مقالة منهجية

تحديد الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد من رئتي الفأر مع الببتيد: رباعيات التوافق النسيجي المعقدة الرئيسية

DOI:

10.3791/66939

⸱

يوليو 19, 2024

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتحديد مجموعات الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد في رئتي الفئران من خلال إثراء الخلايا التائية القائمة على الخرزة المغناطيسية والببتيد: رباعيات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظل تحديد وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد أثناء الصحة والمرض مفتاحا لتحسين فهمنا للفيزيولوجيا المرضية المناعية. تم تطوير التحديات التقنية لتتبع مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد داخل ذخيرة الخلايا التائية الداخلية بشكل كبير من خلال تطوير الببتيد: كواشف رباعي MHC. ترتبط هذه المتعددات القابلة للذوبان ذات العلامات الفلورية لجزيئات MHC من الفئة الأولى أو الفئة الثانية المعقدة إلى حواتم الببتيد المستضدية مباشرة بالخلايا التائية ذات خصوصية مستقبلات الخلايا التائية المقابلة (TCR) ، وبالتالي يمكنها تحديد مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في حالتها الأصلية دون الحاجة إلى استجابة وظيفية ناتجة عن خارج الجسم الحي التحفيز. بالنسبة للمجموعات النادرة للغاية ، يمكن إثراء الخلايا التائية المرتبطة برباعي مغناطيسيا لزيادة حساسية وموثوقية الكشف.

مع تعمق فحص مناعة الخلايا التائية المقيمة في الأنسجة، هناك حاجة ملحة لتحديد الخلايا التائية الخاصة بمولد الضد التي تنتقل إلى الأنسجة غير اللمفاوية وتعيش فيها. في هذا البروتوكول ، نقدم مجموعة مفصلة من التعليمات لعزل وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد الموجودة داخل رئتي الفأر. يتضمن ذلك عزل الخلايا التائية من أنسجة الرئة المهضومة متبوعة بخطوة إثراء مغناطيسي عامة للخلايا التائية وتلطيخ رباعي لتحليل التدفق الخلوي وفرزه. تستخدم الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول تقنيات شائعة وكواشف متاحة بسهولة ، مما يجعلها في متناول أي باحث تقريبا يشارك في علم مناعة الخلايا التائية للفأر ، وهي قابلة للتكيف بشكل كبير مع مجموعة متنوعة من التحليلات النهائية لأي مجموعة خلايا تائية منخفضة التردد خاصة بالمستضد موجودة داخل الرئتين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في قلب جهاز المناعة التكيفي تكمن قدرة الخلية التائية على التعرف على مولد ضد معين والاستجابة له. متى وأين تستجيب الخلية التائية لمستضدها المماثل يحدد توازن العدوى والمناعة الذاتية ، والتوازن والسرطان ، والصحة والمرض1. ويترتب على ذلك أن دراسة الخلايا التائية في سياق معين من المناعة يجب أن تركز على الخلايا ذات الخصوصية لمستضد ذي صلة ذات أهمية. من بين التطورات التكنولوجية التي عززت بشكل كبير القدرة على توصيف مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد ، توجد multimers القابلة للذوبان الموسومة بالفلورسنت (عادة رباعيات) لجزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الفئة الأولى أو الفئة الثانية المعقدة إلى حواجز الببتيد المستضدية ، والمعروفة باسم "الببتيد: رباعي MHC"2،3،4،5. من خلال تمثيل الروابط الطبيعية لمستقبلات مستضد الخلايا التائية (TCRs) ، يوفر الببتيد: رباعي الفئة الأولى والفئة الثانية من MHC وسيلة لتحديد خلايا CD8 + و CD4 + T الخاصة بالمستضد مباشرة ، على التوالي ، ضمن الذخيرة الداخلية للخلايا التائية في الجهاز المناعي دون الحاجة إلى استجابة لتحفيز المستضد في الفحص. تمثل Tetramers نهجا أكثر أناقة لدراسة الخلايا التائية الخاصة بالمستضد من نماذج النقل بالتبني للخلايا التائية المعدلة وراثياTCR 6 ، وقد تم استخدامها بشكل متزايد لتحديد مجموعات الخلايا التائية الأجنبية والذاتية الخاصة بالمستضد في كل من نماذج الفئران التجريبية والأمراض البشرية 4,5.

في حين أن tetramers يمكن بسهولة تحديد المجموعات عالية التردد من الخلايا التائية التي توسعت استجابة لتحفيز المستضد ، فإن استخدامها للخلايا التائية الساذجة أو الخاصة بالمستضد الذاتي أو الذاكرة محدود بسبب الترددات المنخفضة جدا لهذه المجموعات7. قامت مجموعتنا وغيرها بتطوير ونشر استراتيجيات التخصيب المغناطيسي القائمة على رباعي الرباعي التي تزيد من حساسية الكشف لتمكين دراسات مجموعات الخلايا هذه في الأنسجة اللمفاوية للفأر8،9،10،11.

