يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحضير معلق أحادي الخلية للخلايا الظهارية الصعترية للفأر وتلوين الجزيئات داخل الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي

2.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66945

⸱

يوليو 26, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content"> نصف بروتوكولات لإعداد تعليق خلية واحدة للخلايا الظهارية الصعترية للفأر وتلوين الجزيئات داخل الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي.

الملخص

< p class = "jove_content" >تلعب الخلايا الظهارية الصعترية (TECs) دورا أساسيا في تعزيز تطوير الخلايا التائية واختيارها. تحفز الخلايا الطارئة القشرية (cTECs) في القشرة الصعترية التطور المبكر للخلايا التائية والاختيار الإيجابي للخلايا الزعترية القشرية. في المقابل ، تجذب الخلايا الصعترية النخاعية (mTECs) في النخاع الصعتري الخلايا الزعترية المختارة بشكل إيجابي من القشرة وتؤسس التسامح الذاتي في الخلايا التائية. تساهم مجموعة متنوعة من الجزيئات ، بما في ذلك DLL4 و beta5t المعبر عنها في cTECs ، بالإضافة إلى Aire و CCL21 المعبر عنها في mTECs ، في وظيفة الغدة الصعترية التي تدعم تطور الخلايا التائية واختيارها. يعد تحليل قياس التدفق الخلوي للجزيئات ذات الصلة وظيفيا في cTECs و mTECs مفيدا لتحسين فهمنا لبيولوجيا TECs ، على الرغم من أن الطرق الحالية لإعداد معلقات خلية واحدة من TECs يمكنها استرداد جزء صغير فقط من TECs (حوالي 1٪ ل cTECs وحوالي 10٪ ل mTECs) من الغدة الصعترية للفأر البالغ الصغير. نظرا لأن العديد من هذه الجزيئات ذات الصلة وظيفيا في TECs مترجمة داخل الخلايا ، فإننا نصف بروتوكولاتنا لإعداد تعليق الخلية المفردة ل TECs للفأر وتلوين الجزيئات داخل الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي.

المقدمة

الغدة الصعترية هي عضو اللحمة المتوسطة الظهارية التي تعزز تطوير واختيار ذخيرة الخلايا الليمفاوية التائية. في البيئات الدقيقة القشرية والنخاعية داخل الغدة الصعترية ، تلعب الخلايا الظهارية الصعترية (TECs) دورا مهما في توجيه تطور الخلايا التائية واختيارها. من المقبول جيدا أن TECs القشرية (cTECs) في القشرة الصعترية تساهم بشكل أساسي في تحريض التطور المبكر للخلايا التائية والاختيار الإيجابي للخلايا الزعترية التي تعبر عن مستقبلات مستضد الخلايا التائية (TCR) التي تم إنشاؤها حديثا. في المقابل ، تعتبر الخلايا التائية النخاعية (mTECs) في النخاع الصعتري ضرورية لجذب الخلايا الزعترية المختارة بشكل إيجابي من القشرة وإنشاء التسامح الذاتي المركزي عن طريق القضاء على الخلايا التائية ذاتية التفاعل وتوليد الخلايا التائية التنظيمية < فئة الدعم = "xref" >1،< sup class = "xref">2. يتم التوسط في وظائف TECs في دعم تطور الخلايا التائية واختيارها من خلال مجموعة متنوعة من الجزيئات المعبر عنها في cTECs و mTECs.

