذات التشابه الأكبر هي الجنس المستهدف.
  3. استخدم MEGA11 لمحاذاة التسلسل ، وتحليل ومقارنة تباين التسلسل غير المحدد ومتعدد الأنواع ، وبناء شجرة مرتبطة بالجار والتطور.
    1. قم بتنزيل تسلسلات ثلاثة أنواع من حشيشة الملاك ونوع واحد من Peucedanum praeruptorum كمجموعة خارجية من NCBI. قم بتحليل هذه التسلسلات مع تسلسل النتائج الذي تم الحصول عليه.
    2. انقر فوق ملف، واختر فتح ملف/جلسة لاستيراد الملف، وسيظهر مربع حوار. اختر Align > DNA، وحدد Align by ClustalW لمقارنة التسلسل. اختر تحليل النشوء والتطور في البيانات ، ثم ارجع إلى الصفحة الرئيسية. انقر فوق إنشاء/اختبار شجرة الانضمام إلى الجار في PHYLOGENY. يولد البرنامج شجرة النشوء والتطور.

النتائج

عينة من جودة الحمض النووي

كان نطاق نسب امتصاص OD260 / OD280 1.80-1.84. كانت كمية الحمض النووي المقاسة بواسطة مقياس الطيف الضوئي لكل عينة أكبر من 100 نانوغرام / ميكرولتر (الجدول 3) ، مما يشير إلى جودة جيدة لاستخراج الحمض النووي للعينة. يشير هذا إلى أن العينات لم تكن ملوثة بالبروتين أو الحمض النووي الريبي أو الكواشف أثناء عملية الاستخراج وأنها كانت ذات نوعية جيدة ومناسبة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في اتجاه مجرى النهر.

تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل

تم إجراء الرحلان الكهربائي للهلام على منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل للعينات التجريبية الثلاث المتوازية. كان الإعداد: علامة ، عينات 1-3 (AS-1 ، AS-2 ، AS-3) ، والتحكم السلبي (0) ، كما هو موضح في الشكل 3. تتراوح أحجام AS-1 و AS-2 و AS-3 بين 500 نقطة أساس مع نطاقات مفردة ومشرقة وواضحة ، ولا توجد نطاقات في 0 ، مما يشير إلى أن الحمض النووي المستخرج قد تم تضخيمه إلى 500 نقطة أساس باستخدام بادئات ITS2.

مقارنة قاعدة بيانات نتائج التسلسل

حددت نتائج التسلسل A. sinensis مع تشابه التسلسل بنسبة 100٪ من خلال الجمع بين نتائج تحديد BLAST لقاعدة بيانات NCBI ، وهي نفس نتائج تحديد الأنواع لقاعدة بيانات GPGD (الجدول 4). تم تحديد نتيجة BLAST باستخدام أعلى نسبة مئوية من درجات الهوية وأقل قيمة إلكترونية. اعتبر تحديد الأنواع ناجحا عندما تضمنت أعلى نسبة مئوية قصوى للهوية نوعا واحدا وسجلت >99٪. إذا كانت النتيجة ≤ 99٪، فتحقق من جودة ملف التسلسل أو ما إذا كان منتج PCR ملوثا.

التحليل القائم على شجرة النشوء والتطور لتحديد الأنواع

أظهرت النتائج أنه في شجرة النشوء والتطور في نيوجيرسي ، تم تجميع جميع الأنواع الأربعة في كتل منفصلة ، و P. praeruptorum كمجموعة خارجية تم فصلها عن كتل حشيشة الملاك . تم تجميع تسلسلات الربط مع A. sinensis OR879715.1 كليد ، وكانت قيمة دعم الكليد (التمهيد) 100 ، ثم تم تجميع النوعين الآخرين ، A. dahurica ، و A. cartilaginomarginata في كليد منفصل ، مما يثبت أن تسلسل الربط كان A. sinensis (الشكل 4).