أدى ظهور الخلايا التائية المقيمة في الأنسجة في هذا المجال إلى زيادة التركيز على تطوير طرق جديدة لدراسة الخلايا التائية في الفضاء غير اللمفاوي. مثل العديد من الأسطح المخاطية الأخرى ، تواجه الخلايا التائية في الرئتين مجموعة من المستضدات الذاتية والأجنبية المشتقة من ظهارة المضيف ، والميكروبات المتعايشة والمعدية ، والكيانات البيئية ، بما في ذلك المواد المسببة للحساسية. يوضح التحليل النسخي للخلايا التائية التي يتم حصادها من الأنسجة غير اللمفاوية (NLT) نمطا ظاهريا يشبه الذاكرة يحمل مصيرا ووظيفة فريدة خاصة بالأنسجة ، وغالبا ما يتم توجيهه إلى الاتجار وتوازن الأنسجة12. علاوة على ذلك ، تميل الخلايا التائية للذاكرة المقيمة في الأنسجة (Trms) إلى أن تكون أكثر تقييدا من تلك الموجودة في الدورةالدموية 13. يعد تحديد كيف ولماذا تدفع المستضدات إقامة الخلايا التائية في NLT أمرا بالغ الأهمية لفهم كيفية حماية الجهاز المناعي من العدوى ، والحفاظ على توازن الأنسجة ، وفي بعض الأحيان ، يتحول إلى مناعة ذاتية. ومع ذلك ، يبدو أن هناك استنزاف أكبر بين الخلايا التائية المقيمة في الأنسجة من الرئتين مقارنة ب NLT14 الأخرى. وفقا لذلك ، فإن القدرة على تحديد وتوصيف الخلايا التائية الداخلية للرئة مع خصوصية مستضد معينة محدودة بسبب ندرتها المتأصلة.

من خلال الجمع بين استخدام تقنيات إثراء الخلايا القائمة على الخرزة المغناطيسية والببتيد: تلطيخ رباعي MHC ، نجحنا في اكتشاف الخلايا التائية الموسعة ولكن النادرة الخاصة بالمستضد الذاتي في رئتي الفأر15,16. نقدم هنا وصفا تفصيليا لبروتوكول قمنا بتحسينه لعزل وتوصيف أي مجموعة نادرة من الخلايا التائية الخاصة بمولد الضد موجودة في رئتي الفأر بشكل موثوق (الشكل 1). يتضمن هذا البروتوكول خطوة تلطيخ الأجسام المضادة في الجسم الحي لتمييز الأنسجة المقيمة عن الخلايا التائية الوعائية17 متبوعة بطريقتين مختلفتين لمعالجة أنسجة الرئة لاستيعاب توافر الموارد. ثم يتبع ذلك خطوة عامة للتخصيب المغناطيسي للخلايا التائية ، وتلطيخ رباعي ، وتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تعزيز صلاحية الخلية وتلطيخ رباعي في هذا البروتوكول عن طريق إضافة أمينوجوانيدين ، الذي يمنع سينسيز أكسيد النيتريك المستحث (iNOS) بوساطة موت الخلايا التائيةالناجم عن موت الخلايا المبرمج 18 و Dasatinib الذي يحد من تخفيض TCR19. تستخدم الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول تقنيات شائعة وكواشف متاحة بسهولة ، مما يجعلها في متناول أي باحث تقريبا يشارك في علم مناعة الخلايا التائية للفأر وقابلة للتكيف بدرجة كبيرة لمجموعة متنوعة من التحليلات النهائية. على الرغم من أنه من غير المحتمل العثور على الخلايا التائية الساذجة في الرئتين، فإننا نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون مفيدا بشكل خاص لدراسة الخلايا التائية الخاصة بمولد الضد الذاتي و Trms في الرئتين.

figure-introduction-1
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل البروتوكول. يتم حصاد الرئتين من الفئران وفصلها إلى خلايا مفردة. يتم إثراء العينات لاحقا للخلايا التائية قبل تلطيخها بالببتيد: رباعيات MHC والأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لتحليل التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وتطويرها وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في مستشفى ماساتشوستس العام ، وهو برنامج إدارة معتمد من الجمعية الأمريكية لاعتماد رعاية المختبر (AAALAC). أجريت التجارب على ذكور وإناث الفئران البالغة من العمر 8-12 أسبوعا على خلفية وراثية C57BL / 6 تم تربيتها والحفاظ عليها في منشأة MGH الحيوانية في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.

