يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد من رئتي الفأر مع الببتيد: رباعيات التوافق النسيجي المعقدة الرئيسية

2.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66939

⸱

يوليو 19, 2024

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

في هذه المقالة

ملخص

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتحديد مجموعات الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد في رئتي الفئران من خلال إثراء الخلايا التائية القائمة على الخرزة المغناطيسية والببتيد: رباعيات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC).

الملخص

يظل تحديد وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد أثناء الصحة والمرض مفتاحا لتحسين فهمنا للفيزيولوجيا المرضية المناعية. تم تطوير التحديات التقنية لتتبع مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد داخل ذخيرة الخلايا التائية الداخلية بشكل كبير من خلال تطوير الببتيد: كواشف رباعي MHC. ترتبط هذه المتعددات القابلة للذوبان ذات العلامات الفلورية لجزيئات MHC من الفئة الأولى أو الفئة الثانية المعقدة إلى حواتم الببتيد المستضدية مباشرة بالخلايا التائية ذات خصوصية مستقبلات الخلايا التائية المقابلة (TCR) ، وبالتالي يمكنها تحديد مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في حالتها الأصلية دون الحاجة إلى استجابة وظيفية ناتجة عن خارج الجسم الحي التحفيز. بالنسبة للمجموعات النادرة للغاية ، يمكن إثراء الخلايا التائية المرتبطة برباعي مغناطيسيا لزيادة حساسية وموثوقية الكشف.

مع تعمق فحص مناعة الخلايا التائية المقيمة في الأنسجة، هناك حاجة ملحة لتحديد الخلايا التائية الخاصة بمولد الضد التي تنتقل إلى الأنسجة غير اللمفاوية وتعيش فيها. في هذا البروتوكول ، نقدم مجموعة مفصلة من التعليمات لعزل وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد الموجودة داخل رئتي الفأر. يتضمن ذلك عزل الخلايا التائية من أنسجة الرئة المهضومة متبوعة بخطوة إثراء مغناطيسي عامة للخلايا التائية وتلطيخ رباعي لتحليل التدفق الخلوي وفرزه. تستخدم الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول تقنيات شائعة وكواشف متاحة بسهولة ، مما يجعلها في متناول أي باحث تقريبا يشارك في علم مناعة الخلايا التائية للفأر ، وهي قابلة للتكيف بشكل كبير مع مجموعة متنوعة من التحليلات النهائية لأي مجموعة خلايا تائية منخفضة التردد خاصة بالمستضد موجودة داخل الرئتين.

المقدمة

في قلب جهاز المناعة التكيفي تكمن قدرة الخلية التائية على التعرف على مولد ضد معين والاستجابة له. متى وأين تستجيب الخلية التائية لمستضدها المماثل يحدد توازن العدوى والمناعة الذاتية ، والتوازن والسرطان ، والصحة والمرض1. ويترتب على ذلك أن دراسة الخلايا التائية في سياق معين من المناعة يجب أن تركز على الخلايا ذات الخصوصية لمستضد ذي صلة ذات أهمية. من بين التطورات التكنولوجية التي عززت بشكل كبير القدرة على توصيف مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد ، توجد multimers القابلة للذوبان الموسومة بالفلورسنت (عادة رباعيات) لجزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الفئة الأولى أو الفئة الثانية المعقدة إلى حواجز الببتيد المستضدية ، والمعروفة باسم "الببتيد: رباعي MHC"2،3،4،5. من خلال تمثيل الروابط الطبيعية لمستقبلات مستضد الخلايا التائية (TCRs) ، يوفر الببتيد: رباعي الفئة الأولى والفئة الثانية من MHC وسيلة لتحديد خلايا CD8 + و CD4 + T الخاصة بالمستضد مباشرة ، على التوالي ، ضمن الذخيرة الداخلية للخلايا التائية في الجهاز المناعي دون الحاجة إلى استجابة لتحفيز المستضد في الفحص. تمثل Tetramers نهجا أكثر أناقة لدراسة الخلايا التائية الخاصة بالمستضد من نماذج النقل بالتبني للخلايا التائية المعدلة وراثياTCR 6 ، وقد تم استخدامها بشكل متزايد لتحديد مجموعات الخلايا التائية الأجنبية والذاتية الخاصة بالمستضد في كل من نماذج الفئران التجريبية والأمراض البشرية 4,5.

