التحقيق في تكوين الأوعية الدموية على المستوى الوظيفي والجزيئي من خلال الاستفادة من مقايسة هجرة جرح الخدش ومقايسة تنبت كروية

Julian Rapp; Jan Ness; Paula Liang; Martin J. Hug; Hansjürgen Agostini; Günther Schlunck; Clemens Lange; Felicitas Bucher

doi:10.3791/66954

مقالة منهجية

التحقيق في تكوين الأوعية الدموية على المستوى الوظيفي والجزيئي من خلال الاستفادة من مقايسة هجرة جرح الخدش ومقايسة تنبت كروية

DOI:

10.3791/66954

⸱

مايو 31, 2024

Julian Rapp^*¹^,² , Jan Ness^*¹^,³ , Paula Liang¹ , Martin J. Hug⁴ , Hansjürgen Agostini¹ , Günther Schlunck¹ , Clemens Lange⁵ , Felicitas Bucher¹

¹Eye Center, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, ²Department of Medicine I, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, ³Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, ⁴Pharmacy, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, ⁵Ophtha-Lab, Department of Ophthalmology, St. Franziskus Hospital Muenster

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة مقايسة هجرة جرح الخدش ثنائية الأبعاد (2D) ومقايسة تنبت كروية ثلاثية الأبعاد (3D) ، جنبا إلى جنب مع طرق تحليل المصب الخاصة بكل منها ، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي والكيمياء المناعية ، كمقايسات مناسبة لدراسة تكوين الأوعية في المختبر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب تكوين الأوعية دورا حاسما في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية داخل الجسم بما في ذلك نمو الورم أو أمراض العين الوعائية الحديثة. يعد الفهم التفصيلي للآليات الجزيئية الأساسية ونماذج الفحص الموثوقة أمرا ضروريا لاستهداف الأمراض بشكل فعال وتطوير خيارات علاجية جديدة. تم تطوير العديد من المقايسات في المختبر لنمذجة تكوين الأوعية ، والاستفادة من الفرص التي توفرها البيئة الخاضعة للرقابة لتوضيح الدوافع الوعائية على المستوى الجزيئي وفحص الأهداف العلاجية.

تقدم هذه الدراسة سير العمل للتحقيق في تكوين الأوعية في المختبر باستخدام الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). نحن بالتفصيل مقايسة هجرة جرح الخدش باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية الذي يقيس هجرة الخلايا البطانية في إعداد 2D ومقايسة تنبت كروية تقييم الخلايا البطانية تنبت في إعداد 3D التي توفرها مصفوفة الكولاجين. بالإضافة إلى ذلك ، نحدد استراتيجيات لإعداد العينات لتمكين المزيد من التحليلات الجزيئية مثل علم النسخ ، لا سيما في إعداد 3D ، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي وكذلك الكيمياء المناعية. إجمالا ، يوفر هذا الإطار للعلماء مجموعة أدوات موثوقة ومتعددة الاستخدامات لمتابعة استفساراتهم العلمية في مقايسات تكوين الأوعية في المختبر .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكوين الأوعية الدموية ، الذي يشير إلى تكوين أوعية دموية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا¹ ، هو عملية حاسمة أثناء التطور الفسيولوجي والظروف المرضية. لا غنى عنه لتوفير الطاقة للأنسجة النشطة للغاية في التمثيل الغذائي مثل شبكية العين² أو الجهاز العصبي المركزي النامي³ وأثناء شفاء الأنسجة التالفة⁴. تولد الأوعية غير الطبيعي ، من ناحية أخرى ، هو الأساس للعديد من الأمراض. الأورام الصلبة ، مثل سرطان القولون والمستقيم أو سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، تسهل نموها وإمدادات الطاقة اللازمة من خلال تعزيز تكوين الأوعية^{الدموية 5}. بصرف النظر عن السرطان ، فإن أمراض الأوعية الدموية الحديثة في العين مثل اعتلال الشبكية السكري أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والتي تمثل الأسباب الرئيسية للعمى في العالم المتقدم ، تنتج عن نمو الأوعية الشاذة ^6,7. يعد الفهم التفصيلي للآلية المرضية الأساسية أمرا بالغ الأهمية لفهم كيف يمكن تعزيز تكوين الأوعية الفسيولوجية ، على سبيل المثال ، في التئام الجروح مع التحكم بشكل أفضل في الحالات المرضية مثل أمراض العين التكاثرية الوعائية.

على المستوى الخلوي ، يتم تنشيط الخلايا البطانية الوعائية بواسطة جزيئات إشارات مختلفة في تكوين الأوعية الدموية ، مما يؤدي إلى تكاثر الخلايا والهجرة⁸. تنتظم الخلايا لاحقا في تسلسل هرمي ، حيث تشكل خلايا الطرف غير المتكاثرة فيلوبوديا في الحافة الأمامية لفرع الوعاء^{النامي 8}. إلى جانب ذلك ، تتبع خلايا الساق سريعة التكاثر خلايا الطرف ، مما يساهم في تكوين الوعاء الناشئ. بعد ذلك ، يتم تجنيد أنواع أخرى من الخلايا ، مثل الخلايا المحيطة أو خلايا العضلات الملساء ، لزيادة استقرار الفرع^{الوليد 9}.

لاستكشاف العمليات الجزيئية على مستوى الخلايا البطانية الوعائية ، تم تطوير العديد من البروتوكولات في المختبر ومراجعتها مؤخرا¹⁰. تنقسم هذه المقايسات عادة إلى فئتين: مناهج 2D أكثر بساطة ولكنها قابلة للتطوير وبروتوكولات 3D أكثر تفصيلا. في مشروع حديث ، أجرينا تحليلا مقارنا شاملا بين مقايسة هجرة الجروح ثنائية الأبعاد ومقايسة تنبت كروية ثلاثية الأبعاد¹¹ لتقييم مدى اختلافاتها وقدرتها على نمذجة الجوانب المختلفة لتكوين الأوعية^{الدموية 12}.

في حين أن كلاهما يوفر مزايا كونه موثوقا وقابلا للتنفيذ بسهولة ، على المستوى الجزيئي ، كان اختبار تنبت كروي 3D مواتيا في معالجة الجوانب الرئيسية لتكوين الأوعية مقارنة بالبيانات في الجسم الحي ، مثل مفاتيح التمثيل الغذائي أو تفاعلات مصفوفة الخلية. نظرا لاستخدام مقايسات تكوين الأوعية في المختبر لتقييم إمكانات تعديل الأوعية الدموية لمسارات الإشارات¹³ وفحص العوامل العلاجية ، فإن قابلية نقل النتائج في المختبر إلى إعدادات الجسم الحي أمر ضروري. علاوة على ذلك ، فإن فرصة التحليلات القائمة على omics على مستويات الحمض النووي الريبي والبروتين لتوصيف التغيرات الجزيئية استجابة للتعديل المستهدف للعمليات الوعائية في ظل ظروف خاضعة للرقابة تظل فائدة مهمة مقارنة بالإعدادات في الجسم الحي ¹⁴^،¹⁵.