< p class = "jove_content">وتشمل هذه الترابط الشبيه بالدلتا 4 (DLL4) ، المهم لمواصفات سلالة الخلايا التائية لأسلاف اللمفاويات) < sup class = "xref" >3 ، < sup class = "xref" >4 ، beta5t (المعروف أيضا باسم Psmb11 ، مهم للاختيار الإيجابي لخلايا CD8 T) < sup class = "xref" >5،6 ، و Prss16 (المعروف أيضا باسم بروتيز سيرين الخاص بالغدة الصعترية ، أو TSSP ، مهم للاختيار الإيجابي لخلايا CD4 T) < فئة الدعم = "xref" >7 ،8 معبرا عنها في cTECs ، ومنظم المناعة الذاتية (Aire ، مهم للتعبير المختلط عن الجينات الذاتية)< sup class = "xref" >9،10 ، إصبع الزنك لعائلة فاس 2 (Fezf2 ، مهم للتعبير المختلط عن الجينات الذاتية المستقلة عن Aire وتوليد خلايا الخصلة الصعترية)< sup class = "xref" >11 ، < sup class = "xref" >12 ، < sup class = "xref" >13 ، < sup class = "xref" >14، و C-C الشكل الكيميائي ligand 21 (CCL21 ، مهم للهجرة النخاعية وتراكم الخلايا الزعترية المختارة بشكل إيجابي) < فئة sup = "xref" >14 ، < sup class = "xref" > 15 ، < sup class = "xref" >16 معبرا عنها في mTECs. يوفر قياس التدفق الخلوي وسيلة للكشف الكمي عن هذه الجزيئات المهمة وظيفيا في TECs ، مما يسهل تقييم كل من تطور ووظيفة cTECs و mTECs. نظرا لأن العديد من الجزيئات الموجودة في TECs يتم التعبير عنها بشكل أساسي داخل الخلايا ، كما هو الحال في السيتوبلازم (على سبيل المثال ، مكون البروتيازوم beta5t) والنواة (على سبيل المثال ، منظم النسخ Aire) ، فمن المفيد التحليل الكمي للجزيئات داخل الخلايا في cTECs و mTECs باستخدام قياس التدفق الخلوي.

TECs نادرة في الغدة الصعترية. أنثى الفأر في عمر 5 أسابيع لديها ما يقرب من 1 × 106 cTECs وحوالي 2.5 × 106 mTECs ، في حين أن قشرة الغدة الصعترية تحتوي على ما يقرب من 3 × 108 CD4 + CD8 + الخلايا الزعترية وتحتوي النخاع الصعتري على ما يقرب من 5 × 107 CD4 + CD8- و CD4-CD8 + الخلايا الزعترية < فئة السوب = "xref">17. لذلك ، فإن الغالبية العظمى (>99٪) من الخلايا في الغدة الصعترية هي خلايا مكونة للدم ، بما في ذلك الخلايا الزعترية ، بدلا من الخلايا الصعترية ، في الفئران البالغة الصغيرة. علاوة على ذلك ، ترتبط TECs ارتباطا وثيقا بالخلايا المجاورة (مثل الخلايا الزعترية) والمكونات المعمارية خارج الخلية (مثل الكولاجين) داخل الغدة الصعترية ، لذا فإن تحرير TECs في تعليق الخلية يتطلب هضم البروتياز في الغدة الصعترية. الطرق التقليدية للهضم الأنزيمي لا تنتج سوى جزء صغير من TECs. ما يقرب من 1٪ (1 × 104) و 10٪ (2 × 105) ل cTECs و mTECs ، على التوالي ، من فئة الغدة الصعترية < فئة الماوس البالغة من العمر 5 أسابيع = "xref" >17،< sup class = "xref" >18,19. من المحتمل أن تكون الكفاءة المنخفضة لتحرير TEC من الغدة الصعترية ناتجة عن قابلية TECs للإنزيمات المحللة للبروتين والإجهاد الميكانيكي والارتباط الوثيق بين TECs مع الخلايا المجاورة ، لا سيما بين cTECs و CD4 + CD8 + الخلايا الزعترية < فئة sup = "xref" >20. في هذا الصدد ، فإن نتائج تحليل الخلية المفردة ل TECs للفأر ، بما في ذلك تحليل قياس التدفق الخلوي وتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، بناء على طرق تحضير الخلايا بوساطة الهضم الأنزيمي الحالية ، تمثل جزءا صغيرا فقط من TECs ، وبالتالي فهي بعيدة كل البعد عن أن تكون شاملة. ومع ذلك ، على الرغم من هذه القيود في الاسترجاع الأنزيمي ل TECs ، فإن تحليل قياس التدفق الخلوي ل TECs للفأر في معلق خلية واحدة لا يزال مفيدا للتحليل الكمي للجزيئات ذات الصلة وظيفيا في cTECs و mTECs. في تعليق الخلية ، تم تعريف TECs على أنها خلايا إيجابية لجزيء السطح الظهاري EpCAM (CD326) وسلبية لجزيء السطح المكونة للدم CD45. ضمن EpCAM + CD45- TECs ، تم استخدام مستويات التعبير عن سطح الخلية لجزيئات Ly51 (المعروفة أيضا باسم BP-1 و CD249) وقدرة ربط Ulex Europaeus agglutinin I (UEA1) (الارتباط بشكل أساسي بالبروتينات السكرية والجليكوليبيدات التي تحتوي على فوكوز مرتبط α) لتمييز cTECs الظاهري (Ly51مرتفعUEA1منخفض) و mTECs (Ly51منخفضUEA1 مرتفع). نصف هنا بروتوكولاتنا التجريبية للتحضير التقليدي للتعليق أحادي الخلية ل TECs للفأر وتلوين الجزيئات داخل الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي ، مع التركيز على التحليل الكمي للجزيئات داخل الخلايا beta5t و CCL21 و Aire في TECs المعدة حديثا للفأر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

