مقالة منهجية

نهج لبناء مجتمعات الأغشية الحيوية متعددة الأنواع من تربة الجذور

2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66926

⸱

مايو 24, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Provincial Key Lab for Solid Organic Waste Utilization, Key lab of organic-based fertilizers of China, Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Wastes, Educational Ministry Engineering Center of Resource-saving fertilizers, Nanjing Agricultural University, 2National Key Laboratory of Agricultural Microbiology and College of Resources and Environment, Huazhong Agricultural University

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم إجراء سريع وموحد لإنشاء مجتمعات الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التآزرية من مختلف أنواع تربة الجذور هنا. إنه بروتوكول فريد مصمم لسبر ومحاكاة ميكروبيوتا التربة الجذرية المعقدة.

الملخص

الأغشية الحيوية متعددة الأنواع هي نمط حياة طبيعي ومهيمن للبكتيريا في الطبيعة ، بما في ذلك في تربة الجذور ، على الرغم من أن الفهم الحالي لها محدود. هنا ، نقدم نهجا لإنشاء مجتمعات بيوفيلم تآزرية متعددة الأنواع بسرعة. الخطوة الأولى هي استخراج الخلايا من تربة الجذور باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي. بعد ذلك ، يتم تلقيح خلايا التربة هذه في وسط الاستزراع لتشكيل غشاء حيوي حبيبي. بعد 36 ساعة من الحضانة ، يتم تحديد التركيب البكتيري للغشاء الحيوي والمحلول الموجود تحته باستخدام طريقة تسلسل amplicon الجيني 16S rRNA. وفي الوقت نفسه ، يتم إجراء عزل بكتيري عالي الإنتاجية من الغشاء الحيوي للحبيبات باستخدام طريقة التخفيف الحد. بعد ذلك ، يتم اختيار أفضل 5 أصناف بكتيرية بأعلى وفرة في بيانات تسلسل amplicon الجيني 16S rRNA (عينات الأغشية الحيوية الحبيبية) لاستخدامها مرة أخرى في بناء مجتمعات الأغشية الحيوية متعددة الأنواع. تم إنشاء جميع مجموعات الأصناف البكتيرية ال 5 بسرعة باستخدام صفيحة من 24 بئرا ، تم اختيارها لأقوى قدرة على تكوين الأغشية الحيوية بواسطة مقايسة تلطيخ البنفسج البلوري ، وتم تحديدها كميا بواسطة qPCR. وأخيرا، تم الحصول على أقوى تجمعات الأغشية الحيوية البكتيرية متعددة الأنواع الاصطناعية من خلال الطرق المذكورة أعلاه. توفر هذه المنهجية إرشادات إعلامية لإجراء البحوث حول الأغشية الحيوية متعددة الأنواع في الجذور وتحديد المجتمعات التمثيلية لدراسة المبادئ التي تحكم التفاعلات بين هذه الأنواع.

المقدمة

تمثل الأغشية الحيوية مجتمعات ميكروبية معقدة إما مثبتة على الأسطح أو مرتبطة بواجهات بينية. هناك اعتراف واسع النطاق بأن غالبية البكتيريا التي تصادف في بيئات مختلفة ، مثل الموائل الطبيعية والبيئات السريرية والسياقات الصناعية ، تدوم داخل مجتمعات الأغشية الحيوية1. في التربة ، يشكل الريزوسفير - الذي يشمل سطح الجذر والمنطقة المجاورة له التي يبلغ سمكها 2 مم - مكانة بيئية مع توافر المغذيات المتزايدة. طورت بكتيريا معينة استراتيجيات لاستغلال هذا المكان المناسب ، وتعزيز انتشار الميكروبات وتعزيز تكوين مجتمعات الأغشية الحيوية في الجذور2.

تعتبر ميكروبات الجذور "الجينوم الثاني" للنباتات3. تشارك الكائنات الحية الدقيقة المعززة لنمو النبات (PGPM) في التعايش المتبادل مع النباتات ، مما يوفر وظائف كبيرة لتعزيز النمو والمكافحة الحيوية4. من ناحية ، يمكن ل PGPM توفير العناصر الغذائية لجذور النباتات ، وتعزيز امتصاص المغذيات ، والدفاع ضد مسببات الأمراض ، وتحلل الملوثات في تربة الجذور5. من ناحية أخرى ، يستخدم PGPM إفرازات جذور النبات كمصدر غذائي للنمو والتطور ، وبالتالي التأثير على تربة الجذور ونظام الجذر من خلال عملية التمثيل الغذائي الخاصة بهم. تجدر الإشارة إلى أن الشرط الأساسي لجميع هذه الوظائف هو الاستعمار الفعال ل PGPM في جذور النبات ، وتشكيل الأغشية الحيويةالمستقرة 6.