1. إعداد حلول الأسهم

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت HEPES عن طريق إذابة 10 mM HEPES و 5 mM KCl و 1.8 mM CaCl2 و 150 mM NaCl و 1 mM MgCl2 ، والتكيف مع الرقم الهيدروجيني 7.4.
  2. قم بإعداد محلول مخزون Liberase 10x عن طريق إذابة 700 ميكروغرام / مل من وسط Liberase Thermolysin (TM) (انظر جدول المواد) في محلول الملح المتوازن من Hank مع Ca++ و Mg ++ (انظر جدول المواد).
  3. قم بإعداد محلول مخزون أمينوجوانيدين 10x عن طريق إذابة 100 مللي متر ملح أمينوجوانيدين هيميسلفات (انظر جدول المواد) في محلول الملح المتوازن من هانك مع Ca++ و Mg ++ (انظر جدول المواد).
  4. قم بإعداد وسط الأحماض الأمينية الكاملة من Eagle's Ham (EHAA) عن طريق خلط وسط EHAA (انظر جدول المواد) مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 2 مللي متر L-جلوتامين ، و 55 ميكرومتر 2-ميركابتوإيثانول.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام وسائط الخلايا التائية الشائعة الأخرى ، مثل RPMI أو DMEM.
  5. قم بإعداد المخزن المؤقت للفارز عن طريق خلط 1x PBS مع 2٪ FBS و 0.05٪ أزيد الصوديوم.
  6. قم بإعداد كتلة Fc عن طريق تخفيف الجسم المضاد المنقى المضاد للفأر CD16 / 32 (انظر جدول المواد) عند 1: 100 فولت / فولت في المخزن المؤقت للفرز.
  7. قم بإعداد محلول هضم Liberase TM / DNase بإضافة 100 ميكروغرام / مل Liberase TM و 50 ميكروغرام / مل DNase I (انظر جدول المواد) في وسط RPMI 1640 بدون L-glutamine (انظر جدول المواد).
  8. تحضير خليط الكيتامين/الزيلازين بإضافة 10 ملغم/مل من الكيتامين (انظر جدول المواد) و1 ملغ/مل من الزيلازين (انظر جدول المواد) في محلول ملحي عادي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) (انظر جدول المواد).

2. توليد تعليق خلية واحدة من أنسجة الرئة عن طريق مفكك الأنسجة الآلي

  1. لكل فأر ، قم بإعداد 4 مل من المخزن المؤقت HEPES البارد في أنبوب متخصص لتفكيك الأنسجة (انظر جدول المواد) واحتفظ به على الجليد.
  2. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 150-200 ميكرولتر من خليط الكيتامين / الزيلازين. حقن 1-3 ميكروغرام من الجسم المضاد للفأر CD45 المترافق بالفلوروفور (انظر جدول المواد) المخفف في 100 ميكرولتر محلول ملحي عادي عن طريق الوريد في كل فأر مخدر. القتل الرحيم للفأر بعد 3 دقائق من إعطاء الأجسام المضادة بحقن داخل الصفاق من 500-600 ميكرولتر من خليط الكيتامين / الزيلازين.
  3. استئصال الرئتين ووضعها في أنبوب تفكك الأنسجة الخاص بكل منهما المبرد على الجليد. ضع الأنابيب على جهاز فصل الأنسجة الآلي (انظر جدول المواد) وقم بتشغيل البرنامج الأول (برنامج محدد مسبقا) لأنسجة الرئة.
  4. أضف 500 ميكرولتر من محلول مخزون ليبراز و 500 ميكرولتر من محلول مخزون أمينوجوانيدين إلى كل أنبوب يحتوي على أنسجة الرئة المنفصلة. احتضانها على خلاط البندق لمدة 30 دقيقة على حرارة 37 درجة مئوية.
  5. ضع الأنابيب مرة أخرى على جهاز التفكك وقم بتشغيل البرنامج الثاني (البرنامج المحدد مسبقا) لأنسجة الرئة.
  6. صب المعلق أحادي الخلية من أنبوب مفكك الأنسجة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر (انظر جدول المواد) في أنبوب مخروطي 50 مل. شطف أنبوب مفكك الأنسجة مع 5 مل من EHAA الكامل (أو أي وسط الخلايا التائية المكافئة) وتمرير من خلال مصفاة في أنبوب 50 مل.
  7. قم بإزالة المصفاة وارفع حجم تعليق الخلية إلى 50 مل مع EHAA الكامل. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف ، تاركا وراءه حوالي 100 ميكرولتر من المادة الطافية وحبيبات الخلية.
  8. أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر من محلول Fc Block لرفع الحجم الإجمالي إلى 200 ميكرولتر ودوامة بقوة لإعادة تعليق الحبيبات.

3. البروتوكول البديل: توليد تعليق خلية واحدة من أنسجة الرئة عن طريق التفكك اليدوي