< p class = "jove_content" >تم إجراء جميع تجارب الفئران بموافقة لجنة رعاية واستخدامه التابعة للمعهد الوطني للسرطان (ASP21-431 و ASP21-432 و EIB-076-3).

< p class = "jove_title" >1. تحضير تعليق خلية الغدة الصعترية

ملاحظة: يؤثر تطور الفأر على كفاءة التحرر الأنزيمي ل TECs من الغدة الصعترية. يتم وصف ثلاث طرق حسب عمر الفأر على النحو التالي.

  1. لفئران ما بعد الولادة التي يزيد عمرها عن 3 أسابيع
    1. احصد الغدة الصعترية (فصتان من الغدة الصعترية) من فأر واحد. ضع الغدة الصعترية في 5 مل من RPMI1640 تحتوي على 10 ملي مولار من السخول الصعترية في طبق بلاستيكي 60 مم على الثلج.
    2. قم بإزالة الدم والأنسجة غير الصعترية والدهون باستخدام ملاقط منحنية ذات أطراف رفيعة تحت مجهر تشريح. قطع الغدة الصعترية إلى قطع صغيرة (حوالي 1-2 مم في الحجم) بمقص تشريح.
    3. نقل قطع الغدة الصعترية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 3 مل من 1 ملغم / مل كولاجيناز / ديسباز ، و 1 وحدة / مل محلول DNase في RPMI1640 يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS). احتضن في حمام مائي أو كتلة حرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. تخلط برفق باستخدام ماصة نقل بلاستيكية سعة 3 مل. احتضن لمدة 20 دقيقة أخرى في حالة بقاء شظايا الأنسجة مرئية.
    5. تخلط برفق باستخدام ماصة نقل بلاستيكية سعة 3 مل. احتضن لمدة 10 دقائق أخرى في حالة بقاء شظايا الأنسجة مرئية.
    6. تخلط برفق باستخدام ماصة نقل بلاستيكية سعة 3 مل. أضف 5 مل من 5 مللي EDTA في 1x HBSS يحتوي على 1٪ FBS.
    7. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون 60 ميكرومتر وفي أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    8. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من محلول FACS (1x HBSS يحتوي على 1٪ ألبومين مصل بقري [BSA] و 0.1٪ NaN3).
    9. قم بتخزين الخلايا على الجليد وتحديد أرقام الخلايا باستخدام عداد الخلايا.
  2. للفئران حديثي الولادة بين 1 و 2 أسبوع
    1. قم بتنفيذ الخطوة 1.1.1.
    2. قم بإزالة الدم والأنسجة غير الصعترية باستخدام ملاقط تشريح تحت مجهر تشريح. انقل الغدة الصعترية إلى أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل يحتوي على 200 ميكرولتر من RPMI1640 مع 10 ملي مولار HEPES وقم بتقطيع الغدة الصعترية إلى قطع صغيرة (حوالي 1-2 مم في الحجم) باستخدام مقص تشريح.
    3. اترك شظايا الغدة الصعترية تستقر في قاع الأنبوب، ثم قم بإزالة التعليق برفق باستخدام ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر.
    4. انقل قطع الغدة الصعترية إلى أنبوب دائري القاع سعة 5 مل من مادة البولي بروبيلين يحتوي على 2 مل من 0.5 ملغم/مل كولاجيناز / ديسباز و 1 وحدة / مل محلول DNase في RPMI1640 يحتوي على 2٪ FBS. احتضن في حمام مائي أو كتلة حرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    5. امزج برفق باستخدام ماصة نقل بلاستيكية سعة 3 مل ثم باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل مزودة بطرف بلاستيكي لمزيد من التجانس.