figure-results-1
الشكل 1: مخطط انسيابي لتحديد أنواع النباتات الطبية. (أ) مصنع المعالجة ، واستخراج الحمض النووي وتسلسل النباتات الطبية ، (ب) مقارنة تسلسل الأنواع باستخدام قواعد البيانات ، و (ج) استخدام أشجار النشوء والتطور للتحقق التصنيفي لتأكيد العلاقات التطورية بين الأنواع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: سير عمل استخراج الحمض النووي للنباتات الطبية. (أ) يتم تضمين ما مجموعه 6 خطوات في استخراج الحمض النووي من النباتات الطبية. (ب) تضخيم أداة PCR وعملية تدوير PCR. (ج) الرحلان الكهربائي. (د) تسلسل سانجر ومخطط الكروماتوگرام التسلسلي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الرحلان الكهربائي الهلامي لأنجليكا سينينسيس (أوليف.) ديلز. باستخدام علامة الحمض النووي DL5000 كعلامة جزيئية ، يتم استخدام AS-1 و AS-2 و AS-3 كعينات ، و 0 كمجموعة تحكم. تم إجراء الرحلان الكهربائي للهلام ، وأظهرت النتائج أن عينات AS-1 و AS-2 و AS-3 تحتوي جميعها على نطاقات عند 500 نقطة أساس ، بينما لم تظهر المجموعة الضابطة أي نطاقات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: شجرة النشوء والتطور التي تم إنشاؤها من 13 تسلسلا. تم تنزيل ما مجموعه 10 تسلسلات من أربعة أنواع نباتية من قاعدة بيانات NCBI ، وتمت مقارنة تسلسلات الربط لتحليل ومقارنة تباين التسلسل غير المحدد وبين الأنواع وبناء أشجار مجاورة مرتبطة بالنشوء والتطور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم المواد / المعداتجرعة
بولي فينيل بيروليدون10 جرام
تريس حمض الهيدروكلوريك1 م 50 مل
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك0.5 م 20 مل
كلوريد الصوديوم20.45 غ
β ميركابتو إيثانول10 مل
ماء معقم منزوع الأيونات500 مل

الجدول 1: كواشف تركيبة العزل النووي العازل.

الباركودالتمهيديتسلسل التمهيدي (5'-3')تسلسل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
ها2R: 3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT94 درجة مئوية5 دقائق
94 درجة مئوية30 ثانية40 دورة
56 درجة مئوية30 ثانية
F: 2FATGCGATACTTGGTGTGAAT72 درجة مئوية45 ثانية
72 درجة مئوية10 دقائق

الجدول 2: بادئات الباركود الحمض النووي وظروف تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

العيناتاستخراج الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر)OD260 / OD280
أ 11241.84
أ 21841.81
أ س-31641.82

الجدول 3: حشيشة الملاك (أوليف.) استخرج Diels جودة الحمض النووي.

العيناتطول التسلسل المحاذاة (bp)طول تسلسل الربط (bp)GC (٪)NCBI: النسبة المئوية للانفجار (٪)GPGD: النسبة المئوية لتحديد الأنواع (٪)
أ 1500 نقطة أساس229 نقطة أساس55.50%100%100%
أ 2504 نقطة أساس229 نقطة أساس55.50%100%100%
أ س-3499 نقطة أساس229 نقطة أساس55.50%100%100%

الجدول 4: مقارنة قاعدة بيانات نتائج التسلسل.

المناقشة

تقنية التحديد الجزيئي أسهل في التعلم والإتقان من طرق تحديد الهوية التقليدية. يتغلب على قيود تحديد الأعشاب الطبية التقليدية ، حيث لا يتأثر بمرحلة نمو النبات ولا يعتمد على الحكم الذاتي أو تراكم الخبرات المتخصصة35. يتم الخلط بين الأنواع الأخرى و A. sinensis بسبب مورفولوجيتها وأجزائها الطبية المتشابهة ، ولكن باستخدام تشفير الحمض النووي الشريطي ، يمكن تحديدها بشكل نهائي36.

