يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة وغير مميتة لشراء الغدد الجار درقية من الخنازير. يتكون الإجراء من ثلاث خطوات رئيسية: تحضير الخنازير بالتخدير ، واسترجاع الغدة الصعترية من جانب واحد ، وتحديد الغدة الجار درقية داخل الجسم الصعبة واستخراج الغدة الجار درقية داخل الجسم الصعب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
شراء الغدد الجار درقية من الخنازير المانحة الحية وتحديد هوية Ex Vivo
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
قصور الدريقات ، الذي غالبا ما ينتج عن مضاعفات جراحية ، يعطل بشدة توازن الكالسيوم ، مما يؤدي إلى أعراض معوقة. تقدم العلاجات الحالية راحة محدودة ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى علاجات بديلة مثل زرع الغدة الجار درقية. تقدم هذه الدراسة طريقة بسيطة لشراء الغدة الجار درقية من متبرع حي من الخنازير ، مع تطبيقات محتملة في أبحاث الزرع ، خاصة في مجال زرع الأجانب. يتضمن الإجراء ثلاث خطوات رئيسية: تحضير الخنازير بالتخدير ، واسترجاع الغدة الصعترية من جانب واحد ، وتحديد الغدة الجار درقية داخل الجسم الحي واستخراجها. يستخدم البروتوكول خنازير Landrace ، مع إجراءات تضمن العلاج الأخلاقي والتعافي بعد العملية. نجحنا في استخراج الغدد الجار درقية ، مما يؤكد صلاحيتها وسلامتها من خلال التحليل اللاحق. تجاوزت مستويات PTH في المادة الطافية للأنسجة 1,000 بيكوغرام / مل ، وميز تلطيخ التألق المناعي الغدد الجار درقية عن أنسجة الغدة الصعترية ، مما يثبت موثوقية الإجراء. يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة وغير مميتة وسليمة أخلاقيا لشراء الغدة الجار درقية من الخنازير ، ومعالجة الاختلافات التشريحية بين الخنازير والبشر. إنه يوفر نهجا مستداما له آثار كبيرة على أبحاث قصور الدريقات وزرع الأجانب.
المقدمة
يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة وغير مميتة لشراء الغدة الجار درقية من الخنازير. قصور الدريقات ، الذي يتميز بعدم كفاية إفراز الهرمونات المجاورة ، يعطل بشكل خطير توازن الكالسيوم1. تتجلى هذه الحالة ، التي هي في الغالب من المضاعفات الجراحية بعد استئصال الغدة الجار درقية أو استئصال الغدة الدرقية ، من خلال أعراض مثل الوهن والألم المزمن وعدم انتظام دقات القلب والنوبات وحتى مرض الكلى في المرحلةالنهائية 2. في بعض الأحيان ، ينشأ من اضطرابات المناعة الذاتية أو الوراثية النادرة. العلاجات الحالية ، وخاصة مكملات الكالسيوم وفيتامين د عن طريق الفم أو الهرمون المؤتلف ، توفر راحة جزئية فقط من الأعراض الجهازية مثل التعب والاكتئاب3،4. تؤكد الضرورة المتزايدة لزرع الغدة الجار درقية كعلاج محتمل لقصور الدريقات الشديد على ضرورة إنشاء بروتوكولات زرع موحدة5،6،7،8،9. ومع ذلك ، لا تزال الدراسات قبل السريرية حول زرع الغدة الجار درقية محدودة ، وهناك نقص في النماذج الحيوانية الموحدة. علاوة على ذلك ، فإن الزيادة الأخيرة في مجال زرع الأعضاء10 ، 11 ، تزيد من الاهتمام بالتطبيقات السريرية لزرع الأعضاء ، خاصة في مجال العلاج بخلايا الغدد الصماء12 ، 13. ومع ذلك ، فإن نماذج الخنازير لزرع الغدة الجار درقية تمثل تحديا بسبب تعقيد تحديد أنسجة الغدة الجار درقية في الخنازير. وبالتالي ، هناك حاجة لتوفير تقنية قابلة للتكرار ومستدامة وأخلاقية لاستعادة الغدد الجار درقية من الخنازير لتطوير زراعة الغدة الجار درقية.