يؤثر الأغشية الحيوية للجذمور على عملية تجميع ميكروبات الريزوسفير ، وترتبط الخصائص الزمنية والمكانية لتجميع ميكروب الجذور ارتباطا وثيقا بتفاعل الأغشية الحيويةمتعددة الأنواع 7. إنه بمثابة محور لتفاعلات الميكروبيوم النباتي ، مما يوفر مكانا مستقرا ويمكن التحكم فيه للتفاعل بفعالية. لذلك ، تعد دراسة الأغشية الحيوية للجذور اتجاها مهما لاكتساب نظرة ثاقبة للتفاعل بين النباتات والميكروبات.

ومع ذلك ، لا يوجد حاليا سوى القليل من الأبحاث حول الأغشية الحيوية متعددة الأنواع في الجذور. التعقيد العالي لتكوين الميكروبيوم يجعل من الصعب الإجابة على الأسئلة البيئية الأساسية المحيطة بالمجتمعات الميكروبية الطبيعية8. في عملية التجارب ، يجب مراعاة العديد من الظروف ، مثل نوع التربة ونوع النبات والعدد الكبير من المجتمعات الميكروبية. هناك عوامل مختلفة تحد من البحث في الأغشية الحيوية متعددة الأنواع في الجذور.

لمزيد من التحقيق في مجتمعات الأغشية الحيوية متعددة الأنواع من تربة الجذور ، مثل التفاعلات التآزرية بين الأنواع أو التغذية المتقاطعة للمستقلب8 ، من المستحسن بناء مجتمع ميكروبي اصطناعي مبسط وتمثيلي ومستقر وقابل للتتبع في ظل ظروف المختبر 9,10. هنا ، يجمع بروتوكول موحد بين العديد من أحدث التقنيات الميكروبيولوجية والمعلوماتية الحيوية.

البروتوكول

ينطبق هذا البروتوكول بشكل عام على ميكروبيوتا التربة الجذرية من النباتات المختلفة. هنا ، يتم استخدام الخيار كمثال. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. العزلة البكتيرية

  1. عزل التربة الجذرية
    1. ثقافة الخيار
      1. تطهير بذور الخيار مع 75 ٪ من الإيثانول و 2 ٪ من محلول هيبوكلوريت الصوديوم (NaClO) ، ثم شطفها في الماء المعقم11.
      2. تنبت البذور في ظل ظروف معقمة واختيار تلك التي تصل إلى المرحلة المكونة من ورقتين12. بعد ذلك ، قم بزرع شتلات الخيار المنبثقة باستمرار في أواني تحتوي على 2 كجم من التربة السوداء.
        ملاحظة: يتم استخدام نوعين من التربة السوداء من مواقع مختلفة في شمال شرق الصين لتقليل الأخطاء المنهجية.
    2. إعداد تعليق التربة
      1. تحضير المخزن المؤقت PBS-S باستخدام التركيبة: 6.33 جم من NaH2PO4 · H2O ، 16.5 جم من Na2HPO4 · 7H2O ، 200 ميكرولتر من Silwet L-77 ، و 1 لتر ماء مقطر.
      2. عندما تصل الشتلات إلى المرحلة12 المكونة من أربع أوراق ، اقلب الوعاء واعزل الجذور مع تربة جذرية بسمك 2 مم باستخدام قفازات معقمة.
      3. ضع الجذور في 30 مل من المخزن المؤقت PBS-S في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. بعد الهز لمدة 20 دقيقة ، قم بتصفية التعليق من خلال مرشح خلية نايلون 100 ميكرومتر لإزالة الجذور والرواسب الكبيرة.
      4. انقل المرشح إلى أنبوب طرد مركزي آخر سعة 50 مل ، وطرده مركزيا عند 3200 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخزينه مؤقتا عند 4 درجات مئوية.
  2. استخراج الخلايا البكتيرية في التربة الجذرية.
    ملاحظة: تعتمد هذه المنهجية طريقة الطرد المركزي التفاضلي13 ، على الرغم من أن طريقة الطرد المركزي المتدرج الكثافةNycodenz 14 تنطبق أيضا على هذه الخطوة.
    1. قم بتخفيف تعليق التربة بمحلول 0.2٪ Na4P2O7 إلى 500 مل وأجهزة طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق لفصل الكائنات الحية في البداية عن التربة.
    2. أعد تجانس الراسب ، وطرده بنفس السرعة المنخفضة لمدة 60 ثانية ، وكرر العملية ثلاث مرات. اجمع بين المواد الطافية ، وطردها مركزيا عند 12000 × جم لمدة 20 دقيقة ، ثم تخلص من المادة الطافية.
    3. إعادة تعليق الراسب في 50 مل من المخزن المؤقت PBS-S ، مما يشكل تعليق الخلايا البكتيرية في التربة الجذرية.