في حين أن tetramers يمكن بسهولة تحديد المجموعات عالية التردد من الخلايا التائية التي توسعت استجابة لتحفيز المستضد ، فإن استخدامها للخلايا التائية الساذجة أو الخاصة بالمستضد الذاتي أو الذاكرة محدود بسبب الترددات المنخفضة جدا لهذه المجموعات7. قامت مجموعتنا وغيرها بتطوير ونشر استراتيجيات التخصيب المغناطيسي القائمة على رباعي الرباعي التي تزيد من حساسية الكشف لتمكين دراسات مجموعات الخلايا هذه في الأنسجة اللمفاوية للفأر8،9،10،11.

أدى ظهور الخلايا التائية المقيمة في الأنسجة في هذا المجال إلى زيادة التركيز على تطوير طرق جديدة لدراسة الخلايا التائية في الفضاء غير اللمفاوي. مثل العديد من الأسطح المخاطية الأخرى ، تواجه الخلايا التائية في الرئتين مجموعة من المستضدات الذاتية والأجنبية المشتقة من ظهارة المضيف ، والميكروبات المتعايشة والمعدية ، والكيانات البيئية ، بما في ذلك المواد المسببة للحساسية. يوضح التحليل النسخي للخلايا التائية التي يتم حصادها من الأنسجة غير اللمفاوية (NLT) نمطا ظاهريا يشبه الذاكرة يحمل مصيرا ووظيفة فريدة خاصة بالأنسجة ، وغالبا ما يتم توجيهه إلى الاتجار وتوازن الأنسجة12. علاوة على ذلك ، تميل الخلايا التائية للذاكرة المقيمة في الأنسجة (Trms) إلى أن تكون أكثر تقييدا من تلك الموجودة في الدورةالدموية 13. يعد تحديد كيف ولماذا تدفع المستضدات إقامة الخلايا التائية في NLT أمرا بالغ الأهمية لفهم كيفية حماية الجهاز المناعي من العدوى ، والحفاظ على توازن الأنسجة ، وفي بعض الأحيان ، يتحول إلى مناعة ذاتية. ومع ذلك ، يبدو أن هناك استنزاف أكبر بين الخلايا التائية المقيمة في الأنسجة من الرئتين مقارنة ب NLT14 الأخرى. وفقا لذلك ، فإن القدرة على تحديد وتوصيف الخلايا التائية الداخلية للرئة مع خصوصية مستضد معينة محدودة بسبب ندرتها المتأصلة.

من خلال الجمع بين استخدام تقنيات إثراء الخلايا القائمة على الخرزة المغناطيسية والببتيد: تلطيخ رباعي MHC ، نجحنا في اكتشاف الخلايا التائية الموسعة ولكن النادرة الخاصة بالمستضد الذاتي في رئتي الفأر15,16. نقدم هنا وصفا تفصيليا لبروتوكول قمنا بتحسينه لعزل وتوصيف أي مجموعة نادرة من الخلايا التائية الخاصة بمولد الضد موجودة في رئتي الفأر بشكل موثوق (الشكل 1). يتضمن هذا البروتوكول خطوة تلطيخ الأجسام المضادة في الجسم الحي لتمييز الأنسجة المقيمة عن الخلايا التائية الوعائية17 متبوعة بطريقتين مختلفتين لمعالجة أنسجة الرئة لاستيعاب توافر الموارد. ثم يتبع ذلك خطوة عامة للتخصيب المغناطيسي للخلايا التائية ، وتلطيخ رباعي ، وتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تعزيز صلاحية الخلية وتلطيخ رباعي في هذا البروتوكول عن طريق إضافة أمينوجوانيدين ، الذي يمنع سينسيز أكسيد النيتريك المستحث (iNOS) بوساطة موت الخلايا التائيةالناجم عن موت الخلايا المبرمج 18 و Dasatinib الذي يحد من تخفيض TCR19. تستخدم الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول تقنيات شائعة وكواشف متاحة بسهولة ، مما يجعلها في متناول أي باحث تقريبا يشارك في علم مناعة الخلايا التائية للفأر وقابلة للتكيف بدرجة كبيرة لمجموعة متنوعة من التحليلات النهائية. على الرغم من أنه من غير المحتمل العثور على الخلايا التائية الساذجة في الرئتين، فإننا نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون مفيدا بشكل خاص لدراسة الخلايا التائية الخاصة بمولد الضد الذاتي و Trms في الرئتين.