في هذا المنشور ، نقدم المقايسات الرئيسية لاستكشاف الأسئلة المتعلقة بتكوين الأوعية من خلال استخدام مقايسة هجرة تصوير الخلايا الحية ومقايسة تنبت كروية ، بما في ذلك التحليلات الجزيئية اللاحقة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي للتحليل النسخي والكيمياء المناعية على مستوى البروتين.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة خلايا HUVEC

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية تحت ظروف العمل المعقمة (منضدة العمل المعقمة).

توسيع HUVECs
1. لكل من مقايسات تكوين الأوعية ، استخدم الخلايا البطانية للوريد السري البشري المجمعة (HUVECs) أو الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية (HMVECs).
2. قم بزراعة الخلايا حتى تصل إلى التقاء 90٪ في قارورة T75 غير المطلية مع وسط نمو الخلايا البطانية (EGM) قبل إجراء الانقسام. إجراء تغيير متوسط 3 مرات في الأسبوع.
  ملاحظة: لتسريع النمو ، يمكن تغيير الوسيط يوميا. لا تستخدم HUVECs بعد المقطع السادس. تلقت الدراسة النتائج الأكثر اتساقا في جميع التجارب مع HUVECs من نفس المقطع.
تقسيم HUVECs
1. عندما تصل HUVECs إلى الالتقاء المطلوب في قارورة T75 ، اشطفها مرة واحدة ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، متبوعا باحتضان الخلايا بنسبة 0.5٪ تربسين لمدة 2 دقيقة في الحاضنة.
  ملاحظة: يمكن أن يؤدي التعرض المطول للتربسين إلى إتلاف وظيفة HUVEC.
2. افصل الخلايا برفق عن طريق النقر على القارورة. تأكد من الانفصال الناجح تحت مجهر تباين الطور المقلوب.
3. أضف 8 مل من EGM ، وانقل المحلول إلى أنبوب ، وقم بتجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 3 دقائق.
4. إذا كان عد الخلايا ضروريا ، فأعد تعليق الخلايا في 5 مل من EGM واستخدم غرفة Neubauer. خلاف ذلك ، أضف 40 مل من EGM ووزعها على 4 قوارير زراعة خلايا T75 جديدة.

2. فحص هجرة جرح الخدش

ملاحظة: يتطلب اختبار ترحيل جرح الخدش مدة 3 أيام حتى يكتمل (الشكل 1). قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية تحت ظروف العمل المعقمة (مقعد العمل المعقم).

تصفيح وتجويع الخلايا (اليوم 1)
1. باستخدام صفيحة متخصصة من 96 بئرا لتصوير الخلايا الحية ، قم بزرع 20000 HUVECs في 100 ميكرولتر من EGM لكل بئر. اسمح للخلايا بالاستقرار لمدة 6 ساعات في الحاضنة.
  ملاحظة: ينصح بتحسين أعداد الخلايا بالنظر إلى السرعة المتفاوتة لنمو الخلايا البطانية الوعائية بين الموردين والمختبرات. الهدف هو تحقيق طبقة أحادية مثالية في اليوم التالي قبل بدء الخدش. يمكن للآبار المكتظة بالسكان تغيير سلوك الخلايا البطانية ، على سبيل المثال ، عن طريق تثبيط الاتصال¹⁶ ، في حين أن الطبقة الأحادية غير المكتملة تعيق التحليل بشكل كبير.
2. تجويع جميع الآبار بين عشية وضحاها مع 100 ميكرولتر من EBM لكل بئر مع استكمال 2٪ FBS.
  ملاحظة: احرص على عدم إتلاف الطبقة الأحادية للخلية ، خاصة عند استخدام ماصة متعددة القنوات.
تحضير محاليل التحفيز (اليوم 2)
1. تمييع المواد المرغوبة والضوابط في الوسط القاعدي لنمو الخلايا البطانية (EBM) المكمل ب 2٪ FBS. لكل بئر ، استخدم 100 ميكرولتر من المحلول.
  ملاحظة: EBM المكمل ب 2٪ FBS يعمل كعنصر تحكم سلبي ، بينما يمكن استخدام عامل نمو بطانة الأوعية الدموية البشرية المؤتلف (VEGF) عند 25 نانوغرام / مل كعنصر تحكم إيجابي. باستخدام ألواح 96 بئرا ، يوصى بتصميم التجارب بحد أدنى من النسخ المتماثلة التقنية (4 آبار بظروف متطابقة) ، على الرغم من أنه يقترح استخدام 8 للحصول على أفضل النتائج. احرص على تقليل تأثيرات الحافة أو الزاوية المحتملة عند التخطيط للتخطيط.
إنشاء الصفر (اليوم 2)
1. افحص الخلايا تحت المجهر للتحقق من وجود طبقة أحادية متقاربة للخلية وصلاحية الخلية. ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا في أداة صانع الجروح ذات 96 بئرا وقم بإنشاء الخدش عن طريق الضغط لأسفل على ذراع الجهاز. ارفع غطاء أداة صانع الجروح بعناية قبل تحرير الرافعة لمنع الخدش المزدوج.
2. اغسل جميع الآبار مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من EBM لكل بئر مع 2٪ FBS. تأكد تحت المجهر من إزالة الحطام بنجاح.
تحفيز الخلايا (اليوم 2)
1. أضف 100 ميكرولتر من محاليل التحفيز أو التحكم المعدة لكل بئر.
التصوير (اليوم 2-3)
1. احصل على الصور مرة واحدة في الساعة لمدة تصل إلى 24 ساعة باستخدام جدول زمني تلقائي يوفره مجهر التصوير بالخلايا الحية.
  ملاحظة: لضمان جودة صورة جيدة ، قم بمسح كل بئر فور نقلها إلى الحاضنة التي تضم نظام تصوير الخلايا الحية. يساعد وقت التأقلم لمدة 30 دقيقة في الحاضنة في الحصول على جودة صورة أفضل. تمت برمجة برنامج المجهر للحصول على صورة واحدة في الساعة لكل بئر عند خط الوسط للخدش المحدد.
في حالة عدم وجود أداة صنع الجروح وتصوير الخلايا الحية ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
1. استخدم طرف ماصة في لوحة 24 بئرا للحث على حدوث خدش. التقط صورا باستخدام مجهر زراعة الخلايا الكلاسيكي على فترات زمنية محددة. لهذا الغرض ، استخدم مجهرا آليا مزودا بقدرات تتبع دقيقة x و y. يتيح ذلك تحديد المواقع تلقائيا ، مما يضمن التقاط صور متسقة في مواقع محددة مسبقا.
  ملاحظة: عندما يكون التصوير اليدوي ضروريا ، يكون خيارا قابلا للتطبيق لتصوير T0 فقط بالإضافة إلى نقطة زمنية واحدة "x" بعد ساعات من العلاج. في البروتوكول الموصوف باستخدام HUVECs ، كانت النقطة الزمنية T12 (12 ساعة بعد التحفيز) نقطة زمنية جذابة مع فصل واضح بين التحكم الإيجابي السلبي والمحفز ب VEGF. ومع ذلك ، يوصى بإجراء تجارب دورة زمنية أولية مع التصوير كل 2 ساعة أو 1 ساعة لتحديد النقطة الزمنية المثلى للإعدادات التجريبية المحددة في كل مختبر.
التحليل (اليوم 3)
1. قد يتيح برنامج مجهر تصوير الخلايا الحية التحليل المباشر للصور المكتسبة. حدد الأقنعة التي تحدد حديقة الخلية والخدش الأولي ومناطق كثافة الجرح النسبية. تحديد حدود الخلايا بناء على اختلافات التباين.
  ملاحظة: تم استخدام تعديل تجزئة 1.6 ، وملف ثقب 500 ميكرومتر² ، وحجم معدل 1 بكسل ، ومساحة >500 ميكرومتر ، وانحراف مركزي >0.6 للتجارب التي أجريت مع HUVECs. من الضروري إجراء فحص بصري شامل لمعلمات اكتشاف الخلايا بالنسبة للصور الفعلية. من خلال التكوينات المحسنة ، يحسب البرنامج كثافة الجرح النسبية (RWD) بمرور الوقت تلقائيا ويولد الرسوم البيانية الزمنية المقابلة مع الانحراف المعياري (SD) للنسخ المتماثلة التقنية. يمكن بعد ذلك استخدام هذه البيانات للتحليل الإحصائي.