2. تسلسل وتحديد ميكروبيوتا الأغشية الحيوية للجذمور

  1. الإعداد الإعلامي
    ملاحظة: مرق الصويا التربتيك (TSB) ووسائط الغلوتامات الغليسيرول الضئيلة (MSgg) متوفرة تجاريا. الصيغ الواردة أدناه هي للإشارة فقط.
    1. تحضير وسط مكتب تقييس الاتصالات باستخدام الصيغة التالية: 15 ميكروغرام/مل تريبتون، 5 ميكروغرام/مل ببتون الصويا، 5 ميكروغرام/مل كلوريد الصوديوم، الرقم الهيدروجيني = 7.
    2. تحضير وسط MSgg باستخدام الصيغة التالية: 5 mM KH2PO4 ، 100 mM 3- (N-morpholino) حمض البروبان السلفونيك (MOPS) ، 2 mM MgCl2 ، 700 μM CaCl2 ، 50 μM MnCl2 ، 50 μM FeCl3 ، 1 μM ZnCl2 ، 2 μM الثيامين ، 0.5٪ الجلسرين ، 0.5٪ الغلوتامات ، 50 ميكروغرام / مل التربتوفان ، 50 ميكروغرام / مل فينيل ألانين ، الرقم الهيدروجيني = 7.
    3. لإعداد وسائط TSB-MSgg، امزج وسائط TSB مع وسائط MSgg بنسبة 1:1 (v/v)15.
  2. زراعة الأغشية الحيوية الحبيبية
    1. احتضان معلق الخلية في وسط TSB عند 30 درجة مئوية طوال الليل (عادة 12 ساعة) لتنشيط البكتيريا.
    2. ضع مرشحات خلايا النايلون 100 ميكرومتر على ألواح 24 بئرا. احتضان البكتيريا في وسائط TSB وإعداد ثلاث تكرارات. استزرع الغشاء الحيوي الحبيبي لمدة 36 ساعة عند 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا لم يكن الغشاء الحيوي الحبيبي من الخطوة الأخيرة مزروعا جيدا، فإن الوسط TSB-MSgg هو بديل فعال لوسط مكتب تقييس الاتصالات.
    3. قم بإزالة المرشح الذي يحتوي على الغشاء الحيوي الحبيبي. أضف 2 مل من المخزن المؤقت PBS-S إلى لوحة خلية جديدة مكونة من 24 بئرا ، ضع مرشح 24 بئرا فيه لغسل الغشاء الحيوي ، وإزالة الخلايا الحرة. كرر عملية الغسيل ثلاث مرات.
  3. استخراج الحمض النووي للغشاء الحيوي الحبيبي
    1. استخرج جينوم الأغشية الحيوية باستخدام مجموعة الحمض النووي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  4. تسلسل عالي الإنتاجية
    ملاحظة: يمكن لشركات التكنولوجيا الحيوية المساعدة في إكمال تجارب التسلسل لمعظم المختبرات. إذا كانت هناك حاجة إلى التركيب الميكروبي في المحلول المتبقي ، فقم بتسلسله في هذه الخطوة. تختلف خطوة التسلسل حسب الأدوات. يرجى اتباع تعليمات الشركة المصنعة. الخطوة 2.4.1 هي للإشارة فقط.
    1. تضخيم مناطق V3-V4 لجين 16S rRNA بناء على قاعدة البيانات ذات تسلسلات جينات 16S rRNA كاملة الطول. إنشاء أنواع OTUs وفقا للحد الأدنى لعدد التسلسلات لكل عينة16. تجميع شروح تصنيف الأنواع والحصول على تركيبات المجتمعات من كل عينة.
    2. بناء على بيانات التسلسل ، حدد السلالات الخمس الأولى من حيث وفرتها النسبية.
  5. عزل وثقافة بكتيرية عالية الإنتاجية
    ملاحظة: تم تصميم هذه الخطوة وفقا لأحدث منهجية ميكروبيولوجية ومعلوماتية حيوية17. تتوفر طريقة اللوحة المطلية بالتخفيف للعزل البكتيري هنا ، على الرغم من أنها تستغرق وقتا أطول وأقل استهدافا مقارنة بالتقنيات عالية الإنتاجية.
    1. خلط الأغشية الحيوية المزروعة. استخدم التخفيف المحدد لضمان عدم ظهور نمو البكتيريا في أكثر من 30٪ من الآبار في اللوحة المكونة من 24 بئرا.
      ملاحظة: لتحديد التخفيف الأنسب، قم بإجراء تجارب أولية باستخدام مجموعة واسعة من معدلات التخفيف. يجب ألا يحتوي التخفيف الأمثل على أكثر من اثنين من البكتيريا القابلة للزراعة لكل ملليلتر ، مما يمثل الحضانة البكتيرية في أقل من 30 ٪ من الآبار.
    2. تضخيم جين 16S rRNA للبكتيريا أثناء إضافة ملصقات للآبار والألواح وتسلسلها باستخدام منصة Illumina عالية الإنتاجية17.
    3. إجراء تحليلات المعلوماتية الحيوية باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا للحصول على معلومات النقاء وتصنيف الأنواع لكل مستزرع.
    4. قم بزراعة البكتيريا النقية الخمسة الأولى الوفيرة عن طريق زراعة الخط المستمر واستخدم الجلسرين للحفاظ على البكتيريا عند -80 درجة مئوية.