على عكس البشر ، الذين لديهم عادة أربع غدد جار درقية تقع خلف الغدة الدرقية ، تمتلك الخنازير ، بالنسبة لمعظم الناس ، غدتين من الغدة الجار درقية ، تقع كل منهما في الجزء الجمجمي من الغدة الصعترية. اعتمدت الدراسات السابقة التي تهدف إلى تحديد موقع الغدد الجار درقية في الخنازير إما على طرق مميتة لتحديد الهوية خارج الجسم الحي أو التقنيات القائمة على الفلوروفور ، والتي قد يكون من الصعب تنفيذها في زرع الأعضاء في زرع الأعضاء14 ، 15 ، 16. نقترح هنا تقنية بسيطة وغير مميتة ، مناسبة لزرع الأعضاء ، بناء على خطوتين رئيسيتين: استرجاع الغدة الصعترية الخنازير وتحديد الغدة الجار درقية خارج الجسم الحيباستخدام الإضاءة. قد تكون هذه التقنية مفيدة للبحث في فسيولوجيا الغدة الجار درقية، وكذلك الزرع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الدراسات التي أجريت على من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة ليل (المشار إليها # 20491-20190219161313).
1. تخدير الخنازير
- تطبيق البوبرينورفين (0.015 ملغ/كغ، في العضل) قبل 30 دقيقة من الشق الأول لتوفير التسكين قبل الجراحة.
- إجراء حقن عضلي من الكيتامين (50 ملغ/كغ) والزيلازين (3 ملغ/كغ) للحث على التخدير. تطبيق 5٪ إيزوفلوران عن طريق الاستنشاق لمدة 3-5 دقائق لتعميق التخدير.
- قم بتقييم عمق التخدير عن طريق فحص منعكس إغلاق الجفن وانفعال البلع. قم بتنبيب الخنزير ووضعه ضعيفا على طاولة العمليات. تقليل تركيز الأيزوفلوران إلى 2٪ عن طريق الاستنشاق للحفاظ على التخدير.
- راقب باستمرار معدل ضربات القلب وتشبع الأكسجين باستخدام جهاز مراقبة بيطري محمول متعدد المعلمات لضمان عمق التخدير الأمثل والاستقرار الفسيولوجي طوال العملية.
2. عرض مجال الاهتمام
- حلق وتنظيف منطقة عنق الرحم بدقة ، تمتد من المنطقة تحت الفك السفلي إلى عظم القص.
- ضع صابونا مطهرا ، متبوعا بالكلورهيكسيدين ، لضمان حقل معقم. جفف المنطقة بأكملها تماما.
- ضع الستائر المعقمة لعزل منطقة عنق الرحم الأمامية للتدخل الجراحي.
3. التعرض للغدة الصعترية الخنازير
- قم بإجراء شق عمودي 10 سم على طول خط عنق الرحم الأبيض باستخدام مشرط. قم بتشريح المنطقة بعناية باستخدام مقص Metzenbaum لفصل عضلات ما قبل الغدة الدرقية ، مما يخلق مجالا جراحيا واضحا.
- ضع ضام ذاتي الاحتفاظ بين العضلة الواهية والغضروف الغدري لتسهيل تشريح النسيج الضام وفضح الغدة الصعترية.
ملاحظة: تجنب الضغط المفرط على القصبة الهوائية لمنع الإصابة. - قم بتعريض الجزء الجمجفي من الغدة الصعترية تدريجيا وافصله بعناية عن غمد الشريان السباتي الذي يحتوي على العصب المبهم والوريد الوداجي الداخلي والشريان السباتي المشترك.
ملاحظة: لمنع الإصابة ، استخدم التخثير الكهربائي لتحقيق الإرقاء.
4. استرجاع الغدة الصعترية الخنازير
- بمجرد إطلاقه ، استخرج الجزء الجمجفي من الغدة الصعترية ، والذي يبلغ قياسه عادة من 5 إلى 8 سم.