تنطوي الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول على العديد من الاعتبارات الحاسمة. أولا ، يعد تجنب التلوث عند التعامل مع الأعشاب واستخراج الحمض النووي أمرا ضروريا لمنع الحمض النووي أو الشوائب الغريبة من المساس بالنتائج. يعد التنظيف السليم للعينات ضروريا لإزالة الملوثات الخارجية ، بينما يعزز السحق الشامل استخراج الحمض النووي عن طريق زيادة مساحة السطح لتفاعل الكاشف. من المهم أيضا استخدام كمية مناسبة من العينة لضمان الاختلاط الفعال مع الكواشف ، مما يسمح بتحلل الخلايا وإطلاق الحمض النووي بشكل أفضل. أخيرا ، يعد التحكم في وقت الاستحمام المائي أمرا بالغ الأهمية ، حيث يمكن أن يؤدي التسخين المفرط إلى تدهور الحمض النووي ، مما يؤثر على جودة الحمض النووي المستخرج. تضمن هذه الخطوات معا الاستخراج الناجح للحمض النووي عالي الجودة لتحليله.

تحتوي النباتات الطبية على السكريات والبوليفينول التي تؤثر على استخراج الحمض النووي وتضخيمه. يقلل استخدام عازل العزل النووي من تأثير هذه المواد ويتيح تحلل النوى ، مما يؤدي إلى استخراج أفضل ل gDNA عالي النقاء28،29،30. حاليا ، هناك ثلاث طرق أساسية لاستخراج الحمض النووي: طريقة عمود الطرد المركزي ، وطريقة CTAB ، وطريقة SDS. ومع ذلك ، اختارت هذه الدراسة طريقة عمود الطرد المركزي للتجارب نظرا لاستقرارها وبساطتها وكفاءتها وقدرتها على استخراج تركيزات عالية من الحمضالنووي 37 ، ويمكن أن يساعد تسخين المخزن المؤقت للشطف في التخلص من الحمض النووي بجودة أفضل. هنا ، اختارت هذه الدراسة بادئات خاصة ب ITS217،38 ، يعمل تسلسل ITS2 القصير كعلامة تسلسل تصنيفي فعالة مقارنة بالبادئاتالأخرى 39 ، والتي لها تباين كبير بين الأنواع ومجموعة واسعة من التعريفات. السبب المحتمل لفشل التضخيم هو تدهور الحمض النووي في بعض العينات. الاحتمال الآخر هو أن زوج البادئات العالمية ITS2 المستخدم قد لا يعمل مع أنواع معينة أو باستخدام مجموعة بديلة من الاشعال العالمية40. تم تحديد نتيجة BLAST باستخدام أعلى نسبة مئوية من درجات الهوية وأقل قيمة إلكترونية. تم اعتبار تحديد الأنواع ناجحا عندما تضمنت أعلى نسبة مئوية قصوى للهوية نوعا واحدا وسجلت >99٪ 40،41 ، للدرجة ≤99٪ ، تحقق من جودة ملف التسلسل أو ما إذا كان منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ملوثا.

باختصار ، يجب أن يلعب الترميز الشريطي للحمض النووي دورا رئيسيا في مراقبة جودة الأدوية العشبية التقليدية وتجارة الأعشاب الدولية. تقدم هذه الورقة بعض الأفكار حول استخراج الحمض النووي للنبات ودليل مفصل حول استخدام تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي لتحديد النباتات الطبية. يسلط الضوء على النقاط الرئيسية التي يجب ملاحظتها أثناء العملية التجريبية. وبالتالي ، توفر هذه الورقة مراجع لتحديد الأعشاب الأساسية وتساعد المزيد من الأشخاص على إتقان التكنولوجيا بسرعة. ومع ذلك ، في الحالات الخاصة التي تكون فيها كفاءة تحديد الباركود أحادي الموضع غير كافية ، يعتمد ذلك على المكتبة المرجعية. سيكون إنشاء مكتبة مرجعية ذات تغطية عالية للأنواع خطوة رئيسية نحو تحديد الأنواع باستخدام الرموز الشريطية للحمض النووي42 ، وقد اقترح العديد من الباحثين أن تقنية الترميز الشريطي متعدد المواقع يمكن أن تحسن الكفاءة43،44. بالإضافة إلى ذلك ، مع تطور التكنولوجيا الجزيئية ، Zheng et al. تم تطوير تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي مع تقنية تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة والكشف عن RPA-LFD للمصادقة بسرعة على النباتاتالسامة 45 وبعض المجموعات الجاهزة46. تتحسن قاعدة بيانات الباركود للحمض النووي باستمرار ، مما يلعب دورا مهما في تعزيز التعميم والتوحيد القياسي والتدويل لطرق تحديد الأدوية العشبية.