3. بناء المجتمعات الميكروبية الاصطناعية

  1. إعادة بناء ثقافة الأغشية الحيوية الرقيقة
    ملاحظة: لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى Ren et al.18. تتوافق السلالات الخمس مع 31 تركيبة اصطناعية ، بما في ذلك 5 أنواع مفردة ، و 10 أنواع ، و 10 أنواع ثلاثية ، و 5 أربعة أنواع ، و 1 اتحادات من خمسة أنواع.
    1. احتضان السلالات ال 5 في وسط مكتب تقييس الاتصالات حتى يصل OD600 إلى 1 لتنشيطها.
    2. قم بإعداد العديد من الألواح ذات 24 بئرا باستخدام وسيط TSB وضع مرشحات خلايا نايلون 100 ميكرومتر عليها.
      ملاحظة: إذا لم يكن الغشاء الحيوي من الخطوة الأخيرة مستزرعا جيدا، فإن وسيط TSB-MSgg هو بديل فعال لوسط مكتب تقييس الاتصالات.
    3. احتضان 31 مجموعة من المجتمعات الاصطناعية في الوسط. تأكد من أن عدد تلقيح البكتيريا ثابت في كل بئر. قم بإعداد ثلاثة تكرارات لكل مجموعة.
    4. زراعة الأغشية الحيوية عند 30 درجة مئوية لمدة 36 ساعة.
  2. القياس الكمي للغشاء الحيوي الحبيبي
    1. اتبع نفس الإجراء كما في الخطوة 2.2.3.
    2. انقل الغشاء الحيوي إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 180 ميكرولتر من محلول الكريستال البنفسجي وقم بتلطيخها لمدة 20 دقيقة.
    3. انقل العينة الملطخة إلى صفيحة أخرى مكونة من 24 بئرا تحتوي على 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 96٪ ، وقم بإزالتها لمدة 30 دقيقة ، وقم بقياس OD590.

4. تحديد عدد خلايا الكريات

ملاحظة: لتحديد نسبة كل نوع وعدد الخلايا في الحبيبات والمحلول المتبقي ، من الضروري إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. لمزيد من التفاصيل ، راجع Sun et al.16.

  1. تصميم مواد أولية خاصة بالسلالة للمجتمعات الميكروبية الاصطناعية المختارة.
  2. استخدم Roary لإجراء مقارنات الجينوم ومعرفة جينات النسخة المفردة الخاصة بالسلالة لكل عزلة. تأكد من أن البادئات تستهدف هذه الجينات.
  3. Ligase الشظايا المضخمة إلى بلازميدات PMD19T. قم بإنشاء منحنيات قياسية باستخدام البلازميدات التي تحتوي على الأجزاء المقابلة كقوالب.
  4. اتبع نفس الخطوات المذكورة في الخطوة 2.2.
  5. تحضير مكونات التفاعل على النحو التالي: 7.2 ميكرولتر من H2O ، 10 ميكرولتر من 2x qPCR Master mix ، 0.4 ميكرولتر من 10 ميكرومتر من كل برايمر ، و 2 ميكرولتر قالب DNA.
  6. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في ظل الظروف التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، و 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، متبوعة بقطعة منحنى ذوبان قياسية.
  7. أداء ستة مكررات بيولوجية لكل علاج.