    6. أضف 2 مل من 5 ملي EDTA في 1x HBSS يحتوي على 1٪ FBS. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون 60 ميكرومتر وفي أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 16 مل من RPMI1640 تحتوي على 10 ملي هيب.
    7. جهاز الطرد المركزي معلق الخلية 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    8. قم بتخزين الخلايا على الجليد وتحديد أرقام الخلايا باستخدام عداد الخلايا.
  3. للفئران الجنينية والفئران حديثي الولادة حتى عمر 1 أسبوع
    1. احصد الغدة الصعترية (فصتان من الغدة الصعترية) من فأر واحد. ضع الغدة الصعترية في طبق بلاستيكي مقاس 60 مم وقم بإزالة الدم والأنسجة غير الصعترية والدهون باستخدام ملاقط منحنية ذات أطراف رفيعة تحت مجهر تشريح.
    2. ضع الغدة الصعترية في 0.2 مل من RPMI1640 تحتوي على 10 ملي مولار HEPES في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. تخلص من السائل باستخدام ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر.
    3. أضف 0.5 مل من 0.5 ملغم/مل كولاجيناز/ديسباز و1 يو/مل محلول DNase في RPMI1640 تحتوي على 2٪ FBS. احتضن في حمام مائي أو كتلة حرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. امزج برفق باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل بطرف بلاستيكي.
    4. أضف 0.5 مل من 5 ملي EDTA في 1x HBSS يحتوي على 1٪ FBS. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون 60 ميكرومتر وفي أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. أضف 9 مل من RPMI1640 تحتوي على 10 ملي من الهبث.
    5. الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. قم بتخزين الخلايا على الجليد وتحديد أرقام الخلايا باستخدام عداد الخلايا.
  4. الطريقة البديلة: هضم Liberase
    1. تنفيذ الخطوتين 1.1.1 و 1.1.2.
    2. اسمح لشظايا الغدة الصعترية بالاستقرار في قاع الأنبوب؛ ثم قم بإزالة المعلق برفق باستخدام ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر. انقل قطع الغدة الصعترية إلى أنبوب سعة 5 مل يحتوي على 1 مل من 0.5 وحدة / مل من Liberase و 1 U / مل DNase في RPMI1640 يحتوي على 10 ملي من HEPES. احتضن في حمام مائي أو كتلة حرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. امزج برفق باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل بطرف بلاستيكي. احتضن لمدة 15 دقيقة أخرى في حالة بقاء شظايا الأنسجة مرئية.
    4. امزج برفق باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل بطرف بلاستيكي. أضف 1 مل من 5 ملي EDTA في 1x HBSS يحتوي على 1٪ FBS.
    5. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون 60 ميكرومتر وفي أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. أضف 18 مل من RPMI1640 تحتوي على 10 ملي مولار من HEPES.
    6. الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بتعليق الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت FACS (1x HBSS يحتوي على 1٪ BSA و 0.1٪ NaN3).
    7. قم بتخزين الخلايا على الجليد وتحديد أرقام الخلايا باستخدام عداد الخلايا.
< p class = "jove_title" >2. تلطيخ الأجسام المضادة لخلايا الغدة الصعترية