3. استخراج الحمض النووي الريبي مع الخلايا المزروعة 2D

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية حتى الخطوة 3.3 تحت ظروف العمل المعقمة (منضدة العمل المعقمة).

خلايا الطلاء (اليوم 1)
1. افصل HUVECs وفقا للخطوة 1.2 من بروتوكول زراعة الخلايا HUVEC.
2. بذر 50000 خلية لكل بئر في صفيحة 12 بئرا مع 2 مل من EGM لكل بئر.
3. قم بتغيير الوسط بعد 6 ساعات إلى EBM الذي يحتوي على 2٪ FBS (وسائط جائعة) للتجويع بين عشية وضحاها.
علاج الخلايا (اليوم 2)
1. عوامل تمييع الفائدة في EBM تستكمل مع 2 ٪ FBS. استبدل الوسائط الجائعة بالتخفيف المحضر واحتضان الخلايا للوقت المطلوب في حاضنة.
استخراج الحمض النووي الريبي (اليوم 2-3)
1. تحلل الخلايا ب 750 ميكرولتر من Trizol لكل بئر واحتضانها لمدة 10 دقائق على شاكر مداري.
2. أعد تعليق العينات باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر عدة مرات ثم قم بتخزينها في أنابيب RNA محددة منخفضة الارتباط (حجم 1.5 مل). يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

4. الكيمياء المناعية مع الخلايا المزروعة 2D

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية حتى الخطوة 4.4 في ظل ظروف العمل المعقمة (منضدة العمل المعقمة).

إعداد أغطية
1. احتضان 100 غطاء بقطر 12 مم في هيدروكسيد البوتاسيوم 5٪ في الميثانول في أنبوب سعة 50 مل لمدة 30 دقيقة أثناء هز المحلول المطبق.
  ملاحظة: هذه خطوة مهمة جدا في إزالة البروتون من سطح أغطية الغطاء وتحسين ظروف الطلاء والثقافة. في هذه المرحلة ، يوصى بشدة بالتأكد من توزيع أغطية الغطاء جيدا داخل الوسط وعدم تجفيفها ولصقها معا.
2. اغسل أغطية الملابس لمدة 30 دقيقة 4 مرات بالماء منزوع المعادن.
3. بعد الغسيل ، قم بنقلها إلى محلول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ للتخزين.
طلاء أغطية
1. اتكئ على أغطية الغطاء بشكل فردي على جدار طبق بتري مربع للسماح بتبخر كحول الأيزوبروبيل.
2. بعد 5 دقائق ، انقل أغطية الغطاء إلى صفيحة بئر 24 (غطاء واحد لكل بئر). ضع 1 مل من محلول 10 مجم / مل من الكولاجين I في برنامج تلفزيوني على كل بئر واحتضانه لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. ثم اغسل أغطية الغطاء 4-5 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني.
زراعة الخلايا
1. فصل HUVECs باتباع الإجراءات الموضحة في الخطوة 1.2 من بروتوكول زراعة الخلايا HUVEC.
2. بذر 50000 خلية لكل بئر في صفيحة 24 بئرا مع 2 مل من EGM لكل بئر.
3. بعد 6 ساعات ، قم بتغيير الوسط إلى EBM الذي يحتوي على 2٪ FBS للسماح للخلايا بالالتصاق بالبئر وتجويع الخلايا طوال الليل.
4. في اليوم التالي ، استكمل وكلاء الفائدة المخففون في EBM بنسبة 2٪ FBS. استبدل محلول الجوع في الآبار بالتخفيف المحضر واحتضان الخلايا للوقت المطلوب في حاضنة.
التثبيت والحجب
1. قم بزراعة الخلايا للوقت المطلوب ، ثم اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
2. ثبت الخلايا التي تحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. يغسل مع برنامج تلفزيوني 3-4 مرات لمدة 5 دقائق.
4. احتضان العينات مع المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 5٪ مصل الماعز الطبيعي (NGS) ، 0.1٪ Triton-X-100 في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
  ملاحظة: في هذه الخطوة ، من المهم غسل العينات لضمان إزالة PFA تماما. اختر نوع المصل بناء على أصل الجسم المضاد الثانوي.
تلطيخ
1. احتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية في المخزن المؤقت المانع باستخدام الجسم المضاد الأساسي.
2. في اليوم التالي ، لإزالة أي جسم مضاد أولي غير منضم ، اغسل العينات 3-4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منها.
3. بعد ذلك ، احتضان العينات لمدة 1 ساعة في RT مع الجسم المضاد الثانوي المقابل و Phalloidin-FITC ، المخفف معا في المخزن المؤقت للحظر.
4. اغسل 3-4 مرات إضافية.
5. اقلب الغطاء على الشرائح باستخدام قطرة صغيرة من وسيط التثبيت المحتوي على DAPI ، واتركه يجف في الظلام ، وأغلقه بطلاء الأظافر. قم بتخزين العينات في الظلام عند 4 درجات مئوية.

5. مقايسة تنبت كروية

ملاحظة: يتطلب اختبار تنبت كروي 3 أيام للاكتمال (الشكل 2). قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية حتى الخطوة 5.7 تحت ظروف العمل المعقمة (مقعد العمل المعقم).