  1. لكل فأر ، قم بإعداد 1 مل من EHAA الكامل في أنبوب microfuge سعة 1.5 مل واحتفظ به على الجليد.
  2. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 150-200 ميكرولتر من خليط الكيتامين / الزيلازين. حقن 1-3 ميكروغرام من الجسم المضاد للفأر CD45 المترافق بالفلوروفور المخفف في 100 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي عن طريق الوريد في كل فأر مخدر. القتل الرحيم للفأر بعد 3 دقائق من إعطاء الأجسام المضادة بحقن داخل الصفاق من 500-600 ميكرولتر من خليط الكيتامين / الزيلازين.
  3. استئصال الرئتين ووضعهما في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 مل مبرد على الجليد.
  4. بمجرد حصاد جميع الرئتين ، انقل كل رئة إلى أنبوب ميكروفوج جديد بدون أي وسائط خلوية.
  5. قطع الرئتين إلى شظايا صغيرة (~ 2-3 قطع مم) باستخدام مقص داخل أنبوب microfuge.
  6. أضف 1 مل من كوكتيل الهضم Liberase TM / DNase I إلى كل أنبوب.
  7. احتضان لمدة 30 دقيقة على 37 درجة مئوية في حمام مائي. أعد العينات إلى الثلج بعد ذلك لمنع الإفراط في الهضم.
  8. صب العينة فوق مصفاة خلية 100 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل. هرس الأنسجة ضد الشبكة مع الطرف المطاطي للمكبس من حقنة معقمة 1 مل.
  9. شطف مصفاة مع العازلة فارز الباردة ، وجمع حجم النهائي من 7 مل في الأنبوب. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف، وترك ما يقرب من 100 ميكرولتر من طافت وبيليه الخلية.
  10. أضف 100 ميكرولتر من محلول Fc Block لرفع الحجم الإجمالي إلى 200 ميكرولتر ودوامة بقوة لإعادة تعليق الحبيبات.

4. إثراء عينة الرئة للخلايا التائية عن طريق إثراء الحبة المغناطيسية

  1. أضف 50 ميكرولتر من ميكروبيدات CD90.2 المضادة للفأر (انظر جدول المواد). دوامة واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتوافق CD90.2 مع الأليل الذي تعبر عنه الخلايا التائية في الفئران C57BL / 6. تحقق من النمط الجيني للأليل إذا تم استخدام سلالات أخرى من الفئران.
  2. في غضون ذلك ، ضع عمود فصل الخلايا المغناطيسية (انظر جدول المواد) على مغناطيس فصل خلية واحد أو أربعة مواضع (انظر جدول المواد). ضع أنبوبا مخروطيا مفتوحا سعة 15 مل أسفل كل عمود لالتقاط التدفق من خلاله. قم بتجهيز العمود ب 3 مل من المخزن المؤقت للفارز البارد ، مما يسمح للعمود بالتصريف عن طريق الجاذبية في الأنبوب المخروطي أدناه.
  3. بمجرد تحضين الخلايا بالميكروبيدات لمدة 10 دقائق ، أضف محلول فارز بارد إلى حجم 1 مل وانقله من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر موضوعة فوق العمود. اجمع تدفق العمود إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل يوضع أسفل العمود.
  4. بمجرد أن يتم تصريف تعليق الخلية تماما عبر العمود عن طريق الجاذبية ، اغسل العمود عن طريق شطف الأنبوب الأصلي ب 3 مل إضافية من المخزن المؤقت للفرز البارد وتطبيقه على العمود من خلال الشبكة ، وبالتالي شطف المصفاة. قم بإزالة المصفاة.
  5. عندما يتم تصريف العينة تماما مرة أخرى في العمود ، ولا يخرج أي تدفق آخر من العمود ، أخرج العمود من المغناطيس وضعه فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 15 mL.
  6. أضف 5 مل من المخزن المؤقت للفارز البارد إلى العمود.
  7. قم على الفور بإخراج الخلايا المرتبطة بالعمود عن طريق دفع مكبس العمود إلى الأعلى بحركة واحدة مستمرة وإجبار المخزن المؤقت للفارز على الخروج من أسفل العمود إلى الأنبوب الجديد.
  8. أجهزة الطرد المركزي العينات المستخلصة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف ، تاركا وراءه حوالي 100 ميكرولتر من المادة الطافية وحبيبات الخلية.
  9. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز البارد لرفع الحجم الإجمالي إلى 200 ميكرولتر ودوامة بقوة لإعادة تعليق الحبيبات.
  10. قم بتحليل عينة التدفق التي تحتوي على جزء الخلية غير المنضم ، إذا رغبت في ذلك.

5. تلطيخ الخلايا التائية الخاصة بالمستضد بالببتيد: رباعيات MHC

  1. أضف 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر Dasatinib (انظر جدول المواد) إلى كل عينة ، دوامة ، واحتضان لمدة 5 دقائق في RT.
  2. أضف الببتيد المترافق PE أو APC: رباعي MHC إلى تركيز نهائي يبلغ 10 نانومتر (أو تركيز محسن تجريبيا لرباعي معين).
  3. دوامة واحتضان في الظلام لمدة 1 ساعة في RT (أو الوقت ودرجة الحرارة الأمثل تجريبيا).