- اشطف الغدة الصعترية المستخرجة في محلول ملحي متساوي التوتر لتسهيل التعرف على الغدة الجار درقية.
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتعزيز التصور والتمايز في نسيج الغدة الجار درقية المميز
5. تحديد الغدة الجار درقية داخل الغدة الصعترية خارج الجسم الحي
- قم بتسطيح أنسجة الغدة الصعترية برفق لتسهيل التعرف على الغدة الجار درقية.
ملاحظة: تظهر الغدة الجار درقية نسيجا مميزا ، لا سيما بالمقارنة مع الأنسجة المحيطة. الكبسولة الليفية للغدة الجار درقية أكثر صلابة وذات حجم مماثل للحبة البازلاء. - استخدم مصدر ضوء للتعرف على الغدة الجار درقية عن طريق الإضاءة.
ملاحظة: يجب أن تكون الأوعية الدموية المحيطة بالغدة الجار درقية مرئية بوضوح ، مما يساعد في تمايزها. - استئصال الكبسولة بعناية واستخرج الغدة الجار درقية بأكملها. استخدام ملقط ديباكي للتعامل الدقيق ومقص ميتزينباوم للتشريح الدقيق. عزل الغدة عن أنسجة الغدة الصعترية المحيطة.
- ضع الغدة الجار درقية المعزولة في محلول التخزين البارد وحافظ عليها عند 4 درجات مئوية للحفاظ على صلاحيتها للإجراءات اللاحقة.
- قم بتضمين الأنسجة في البارافين لمزيد من المعالجة.
6. الإغلاق الجراحي والاستيقاظ
- بعد استرجاع الغدة الجار درقية ، أغلق موقع الجراحة في طبقات. خياطة العضلات والأنسجة تحت الجلد باستخدام خيوط قابلة للامتصاص. أغلق الجلد بخيوط غير قابلة للامتصاص.
- فطم الخنزير تدريجيا عن التخدير. عند استعادة الوعي ، راقب الخنزير بحثا عن مضاعفات ما بعد الجراحة مباشرة.
- يجب تطبيق المسكنات والمضادات الحيوية وفقا لبروتوكول ما بعد الجراحة (بوبرينورفين 0.03 à 0.05 ملغ/كغ وكلاموكسيل 15 ملغ/كغ لمدة 48 ساعة). أعد الخنازير إلى منشأتها السكنية للتعافي تحت إشراف بيطري.
7. بروتوكول التلوين المناعي
- قم بإجراء إزالة البارافينات والجفاف من عينات البارافين: الزيلين لمدة 5 دقائق ، الزيلين لمدة 10 دقائق ، 100٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، 90٪ إيثانول لمدة 7 دقائق و 30 ، 70٪ إيثانول لمدة 7 دقائق و 30 ، 50٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، الماء المقطر لمدة 5 دقائق و الفوسفات - العازل الملحي (PBS) لمدة 5 دقائق.
- قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق وضع العينات في الميكروويف في الرقم الهيدروجيني المخزن المؤقت للسترات 6 ، عند 650 واط لمدة 9 دقائق. اترك العينات لتبرد في المخزن المؤقت لمدة 20 دقيقة. اشطف ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- احتضان العينات ، المحاطة بقلم داكو ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة بمحلول كتلة البروتين لمنع الارتباط غير المحدد.
- احتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الجسم المضاد الأساسي (الجسم المضاد PTH (H-7) ، Mouse IgG-α-human ، sc-398856 ، 1: 100) المخفف في 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA). يغسل مرتين باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- احتضان لمدة ساعة و 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الجسم المضاد الثانوي (Alexa Fluor 488 ، goat-α-mouse ، A11001 ، 1: 500) المخفف في زلالات مصل البقر بنسبة 1٪. يغسل مرتين باستخدام PBS ومرة بالماء المقطر المزدوج لمدة 5 دقائق.