النتائج

باتباع الإجراء المذكور ، لوحظت تدرجات كبيرة في قدرة تكوين الأغشية الحيوية من ميكروبيوتا التربة في جذور الخيار (الشكل 1). أكد تسلسل amplicon الأغشية الحيوية الأنواع الموجودة في الحبيبات (الشكل 2). استنادا إلى رسم الخرائط الحرارية لبيانات التسلسل ، تم اختيار الأنواع البكتيرية الخمسة الأولى التي تكون وفرتها في الحبيبات أكبر من تلك الموجودة في المحلول المتبقي (الشكل 3). هنا ، تم أخذ مجموعة نموذجية من المجتمعات الاصطناعية كمثال. يتصور تلطيخ البنفسج البلوري وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بشكل مباشر الاختلافات في الكتلة الحيوية للحبيبات والوفرة النسبية لكل نوع في المجتمعات. تشير زيادة الكتلة الحيوية للاستزراع المشترك إلى نجاح بناء مجموعات الأغشية الحيوية التآزرية متعددة الأنواع من تربة الجذور (الشكل 4 والشكل 5).

تظهر النتائج أن Bacillus velezensis SQR9 و Acinetobacter baumannii XL-1 و Burkholderia cenocepacia XL-2 يمكن أن تشكل اتحادات تآزرية بارزة ، مع أقوى مجتمع يتكون من جميع الأنواع الثلاثة. ومن المتوقع أن تظهر تآزرا قويا في تكوين الأغشية الحيوية. من الجدير بالذكر أيضا أن XL-1 بمثابة "مكرس". إنه يعزز تكوين الأغشية الحيوية ل XL-2 و SQR9 ، على الرغم من ضعف نموها والحد الأدنى من الوفرة في الاتحادات (الشكل 5). في حين أن عددا من الأغشية الحيوية متعددة الأنواع تمثل نمطا ظاهريا تآزريا ، فإن بعض الأنواع ، مثل Chryseobacterium sp. ، ترتبط دائما ارتباطا سلبيا بالسلالات الأخرى عن طريق تقليل الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية الاصطناعية (الشكل 2). على الرغم من أن هذه الظاهرة لا تتعلق بهدف هذا البروتوكول ، فقد يكون من المفيد إجراء مزيد من التحقيق في المستقبل.

figure-results-1
الشكل 1: تكوين الأغشية الحيوية للمجتمعات التركيبية المختلفة (SynComs). هنا ، العينات في لوحات قياسية من 24 بئرا. يتم التقاط الصور دون أي تكبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التركيب البكتيري في الحبيبات والمحلول. تستند الرسوم البيانية إلى بيانات تسلسل amplicon الجيني 16S rRNA ، المذكورة في خطوة البروتوكول 2.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: خريطة حرارية لقدرة تكوين الأغشية الحيوية في الحبيبات والمحلول. يمثل اللون الأحمر الوفرة في الأغشية الحيوية ، وهي أعلى من المحلول ، ويمثل اللون الأزرق عكس ذلك. أظهر جنس لا فرق لا تظهر. يتم وضع علامة على الأنواع من أعلى 5 وفرة على اليسار. BB: غشاء حيوي أسود. ب.س: الحل الأسود. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: القياس الكمي للكتلة الحيوية للمجتمعات الاصطناعية في الشكل 1. البيانات مأخوذة من القياس الكمي البنفسجي البلوري مع OD = 590 نانومتر. البيانات المقدمة هي متوسط ± SD ، n = 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: أعداد الخلايا والوفرة النسبية للأنواع للمجتمعات الاصطناعية في الشكل 1. البيانات مأخوذة من تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. البيانات المقدمة هي متوسط ± SD ، n = 6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

وفقا للبروتوكول ، يتم بناء سلسلة من مجتمعات الأغشية الحيوية الاصطناعية القوية متعددة الأنواع على أساس الكائنات الحية الدقيقة في تربة الجذور من نباتات مختلفة. باستخدام تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، يتم فك تشفير تكوين كل مجتمع بوضوح. تشير الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية إلى قوة تفاعلاتها الأيضية المحتملة ، على الرغم من أنه لا يمكن الكشف عن الخصائص والآليات المختلفة وراء التعاون هنا19. ونظرا لحجم المجتمعات الميكروبية الطبيعية وتعقيدها، تمثل المجتمعات الاصطناعية (SynComs) نظاما نموذجيا للتغلب على العقباتالقائمة14. يسلط هذا البروتوكول الضوء على المنهجية المنهجية والأساسية لبناء مجتمعات الأغشية الحيوية الاصطناعية من ميكروبيوتا التربة الجذرية المعقدة.