  1. ضع 16 × 106 خلايا في أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة 5 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  2. أضف 10 ميكرولتر من تركيز العمل للجسم المضاد أحادي النسيلة لمستقبلات Fc المضادة (mAb ، استنساخ 2.4G2) في المخزن المؤقت FACS لمنع الارتباط غير المحدد ل IgG الملطخ بمستقبل Fc على سطح الخلية. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. أضف 40 ميكرولتر لكل من تركيزات العمل من مضاد CD45 mAb (خاص بالخلايا المكونة للدم؛ على سبيل المثال، BV421-المسمى)، ومضاد EpCAM mAb (خاص بالخلية الظهارية؛ على سبيل المثال، PE-Cy7-المسمى)، ومضاد ل Ly51 mAb (الكشف عن cTEC ؛ على سبيل المثال، AF647-المسمى)، و Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1) (الكشف عن mTEC ؛ على سبيل المثال، AF594-المسمى ) في المخزن المؤقت FACS. في موازاة ذلك ، قم بإعداد أنابيب للخلايا الملطخة أحادية اللون والخلايا غير الملوثة لإعداد مقياس التدفق الخلوي.
  4. احتضان في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.
  5. خلايا الطرد المركزي 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. أضف 1 ميكرولتر من Ghost Dye Violet 510 (للتمييز بين الخلايا القابلة للحياة والخلايا الميتة في تحليل التدفق الخلوي للخلايا الثابتة والنفاذة). استخدام كاشف صبغة الشبح غير المخفف. اخلط جيدا. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ؛ تخلط جيدا كل 10 دقائق.
  7. أضف 2 مل من المخزن المؤقت FACS. خلايا الطرد المركزي 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  8. قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  9. أضف 3.5 مل من PBS إلى الأنبوب وخلايا الطرد المركزي 700 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق.
  10. قم باختراق الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من التثبيت داخل الخلايا / النفاذية المؤقتة واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
  11. الطرد المركزي للخلايا 700 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق.
  12. أضف 1 مل من 1x النفاذية عازلة. الطرد المركزي للخلايا عند 700 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  13. أضف 100 ميكرولتر لكل من تركيزات العمل من الأجسام المضادة للبيتا 5t أو الجسم المضاد ل CCL21 ، أو 40 ميكرولتر من تركيزات العمل من الجسم المضاد المضاد للهواء (على سبيل المثال ، المسمى AF488) ، في 1x مخزن مؤقت للنفاذية ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  14. أضف 1 مل من 1x النفاذية عازلة. الطرد المركزي للخلايا عند 700 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  15. كرر الخطوة 2.14.
  16. أضف 100 ميكرولتر من تركيزات العمل من IgG المضادة للأرانب (على سبيل المثال ، علامة AF555) واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  17. أضف 1 مل من 1x النفاذية عازلة. الطرد المركزي للخلايا عند 700 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  18. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من FACS Buffer واخلطها جيدا.
  19. قم بتخزين الخلايا في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى تحليل التدفق الخلوي.
  20. قم بتصفية الخلايا من خلال شبكة نايلون 60 ميكرومتر قبل تحليل التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتطلب التحليل جهاز قياس التدفق الخلوي الذي يسمح بالكشف عن ست قنوات فلورية على الأقل (لـ CD45 وEpCAM وLy51 وUEA1 وGhost Dye وbeta5t وCCL21 و/أو Aire) بالإضافة إلى معلمات التشتت الأمامي والجانبي. تظهر المخططات التمثيلية لقياس التدفق الخلوي لخلايا الغدة الزعترية المهضومة باستخدام Collagenase/Dispase من فئران عمرها 0 يوم وفئران عمرها أسبوعان في الشكل 1 والشكل 2، على التوالي. في كلا الشكلين، يوضح المخطط النقطي في اللوحة A شدة التشتت الأمامي (FSC) وشد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يستخدم الكولاجيناز ، مع أو بدون Dispase ، على نطاق واسع لهضم الغدة الصعترية الفأر لتحضير TECs4،5،9،18،21. يستخدم Liberase ، الذي يحتوي على مزيج من البروتياز بما في ذلك الكولاجيناز ، أيضا لهضم الغدة الصعترية لتحضير TECs17،22. يعطي استخدام الكولاجيناز والليبراز عوائد وجودة مكافئة بشكل أساسي ل cTECs و mTE...