6. تحليل الخلايا التائية التي تحمل علامة رباعي عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. أثناء تلطيخ العينة بالببتيد: رباعي MHC ، قم بإعداد مزيج رئيسي من الأجسام المضادة لتلطيخ العلامات السطحية للخلايا (الجدول 1).
    ملاحظة: تجنب الفلوروفورات التي تتعارض مع الجسم المضاد CD45 الذي يتم إعطاؤه عن طريق الوريد أو رباعي الترامر.
  2. مع بقاء 15 دقيقة في فترة الحضانة لتلطيخ رباعي ، أضف مزيج الجسم المضاد السطحي الرئيسي عند 1: 100 (أو تركيز محسن تجريبيا) لكل عينة.
  3. استمر في الاحتضان في الظلام في RT للفترة المتبقية من فترة الحضانة 1 ساعة.
  4. أضف 50000 حبة من حبات عدد قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد) وأضف المخزن المؤقت للفارز البارد إلى حجم نهائي يبلغ حوالي 5 مل. أجهزة الطرد المركزي العينة الملطخة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية بعناية ، تاركا وراءها حوالي 100 ميكرولتر من المادة الطافية وحبيبات الخلية / الخرز.
  5. أعد تعليق العينة ب 200 ميكرولتر إضافية من المخزن المؤقت للفارز وانقل العينة إلى أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) سعة 5 مل.
  6. تحليل العينة على مقياس التدفق الخلوي. اجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا ، بحد أقصى 2,500,000 حدث إجمالي. تأكد من جمع ما لا يقل عن 20000 حدث خرزة عد. حافظ على معدل الاستحواذ عند أو أقل من 5,000 حدث في الثانية.
  7. احفظ جميع البيانات كملفات FCS.

  

فلوروكرومجسم
بوف 395CD90.2
أزرق المحيط الهادئCD45 (أضيف سابقا عن طريق الحقن الوريدي)
برتقال المحيط الهادئسي دي 8
بريليانت فيوليت 785سي دي 4
فيتكسي دي 3
بيرCP-Cy5.5التفريغ (B220، CD11b، CD11c، F4/80)
بىpMHC tetramer أو علامة النمط الظاهري
بي إي-سي 7علامة النمط الظاهري (مثل CD44 ، PD-1 ، CD69 ، إلخ.)
ايه بي سيpMHC tetramer أو علامة النمط الظاهري
أليكسا فلور 700علامة النمط الظاهري (مثل CD44 ، PD-1 ، CD69 ، إلخ.)
APC-Cy7بقعة حية / ميتة

الجدول 1: مصفوفة تلطيخ العينة. لوحة نموذجية من الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي المترافق بالفلوروفور تستخدم لتحديد وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد.

7. تحليل البيانات

  1. تحليل ملفات بيانات FCS باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي المناسب.
    1. قم بإعداد سلسلة من بوابات التضمين المتتالية لتحديد 1) تشبه الخلايا الليمفاوية ، 2) مفردة ، 3) حية ، 4) خارج الأوعية الدموية ، 5) سلبية التفريغ ، و 6) أحداث CD90.2 الإيجابية التي تكون إما إيجابية CD4 أو CD8 (الشكل 2).
    2. تحديد الخلايا التائية الموجبة للرباعي داخل هذه المجموعات السكانية.
  2. حدد عدد الخلايا الموجبة للرباعي المطلق عن طريق حساب نسبة الخرزات المضافة (50000) إلى عدد الخرزات التي تم جمعها أثناء تشغيل العينة وضرب القيمة في إجمالي عدد الخلايا الموجبة للرباعي التي تم جمعها.
    figure-protocol-1

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 2 استراتيجية البوابة التمثيلية المستخدمة في تحديد الخلايا التائية CD4 + النادرة الخاصة بالمستضد في الرئتين باستخدام الببتيد: رباعيات MHC من الفئة الثانية. يمكن تطبيق نفس العملية على خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد مع الببتيد: رباعيات MHC من الفئة الأولى (البيانات غير معروضة).

نظرا للعدد الكبير من الخلايا غير اللمفاوية في الرئتين ، فإن الكشف الموثوق به عن الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد بواسطة tetramer يتطلب شكلا من أشكال التخصيب المسبق للخلايا التائية ذات الأهمية لتحسين الإشارة إلى الضوضاء. يوضح الشكل 3 فعالية الإثراء المغناطيسي القائم على الأجسام المضادة CD90.2 للخلايا التائية الكلية من أنسجة الرئة الذي وصفناه في هذا البروتوكول. في المتوسط ، نستعيد أكثر من 99٪ من جميع الخلايا التائية CD90.2 + من الرئتين بنقاوة تزيد عن 90٪ من خلال عملية التخصيب هذه. يوضح الشكل 4 تحسين الكشف عن الخلايا التائية CD4 + T النادرة الإيجابية للرباعي الناتجة عن هذا التخصيب مقابل عدم التخصيب أو استراتيجية إثراء الخلايا المباشرة القائمة على tetramer.