توليد كرويات في قطرات معلقة (اليوم 1)
1. فصل HUVECs باتباع الإجراءات الموضحة في الخطوة 1.2 من بروتوكول زراعة الخلايا HUVEC.
2. اجمع بين 200000 خلية مع 8 مل من EGM و 2 مل من محلول مخزون الميثوسيل ، مما يضمن الخلط الشامل. يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 1 للحصول على تعليمات حول إعداد محلول مخزون الميثوسيل.
3. ضعي قطرات 25 ميكرولتر من المحلول على السطح الداخلي المقلوب لطبق بتري كبير مربع. قم بتدوير الغطاء برفق بمقدار 180 درجة وضعه في الجزء السفلي من وعاء زراعة الخلايا بحيث تتدلى القطرات. ضع الوعاء في حاضنة زراعة الخلايا طوال الليل.
تحضير هلام الكولاجين (اليوم 2)
1. امزج جيدا 2.3 مل من كولاجين ذيل الفئران من النوع الأول مع 0.280 مل من 10x متوسط 199 حتى يحقق الخليط لونا أصفر متساويا باستمرار. الحفاظ على هذا الخليط على الجليد طوال العملية برمتها.
معايرة هلام الكولاجين (اليوم 2)
1. قم بمعايرة الخليط لتحقيق درجة حموضة فسيولوجية ، يشار إليها باللون البرتقالي ، باستخدام NaOH (2 N).
2. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES إلى المنتج النهائي.
  ملاحظة: لضمان النطاق الديناميكي الأمثل للمقايسة ، من الضروري الاقتراب قدر الإمكان من درجة الحموضة الفسيولوجية. قد تتطلب دفعات مختلفة من الكولاجين كميات مختلفة من هيدروكسيد الصوديوم. حافظ على الخليط جيدا على الجليد طوال العملية واخلطه بشكل متجانس طوال الوقت.
حصاد الكرويات (اليوم 2)
1. شطف قطرات معلقة من أغطية ثقافة الخلية مع 20 مل من برنامج تلفزيوني.
2. جهاز طرد مركزي الحل لمدة 7 دقائق في 250 × غرام. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الأجسام الكروية في 0.1 مل من FBS و 0.4 مل من EGM عن طريق النقر برفق على الأنبوب.
3. أضف 2 مل من محلول مرق الميثوسيل واخلطه جيدا. استخدم ماصة بسعة لا تقل عن 5 مل لتجنب إتلاف الأجسام الكروية.
إضافة كرويات إلى مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد (اليوم 2)
1. أضف 2 مل من خليط الكولاجين المحضر إلى الكرويات المعاد تعليقها واخلطها جيدا.
2. استغني عن 0.5 مل من الخليط الناتج في آبار صفيحة 24 بئرا واحتضانها في حاضنة الخلايا لمدة 30 دقيقة.
تحفيز الأجسام الكروية في مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد (اليوم 2)
1. تحضير تخفيف المواد المرغوبة في EBM. لكل بئر ، استخدم 100 ميكرولتر من المحلول.
  ملاحظة: يعمل EBM كعنصر تحكم سلبي ، بينما يمكن استخدام عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) عند 25 نانوغرام / مل (التركيز النهائي في 500 ميكرولتر من مصفوفة الكولاجين وطبقة EBM 100 ميكرولتر) كعنصر تحكم إيجابي.
2. احتضان للوقت المطلوب.
  ملاحظة: في الفحص القياسي ، يوصى ب 18-24 ساعة ، ولكن يجب تحسين التوقيت بعناية في كل مختبر.
تصوير كرويات (اليوم 3)
1. استخدم مجهرا مقلوبا ومنصة تصوير لالتقاط صور لجميع الأجسام الكروية غير الملامسة لحافة البئر أو مع بعضها البعض أو تظهر عليها علامات التلف. حافظ على إعدادات متسقة ومستويات التكبير/التصغير في جميع الظروف.
التحليل (اليوم 3)
1. استخدم أداة القياس في ImageJ Fiji للتأكد من طول جميع البراعم من كل كروية في كل صورة.
  ملاحظة: استخدم المكون الإضافي الموجود في الملف التكميلي 2 ، مما يجعل التحليل أكثر كفاءة ويولد ملف .txt الإخراج.
2. قم باستيراد البيانات إلى جدول بيانات أو R أو أي برنامج مفضل آخر ، واستخدم متوسط الطول التراكمي لجميع البراعم لكل كروي كقراءة لكل حالة.
  ملاحظة: لا يمكن الجمع بين النتائج من المواد الهلامية المختلفة في شكل أطوال تنبت مطلقة. يجب تطبيع البيانات من كل مجموعة معالجة إلى مجموعة التحكم EBM أو VEGF (طول النبتة النسبي) قبل دمج البيانات.

6. استخراج الحمض النووي الريبي مع الخلايا المزروعة 3D

مقايسة تنبت كروية
1. قم بإجراء مقايسة تنبت كروية كما هو موضح في القسم 5.
تحلل هلام الكولاجين
1. اغسل المواد الهلامية الكروية مع برنامج تلفزيوني دافئ لمدة 5 دقائق.
2. قطع المواد الهلامية كروية إلى أرباع ونقل كل 4 أرباع في أنبوب 50 مل. استخدام مشرط للتشريح الميكانيكي للمواد الهلامية.
3. عالج عينات الجل بمحلول تحلل (يحتوي على 2 ملغ / مل كولاجيناز D في برنامج تلفزيوني) واحتضانها لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر.
4. اغسل المواد الهلامية برفق باستخدام برنامج تلفزيوني مكمل ب 2 مللي متر EDTA لإيقاف تفاعل المخزن المؤقت للتحلل.
استخراج الحمض النووي الريبي
1. أعد تعليق المواد الهلامية المحللة في 750 ميكرولتر من Trizol واحتضانها لمدة 10 دقائق لضمان استخراج الحمض النووي الريبي الكافي كما هو موضح في الخطوة 3.3.
2. أعد تعليق العينات باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر عدة مرات وانقل العينات إلى أنابيب RNA محددة منخفضة الارتباط (حجم 1.5 مل). قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