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور إيزومي أوهيغاشي على قراءة المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث الداخلية ZIA BC 011806 التابع للمعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني للسرطان ومركز أبحاث السرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كولاجيناز/Dispase Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / مجموعة العازلة لتلطيخ عامل النسخeBioscience00-5523-00
Ghost Dye Violet 510 & nbsp ؛Tonbo13-0870-T500
BV421 الجسم المضاد أحادي النسيلة CD45 المضاد للفأر ، Clone 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 المضاد للفأر Ly51 الجسم المضاد أحادي النسيلة ، Clone 6C3BioLegend108312
PE / Cy7 المضاد للفأر EpCAM / CD326 الجسم المضاد أحادي النسيلة ، Clone G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)Vector مختبراتDL-1067-1
Alexa Fluor 488 المضادة للفأر Aire أحادية النسيلة ، Clone 5H12eBioscience53-5934-82
المضاد للفأر Psmb11 / beta5t الأرانب المضاد أحادي النسيلة ، استنساخ CPTC-PSMB11 (الماوس) -1NIH NCICPTC-PSMB11 (الماوس) -1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
مضاد للفأر CCL21 / exodus 2 أجسام مضادة متعددة النسيلة للأرانبBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 الأجسام المضادة المؤتلفة للماعز ذات السلسلة الثقيلة IgGInvitrogenA27039
المضادة للفأر CD32 / CD16 &ndash ؛ منقى (Fc Block الأجسام المضادة)Leinco TechnologiesC247
شبكة نايلون 60 ميكرونتوريد المكوناتW31436
المعدات
ThermomixerEppendorfHeat Block
Cellometer Auto 2000 Cell VivabilityCounter NexcelomViable cell Count
LSRFortessa CellAnalyzer BD مقياس التدفق الخلويBiosciences خمسة ليزر (355 و 408 و 488 و 595 و 637 نانومتر)
برنامج FACSDiva 9.0.1BD Biosciencesتحليل
الخلوي FlowJo 10.9.0BD Biosciencesبيانات قياس التدفق الخلوي
تخفيف الأجسام المضادة(تركيز العمل)التخفيف المخزن
المضاد للفأر CD32 / CD16 &ndash ؛ منقى (الجسم المضاد Fc Block)1:40FACS Buffer
BV421 المضاد للفأر CD45 الجسم المضاد أحادي النسيلة1:25FACS Buffer
PE / Cy7 المضاد للفأر EpCAM / CD326 الجسم المضاد أحادي النسيلة1:100FACS Buffer
Alexa Fluor 647 المضاد للفأر Ly51 الجسم المضاد أحادي النسيلة1:100FACS Buffer
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)1:400FACS Buffer
مضاد للفأر CCL21 / exodus 2 أجسام مضادة متعددة النسيلة للأرانب1: 2001x عازلة
مضادة للفأر Psmb11 / beta5t أجسام مضادة أحادية النسيلة للأرانب ، استنساخ CPTC-PSMB11 (فأر) -11: 10001x عازلة
Alexa Fluor 555 المضادة للأرانب IgG الجسم المضاد المؤتلف للماعز ذات السلسلة الثقيلة1: 400عازلة العازلة
الغرض
RPMI1640 تحتوي على 10 ملي مولار HEPES   ؛لتحضير
الخلية RPMI1640 تحتوي على 2٪ FBSلتحضير
FACS buffer (1x HBSS يحتوي على 1٪ BSA   ؛ و 0.1٪ أزيد الصوديوم)لتحضير الخلايا وتلوين
1 مجم / مل كولاجيناز / ديسباز و 1U / مل محلول DNase في RPMI1640 يحتوي على 2٪ FBSلهضم
2٪ PFA في PBSلتثبيت
التثبيت / النفاذية عازلة (جزء واحد من تركيز التثبيت / النفاذية مع 3 أجزاء من التثبيت / المخفف للنفاذية)لتثبيت الخلايا
1x عازلة النفاذية (1 جزء 10X مركز مع 9 أجزاء من الماء المقطر)لتلوين الأجسام المضادة بين الخلايا   ؛
إصدار قياس التدفق تحليل معدل المؤقت نفاذيةنفاذية 1x النفاذية الخليةالأجسام المضادةالإنزيمالخلايا