يتضح من الجزء الأخير أن SQR9 و XL-1 و XL-2 تظهر إمكانات قوية للاستعمار المستقر في الغلاف الجذري الفعلي. يمكن للباحثين البدء في التحقيق في العلاقات الأيضية وآليات الاستعمار المشترك بناء على هذه السلالات. يمكن أيضا الوصول إلى الأبحاث اللاحقة حول اللقاحات الميكروبية للخيار بعد ذلك.

على الرغم من المزايا المذكورة ، من المهم عدم التغاضي عن عيوب البروتوكول. بسبب الاختلافات بين الاستزراع المختبري والظروف في الموقع ، قد لا تمثل نتائج كل مجتمع اصطناعي بدقة الجراثيم في تربة الجذور الحقيقية20. التأكيد من خلال مزيد من التلقيح الجذور ضروري. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استنساخ هذه النتائج ضعيف نسبيا. قد تكون أنواع الأغشية الحيوية الحبيبية في المختبر قد خضعت لطفرات على مدى أجيال عديدة مقارنة بالأنواع البرية في التربة ، مما أدى إلى بعض الأخطاء التي لا يمكن السيطرة عليها.

هناك عدة بدائل لخطوات معينة في البروتوكول. على سبيل المثال ، في الخطوة 1.2 ، تعد طريقة الطرد المركزي المتدرج الكثافة Nycodenz أكثر كفاءة نسبيا لجمع عينات خلايا التربة13. بالإضافة إلى ذلك ، في الخطوة 2.4 ، فإن أحدث زراعة عالية الإنتاجية وتحديد البكتيريا تزيد بشكل كبير من الكفاءة التجريبية ، وإن كان ذلك بتكلفة أعلى. لذلك ، تظل طريقة اللوحة التقليدية المطلية بالتخفيف مناسبة لاختيار عدد قليل من الأنواع. أخيرا ، في الخطوة 3.2 ، يمكن تقييم الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية المزروعة عن طريق تلطيخ الكريستال البنفسجي ووزنها مباشرة على ميزان تحليلي.

يمتد هذا البروتوكول إلى ما هو أبعد من مجرد إنشاء مواد تجريبية أساسية للبحوث الميكروبية والبيئية. إن تحديد أقوى مجتمعات الأغشية الحيوية البكتيرية متعددة الأنواع الاصطناعية هو مجرد خطوة أولى في تفكيك النظام البيئي المفتوح والمعقد للجذور. من خلال التركيز على الأنواع الأساسية من SynComs ، يمكن للباحثين اكتساب نظرة ثاقبة للحالات الحقيقية في الموقع بطريقة أكثر استهدافا وسرعة. قد يقدم هذا النهج أيضا منظورا جديدا لاستكشاف الأغشية الحيوية على نطاق أوسع ، مثل مجاميع التربة في الجذور ، وللإدارة الدقيقة للمجتمعات الميكروبية في الجذور من أجل نمو النبات وصحته21.