7. الكيمياء المناعية للكرويات في مصفوفة الكولاجين 3D

مقايسة تنبت كروية
1. قم بإجراء مقايسة تنبت كروية كما هو موضح في القسم 5.
التثبيت والحجب
1. إصلاح المواد الهلامية مع 4 ٪ PFA في PBS لمدة 1 ساعة.
  ملاحظة: لضمان التثبيت الجيد للخلايا الموجودة في الجل ، يجب فصل المواد الهلامية بعناية على جوانب الآبار بمشرط وملاقط بعد الشطف باستخدام برنامج تلفزيوني.
2. اغسل المواد الهلامية برفق 3-4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ثم افصلها تماما عن سطح الآبار وانقلها إلى ألواح جديدة من 24 بئرا.
3. احتضان المواد الهلامية لمدة 1 ساعة في RT مع محلول الحجب (يحتوي على 5٪ NGS و 0.1٪ Triton-X-100 في PBS) على شاكر مداري.
تلطيخ
1. احتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر مداري مع الجسم المضاد الأساسي المخفف في المخزن المؤقت المانعة.
  ملاحظة: لم يؤد تحويل المواد الهلامية أثناء هذه الحضانة إلى تحسين جودة التلطيخ.
2. في اليوم التالي ، اغسل المواد الهلامية برفق 4-5 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
3. احتضان الجسم المضاد الثانوي المقابل ، المخفف ب Phalloidin-FITC في حجب المخزن المؤقت طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر المدار.
4. قم بإجراء 4-5 خطوات غسيل إضافية باستخدام برنامج تلفزيوني.
5. انقل المواد الهلامية إلى شرائح المجهر وقم بتركيبها بقطرتين من وسيط التثبيت المحتوي على DAPI على غطاء يوضع على كل هلام. اترك العينات تجف قبل إغلاقها بطلاء الأظافر وقم بتخزينها في الظلام عند 4 درجات مئوية.
مجهريه
1. صور جميع العينات على مجهر متحد البؤر. استخدم هدف 20x وركز على منطقة الاهتمام. احصل على الصور على شكل مكدسات Z ، بالإضافة إلى صور المستوى البؤري الفردية.
  ملاحظة: يعد الحصول على صور Z-stack والمستوى البؤري في أقسام متعددة في جميع أنحاء عينة 3D أمرا ضروريا لالتقاط التمثيل الكامل ، خاصة بالنسبة للعينات ثلاثية الأبعاد السميكة.

8. الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين البشرية (HRMVECs)

ملاحظة: يمكن أيضا تنفيذ جميع الخطوات الموضحة باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة ، على سبيل المثال ، الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين البشرية (HRMVECs). في هذه الحالة ، يجب تحويل الوسط إلى وسط خلية بطانية وعائية دقيقة محددة تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) للزراعة بالإضافة إلى خطوات محددة في كل فحص. وترد أدناه الاختلافات الخاصة بلجنة إدارة الموارد البشرية والمالية والنقدية لبروتوكولات المقايسة:

فحص جرح الخدش
1. زراعة الخلايا في 10٪ FBS وسط الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة بدلا من EGM.
2. بذرة 20000 خلية / بئر.
3. لا تجوع الخلايا بين عشية وضحاها.
4. بعد إجراء الخدش ، قم بتغيير وسط الخلية البطانية المتوسطة إلى القاعدية التي تحتوي على 5٪ FBS بدلا من EBM مع 2٪ FBS.
الكيمياء المناعية ل 2D HRMVECs المزروعة
1. زراعة الخلايا في 10٪ من وسط الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة بدلا من EGM.
2. لا تجوع الخلايا بين عشية وضحاها.
3. قم بتغيير الوسيط قبل العلاج مباشرة إلى EBM + 5٪ FBS بدلا من EBM + 2٪ FBS.
مقايسة تنبت كروية
1. قم بزرع الخلايا كقطرات معلقة مع وسط خلية بطانية للأوعية الدموية الدقيقة تحتوي على 10٪ FBS بدلا من EGM.
الكيمياء المناعية للكرويات في مصفوفة الكولاجين 3D
1. قم بزرع الخلايا كقطرات معلقة مع وسط خلية بطانية للأوعية الدموية الدقيقة تحتوي على 10٪ FBS بدلا من EGM.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لفحص الترحيل ، من الأهمية بمكان إجراء فحص شامل للصور الملتقطة عند النقطة الزمنية t = 0 h لضمان اكتشاف النظام بدقة وجود طبقة أحادية الخلية كاملة التكوين (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك ، يجب تأكيد وضوح واستقامة حدود الخدش (الشكل 1 ب). يجب أن تكون المنطقة الخالية من الزنزانات خالية إلى حد كبير من الحطام. في نهاية الفحص ، يجب أن تظهر المجموعة المحفزة ، على سبيل المثال ، 25 نانوغرام / مل VEGF كعنصر تحكم إيجابي هجرة ناجحة في المنطقة الأصلية المخدوشة (الشكل 1 ب). قد تظهر حالة من المشكلات الفنية على شكل نمو غير مكتمل للخلايا أو خدش مزدوج أو تموج في حدود الخدش (الشكل 1C). علاوة على ذلك ، من المهم إنشاء نطاق ديناميكي كبير بين التحكم السلبي (العينات المحفزة بواسطة EBM) والتحكم الإيجابي (عينات VEGF) (الشكل 1 د). في إعدادنا التجريبي ، نعتبر زيادة بنسبة 25٪ في RWD بعد 12 ساعة كنطاق مثالي (الشكل 1D). في الفحص الإشكالي الفني ، لا يتم فصل عناصر التحكم الإيجابية والسلبية بشكل صحيح ، مما يشير إلى نطاق ديناميكي منخفض (الشكل 1E).

تلطيخ كيميائي مناعي ل HUVECs على أغطية ، يتم تصوره تحت مجهر مضان للتحقق من صحة التلوين الناجح (الشكل 1F). من المهم مسح غالبية الخلايا وتحديد منطقة مميزة للشريحة. يتم تقييم خصوصية التلوين باستخدام شريحة تحكم تعالج فقط بجسم مضاد ثانوي لاستبعاد الارتباط غير المحدد (الشكل 1F). يجب فحص إشارات التلوين المحددة بشكل نقدي وفقا للتوطين تحت الخلوي المعروف للبروتين المستهدف. نستخدم أنماط التوطين تحت الخلوية جنبا إلى جنب مع عدم وجود إشارة في عينة التحكم كمؤشرات لبروتوكول تلطيخ مناعي ناجح.

وبالمثل ، يجب مراعاة جوانب معينة لمقايسات تنبت كروية عالية الجودة. يجب تقييم الجودة ، في هذه الحالة ، في نهاية الفحص عند ، على سبيل المثال ، t = 24 h. يجب أن تظهر مصفوفة الكولاجين التي لوحظت تحت المجهر تجانسا ويجب ألا تبدو قابلة للتفتيت أو خشنة (الشكل 2 ب). يجب تمييز الكرات الكروية المحفزة بوسط قاعدي فقط كعنصر تحكم سلبي و 25 نانوغرام / مل VEGF كعنصر تحكم إيجابي بوضوح (الشكل 2 ب). علاوة على ذلك ، يجب أن تطفو الأجسام الكروية في الجل ولا تسقط على الأرض ، حيث تتشتت ، مما يشير إلى جودة منخفضة (الشكل 2C). غالبا ما تنشأ هذه المشكلة من عدم كفاية تبريد الكولاجين أثناء معايرة الخليط أو من زيادة أو نقص معايرة الأس الهيدروجيني (الشكل 2C). يجب أن يكون ما لا يقل عن 10 كرويات لكل بئر قابلة للتصوير لكل بئر. يجب أن يظهر التحكم السلبي (العينات المحفزة بواسطة EBM) معدل إنبات خط الأساس المعتدل ، في حين أن VEGF ، الذي يعمل كعنصر تحكم إيجابي ، يضاعف بشكل مثالي أو يفضل مضاعفة RSL ثلاث مرات مقارنة بعناصر التحكم (الشكل 2D ، الرسم البياني الأيسر). يجب أن يظهر عدد البراعم أيضا نطاقا ديناميكيا مشابها (الشكل 2D ، الرسم البياني الأيمن). لن يظهر الفحص التقني دون المستوى الأمثل هذا النطاق الديناميكي بين عناصر التحكم ، وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى تفسير خاطئ للبيانات (الشكل 2E).