figure-introduction-1
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل البروتوكول. يتم حصاد الرئتين من الفئران وفصلها إلى خلايا مفردة. يتم إثراء العينات لاحقا للخلايا التائية قبل تلطيخها بالببتيد: رباعيات MHC والأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لتحليل التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وتطويرها وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في مستشفى ماساتشوستس العام ، وهو برنامج إدارة معتمد من الجمعية الأمريكية لاعتماد رعاية المختبر (AAALAC). أجريت التجارب على ذكور وإناث الفئران البالغة من العمر 8-12 أسبوعا على خلفية وراثية C57BL / 6 تم تربيتها والحفاظ عليها في منشأة MGH الحيوانية في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.

1. إعداد حلول الأسهم

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت HEPES عن طريق إذابة 10 mM HEPES و 5 mM KCl و 1.8 mM CaCl2 و 150 mM NaCl و 1 mM MgCl2 ، والتكيف مع الرقم الهيدروجيني 7.4.
  2. قم بإعداد محلول مخزون Liberase 10x عن طريق إذابة 700 ميكروغرام / مل من وسط Liberase Thermolysin (TM) (انظر جدول المواد) في محلول الملح المتوازن من Hank مع Ca++ و Mg ++ (انظر جدول المواد).
  3. قم بإعداد محلول مخزون أمينوجوانيدين 10x عن طريق إذابة 100 مللي متر ملح أمينوجوانيدين هيميسلفات (انظر جدول المواد) في محلول الملح المتوازن من هانك مع Ca++ و Mg ++ (انظر جدول المواد).
  4. قم بإعداد وسط الأحماض الأمينية الكاملة من Eagle's Ham (EHAA) عن طريق خلط وسط EHAA (انظر جدول المواد) مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 2 مللي متر L-جلوتامين ، و 55 ميكرومتر 2-ميركابتوإيثانول.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام وسائط الخلايا التائية الشائعة الأخرى ، مثل RPMI أو DMEM.
  5. قم بإعداد المخزن المؤقت للفارز عن طريق خلط 1x PBS مع 2٪ FBS و 0.05٪ أزيد الصوديوم.
  6. قم بإعداد كتلة Fc عن طريق تخفيف الجسم المضاد المنقى المضاد للفأر CD16 / 32 (انظر جدول المواد) عند 1: 100 فولت / فولت في المخزن المؤقت للفرز.
  7. قم بإعداد محلول هضم Liberase TM / DNase بإضافة 100 ميكروغرام / مل Liberase TM و 50 ميكروغرام / مل DNase I (انظر جدول المواد) في وسط RPMI 1640 بدون L-glutamine (انظر جدول المواد).
  8. تحضير خليط الكيتامين/الزيلازين بإضافة 10 ملغم/مل من الكيتامين (انظر جدول المواد) و1 ملغ/مل من الزيلازين (انظر جدول المواد) في محلول ملحي عادي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) (انظر جدول المواد).