والأهم من ذلك ، أن هذه المنهجية ستلقي الضوء على مزيد من البحث في التفاعلات بين الأنواع التي تحكم تجميع وديناميكيات ميكروبيوتا التربة في الجذور. على سبيل المثال ، عند التعامل مع مجتمع جذري معقد ، غالبا ما يتم الجمع بين الطرق التحليلية الأخرى مثل تحليل شبكة الحدوث المشترك أو النمذجة الأيضية على نطاق الجينوم15 مع هذه الخطوات الأساسية لبناء مجتمع بيوفيلم تمثيلي بشكل مصطنع. وهذا يشمل اعتبارات العلاقات بين الأنواع.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (42307173 و 42107328) والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (2022YFD1500202 و 2022YFF1001800). صمم P.W، Z.X الدراسة. قام كل من P.W و B.X و Z.C و JX و NZ بتحليل البيانات وإنشاء الأرقام. كتب P.W المسودة الأولى للمخطوطة. قام كل من Z.X. و R.Z. و Q.S. بمراجعة المخطوطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2٪ Na4P2O7 حلSinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd.20041418تستخدم لتخفيف تعليق التربة.
100 مو ؛ م النايلون الخلية تصفيةسانغون التكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةF613463-0001تستخدم لتصفية محلول الثقافة وفصل الأغشية الحيوية للبليل.
2 ٪ محلول NaClOSinopharm الكاشف الكيميائي المحدودةL03336903تستخدم لتعقيم البذور.
24 بئر لوحةميرك وشركاه ، Inc.PSRP010تستخدم للزراعة الميكروبية وفصل الأغشية الحيوية للبيليكل.
3- (N-morpholino) حمض البروبان سلفونيك (MOPS)Bioolook للأبحاث العلمية2360010خاص يستخدم لإعداد وسائط MSgg.
50 مل أنبوب الطرد المركزيبكين Su-bio Biotech المحدودة62.547.254أنابيب الطرد المركزي ذات الحجم المناسب لبروتوكولنا.
75٪ C2< / sub>H5< / sub>OH حلSinopharm Chemical Reagents Co.، Ltd.801769680تستخدم لتعقيم البذور.
Acinetobacter baumannii < / em>XL-1جامعة نانجينغ الزراعيةN / Aسلالات معزولة من تربة الجذور.
Bacillus velezensis SQR9< / em>جامعة نانجينغ الزراعيةN / Aسلالات معزولة من تربة الجذور.
مجموعة الحمض النووي للبكتيريانانجينغ دينسي التكنولوجيا الحيوية المحدودةD3350020000K04U021يستخدم لاستخراج الحمض النووي البكتيري.
التربة السوداء Iجامعة نانجينغ الزراعيةN / Aتربة سوداء من مقاطعة جيلين.
السوداء IIجامعة نانجينغ الزراعيةN / Aتربة سوداء من مقاطعة هيلونغجيانغ.
Burkholderia cenocepacia< / em> XL-2جامعة نانجينغ الزراعيةغير / أسلالات معزولة من تربة جذورية.
CaCl2< / sub>Xilong Scientific Co.، Ltd.10035048تستخدم لإعداد وسائط MSgg.
الطرد المركزيسانغون التكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةG508009-0001جهاز طرد مركزي عالي السرعة.
ChamQ SYBR qPCR ماستر ميكسVazyme Biotech المحدودةQ311-02يستخدم لتضخيم الحمض النووي في qPCR.
مقعد نظيفسوتشو أنتاي Airtech المحدودةNB026143تستخدم للعملية المعقمة.
حاضنة درجة حرارة ثابتةShangHai CIMO Medical Instrument Co.، LtdGNP-9080BS-figure-materials-1تستخدم للزراعة الميكروبية.
كريستال البنفسجي صبغسانغون التكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA600331تستخدم لتلوين الأغشية الحيوية والقياس الكمي.
بذور الخيارجامعة نانجينغ الزراعيةN / A"Jinchun I" بذور الخيار.
Culturome v 1.0معهد علم الوراثة والبيولوجيا التنموية التابع للأكاديمية الصينية للعلومN / Aيستخدم للزراعة البكتيرية للتربة الجذرية عالية الإنتاجية وتحديد
FeCl3< / sub>Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd10011918تستخدم لإعداد وسائط MSgg.
ثلاجةHefei ميديا ثلاجة المحدودةBCD-556WKPM (Q)تستخدم للحفاظ على السلالة.
الغلوتاماتBioolook للأبحاث العلميةالخاصة 2180020تستخدم لإعداد وسائط MSgg.
الجلسرينSinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة10010618تستخدم لإعداد وسائط MSgg.
سلة الزراعة المائية6526262626يستخدم متجر Yulv للأثاثفي الزراعة المائية للخيار.
KH2PO4Xilong Scientific Co.، Ltd.10017618تستخدم لإعداد وسائط MSgg.
MgCl2< / sub>Xilong العلمية المحدودة7791186تستخدم لإعداد وسائط MSgg.
MnCl2< / sub>Xilong Scientific Co.، Ltd.10400101تستخدم لإعداد وسائط MSgg.
Msgg المتوسطةشنغهاي Bioesn التكنولوجيا الحيوية المحدودةBES20791KBوسط ثقافة الأغشية الحيوية Pellicle.
Na2HPO4· 7H2OMerck & Co.، Inc.S9390-100Gتستخدم لإعداد وسائط TSB.
NaCIChinasun المنتجات المتخصصة المحدودةHS0416تستخدم لإعداد وسائط TSB.
NaH2PO4· H2OMerck & Co.، Inc.S9638-25Gتستخدم لإعداد وسائط TSB.
PBS-S عازلةسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةE607008-0001عازلة أساسية للأنسجة الحية.