تعتبر البقع التناظرية إلى ثنائية الأبعاد ، وفحص الشرائح تحت المجهر الفلوري والتقييم النقدي للهياكل الملطخة ذات أهمية كبيرة لنجاح التلوين (الشكل 2F). إذا كان التوطين الخلوي للهياكل وشدة الإشارة مقارنة بالتحكم مفهوما ، فيمكن افتراض أن التلوين كان ناجحا.

figure-results-1
الشكل 1: مقايسة هجرة جرح الخدش بتصوير الخلايا الحية. (أ) مخطط مقايسة هجرة جرح الخدش. (ب) صور تعرض نسخة تقنية عالية الجودة عند t = 0 h و t = 12 h. تم تحفيز الخلايا ب 25 نانوغرام / مل VEGF لتكون بمثابة عنصر تحكم إيجابي. (ج) أمثلة على مكررين تقنيين منخفضي الجودة عند t = 0 h بسبب الخدش غير السليم أو الخدش المزدوج. (د) نتائج مقايسة هجرة جرح الخدش الناجحة. تم تصور الفصل الصحيح للتحكم الإيجابي المحفز ب 25 نانوغرام / مل VEGF والتحكم السلبي الذي تم معالجته للتو بالوسط القاعدي بواسطة مخطط كمان عند t = 12 h. وتشمل البيانات 7-8 مكررات تقنية لكل مجموعة. (ه) نتائج نموذجية تسلط الضوء على فشل اختبار هجرة جرح الخدش. تم تصور الفصل دون المستوى الأمثل للتحكم الإيجابي المحفز ب 25 نانوغرام / مل VEGF والتحكم السلبي الذي تم معالجته للتو بالوسط القاعدي بواسطة مخطط كمان عند t = 12 ساعة. وتشمل البيانات 7-8 مكررات تقنية لكل مجموعة. (و) صور نموذجية لمركبات HUVEC مصنفة على أغطية وملطخة ل DAPI و phalloidin و VEGF-R2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مقايسة تنبت كروية. (أ) مخطط مقايسة تنبت كروية. (ب) صور تعرض التحكم السلبي (كرويات محفزة متوسطة قاعدية) والتحكم الإيجابي (كرويات محفزة VEGF 25 نانوغرام / مل) لمقايسة فنية مثالية في النهاية عند t = 24 h. (C) أمثلة على اثنين من الكرويات منخفضة الجودة عند t = 24 h. تصور الصور اليسرى كرويا تالفا سقط إلى أسفل اللوحة ، مما يؤدي إلى ارتخاء الجسم الكروي ومعدل إنبات محسن بشكل غير طبيعي. تصور الصورة اليمنى الكولاجين مع بقع ملونة ملحوظة ، مما يخلق بيئة غير متجانسة للغاية تضر بشكل كبير بجودة الفحص. (د) تحليل RSL (الرسم البياني الأيسر) وعدد البراعم (الرسم البياني الأيمن) للمقايسة الناجحة مع نطاق ديناميكي جيد بين التحكم السلبي والإيجابي. يتم تصور البيانات باستخدام مؤامرة الكمان وتشمل 10-25 كروية لكل مجموعة. (ه) تحليل RSL (الرسم البياني الأيسر) وعدد البراعم (الرسم البياني الأيمن) لمقايسة إشكالية فنية مع نطاق ديناميكي دون المستوى الأمثل بين التحكم السلبي والإيجابي. يتم تصور البيانات باستخدام مؤامرة الكمان وتشمل 10-25 كروية لكل مجموعة. (F) صور نموذجية لمركبات HUVECs من مقايسة تنبت كروية ملطخة ل DAPI و phalloidin و VEGF-R2.c

الملف التكميلي 1: تعليمات لإعداد محلول مخزون الميثوسيل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: المكون الإضافي SpheroidCount.ijm. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا التقرير ، قدمنا مجموعة من التقنيات مع قراءات وظيفية وجزيئية لدراسة تكوين الأوعية في المختبر.

يمثل اختبار الهجرة تقنية راسخة تستخدم في جميع مجالات العمل المختبري الرطب. لقد اخترنا نهج تصوير الخلايا الحية المتاح تجاريا للاستفادة من تنسيق 96 بئرا المناسب لتجارب الفحص والاستجابة للجرعة ، وحجم الجرح القياسي والقابل للتكرار الذي تم إنشاؤه بواسطة أداة WoundMaker ، وفرصة مراقبة حركة الهجرة من خلال التصوير بفاصل زمني على مدار ما يصل إلى 24 ساعة بالإضافة إلى برنامج القياس الكمي الآلي للصور. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى وجود نظام تصوير خلايا الحياة المجهز ببرنامج تحليل تولد الأوعية في المختبر أو منشأة أساسية. تم إنشاء العديد من الإعدادات التجريبية البديلة التي لا تتطلب مجاهر تصوير خلايا حية محددة أو معدات خاصة أخرى¹⁰.