2. توليد تعليق خلية واحدة من أنسجة الرئة عن طريق مفكك الأنسجة الآلي

  1. لكل فأر ، قم بإعداد 4 مل من المخزن المؤقت HEPES البارد في أنبوب متخصص لتفكيك الأنسجة (انظر جدول المواد) واحتفظ به على الجليد.
  2. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 150-200 ميكرولتر من خليط الكيتامين / الزيلازين. حقن 1-3 ميكروغرام من الجسم المضاد للفأر CD45 المترافق بالفلوروفور (انظر جدول المواد) المخفف في 100 ميكرولتر محلول ملحي عادي عن طريق الوريد في كل فأر مخدر. القتل الرحيم للفأر بعد 3 دقائق من إعطاء الأجسام المضادة بحقن داخل الصفاق من 500-600 ميكرولتر من خليط الكيتامين / الزيلازين.
  3. استئصال الرئتين ووضعها في أنبوب تفكك الأنسجة الخاص بكل منهما المبرد على الجليد. ضع الأنابيب على جهاز فصل الأنسجة الآلي (انظر جدول المواد) وقم بتشغيل البرنامج الأول (برنامج محدد مسبقا) لأنسجة الرئة.
  4. أضف 500 ميكرولتر من محلول مخزون ليبراز و 500 ميكرولتر من محلول مخزون أمينوجوانيدين إلى كل أنبوب يحتوي على أنسجة الرئة المنفصلة. احتضانها على خلاط البندق لمدة 30 دقيقة على حرارة 37 درجة مئوية.
  5. ضع الأنابيب مرة أخرى على جهاز التفكك وقم بتشغيل البرنامج الثاني (البرنامج المحدد مسبقا) لأنسجة الرئة.
  6. صب المعلق أحادي الخلية من أنبوب مفكك الأنسجة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر (انظر جدول المواد) في أنبوب مخروطي 50 مل. شطف أنبوب مفكك الأنسجة مع 5 مل من EHAA الكامل (أو أي وسط الخلايا التائية المكافئة) وتمرير من خلال مصفاة في أنبوب 50 مل.
  7. قم بإزالة المصفاة وارفع حجم تعليق الخلية إلى 50 مل مع EHAA الكامل. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف ، تاركا وراءه حوالي 100 ميكرولتر من المادة الطافية وحبيبات الخلية.
  8. أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر من محلول Fc Block لرفع الحجم الإجمالي إلى 200 ميكرولتر ودوامة بقوة لإعادة تعليق الحبيبات.

3. البروتوكول البديل: توليد تعليق خلية واحدة من أنسجة الرئة عن طريق التفكك اليدوي

  1. لكل فأر ، قم بإعداد 1 مل من EHAA الكامل في أنبوب microfuge سعة 1.5 مل واحتفظ به على الجليد.
  2. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 150-200 ميكرولتر من خليط الكيتامين / الزيلازين. حقن 1-3 ميكروغرام من الجسم المضاد للفأر CD45 المترافق بالفلوروفور المخفف في 100 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي عن طريق الوريد في كل فأر مخدر. القتل الرحيم للفأر بعد 3 دقائق من إعطاء الأجسام المضادة بحقن داخل الصفاق من 500-600 ميكرولتر من خليط الكيتامين / الزيلازين.
  3. استئصال الرئتين ووضعهما في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 مل مبرد على الجليد.
  4. بمجرد حصاد جميع الرئتين ، انقل كل رئة إلى أنبوب ميكروفوج جديد بدون أي وسائط خلوية.
  5. قطع الرئتين إلى شظايا صغيرة (~ 2-3 قطع مم) باستخدام مقص داخل أنبوب microfuge.
  6. أضف 1 مل من كوكتيل الهضم Liberase TM / DNase I إلى كل أنبوب.
  7. احتضان لمدة 30 دقيقة على 37 درجة مئوية في حمام مائي. أعد العينات إلى الثلج بعد ذلك لمنع الإفراط في الهضم.
  8. صب العينة فوق مصفاة خلية 100 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل. هرس الأنسجة ضد الشبكة مع الطرف المطاطي للمكبس من حقنة معقمة 1 مل.
  9. شطف مصفاة مع العازلة فارز الباردة ، وجمع حجم النهائي من 7 مل في الأنبوب. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف، وترك ما يقرب من 100 ميكرولتر من طافت وبيليه الخلية.
  10. أضف 100 ميكرولتر من محلول Fc Block لرفع الحجم الإجمالي إلى 200 ميكرولتر ودوامة بقوة لإعادة تعليق الحبيبات.