- قم بتركيب الشرائح بمحلول DAPI وقم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تشمل النتائج الأولية لهذه الدراسة الاستخراج الناجح للغدد الجار درقية من خنازير Landrace والتحليل اللاحق لتأكيد قابليتها للحياة وسلامتها. يتم تلخيص النتائج على النحو التالي. تم تأكيد تحديد أنسجة الغدة الجار درقية أثناء الجراحة عن طريق الإضاءة. بعد الاستخراج ، تم جمع عينتين صغيرتين من الأنسجة (حوالي 10٪ لكل منهما). تم فرم عينة واحدة في طبق طبق في 1 مل من وسط الاستزراع DMEM-F12. بعد الفرم ، تم جمع 1 مل من المادة الطافية ، وتم تقييم مستويات PTH باستخدام مقايسة PTH السريعة أثناء الجراحة ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة وغير مميتة لشراء الغدة الجار درقية في الخنازير. تتضمن الخطوة الرئيسية في البروتوكول توطين الغدة الصعترية الخنازير لضمان الاسترداد الكامل لمزيد من التحقيق خارج الجسم الحي . بمجرد استخراج الغدة الصعترية ، يمكن التعرف بسهولة على الغدة الجار درقية باستخدام الإضاءة.
يتمثل أحد التحديات الرئيسية لهذه التقنية في الحاجة إلى تجنب الاعتماد على العادات الجراحية البشرية المرتبطة باستئصال الغدة الجار درقية ، حيث يتحايل بروتوكولنا على...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
ونود أن نتوجه بخالص الشكر إلى الجمعية الفرنسية للسكري ومؤسسة البحث الطبي، على دعمهما وتمويلهما للبحوث.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي> المعدات< / قوي>22G | |||
| القسطرة الطرفية القصيرة | سميث الطبية | 5060 | |
| مجموعة أساسية II، كريب | هارتمان | 9389253 | |
| بوباك (bupr & eacute; نورفين) | Virbac | ||
| Clippers Favorita II | Aesculap Schermaschinen | GT104 | |
| مشارط يمكن التخلص منها | Swann-Morton | 0510 | |
| ملعقة كهربائية | Erbe | 21191-002 | |
| مولد الجراحة الكهربائية BE VIO 200p | Erbe | 10140-400 | |
| Euroklav 23 VS + | MELAG | 10056 | |
| صمام ضخ الجاذبية 3 اتجاهات مع طرف قفل لور المحمول | Care Fusion | A64-3V | |
| مقبض مع زرين للأقطاب الكهربائية Slim-Line ؛ | Erbe | 20190-065 | |
| Isoflurane Funnel Fill Vaporizer | Supera Anesthesia Innovations | VAP3000 | |
| Isorane (isoflurane) | Axience | ||
| Ketamidor (k & eacute; تامين) | Axience | ||
| Light Ceiling مزدوج | RIMSA | PENTA81 + 30E | |
| Medisorb ماصة لثاني أكسيد الكربون | Vyaire | 8570043 | |
| Merstitches 0 | Ethicon | F2520 | |
| Microtome | LEICA RM2255 | ||
| Miller Blade | Opticlar | 600.020 | |
| مكثف أكسجين | DeVilbiss | 525KS | |
| Paxman (xylazine) | Virbac | ||
| جهاز مراقبة بيطرية محمول متعدد المعلمات | Mindray | IPM 10 | |
| مقابض منظار الحنجرة القابلة لإعادة الاستخدام | Opticlar | 600.080 | |
| جهاز التنفس الصناعي للتخدير الحيواني الصغير | Midmark | 91806001 | |
| حقن كلوريد الصوديوم Viaflo | Baxter | ||
| الأدوات الجراحية | Kohler medizintechnik | ||
| الجدول الجراحي | Vetinox | TA700005 | |
| أنبوب القصبة الهوائية | سميث الطبية | 100/179/070 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | JV453 | |
| VMS | Midmark | 91800003 | |
| المواد والكواشف< / قوي> | |||
| DMEM F-12 متوسط | ThermoFischer | 11320033 | |
| الأجسام المضادة Parathormone | SantaCruz | sc-398856 | |
| فحص pth سريع أثناء | الجراحة بيكمان كولتر | A16972 |
المراجع
- Gafni, R. I., Collins, M. T. Hypoparathyroidism. N. Engl. J. Med. 380, 1738-1747 (2019).