الإفصاحات

ويعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال تقديم مشروع دعم تمويل بدء البحث العلمي للشخص الموهوب لجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (030040015).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة استخراج الحمض النووي الجيني النباتي السريع CTABشنغهاي Huiling Biotechnology Co.NG411Mمناسبة للاستخراج السريع للحمض النووي الجيني عالي الجودة من أنسجة مختلفة من مجموعة واسعة من النباتات
DL5000 علامة الحمض النووينانجينغ فازيم التكنولوجيا الحيوية المحدودة.MD102-02منتج جاهز للاستخدام ، خذ كمية مناسبة من هذا المنتج مباشرة للرحلان الكهربائي عند تشغيل الجل.
الرحلان الكهربائيبكين Liuyi التكنولوجيا الحيوية المحدودةDYY-6Cاعتماد تصميم شاشة تعمل باللمس ، يمكن عرض ضبط الجهد ، ضبط التيار في نفس الوقت ، الإخراج المتوازي
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكBeijingpsaitongBiotechnologyCo.، LtdE70015-100Gكواشف صياغة العزل النووي العازلة.
Goldview جل الحمض النووي صبغة (10،000 مرة;)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co.، Ltd10201ES03عند استخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز للكشف عن الحمض النووي ، فإنه يرتبط بالحمض النووي وينتج إشارة فلورية قوية.
جهاز طرد مركزي منضدية عالي السرعةمنطقة التنمية الصناعية عالية التقنية Changsha شركة Xiangyi للطرد المركزي Instrument Co.H1650لفصل العينات بسرعة وكفاءة ، يوفر جهاز الطرد المركزي المدمج وخفيف الوزن هذا أمانا موثوقا
به طاحونة مناديل عالية الإنتاجيةShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48أداة اهتزاز عالية التردد لطحن العينات
http://www.gpgenome.com/معهد المواد الطبية الصينية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبيةالصينية -قاعدة بيانات HerbGenomics تتضمن تسلسل الجينوم ومجموعات الجينات وجينومات العضيات وبيانات الجينوم منخفضة التغطية وتسلسل الباركود للحمض النووي.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/المكتبة الوطنية الأميركية للطب-المركز الوطني للتكنولوجيا الحيوية تعمل المعلومات على تطوير العلوم والصحة من خلال توفير الوصول إلى المعلومات الطبية الحيوية والجينية.
شركة Kylin-BellHaimen Qilinbel لتصنيع الأدواتVORTEX-5خلط سريع على شكل دوامة عالية السرعة ، سرعة الخلط ، التوحيد ، الدقة LifeTouch
Hangzhou BORI Technology Co.TC-96 / G / H (b) Bاعتماد تقنية التبريد الكهروحرارية المتقدمة وتقنية TAS التي تم إنشاؤها حديثا لتعزيز أدائها
العام نظام تحليل صور الهلام متعدد الوظائفمركز التشغيل الجنوبي الغربي لشركة Shanghai Tianneng Life Science Co.يقوم Tanon-Mini Space 2000بإجراء تجارب تضخيم الجينات السريعة مع وظيفة التدرج لرسم خرائط ظروف التضخيم ونطاق درجة حرارة تدرج يصل إلى 30 درجة ؛ C
NaClBeijing Solarbio Science & التكنولوجيا المحدودةS8210-100كواشف صياغة العزل النووي العازلة.
نانودروب واحدالجينز المحدودةND ONEتحديد عينات الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين في ثوان باستخدام 1-2 فقط & micro; L من عينة
البولي فينيل بيروليدونشنغهاي yuanye Bio-Technology Co.، LtdS30268-500gكواشف صياغة العازلة النووية العازلة.
صانع الثلج ندفةالثلج شنغهاي Zhixin شركة تكنولوجيا الأدوات التجريبيةZX-60Xاعتماد طريقة صنع الثلج بالبثق الدوار ، وسرعة صنع الثلج السريع والكفاءة العالية لإنتاج الثلج
حبات الفولاذ المقاوم للصدأ لخالط الأنسجةBeyotime Biotechnology.F6623معدات لطحن وخلط الأنسجة والعينات الأخرى عن طريق الاهتزاز
عازلة Tris Acetate-EDTABeyotime Biotech IncST716TAE عبارة عن مخزن مؤقت شائع الاستخدام للرحلان الكهربائي للحمض النووي ، ويستخدم بشكل متكرر في الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
تريس - حمض الهيدروكلوريكبكين Solarbio Science & التكنولوجيا المحدودةكواشف صياغة العزلالعازل T8230
غلاية حمام مائيشنغهاي Senxin Experimental Instrument Co.DK-8Dترموستات دقيق وتنظيم درجة الحرارة ، تحكم دقيق وموثوق في درجة الحرارة
بيتا - ميركابتو إيثانولشنغهاي إيون للتكنولوجيا الكيميائية المحدودة.R054186-100 مل   ؛  كواشف تركيبة العزل النووي العازلة.
شركة النووي .