4. إثراء عينة الرئة للخلايا التائية عن طريق إثراء الحبة المغناطيسية

  1. أضف 50 ميكرولتر من ميكروبيدات CD90.2 المضادة للفأر (انظر جدول المواد). دوامة واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتوافق CD90.2 مع الأليل الذي تعبر عنه الخلايا التائية في الفئران C57BL / 6. تحقق من النمط الجيني للأليل إذا تم استخدام سلالات أخرى من الفئران.
  2. في غضون ذلك ، ضع عمود فصل الخلايا المغناطيسية (انظر جدول المواد) على مغناطيس فصل خلية واحد أو أربعة مواضع (انظر جدول المواد). ضع أنبوبا مخروطيا مفتوحا سعة 15 مل أسفل كل عمود لالتقاط التدفق من خلاله. قم بتجهيز العمود ب 3 مل من المخزن المؤقت للفارز البارد ، مما يسمح للعمود بالتصريف عن طريق الجاذبية في الأنبوب المخروطي أدناه.
  3. بمجرد تحضين الخلايا بالميكروبيدات لمدة 10 دقائق ، أضف محلول فارز بارد إلى حجم 1 مل وانقله من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر موضوعة فوق العمود. اجمع تدفق العمود إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل يوضع أسفل العمود.
  4. بمجرد أن يتم تصريف تعليق الخلية تماما عبر العمود عن طريق الجاذبية ، اغسل العمود عن طريق شطف الأنبوب الأصلي ب 3 مل إضافية من المخزن المؤقت للفرز البارد وتطبيقه على العمود من خلال الشبكة ، وبالتالي شطف المصفاة. قم بإزالة المصفاة.
  5. عندما يتم تصريف العينة تماما مرة أخرى في العمود ، ولا يخرج أي تدفق آخر من العمود ، أخرج العمود من المغناطيس وضعه فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 15 mL.
  6. أضف 5 مل من المخزن المؤقت للفارز البارد إلى العمود.
  7. قم على الفور بإخراج الخلايا المرتبطة بالعمود عن طريق دفع مكبس العمود إلى الأعلى بحركة واحدة مستمرة وإجبار المخزن المؤقت للفارز على الخروج من أسفل العمود إلى الأنبوب الجديد.
  8. أجهزة الطرد المركزي العينات المستخلصة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف ، تاركا وراءه حوالي 100 ميكرولتر من المادة الطافية وحبيبات الخلية.
  9. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز البارد لرفع الحجم الإجمالي إلى 200 ميكرولتر ودوامة بقوة لإعادة تعليق الحبيبات.
  10. قم بتحليل عينة التدفق التي تحتوي على جزء الخلية غير المنضم ، إذا رغبت في ذلك.

5. تلطيخ الخلايا التائية الخاصة بالمستضد بالببتيد: رباعيات MHC

  1. أضف 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر Dasatinib (انظر جدول المواد) إلى كل عينة ، دوامة ، واحتضان لمدة 5 دقائق في RT.
  2. أضف الببتيد المترافق PE أو APC: رباعي MHC إلى تركيز نهائي يبلغ 10 نانومتر (أو تركيز محسن تجريبيا لرباعي معين).
  3. دوامة واحتضان في الظلام لمدة 1 ساعة في RT (أو الوقت ودرجة الحرارة الأمثل تجريبيا).