يوضح الشكل 5 تحسن وضع العلامات الرباعية للخلايا التائية الخاصة بالمستضد والمعالجة بداساتينيب ، خاصة في المجموعات النادرة.

figure-results-1
الشكل 2: استراتيجية البوابات لتحليل قياس التدفق الخلوي. بوابات التضمين والاستبعاد المتسلسلة المستخدمة لتحديد الخلايا التائية CD4 + T النادرة الخاصة بالمستضد الذاتي والتي تتراكم في الرئتين بعد إصابة الأنسجة الحادة. يمكن التعرف على عدد حبات الخرز مباشرة بناء على مضانها على طول قناة FITC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 3: الإثراء المغناطيسي القائم على الأجسام المضادة CD90.2 لإجمالي الخلايا التائية في الرئتين. يتم عرض مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلي للأجزاء غير المنضمة (اليسرى) والمرتبطة (اليمنى) لعينة الرئة بعد الإخصاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 4: مقارنة بين إستراتيجيات إثراء الخلايا للمساعدة في الكشف عن الخلايا التائية النادرة المتخصصة بمولد الضد في الرئتين. تم تحصين ثلاثة فئران تعبر عن مستضد ذاتي نموذجي في ظهارة الرئة تحت الجلد باستخدام حاتم الببتيد من المستضد الذاتي المستحلب في مساعد فرويند الكامل (CFA). بعد 7 أيام ، تم حصاد رئتي الفأر ودمجهما وتقسيمهما إلى ثلاث عينات متساوية لتلطيخ رباعي بعد عدم تخصيب الخلايا (يسار) ، أو إثراء الخلايا القائمة على الأجسام المضادة CD90.2 (في الوسط) ، أو إثراء الخلايا القائم على رباعي (يمين). تم تحليل العينات بواسطة قياس التدفق الخلوي لما لا يزيد عن 1,500,000 حدث إجمالي (تظهر أحداث CD4 + المسورة). لوحظت أعداد الأحداث الإيجابية للرباعي باللون الأسود ، بينما يشار إلى العدد الإجمالي المحسوب للخلايا التائية الخاصة بالمستضد في عينات الرئة باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 5: علاج داساتينيب يعزز تلطيخ رباعي الأضلاع. تم تحصين الفئران البرية (يسار) أو الفئران التي تعبر عن مستضد ذاتي نموذجي في ظهارة الرئة (يمين) تحت الجلد باستخدام حاتم الببتيد من المستضد الذاتي المستحلب في CFA. تم حصاد الطحال والأعضاء اللمفاوية من الفئران ودمجها وتقسيمها إلى عينتين متساويتين لوضع العلامات مع الببتيد: رباعيات MHC من الفئة الثانية مع أو بدون معالجة داساتينيب المسبقة. يتم تراكب الرسوم البيانية لتلطيخ رباعي الأضلاع ، ومقارنة العينات المعالجة ب (أحمر) وبدون (أزرق) داساتينيب. يشار إلى متوسط شدة التألق لكل عينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استفادت التوصيفات السابقة للخلايا التائية الخاصة بالمستضد من الرئتين من الأعداد القوية للخلايا التائية الخاصة بالمستضد والتي تتوسع بعد حدث فتيلة حاد مثل التحصين داخل الأنف أو العدوى20،21،22. ومع ذلك ، يصعب اكتشاف مجموعات الخلايا التائية النادرة في الرئتين ، مثل الخلايا التائية الخاصة بالمستضد الذاتي أو الخلايا التائية ذات الذاكرة المقيمة في الأنسجة ، دون شكل من أشكال إثراء العينة للخلايا التائية ذات الأهمية15،16،23. لقد حققنا هذا الهدف من خلال الجمع بين تقنيات تفكك أنسجة الرئة الموصوفة سابقا لإنتاج نسبة عالية من الخلايا الليمفاوية القابلة للحياة24,25 مع استراتيجية للتمييز داخل الأوعية الدموية عن الخلايا التائية المتني وعملية إثراء عامة قائمة على الخلايا التائية تليها تلطيخ رباعي17. باستخدام هذا البروتوكول ، أثبتنا القدرة على تحديد وتوصيف الخلايا التائية النادرة المحددة ضد المستضدات الذاتية في الرئة والتي تنشأ استجابة للتحصين المباشر بالببتيد الخارجي أو التنشيط غير المباشر من إطلاق المستضد أثناء تلف الأنسجة15,16. تم وضع العديد من الاعتبارات في تطوير هذا البروتوكول.

لقد وصفنا بروتوكولين مختلفين لمعالجة أنسجة الرئة يعملان بشكل جيد. يتضمن أحدهما استخدام أداة تفكك الأنسجة الآلية ، بينما يعتمد الآخر على عملية يدوية. الأهم من ذلك ، أن كلتا الطريقتين تستخدمان Liberase TM ، وهو مزيج من كولاجيناز I و II والذي يحتوي أيضا على ميتالوبروتياز ثيرموليسين. وقد ثبت أن مزيج الإنزيم هذا يزيد من نشاط الجهاز الهضمي على كوكتيل كولاجيناز واحد وقد ثبت أنه يعمل بشكل جيد مع استعادة الكريات البيض من أنسجة الرئة26.