المراجع

  1. Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. Chin Med. 11, 37(2016).
  2. Han, J., et al. An authenticity survey of herbal medicines from markets in China using DNA barcoding. Sci Rep. 6, 18723(2016).
  3. Zhang, W., et al. Integration of high-throughput omics technologies in medicinal plant research: The new era of natural drug discovery. Front Plant Sci. 14, 1073848(2023).
  4. Ji, C., et al. Determination of the authenticity and origin of panax notoginseng: A review. J AOAC Int. 105 (6), 1708-1718 (2022).
  5. Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes. Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).
  6. Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).
  7. Xiong, Y., et al. Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges. Phytomedicine. 103, 154237(2022).
  8. Virk, J. K., Gupta, V., Kumar, S., Singh, R., Bansal, P. Ashtawarga plants - suffering a triple standardization syndrome. J Tradit Complement Med. 7 (4), 392-399 (2017).
  9. An, Y. L., Wei, W. L., Guo, D. A. Application of analytical technologies in the discrimination and authentication of herbs from fritillaria: A review. Crit Rev Anal Chem. 54 (6), 1775-1796 (2024).
  10. Li, M., Cao, H., But, P. P. H., Shaw, P. C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. J Systemat Evolut. 49 (3), 271-283 (2011).
  11. Khan, A., et al. Herbal spices as food and medicine: Microscopic authentication of commercial herbal spices. Plants (Basel). 13 (8), 1067(2024).
  12. Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods. Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).
  13. Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., Yoga Latha, L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8 (1), 1-10 (2011).
  14. Wei, Y., et al. Identification techniques and detection methods of edible fungi species. Food Chem. 374, 131803(2022).
  15. Mehle, N., Trdan, S. Traditional and modern methods for the identification of thrips (thysanoptera) species. J Pest Sci. 85 (2), 179-190 (2012).
  16. Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., Dewaard, J. R. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  17. Chen, S., et al. Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 5 (1), e8613(2010).
  18. Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).
  19. Raskoti, B. B., Ale, R. DNA barcoding of medicinal orchids in asia. Sci Rep. 11 (1), 23651(2021).
  20. Chen, S., et al. DNA barcoding in herbal medicine: Retrospective and prospective. J Pharm Anal. 13 (5), 431-441 (2023).
  21. Pei, Y., et al. Whole-genome sequencing in medicinal plants: Current progress and prospect. Sci China Life Sci. 67 (2), 258-273 (2024).
  22. Zhu, S., Liu, Q., Qiu, S., Dai, J., Gao, X. DNA barcoding: An efficient technology to authenticate plant species of traditional chinese medicine and recent advances. Chin Med. 17 (1), 112(2022).
  23. Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials. J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).
  24. Ajmal Ali, M., et al. The changing epitome of species identification - DNA barcoding. Saudi J Biol Sci. 21 (3), 204-231 (2014).
  25. Peng, H., Chen, G., Ou, L. L., Luo, M., Zhang, C. Development of a new efficient scar marker for authentication of Angelica sinensis, an important traditional Chinese medicine. Scienceasia. 47 (6), 751-757 (2021).