- Gosmanova, E. O., Houillier, P., Rejnmark, L., Marelli, C., Bilezikian, J. P. Renal complications in patients with chronic hypoparathyroidism on conventional therapy: a systematic literature review: Renal disease in chronic hypoparathyroidism. Rev. Endocr. Metab. Disord. 22, 297-316 (2021).
- Frey, S., et al. Impact of permanent post-thyroidectomy hypoparathyroidism on self-evaluation of quality of life and voice: results from the national qol-hypopara study. Ann. Surg. 274, 851-858 (2021).
- Büttner, M., Krogh, D., Siggelkow, H., Singer, S. What are predictors of impaired quality of life in patients with hypoparathyroidism. Clin. Endocrinol. (Oxf). 97, 268-275 (2022).
- Gadelha, D. D., Filho, W. A., Brandão, M. A. J., Montenegro, R. M. Is parathyroid allotransplantation a viable option in the treatment of permanent hypoparathyroidism? A review of the literature. Endocrine. 80 (2), 253-265 (2022).
- Sakane, E. N., Vieira, M. C. C., Vieira, G. M. M., Maeda, S. S. Treatment options in hypoparathyroidism. Arch. Endocrinol. Metab. 66, 651-657 (2022).
- Zhang, J. L. H., Appelman-Dijkstra, N. M., Schepers, A. Parathyroid allotransplantation: A systematic review. Med. Sci. 10, 19(2022).
- Goncu, B., et al. Graft survival effect of HLA-A allele matching parathyroid allotransplantation. J. Investig. Med. Off. Publ. Am. Fed. Clin. Res. 69, 785-788 (2021).
- Barczyński, M., Gołkowski, F., Nawrot, I. Parathyroid transplantation in thyroid surgery. Gland Surg. 6, 530-536 (2017).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N. Engl. J. Med. 386, 1889-1898 (2022).
- Loupy, A., et al. Immune response after pig-to-human kidney xenotransplantation: a multimodal phenotyping study. The Lancet. 402, 1158-1169 (2023).
- Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Exp. Clin. Transplant. Off. J. Middle East Soc. Organ Transplant. 21, 901-912 (2023).
- Hasse, C., et al. Parathyroid xenotransplantation without immunosuppression in experimental hypoparathyroidism: long-term in vivo function following microencapsulation with a clinically suitable alginate. World J. Surg. 24, 1361-1366 (2000).
- Oster, M., et al. Fast and reliable dissection of porcine parathyroid glands - A protocol for molecular and histological analyses. Ann. Anat. - Anat. Anz. 219, 76-81 (2018).
- Hyun, H., et al. Structure-inherent targeting of near-infrared fluorophores for parathyroid and thyroid gland imaging. Nat. Med. 21, 192-197 (2015).
- Klute, K. Contribution to the topography and histology of porcine parathyroid glands. , Justus Liebig University of Giessen. Beitrag zur Topographie und Histologie der Epithelkörperchen des Schweines. Ph.D. thesis. Justus Liebig-Universität zu Giessen (1959).
- Arndt, H. On the topography of epithelial cells in pigs with special consideration of the suitability of pigs for the production of organo-therapeutic epithelial cell preparations. Z. Anat. 81, (Zur Topographie der Epithelkörperchen beim Schwein mitbesonderer Berücksichtigung der Eignung des Schweines für die Gewinnungorgano-therapeutischer Epithelkörperchenpräparate) 191-197 (1926).
- Butylina, M., Föger-Samwald, U., Gelles, K., Pietschmann, P., Sipos, W. Challenges in establishing animal models for studying osteoimmunology of hypoparathyroidism. Front. Vet. Sci. 10, 1163903(2023).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