المراجع

  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
  2. Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. Generation of diversity in thymic epithelial cells. Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).
  3. Hozumi, K., et al. Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development. J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).
  4. Koch, U., et al. Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment. J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).
  5. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).
  6. Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t. Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).
  7. Gommeaux, J., et al. Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes. Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).
  8. Viret, C., et al. Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire. J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).
  9. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  10. Mathis, D., Benoist, C. Aire. Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).
  11. Takaba, H., et al. Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
  12. Takaba, H., Takayanagi, H. The mechanisms of T cell selection in the thymus. Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).
  13. Lammers, S., et al. Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development. Front Immunol. 14, 1277365(2024).
  14. Ushio, A., et al. Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance. Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).
  15. Kozai, M., et al. Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells. J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).
  16. Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells. J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).
  17. Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse. J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).
  18. Hirakawa, M., et al. Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse. Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).
  19. Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration. Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).
  20. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).
  21. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).
  22. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).
  24. Adkins, B., Tidmarsh, G. F., Weissman, I. L. Normal thymic cortical epithelial cells developmentally regulate the expression of a B-lineage transformation-associated antigen. Immunogenetics. 27 (3), 180-186 (1988).
  25. Farr, A. G., Anderson, S. K. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: fucose-specific lectins bind medullary epithelial cells. J Immunol. 134 (5), 2971-2977 (1985).
  26. Wells, K. L., et al. Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells. eLife. 9, e60188(2020).
  27. Hubert, F. X., et al. A specific anti-Aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery. J Immunol. 180 (6), 3824-3832 (2008).
  28. Nishikawa, Y., et al. Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program. J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).
  29. Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J., Anderson, G. PDGFR alpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches. Blood. 109 (3), 954-960 (2007).
  30. Cosway, E. J., et al. Redefining thymus medulla specialization for central tolerance. J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).
  31. Farr, A. G., Eisenhardt, D. J., Anderson, S. K. Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro. Anat Rec. 216 (1), 85-94 (1986).
  32. Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J., Anderson, G., Jenkinson, W. E. Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors. Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).
  33. Ohigashi, I., et al. Developmental conversion of thymocyte-attracting cells into self-antigen-displaying cells in embryonic thymus medulla epithelium. eLife. 12, RP92552(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

قياس التدفق الخلويالصبغ داخل الخلاياغدة تيموسية للفئرانعزل الخلاياالخلايا الظهارية التيموسية القشريةالخلايا الظهارية التيموسية النخاعيةتعبير Beta5tكشف CCL21
تحضير معلق أحادي الخلية للخلايا الظهارية الصعترية للفأر وتلوين الجزيئات داخل الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.