يتطلب بروتوكول تفكك الأنسجة الآلي تكلفة مقدمة كبيرة للآلة وأنابيب تفكك الأنسجة المتخصصة ، ولكن يمكن غسل الأنابيب وإعادة استخدامها جنبا إلى جنب مع مصافي الخلايا ، والتي يمكن أيضا إعادة استخدامها بشكل عام. لا يتحمل بروتوكول التفكك اليدوي التكلفة الأولية للمعدات المتخصصة ، ولكنه كثيف العمالة ويطيل الحصاد حيث يتم تقطيع كل عينة على حدة. هناك اختلافات أخرى بين البروتوكولات المتعلقة باستخدام aminoguanidine أو DNase I للحد من موت الخلايا وتكتل الخلايا ، لكننا لم نقارن بعناية تأثير هذه المواد المضافة. يجب أن يعتمد قرار استخدام أي من البروتوكولين على الخبرة الشخصية في نوع الدراسة التي يتم إجراؤها بالإضافة إلى توفر أداة تفكك الأنسجة الآلية ، والتي ستمثل العامل الأكبر في التكلفة. في الواقع ، يمكن خلط عناصر البروتوكولين ومطابقتها لتوفير أفضل أداء للاحتياجات المحددة للدراسة.

يستبعد البروتوكول المذكور أعلاه بشكل ملحوظ استخدام تدرج الكثافة لعزل الخلايا الليمفاوية من معلق الخلية الواحدة المحضر من تفكك الأنسجة. لقد وجدنا أن خطوة إثراء الخلايا التائية المغناطيسية اللازمة لتحديد الخلايا التائية النادرة الخاصة بمولد الضد تتجنب هذه الخطوة. ومع ذلك ، في الحالات التي تكون فيها ترددات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد عالية بما يكفي للتخلص من الحاجة إلى خطوة إثراء الخلايا التائية تماما ، يوصى بتدرج الكثافة لأنه سيوفر كمية كبيرة من إثراء الخلايا المستهدفة عن طريق إزالة عدد كبير من الخلايا غير اللمفاوية. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت مستحضرات الرئة أحادية الخلية كبيرة و / أو فوضوية بشكل خاص ، فيمكن استخدام خطوة تدرج الكثافة قبل التخصيب المغناطيسي لإزالة حطام الخلايا الزائد الذي قد يسد الأعمدة لاحقا (الخطوات 4.4-4.7).

اخترنا التخصيب العام لجميع الخلايا التائية بناء على علامة الخلايا التائية CD90 pan T (CD90.2 للأليل المعبر عنه في الفئران C57BL / 6) بدلا من استراتيجية تخصيب الخلايا القائمة على رباعي الرباعي بشكل مباشر. هذا يقدم العديد من المزايا. (1) ينتج عن التخصيب القائم على CD90 أعداد أكبر من الأحداث الخاصة بالمستضد المكتشفة في قياس التدفق الخلوي مقارنة بعينات الإثراء غير المخصبة أو القائمة على رباعي (الشكل 4). يساهم هذا في تقديرات أفضل لترددات الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد دون الحاجة إلى جمع أعداد مفرطة من إجمالي الأحداث (>2,500,000) ، مما يطيل أوقات جمع العينات ويزيد من دقة الإشارة إلى الضوضاء. (2) على عكس التخصيب القائم على رباعي الأضلاع ، يسمح التخصيب القائم على CD90 بتقييم حجرة الخلايا التائية بأكملها في الرئة ، بما في ذلك خلايا CD4 + و CD8 + T ، والخلايا التائية داخل الأوعية مقابل الخلايا التائية خارج الأوعية الدموية ، والمستضد المحدد مقابل المستضد غير المحدد ، كل ذلك في عينة واحدة (الشكل 2). (3) نظرا لأن خطوة التخصيب المستندة إلى CD90 تحدث قبل تلطيخ tetramer ، فإنها تقلل من الوقت قبل تحليل الخلايا التي تحمل علامة tetramer على مقياس التدفق الخلوي ، مما يحد من الخسارة المحتملة للإشارة من انفصال tetramer.

تعتمد عملية تخصيب الخلايا التائية في هذا البروتوكول على الانتقاء الإيجابي باستخدام حبات CD90.2 المغناطيسية ، ولكن يمكن تحقيق نتائج مماثلة من خلال استراتيجيات الاختيار السلبي التي توفرها مجموعات عزل الخلايا التائية CD4 أو CD8 أو عموم الخلايا التائية. نحن نصف استخدام علامة تجارية معينة من الميكروبيدات والأعمدة والمغناطيس ، ولكن يجب أن تعمل أنظمة التخصيب المغناطيسي الأخرى أيضا. مرة أخرى ، يجب أن تستند القرارات إلى الأداء في الدراسة المحددة التي يتم إجراؤها بالإضافة إلى التكاليف الإجمالية ، والتي يمكن أن تكون كبيرة. في تجربتنا مع بروتوكولات التخصيب ، هناك مقايضة عامة بين إنتاجية الخلية المستهدفة ونقاوتها ، ولأغراض الكشف عن أعداد محدودة للغاية من الخلايا التائية الخاصة بالمستضد ، يكون للإنتاج الأسبقية.

في حين أن النتائج التمثيلية تصور التجارب التي تنطوي على خلايا CD4 + T والببتيد: رباعيات MHC من الفئة الثانية ، فإن هذا البروتوكول فعال بنفس القدر بالنسبة للخلايا التائية CD8 + والببتيد: رباعيات MHC من الفئة الأولى. في مثل هذه الحالات ، ينبغي مراعاة الظروف المختلفة المحتملة التي يتطلبها تلطيخ رباعي الدرجة الأولى (التركيز والوقت ودرجة الحرارة). علاوة على ذلك ، لا نرى أي أسباب تحول دون استخدامه لدراسات الخلايا البائية الخاصة بالمستضد مع كواشف مستضد الخلايا البائية المناسبة التي تحمل علامة الفلوروكروم27.

أخيرا ، يتضمن البروتوكول الموصوف هنا إضافة مثبط بروتين كيناز Dasatinib إلى العينة قبل تلطيخ tetramer. يمنع Dasatinib إشارات TCR والاستيعاب الداخلي ، مما يحسن وضع العلامات على رباعي الخلايا التائية مع تقليل موت الخلايا التائية الناجم عن رباعي19. وجدنا فائدة علاج Dasatinib بشكل بارز في الكشف عن السكان الأكثر ندرة في المستضد الذاتي. من المحتمل أن يكون هذا بسبب حقيقة أن الخلايا التائية الخاصة بالمستضد الذاتي تعبر عن تقارب أقل TCR بسبب تأثيرات الاختيار السلبي أثناء التسامح المركزي28،29،30،31.

تم دمج البروتوكول المستخدم هنا بنجاح مع بروتوكولات التلوين داخل الخلايا لتحليل عامل النسخ وتعبير السيتوكين في الخلايا التائية النادرة الخاصة بمولد الضد المقيم في الرئة. لقد نجحنا أيضا في فرز هذه المجموعات النادرة للتحليلات النهائية ، بما في ذلك النسخ أحادي الخلية وتسلسل TCR. يجب أن يفيد الاستخدام والتطوير المستمران لهذا البروتوكول بشكل كبير دراسات المناعة التكيفية في الفيزيولوجيا المرضية للرئة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر L. Kuhn على المساعدة الفنية في معالجة الأنسجة وإنتاج tetramer. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI107020 و P01 AI165072 إلى JM ، T32 AI007512 إلى D.S.S.) ، واتحاد ماساتشوستس حول الاستعداد لمسببات الأمراض (JJM) ، واللجنة التنفيذية للأبحاث في مستشفى ماساتشوستس العام (JM).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مصفاة خلية 100 ممفيشر ساینتفيك22-363-549
10x PBS بدون Ca++< / sup> أو Mg++< / sup>Corning46-013-CM
1x PBS بدون Ca++< / sup> أو Mg++< / sup>Corning21-031-CV
AccuCheck عد الخرزInvitrogenPCB100
ملح أمينوجوانيدين هيميسولفاتسيجما-ألدريتشA7009
CD90.2 ميكروبيدات ، ماوسMiltenyi130-121-278
مغناطيس فصل الخلايا (فاصل MidiMAKS)Miltenyi130-042-302يحمل عمود LS
واحد مغناطيس فصل الخلية (فاصل QuadroMAKS)Miltenyi130-090-976يحمل 4 أعمدة LS
Dasatinibسيجما ألدريتشCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle ' س هام s الأحماض الأمينية المتوسطةسيجما ألدريتشC5572
لطيفMACSMiltenyi130-093-235مفكك الأنسجة الآلي
لطيف أنابيب MACS CMiltenyi130-093-237أنابيب فصل الأنسجة الآلية
محلول الملح المتوازن من هانك مع Ca++< / sup> أو Mg++< / sup>Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
الجسم المضاد CD45 المضاد للأزرق المحيط الهادئ (الاستنساخ: 30-F11) Biolegend103126
أعمدة فصل الخلايا المغناطيسية (أعمدة LS)Miltenyi130-042-401يأتي مع مكبس
منقى مضاد للماوس CD16 / 32 الجسم المضاد (الاستنساخ: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 متوسط بدون L-glutamineCorning15-040 سم
كلوريد الصوديوم 0.9٪ (محلول ملحي عادي)CytivaZ1376
XylazinePivetal NDC466066-750-02

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  3. Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
  4. Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
  5. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  6. Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
  7. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  8. Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
  10. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. (68), e4420(2012).
  12. Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), 9673(2019).
  13. Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
  14. Zheng, M. Z. M., Wakim, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
  15. Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
  16. Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839(2023).
  17. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
  18. Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
  19. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  20. Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
  21. Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
  22. Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
  23. Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
  24. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  25. Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
  26. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
  27. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  28. Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
  29. Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
  30. Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
  31. Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MHC

مقالات ذات صلة