  26. He, Y., et al. Authentication of Angelica anomala avé-lall cultivars through DNA barcodes. Mitochondrial DNA. 23 (2), 100-105 (2012).
  27. Yuan, Q. J., et al. Identification of species and materia medica within Angelica l. (umbelliferae) based on phylogeny inferred from DNA barcodes. Mol Ecol Resour. 15 (2), 358-371 (2015).
  28. Xie, P. J., Ke, Y. T., Kuo, L. Y. Modified ctab protocols for high-molecular-weight DNA extractions from ferns. Appl Plant Sci. 11 (3), e11526(2023).
  29. Stefanova, P., Taseva, M., Georgieva, T., Gotcheva, V., Angelov, A. A modified ctab method for DNA extraction from soybean and meat products. Biotech Biotechnol Equipment. 27 (3), 3803-3810 (2013).
  30. Li, Z., Parris, S., Saski, C. A. A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies. Plant Meth. 16, 38(2020).
  31. Keller, A., et al. 5.8s-28s rrna interaction and hmm-based its2 annotation. Gene. 430 (1-2), 50-57 (2009).
  32. Morgulis, A., et al. Database indexing for production megablast searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
  33. Liao, B., et al. Global pharmacopoeia genome database is an integrated and mineable genomic database for traditional medicines derived from eight international pharmacopoeias. Sci China Life Sci. 65 (4), 809-817 (2022).
  34. Ghahramanlu, A., Rezaei, M., Heidari, P., Balandari, A. Species survey of iranian barberry genotypes using ITS2 sequences and basic local alignment search tools. Erwerbs-Obstbau. 65, 2491-2499 (2023).
  35. Han, K., Wang, M., Zhang, L., Wang, C. Application of molecular methods in the identification of ingredients in Chinese herbal medicines. Molecules. 23 (10), 2728(2018).
  36. Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., Chen, S. A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix (danggui) and its products. Sci Rep. 6, 34940(2016).
  37. Chen, R., et al. DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines. Sci Rep. 2, 958(2012).
  38. Hou, D. Y., et al. Molecular identification of corni fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences. Chin J Nat Med. 11 (2), 121-127 (2013).
  39. Han, J., et al. The short ITS2 sequence serves as an efficient taxonomic sequence tag in comparison with the full-length its. Biomed Res Int. 2013, 741476(2013).
  40. Trujillo-Argueta, S., Del Castillo, R. F., Velasco-Murguía, A. Testing the effectiveness of rbcla DNA-barcoding for species discrimination in tropical montane cloud forest vascular plants (oaxaca, mexico) using blast, genetic distance, and tree-based methods. PeerJ. 10, e13771(2022).
  41. Marizzi, C., et al. DNA barcoding brooklyn (new york): A first assessment of biodiversity in marine park by citizen scientists. PLoS One. 13 (7), e0199015(2018).
  42. Antil, S., et al. DNA barcoding, an effective tool for species identification: A review. Mol Biol Rep. 50 (1), 761-775 (2023).
  43. Pang, X., et al. Utility of the trnh-psba intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes: A meta-analysis. PLoS One. 7 (11), e48833(2012).
  44. Tripathi, A. M., et al. The internal transcribed spacer (its) region and trnh-psba [corrected] are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 8 (2), e57934(2013).
  45. Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection. Engineering. 7 (1), 14-16 (2021).
  46. Jiang, C., et al. Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants. Biomed Res Int. 2014, 809037(2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA ITS2 BLAST

مقالات ذات صلة