بناء على تجربتنا ، من الأهمية بمكان تحسين إعدادات المحلل ، حيث يمكن أن تميل HUVECs وأنواع الخلايا البطانية الوعائية الأخرى إلى توفير تباين ضعيف ، مما يعيق القراءة الآلية بواسطة برنامج المجهر. لمعالجة هذه المشكلة ، يمكن تقديم خطوة تلطيخ مضان إضافية (على سبيل المثال ، تلطيخ الخلايا الحية). تدعم أنظمة التصوير بالخلايا الحية مثل هذا التلوين وحتى التلوين متعدد الألوان لتتبع البروتين محل الاهتمام. أحد القيود الرئيسية للفحص هو أن التمييز بين هجرة الخلايا وانتشارها ليس دائما واضحا وأن نتائج الفحص تمثل مزيجا من كلتا العمليتين. يحاول حل تصوير الخلايا الحية المستخدم في هذه الدراسة معالجة هذه المشكلة من خلال إدخال كثافة الجرح النسبية (RWD). على عكس الالتقاء المستخدم تقليديا في المنطقة المخدوشة ، يقوم RWD بتقييم التقاء المنطقة المخدوشة بالنسبة إلى المنطقة المخدوشة الخارجية. تعمل الهجرة في المنطقة المخدوشة على رفع RWD عن طريق زيادة الالتقاء داخلها مع تقليل الالتقاء خارج المنطقة المخدوشة في نفس الوقت بسبب هجرة الخلايا. على العكس من ذلك ، يزيد تكاثر الخلايا أيضا من التقاء المنطقة المخدوشة ، وبالتالي تقليل RWD. ومن المهم الاعتراف بذلك بوصفه نهجا للتحليل الاستراتيجي لا يؤدي إلا إلى الحد من أثر الانتشار على القراءة النهائية. وقد تكون هناك حاجة إلى مقايسات تكميلية للانتشار لمعالجة هذه المسألة. بدلا من ذلك ، يمكن إضافة مثبطات دورة الخلية مثل ميتوميسين C إلى الفحص لمنع الانتشار. يجب تحسين تنفيذ البروتوكولات باستخدام هذه المثبطات بعناية في كل مختبر لتحقيق التأثير المطلوب دون تقليل النطاق الديناميكي للفحص. علاوة على ذلك ، من خلال زيادة وتيرة المسح لكل بئر ، يوفر هذا الإعداد فرصة سهلة التنفيذ لتتبع الخلايا المتحركة بدقة على المستوى الفردي إذا كان هذا التتبع التفصيلي ذا أهمية خاصة.

بينما يوضح اختبار ترحيل التصوير بالخلايا الحية ميزة قابلية التوسع والتحليلات الآلية غير المتحيزة ، سلطت دراستنا السابقة الضوء على قدرة مقايسة تنبت كروية على التقاط تفاصيل أكثر تعقيدا عن تكوين الأوعية. يتضمن ذلك الجوانب الأساسية مثل تكوين خلية الطرف والساق ، وتفاعل مصفوفة الخلية ، ومفتاح تحلل السكر¹². لضمان استنساخ الفحص ، يجب أن يكون الباحث من ذوي الخبرة في إعداد مصفوفة الكولاجين ، حيث يمكن أن تؤثر الاختلافات في درجة الحموضة ودرجة الحرارة أثناء هذه العملية على النتائج. علاوة على ذلك ، يتم إجراء التحليل يدويا. وبالتالي فإن تحليل الصور يستغرق وقتا طويلا ويحتوي على مخاطر التحيز. يعد الإخفاء المناسب للظروف أثناء التحليل أمرا ضروريا لمنع إدخال التحيز. لمعالجة هذا القلق ، اقترحنا مؤخرا نهجا قائما على الشبكة العصبية لتحديد وتخفيف التحيز المحتمل في تحليل مقايسات البراعم ، والتي يمكن تنفيذها بسهولة¹⁷. في الختام ، فإن أفضل طريقة للتحقق من صحة النتائج هي الجمع بين كلا المقايسات. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان الاعتراف بأن الاختلافات قد تنشأ بسبب الطبيعة المميزة لإعدادات 2D و 3D¹².

نظرا لوجود مجموعة واسعة من فحوصات تكوين الأوعية الدموية في المختبر 2D و 3D ، فمن المهم مراعاة مزايا وعيوب المقايسات المقدمة مقارنة بالطرق الأخرى. يركز فحص جرح الخدش ، على سبيل المثال ، على الهجرة الأفقية 2D على طبق بلاستيكي ، بينما يميز فحص غرفة Boyden الهجرة الرأسية من خلال إدراج شبكي مع جاذب كيميائي في "الغرفة الخارجية". استنادا إلى الإعداد البسيط والقراءة ، يسمح فحص جرح الخدش بإجراء تجارب عالية الإنتاجية ، لا سيما في تنسيق 96 بئرا ، مما يوفر قابلية عالية للتكرار بالإضافة إلى إمكانية تصور التجربة وإجراء فاصل زمني. لسوء الحظ ، فإن عيوب فحص جرح الخدش هي صعوبة التمييز بين الانتشار والهجرة ، والحاجة إلى خلايا ملتصقة ، وفي حالة عدم وجود أداة صانع الجروح ، تباين أعلى بسبب الخدوش غير المتكافئة. تتميز قراءة فحص غرفة بويدن بميزة قياس التأثير الكيميائي للمواد القابلة للذوبان على الخلايا المتحركة¹⁸ وتسلط الضوء على كل من الغزو والهجرة. لسوء الحظ ، تتمثل العيوب في ضعف قابلية التكرار والتباين العالي للفحص ، وعدم القدرة على تصور حركة الخلايا ، والعدد الكبير من الخلايا المهاجرة المطلوبة للحصول على إشارة ، والإعداد والقراءات الطويلة والمتقنة ، فضلا عن عدم وجود فرصة لإعداد الفاصل الزمني¹⁹.

يحدد فحص تنبت كروي تنبت الخلايا البطانية في مصفوفة هلام 3D ، في حين أن مقايسة تكوين الأنبوب تميز تكوين الأنابيب الخلوية على سطح مصفوفة هلام²⁰. يتميز الفحص المنبت بتوصيف غزو الخلايا في مصفوفة بالإضافة إلى الانتشار والهجرة. العيوب هي التباين العالي لهلام الكولاجين المعاير ، وبناء على ذلك ، جودة الكائنات الكروية. تتمثل ميزة فحص تكوين الأنبوب في تكوين أنابيب الأوعية الدموية بعد فترة زمنية مميزة (تعتمد على السيتوكين) ونهج سهل. العيوب هي عدم غزو الخلايا وتأثير Matrigel نفسه على تكوين الأنبوب²¹.

تم إجراء جميع التجارب المقدمة مع HUVECs. من المعروف أن هناك اختلافات كبيرة في سلوك الخلايا البطانية الوعائية من أصول مختلفة (على سبيل المثال ، الأوعية الدموية الكبيرة مقابل الأوعية الدموية الدقيقة)^22,23. وبالتالي قد يكون من الضروري التحقق من صحة النتائج التجريبية مع خطوط الخلايا البطانية الوعائية الأخرى. كانت الإعدادات التجريبية قابلة للنقل لبطانة الأوعية الدموية الدقيقة في شبكية العين البشرية (HRMVECS) ، باستثناء حقيقة أن HRMVECs تتطلب تركيزات أعلى من FBS. من ناحية أخرى ، لا يمكن استخدام خط الخلايا البطانية الأبهرية البقرية شائعة الاستخدام (BAECs) في مقايسة تنبت كروية بسبب معدل النبتة القاعدية المفرط.