6. تحليل الخلايا التائية التي تحمل علامة رباعي عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. أثناء تلطيخ العينة بالببتيد: رباعي MHC ، قم بإعداد مزيج رئيسي من الأجسام المضادة لتلطيخ العلامات السطحية للخلايا (الجدول 1).
    ملاحظة: تجنب الفلوروفورات التي تتعارض مع الجسم المضاد CD45 الذي يتم إعطاؤه عن طريق الوريد أو رباعي الترامر.
  2. مع بقاء 15 دقيقة في فترة الحضانة لتلطيخ رباعي ، أضف مزيج الجسم المضاد السطحي الرئيسي عند 1: 100 (أو تركيز محسن تجريبيا) لكل عينة.
  3. استمر في الاحتضان في الظلام في RT للفترة المتبقية من فترة الحضانة 1 ساعة.
  4. أضف 50000 حبة من حبات عدد قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد) وأضف المخزن المؤقت للفارز البارد إلى حجم نهائي يبلغ حوالي 5 مل. أجهزة الطرد المركزي العينة الملطخة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية بعناية ، تاركا وراءها حوالي 100 ميكرولتر من المادة الطافية وحبيبات الخلية / الخرز.
  5. أعد تعليق العينة ب 200 ميكرولتر إضافية من المخزن المؤقت للفارز وانقل العينة إلى أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) سعة 5 مل.
  6. تحليل العينة على مقياس التدفق الخلوي. اجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا ، بحد أقصى 2,500,000 حدث إجمالي. تأكد من جمع ما لا يقل عن 20000 حدث خرزة عد. حافظ على معدل الاستحواذ عند أو أقل من 5,000 حدث في الثانية.
  7. احفظ جميع البيانات كملفات FCS.

  

فلوروكرومجسم
بوف 395CD90.2
أزرق المحيط الهادئCD45 (أضيف سابقا عن طريق الحقن الوريدي)
برتقال المحيط الهادئسي دي 8
بريليانت فيوليت 785سي دي 4
فيتكسي دي 3
بيرCP-Cy5.5التفريغ (B220، CD11b، CD11c، F4/80)
بىpMHC tetramer أو علامة النمط الظاهري
بي إي-سي 7علامة النمط الظاهري (مثل CD44 ، PD-1 ، CD69 ، إلخ.)
ايه بي سيpMHC tetramer أو علامة النمط الظاهري
أليكسا فلور 700علامة النمط الظاهري (مثل CD44 ، PD-1 ، CD69 ، إلخ.)
APC-Cy7بقعة حية / ميتة

الجدول 1: مصفوفة تلطيخ العينة. لوحة نموذجية من الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي المترافق بالفلوروفور تستخدم لتحديد وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد.

7. تحليل البيانات

  1. تحليل ملفات بيانات FCS باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي المناسب.
    1. قم بإعداد سلسلة من بوابات التضمين المتتالية لتحديد 1) تشبه الخلايا الليمفاوية ، 2) مفردة ، 3) حية ، 4) خارج الأوعية الدموية ، 5) سلبية التفريغ ، و 6) أحداث CD90.2 الإيجابية التي تكون إما إيجابية CD4 أو CD8 (الشكل 2).
    2. تحديد الخلايا التائية الموجبة للرباعي داخل هذه المجموعات السكانية.
  2. حدد عدد الخلايا الموجبة للرباعي المطلق عن طريق حساب نسبة الخرزات المضافة (50000) إلى عدد الخرزات التي تم جمعها أثناء تشغيل العينة وضرب القيمة في إجمالي عدد الخلايا الموجبة للرباعي التي تم جمعها.
    figure-protocol-1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 2 استراتيجية البوابة التمثيلية المستخدمة في تحديد الخلايا التائية CD4 + النادرة الخاصة بالمستضد في الرئتين باستخدام الببتيد: رباعيات MHC من الفئة الثانية. يمكن تطبيق نفس العملية على خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد مع الببتيد: رباعيات MHC من الفئة الأولى (البيانات غير معروضة).

نظرا للعدد الكبير من الخلايا غير اللمفاوية في الرئتين ، فإن الكشف الموثوق به عن الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد بواسطة tetramer يتطلب شكلا من أشكال التخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

استفادت التوصيفات السابقة للخلايا التائية الخاصة بالمستضد من الرئتين من الأعداد القوية للخلايا التائية الخاصة بالمستضد والتي تتوسع بعد حدث فتيلة حاد مثل التحصين داخل الأنف أو العدوى20،21،22. ومع ذلك ، يصعب اكتشاف مجموعات الخلايا التائية النادرة في الرئتين ، مثل الخلايا التائية الخاصة بالمستضد الذاتي أو الخلايا التائية ذات الذاكرة المقيمة في الأنسجة ، دون شكل من أشكال إثراء العينة للخلايا التائية ذات الأهمية15

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.

شكر وتقدير

نشكر L. Kuhn على المساعدة الفنية في معالجة الأنسجة وإنتاج tetramer. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI107020 و P01 AI165072 إلى JM ، T32 AI007512 إلى D.S.S.) ، واتحاد ماساتشوستس حول الاستعداد لمسببات الأمراض (JJM) ، واللجنة التنفيذية للأبحاث في مستشفى ماساتشوستس العام (JM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مصفاة خلية 100 ممفيشر ساینتفيك22-363-549
10x PBS بدون Ca++< / sup> أو Mg++< / sup>Corning46-013-CM
1x PBS بدون Ca++< / sup> أو Mg++< / sup>Corning21-031-CV
AccuCheck عد الخرزInvitrogenPCB100
ملح أمينوجوانيدين هيميسولفاتسيجما-ألدريتشA7009
CD90.2 ميكروبيدات ، ماوسMiltenyi130-121-278
مغناطيس فصل الخلايا (فاصل MidiMAKS)Miltenyi130-042-302يحمل عمود LS
واحد مغناطيس فصل الخلية (فاصل QuadroMAKS)Miltenyi130-090-976يحمل 4 أعمدة LS
Dasatinibسيجما ألدريتشCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle ' س هام s الأحماض الأمينية المتوسطةسيجما ألدريتشC5572
لطيفMACSMiltenyi130-093-235مفكك الأنسجة الآلي
لطيف أنابيب MACS CMiltenyi130-093-237أنابيب فصل الأنسجة الآلية
محلول الملح المتوازن من هانك مع Ca++< / sup> أو Mg++< / sup>Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
الجسم المضاد CD45 المضاد للأزرق المحيط الهادئ (الاستنساخ: 30-F11) Biolegend103126
أعمدة فصل الخلايا المغناطيسية (أعمدة LS)Miltenyi130-042-401يأتي مع مكبس
منقى مضاد للماوس CD16 / 32 الجسم المضاد (الاستنساخ: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 متوسط بدون L-glutamineCorning15-040 سم
كلوريد الصوديوم 0.9٪ (محلول ملحي عادي)CytivaZ1376
XylazinePivetal NDC466066-750-02

المراجع

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  3. Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
  4. Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
  5. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  6. Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
  7. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  8. Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
  10. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. (68), e4420(2012).
  12. Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), 9673(2019).
  13. Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
  14. Zheng, M. Z. M., Wakim, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
  15. Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
  16. Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839(2023).
  17. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
  18. Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
  19. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  20. Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
  21. Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
  22. Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
  23. Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
  24. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  25. Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
  26. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
  27. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  28. Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
  29. Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
  30. Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
  31. Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

رباعيات MHC الببتيديةمناعة رئة الفئرانالخلايا التائية المقيمة في الأنسجةالإثراء المغناطيسيقياس التدفق الخلويتفكيك أنسجة الرئةالخلايا التائية الذاكرةواسمات سطح الخليةعزل الخلايا التائية
تحديد الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد من رئتي الفأر مع الببتيد: رباعيات التوافق النسيجي المعقدة الرئيسية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.