فينيل ألانينريونRT3486L005يستخدم لتحضير وسائط MSgg.
الماصةبكين Labgic التكنولوجيا المحدودةBS-1000-Tتستخدم لتلقيح السلالة.
PMD19T البلازميدتاكارا التكنولوجيا الطبية الحيوية (بكين) المحدودةD102Aتستخدم لإنشاء منحنيات qPCR القياسية.
وعاءSinopharm الكاشف الكيميائي المحدودةYHHWS2401تستخدم لزراعة تربة الخيار.
التمهيدي ل qPCRSangon Biotech (شنغهاي) المحدودة.غير متاحيستخدم لتضخيم الحمض النووي في qPCR.
الوقت الحقيقي PCR أداةالحرارية فيشر العلمية (الصين) المحدودة4484073يستخدم لإجراء qPCR على الأغشية الحيوية الباليلية المختارة.
RoaryThe Wellcome Trust SangerInstituteN / Aتستخدم لتصميم الاشعال من qPCR
شاكرشنغهاي Zhichu Instrument Co.، LtdZQTY-50Sتستخدم لخلط المحلول والزراعة الميكروبية.
Silwet L-77Cytiva التكنولوجيا الحيوية (هانغتشو) المحدودةSL77080596تستخدم لإعداد وسائط TSB.
الصويا ببتونتشينغداو التكنولوجيا الفائقة الحديقة الصناعية هوب التكنولوجيا الحيوية المحدودةHB8275تستخدم لإعداد وسائط TSB.
مقياس الطيفالضوئي شنغهاي Yidian Analysis Instrument Co.، Ltd.76713100010تستخدم في القياس الكمي للبنفسج الحيوي المكرسي.
المعقمةSinopharm الكاشف الكيميائي المحدودةSW150302يستخدم لغسل الأغشية الحيوية pellicle.
قفازات النتريل المعقمةبكين Labgic التكنولوجيا المحدودة223016852LLZAتستخدم للعمليات التجريبية الأساسية.
قالب الحمض النوويسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةغير متاحيستخدم لتضخيم الحمض النووي في qPCR.
ثيامينBioolook للأبحاث العلمية2180020خاص يستخدم لإعداد وسائط MSgg.
LP0042B TryptoneThermo Fisher Scientificلإعداد وسائط TSB.
التربتوفانBioolook البحوث العلميةالخاصة 2190020تستخدم لإعداد وسائط MSgg.
TSB المتوسطةقوانغدونغ Huankai الميكروبية العلوم والتكنولوجيا المحدودة024048وسط بكتيري واسع الطيف.
TSB-Msgg MeidiumNanjing University AgriculturalN / Aوسيط مختلط لثقافة الأغشية الحيوية مع قابلية تطبيق أوسع.
ZnCl2< / sub>نانجينغ الكاشف الكيميائي المحدودةC0310520123تستخدم لإعداد وسائط MSgg.
التربة في فول المياه يستخدم

المراجع

  1. Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
  2. Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. Anatomy and community structure of the rhizosphere. Rhizosphere. , 11-34 (1990).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).
  5. Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).
  6. Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).
  7. Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).
  8. Sun, X., et al. Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions. ISME J. 16, 774-787 (2021).
  9. Pandhal, J., Noirel, J. Synthetic microbial ecosystems for biotechnology. Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).
  10. Grosskopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).
  11. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  12. Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528, 364-369 (2015).
  13. Bakken, L. R. Separation and purification of bacteria from soil. Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).
  14. Yang, O., et al. Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions. Soil Biol Biochem. 155, 108178(2021).
  15. Ren, D., et al. High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions. Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).
  16. Sun, X., et al. Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities. mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).
  17. Zhang, J., et al. High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota. Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).
  18. Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation. ISME J. 9, 81-89 (2015).
  19. Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066(2024).
  20. Palková, Z. Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature. EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).
  21. Xu, Z., et al. Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes. Curr Opin Microbiol. 72, 102269(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

16S rRNA
نهج لبناء مجتمعات الأغشية الحيوية متعددة الأنواع من تربة الجذور
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.