يشترك كلا المقايسين المقدمين في القيد المتمثل في أنهما محصوران في نوع خلية واحد. بالنظر إلى أن تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي هو عملية معقدة متعددة الخلايا ، فإن هذا الجانب الحاسم لا يتم التقاطه بدقة من خلال أي من الفحص. تم تطوير اختلافات الاستزراع المشترك لكلا المقايسات ، مع التركيز بشكل خاص على مقايسة تنبت كروية ، وتمت مناقشتها مؤخرا¹⁰^،²⁴. بدلا من ذلك ، يمثل التحقق من صحة البيانات مباشرة في نماذج تكوين الأوعية ذات الصلة في الجسم الحي خيارا قابلا للتطبيق. تشمل المقايسات المنشأة لهذا الغرض نموذج الفأر لاعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) ²⁵ ، ونموذج الأوعية الدموية المشيمية المستحثة بالليزر (Laser-CNV)²⁶ ، ومقايسة^{القابس 27}.

بشكل عام ، يوفر كل من مقايسة ترحيل تصوير الخلايا الحية 2D ومقايسة تنبت كروية 3D ، جنبا إلى جنب مع أدوات التحليل الجزيئي المقدمة ، منصة قوية لأبحاث تكوين الأوعية الدموية ومعترف بها على نطاق واسع داخل مجتمع تكوين الأوعية. إن الجمع بين هذه المقايسات والتحليلات اللاحقة في الجسم الحي للتحقق من صحة النتائج يوفر أساسا متينا للتحقيق في أسئلة محددة متعلقة بتكوين الأوعية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح في هذا المشروع.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون صوفي كروجر وغابرييل برينز على دعمهما الفني الممتاز. نشكر سيباستيان ماير على تطوير المكون الإضافي ImageJ لتحديد براعم الكرة الأرضية ومرفق المنارة الأساسي ، Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ) ، قسم الطب الأول ، مستشفى جامعة فرايبورغ لاستخدام نظام IncuCyte. تم إنشاء الرسومات باستخدام biorender.com. تم دعم هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135 / 3-1 + Bu3135 / 3-2 to F.B] ، و Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Berta-Ottenstein-Program للعلماء السريريين والعلماء السريريين المتقدمين إلى F.B.] ، و Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 to F.B.] و "زمالة CORTEX للعلماء السريريين إلى JR] و Volker Homann Stiftung [إلى JN + F.B.] و "Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburg إ. ف." [إلى P.L.]

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10x متوسط 199	Sigma-Aldrich	M0650
Alexa Fluor 647 مترافق AffiniPure F (ab) ' 2-جزء	جاكسون IR & nbsp ؛	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK الأنظمة
الكولاجين من النوع 1 ذيل الفئران	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
الخلية البطانية القاعدية المتوسطة	Lonza	CC-3156	EBM
نمو الخلايا البطانية المتوسطة	Lonza	CC-3162	EGM
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ؛	سيرفا	11290.02	EDTA
مصل الأبقار الجنيني	Bio& بيع	S 0615	FBS
الخلايا البطانية للوريد السري البشري ، مجمعة	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 نظام تحليل الخلايا الحية	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
وسط الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة مع 10٪ FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein isothiocyanate المسمى (0.5 مجم / مل ميثانول)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
أنظمة الخلايا البطانية	الخلايا	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant مع NucBlue	Invitrogen بواسطة ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
عامل النمو البطاني للأوعية الدموية البشرية	المؤتلف PeproTech	100-20	VEGF
طبق بتري المربع	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (أحادي النسيلة)	شركة ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
صانع الجروح	Sartorius	4493

البصرية الشبكية الدقيقة للشبكية البشرية أنظمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
Gariano, R. F., Gardner, T. W. Retinal angiogenesis in development and disease. Nature. 438 (7070), 960-966 (2005).
Mancuso, M. R., Kuhnert, F., Kuo, C. J. Developmental angiogenesis of the central nervous system. Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 173-180 (2008).
Tonnesen, M. G., Feng, X., Clark, R. A. Angiogenesis in wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 5 (1), 40-46 (2000).
Folkman, J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis. Semin Oncol. 29, 6 Suppl 16 15-18 (2002).
Crawford, T. N., Alfaro, D. V., Kerrison, J. B., Jablon, E. P. Diabetic retinopathy and angiogenesis. Curr Diabetes Rev. 5 (1), 8-13 (2009).
Ng, E. W., Adamis, A. P. Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration. Can J Ophthalmol. 40 (3), 352-368 (2005).
Blanco, R., Gerhardt, H. Vegf and notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (1), 006569(2013).
Hellström, M., Kalén, M., Lindahl, P., Abramsson, A., Betsholtz, C. Role of PDGF-B and PDGFR-β in recruitment of vascular smooth muscle cells and pericytes during embryonic blood vessel formation in the mouse. Development. 126 (14), 3047-3055 (1999).
Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. J Cell Sci. 112, Pt 19 3249-3258 (1999).
Rapp, J., et al. 2D and 3D in vitro angiogenesis assays highlight different aspects of angiogenesis. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1870 (3), 167028(2024).
Rapp, J., et al. STAT3 signaling induced by the IL-6 family of cytokines modulates angiogenesis. J Cell Sci. 136 (1), 260182(2023).
Heiss, M., et al. Endothelial cell spheroids as a versatile tool to study angiogenesis in vitro. FASEB J. 29 (7), 3076-3084 (2015).
Rapp, J., et al. Oncostatin m reduces pathological neovascularization in the retina through müller cell activation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (1), 22(2024).
Fagotto, F., Gumbiner, B. M. Cell contact-dependent signaling. Dev Biol. 180 (2), 445-454 (1996).
Rapp, J., et al. Addressing bias in manual segmentation of spheroid sprouting assays with U-Net. Mol Vis. 29, 197-205 (2023).
Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the Boyden chamber assay. J Vis Exp. (129), e56337(2017).
Decicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
Vernon, R. B., Angello, J. C., Iruela-Arispe, M. L., Lane, T. F., Sage, E. H. Reorganization of basement membrane matrices by cellular traction promotes the formation of cellular networks in vitro. Lab Invest. 66 (5), 536-547 (1992).
Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology. Microvasc Res. 55 (1), 65-76 (1998).
Müller, A. M., Hermanns, M. I., Cronen, C., Kirkpatrick, C. J. Comparative study of adhesion molecule expression in cultured human macro-and microvascular endothelial cells. Exp Mol Pathol. 73 (3), 171-180 (2002).
Chiew, G. G. Y., Wei, N., Sultania, S., Lim, S., Luo, K. Q. Bioengineered three-dimensional co-culture of cancer cells and endothelial cells: A model system for dual analysis of tumor growth and angiogenesis. Biotechnol Bioeng. 114 (8), 1865-1877 (2017).
Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (1), 101-111 (1994).
Lambert, V., et al. Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice. Nat Protoc. 8 (11), 2197-2211 (2013).
Kastana, P., et al. Matrigel plug assay for in vivo evaluation of angiogenesis. Methods Mol Biol. 1952, 219-232 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

التحقيق في تكوين الأوعية الدموية على المستوى الوظيفي والجزيئي من خلال الاستفادة من مقايسة هجرة جرح الخدش ومقايسة تنبت كروية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة