تقييم نشاط إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج باستخدام فحوصات المراسلين عالية الإنتاجية والكمية القائمة على التلألؤ

ملخص

نقدم بروتوكولات لتقييم كفاءة مسار إصلاح كسر الشريط المزدوج في الخلايا باستخدام مجموعة من ركائز مراسل خارج الكروموسومات القائمة على التلألؤ.

الملخص

يعد إصلاح فواصل الحمض النووي المزدوج (DSBs) أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على استقرار الجينوم وصلاحية الخلية. يتم التوسط في إصلاح DSB (DSBR) في الخلايا من خلال عدة آليات: إعادة التركيب المتماثل (HR) ، والانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، والانضمام النهائي بوساطة التماثل الدقيق (MMEJ) ، والتلدين أحادي الشريط (SSA). المقايسات الخلوية ضرورية لقياس كفاءة وتعديل هذه المسارات استجابة للمحفزات المختلفة.

هنا ، نقدم مجموعة من فحوصات المراسل خارج الكروموسومات التي يقيس كل منها إعادة تكوين جين مراسل نانولوسيفيراز بواسطة أحد مسارات DSBR الرئيسية الأربعة في الخلايا. عند الانتقال العابر إلى الخلايا ذات الأهمية ، يمكن قياس إصلاح ركائز المراسل الخاصة بالمسار في أقل من 24 ساعة عن طريق الكشف عن تلألؤ نانولوسيفيراز (NanoLuc).

هذه المقايسات القوية كمية وحساسة وقابلة للمعايرة وقابلة للفحص بتنسيق فحص عالي الإنتاجية. توفر هذه الخصائص تطبيقات واسعة في أبحاث إصلاح الحمض النووي واكتشاف الأدوية ، مكملة لمجموعة الأدوات المتاحة حاليا لمقايسات DSBR الخلوية.

المقدمة

تمثل فواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs) فئة سامة بشكل خاص من تلف الحمض النووي¹ بسبب الخلايا التي طورت مسارات متعددة لإصلاح DSB (DSBR) لإصلاح هذه الآفات. آليات DSBR الرئيسية الأربعة هي إعادة التركيب المتماثل (HR) ، والانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، والانضمام النهائي بوساطة التماثل الدقيق (MMEJ) ، والتلدين أحادي الشريط (SSA) ^2,3. تساهم مسارات DSBR في الحفاظ على نمو الأنسجة السليمة وعلم وظائف الأعضاء والحماية من أمراض مثل السرطان. علاوة على ذلك ، فإن آليات الإصلاح هذه تحمل إمكانات علاجية لتطوير معدلات الجزيئات الصغيرة في علم الأورام الدقيق. على سبيل المثال ، جذب استهداف DNA Polymerase θ (Polθ) ، وهو إنزيم محوري في مسار إصلاح MMEJ ، الاهتمام بسبب فتكه الاصطناعي مع نقص الموارد البشرية في السرطان⁴.

وبالتالي ، فإن فهم DSBR له آثار سريرية واسعة ، وهناك حاجة إلى فحوصات خلوية وظيفية قادرة على قياس نشاط جميع مسارات DSBR الرئيسية⁵. يجب أن تكون المقايسات مناسبة لكل من الاستجواب الجيني والدوائي ويمكن نشرها عبر نماذج الخلايا ذات الأهمية. لدعم جهود اكتشاف الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة ، يجب أن تكون المقايسات حساسة للغاية ، وقابلة للمعايرة ، ولها تحول سريع ، وأن تكون قابلة للتطوير إلى تنسيقات عالية الإنتاجية مناسبة للفحص المركب.

بشكل عام ، تم قياس DSBR سابقا باستخدام أنظمة فحص المراسل القائمة على التألق المدمجة بثبات في جينوم الخلية⁶. ومع ذلك ، في حين أن التلخيص الفسيولوجي ل DSBR الكروموسومي هو ميزة واضحة ، فإن مثل المقايسات تقتصر على نموذج مضيف يتم فيه دمج المراسل ، ويستخدم إعداد العينات كثيفة العمالة وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ولها إنتاجية محدودة ، ووقت الاستجابة ، والمتانة ، والحساسية ، وجميع الميزات الأساسية اللازمة لجهود اكتشاف الأدوية.

نصف هنا مجموعة من فحوصات مراسل DSBR التي تسمح بتقييم مسارات DSBR الرئيسية الأربعة. تم توضيح مجموعة ركائز فحص المراسل في الشكل 1 وتم وصفها بمزيد من التفصيل في منشور حديث⁷. إنها خارج الكروموسومات ، مما يسمح بإدخالها إلى الخلايا عن طريق النقل العابر البسيط ، ودمج جين مراسل نانولوسيفيراز⁸ ، والذي يجب إعادة تشكيله من خلال المشاركة مع آليات DSBR محددة ، يولد الحساسية والمتانة وقابلية التوسع. يتم تضمين متغيرات الركيزة التالية لمراسل DSBR في البروتوكول (الشكل 1):

MMEJ مستقل عن الاستئصال: تتكون هذه الركيزة الخطية من منطقة DNA أساسية مزدوجة الشريط (dsDNA) مع أجزاء متدلية من الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) ، والتي تحاكي نهايات الحمض النووي المقطوعة⁹. أربعة نيوكليوتيدات دقيقة في تيرميني من مناطق ssDNA تشفر كودون البداية للجين المراسل. إصلاح هذه الركيزة من خلال MMEJ يعيد إطار القراءة المفتوح لجين المراسل (ORF).

MMEJ المعتمد على الاستئصال: يتم مقاطعة الجين المراسل N-terminal exon بواسطة مقطع يحتوي على كودون توقف ، والذي يحيط به 8 ميكروهومولوجيات دقيقة لزوج القاعدة (bp). مطلوب استئصال نهاية التحلل النووي قبل الإصلاح بوساطة MMEJ لاستعادة جين المراسل السليم.

بلانت نهيج: ينقسم جين المراسل إلى أقسام طرفية N و C ، يتم وضع الأخير منها في المنبع من المروج. يتم إنتاج DSB باستخدام EcoRV ويتطلب الربط المباشر (بدون معالجة نهائية) بواسطة NHEJ لإعادة ربط كل من أجزاء جين المراسل واستعادة ORF للمراسل.

غير حادة NHEJ: يقع DSB داخل إنترون وسيكون له نهايات متماسكة أو غير متماسكة اعتمادا على اختيار إنزيم التقييد. يتطلب إصلاح هذه الركيزة بواسطة NHEJ أن يسبق الربط معالجة نهائية.

قالب طويل للموارد البشرية: ينقطع إكسون N-terminal لجين المراسل بواسطة مقطع الحمض النووي الذي يحتوي على مواقع التقييد ، والتي تحل محل 22 نقطة أساس من تسلسل جين المراسل الأصلي. لاستعادة هذا التسلسل ، يستخدم الإصلاح بواسطة HR قالب التماثل 2.5 كيلو قاعدة (kb) الموضوعة في اتجاه مجرى النهر من إكسون C-terminal.

نموذج قصير للموارد البشرية: يحل موقع التقييد اللازم لإنشاء DSB محل جزء من تسلسل جين المراسل الأصلي ويقدم كودون توقف في الإطار. مثل إصدار القالب الطويل ، تتطلب ركيزة الموارد البشرية هذه قالب التماثل النهائي (360 نقطة أساس) لإصلاح واستعادة المراسل ORF بدقة.

عسى: تحتوي هذه الركيزة على كودون توقف سابق لأوانه يقع داخل الإكسون الطرفي N للجين المراسل. تتطلب إزالة كودون التوقف هذا وإعادة تسلسل جين المراسل السليم إصلاحا بواسطة SSA ، والذي يتضمن استئصالا بعيد المدى ثنائي الاتجاه قبل محاذاة التماثلات.

لتوليد DSB ، يمكن هضم بعض ركائز المراسل باستخدام I-SceI (الشكل 1). سيؤدي ذلك إلى إنشاء ركيزة خطية ذات نهايات غير متماسكة في MMEJ المعتمدة على الاستئصال ، و NHEJ غير الحادة ، ومراسلي الموارد البشرية و SSA ذوي القوالب الطويلة ، والتي تحتوي على مواقع I-SceI جنبا إلى جنب في اتجاهات مقلوبة. في القالب القصير لركيزة مراسل الموارد البشرية ، سيؤدي هضم موقع I-SceI الفردي إلى إنشاء نهايات متماسكة. يمكن أيضا هضم NHEJ غير الحاد ، MMEJ المعتمد على الاستئصال ، القالب الطويل HR وبلازميدات SSA باستخدام HindIII ، والتي ستنتج نهايات متماسكة تكميلية.

نحن نقدم بروتوكولات لتوليد ركائز فحص المراسل ونصف كيف يمكن إجراء المقايسات ، ونقدم تفاصيل حول كيفية استخدامها لتحديد DSBR ، بما في ذلك الاستجابات القابلة للمعايرة للجزيئات الصغيرة ، وتقييم الفعالية الخلوية ، والنشاط على الهدف ، وانتقائية المسار.

البروتوكول

1. إعداد ومراقبة الجودة (QC) من ركائز المراسل

ملاحظة: يمكن نشر البلازميدات التي تشفر ركائز المراسل في سلالات الإشريكية القولونية القياسية (على سبيل المثال ، DH5α ومشتقاتها) واستعادتها عن طريق عزل البلازميد. يتم وصف تفاصيل البلازميد (الحجم ومقاومة المضادات الحيوية) في الجدول 1 والشكل 1.

الشكل 1: مخططات مقايسات مراسل DSBR خارج الكروموسومات القائمة على NanoLuc. تمثيل تخطيطي لركائز مراسل DSBR ، بما في ذلك موقعها داخل كل بلازميد مصدر ، وميزات التسلسل الرئيسية ، والتخطيط النهائي بعد الإصلاح الخاص بالمسار. يتم استئصال قلب ركيزة MMEJ المستقل عن الاستئصال من بلازميد المصدر عن طريق الهضم باستخدام XhoI / HindIII ، وبعد ذلك يجب ربط الأغطية بكلا الطرفين لإنتاج الركيزة ل MMEJ. يتم إنشاء الركيزة مراسل NHEJ حادة عن طريق الاستئصال من البلازميد المصدر مع EcoRV. يتم إنشاء ركائز MMEJ المعتمدة على الاستئصال ، و NHEJ غير الحادة ، و HR ذات القالب الطويل ، وركائز مراسل SSA عن طريق الخطية للبلازميدات المصدر باستخدام إما I-SceI (الذي ينتج نهايات غير متماسكة) أو HindIII (التي تنتج نهايات متماسكة). يتم إنشاء الركيزة الموجزة لمراسل الموارد البشرية عن طريق الخطية لبلازميد المصدر باستخدام I-SceI (الذي ينتج نهايات متماسكة). إصلاح كل ركيزة مراسل بواسطة مسار DSBR المستهدف يعيد تشكيل نانولوسيفيراز ORF سليمة ترميز وظيفي NanoLuc. تم تكييف هذا الرقم من Rajendra et ^al.7. الاختصارات: DSBR = إصلاح كسر حبلا مزدوج ؛ نانولوك = نانولوسيفيراز. MMEJ = الانضمام النهائي بوساطة microhomology ؛ NHEJ = الانضمام النهائي غير المتماثل ؛ HR = إعادة التركيب المتماثل ؛ SSA = تلدين حبلا واحد ؛ ORF = إطار قراءة مفتوح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. إعداد الركيزة مراسل MMEJ المستقلة عن الاستئصال (الشكل 1 و الشكل 2 أ-ج)
   1. تحضير أغطية ssDNA / dsDNA (الشكل 2 أ)
      1. إعادة تعليق قليل النيوكليوتيدات الأربعة المدرجة في الجدول 2 بشكل فردي في مخزن التلدين (20 mM Tris pH 7.5 ، 50 mM NaCl في مياه درجة البيولوجيا الجزيئية) لتوليد محلول مخزون عند 100 ميكرومتر.
      2. تلدين قبعات ss/dsDNA
         1. امزج 50 ميكرولتر لكل من قليل النيوكليوتيدات الطويل والقصير (محلول مخزون 100 ميكرومتر) للغطاء الأيسر من الخطوة 1.1.1.1 في أنبوب 0.2 مل.
         2. كرر لقليل النوكليوتيدات ذات الغطاء الأيمن.
         3. باستخدام جهاز تدوير حراري ، احتضن كل مزيج قليل النوكليوتيد عند 99 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم انحدر إلى 10 درجات مئوية عند 1 درجة مئوية / دقيقة.
            ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى إنتاج القبعات اليمنى واليسرى الملدنة.
      3. (مراقبة الجودة ، اختياري) التحقق من تلدين قليل النوكليوتيد عن طريق الكهربائي
         1. رحلان كهربائي 100 نانوغرام من كل منتج من الخطوة 1.1.1.2 جنبا إلى جنب مع قليل النيوكليوتيدات الفردية من الخطوة 1.1.1.1 وسلم الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي في جل 20٪ من مادة الأكريلاميد-تريس-بورات-EDTA (TBE) عند 200 فولت لمدة 80 دقيقة.
         2. قم بتلطيخ الجل باستخدام مخزن مؤقت لتشغيل TBE يحتوي على صبغة DNA فلورية مناسبة لتصور كل من ssDNA و dsDNA لمدة 10-15 دقيقة على الأقل.
         3. تصور مضان على نظام توثيق هلام (الشكل 2A).
            ملاحظة: تستخدم الخطوات من 1-1-1-3-1 إلى 1-1-1-3-3 للتحقق من أن الأغطية قد صلبت بشكل صحيح. يجب أن تكون الأحجام الظاهرة للغطاء الأيسر والغطاء الأيمن ~ 120 نقطة أساس و ~ 175 نقطة أساس ، على التوالي.
   2. تنقية قلب الركيزة المراسل (الشكل 2 ب)
      1. امزج 100 ميكروغرام من البلازميد الأساسي للمراسل مع 4 ميكرولتر من هندIII و 4 ميكرولتر من XhoI (4 U / ميكروغرام بلازميد لكل إنزيم) و 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x. ارفع الحجم الإجمالي إلى 200 ميكرولتر بالماء المقطر المزدوج (ddH₂O) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ليلة وضحاها لهضم البلازميد.
         ملاحظة: لهضم كميات أكبر أو أصغر ، قم بقياس التفاعل بشكل متناسب.
      2. احتضان تفاعل الهضم عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتسخين إنزيمات التقييد المعطلة.
      3. أضف 40 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوي (2 وحدة / ميكروغرام بلازميد) و 27 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x إلى مزيج التفاعل من الخطوة 1.1.2.2. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لإزالة الفوسفورة البلازميد.
         ملاحظة: قم بقياس التفاعل لأعلى أو لأسفل حسب الحاجة.
      4. أضف 60 ميكرولتر من صبغة التحميل 6x إلى التفاعل من الخطوة 1.1.2.3. رحلان كهربائي جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي في هلام أغاروز-تريس-أسيتات-EDTA (TAE) بنسبة 1.5٪ (وزن / حجم) يحتوي على صبغة dsDNA فلورية عند 120 فولت لمدة 2.5 ساعة أو حتى يتم حل النطاقات بشكل كاف.
      5. تصور مضان على نظام توثيق هلام (الشكل 2B).
      6. قم باستئصال الجزء الأساسي للمراسل (~ 1.5 كيلو بايت) من الجل باستخدام مشرط نظيف ، مع الحرص على عدم التلوث بالعمود الفقري المتجه (~ 2.5 كيلو بايت).
      7. قم باستخراج الجزء الأساسي للمراسل باستخدام مجموعة استخراج الجل ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      8. قياس تركيز الحمض النووي وجودته (A_260/280) عن طريق القياس الطيفي.
   3. ربط قلب الركيزة المراسل بأغطية ssDNA / dsDNA وتنقية ركيزة المراسل النهائي (الشكل 2C)
      1. امزج 30 ميكروغرام من الجزء الأساسي للمراسل من الخطوة 1.1.2.7 مع 3.85 ميكرولتر من كل غطاء يسار ويمين صلب من الخطوة 1.1.2 (حوالي 6: 1 نسبة مولار من الغطاء: الحمض النووي الأساسي) ، 30 ميكرولتر من 10x ligase buffer ، و 1.5 ميكرولتر من T4 DNA ligase (20 U / μg DNA). ارفع الحجم الكلي للتفاعل إلى 300 ميكرولتر مع ddH₂O واحتضانه طوال الليل عند 16 درجة مئوية لربط الأغطية بالجزء الأساسي للمراسل.
         ملاحظة: قم بقياس التفاعل لأعلى أو لأسفل حسب الحاجة.
      2. (مراقبة الجودة ، اختياري) رحلان كهربائي 200 نانوغرام من المنتج الناتج من الخطوة 1.1.3.1 جنبا إلى جنب مع قلب الركيزة المراسل وسلم الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي في هلام أغاروز-تاي 0.7٪ (وزن / حجم) يحتوي على صبغة dsDNA فلورية عند 120 فولت لمدة 1.5 ساعة على الأقل. تحقق من أن النطاق المقابل للمنتج المرتبط يهاجر بمعدل أبطأ قليلا من قلب الركيزة المراسل غير المرتبط (الشكل 2C).
         ملاحظة: خطوة مراقبة الجودة هذه هي التحقق من أن ربط القبعات بالجزء الأساسي للمراسل قد تم بشكل صحيح.
      3. تنقية الحمض النووي من تفاعل الهضم في الخطوة 1.3.1. باستخدام الطريقة المفضلة (على سبيل المثال ، طريقة قائمة على الخرز أو العمود) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
         ملاحظة: تقلل خطوة التنقية 1.1.3.3 بشكل كبير من وجود أغطية غير مربوطة.
   4. قياس تركيز الحمض النووي وجودته (A_260/280) عن طريق القياس الطيفي.
2. إعداد الركيزة مراسل NHEJ حادة (الشكل 1 والشكل 2D ، E)
   1. امزج 100 ميكروغرام من البلازميد الأساسي للمراسل مع 5 ميكرولتر من EcoRV (5 U / μg plasmid) و 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x. ارفع الحجم الإجمالي إلى 200 ميكرولتر مع ddH₂O واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين طوال الليل لهضم البلازميد.
      ملاحظة: لهضم كميات أكبر أو أصغر ، قم بقياس التفاعل بشكل متناسب.
   2. احتضان تفاعل الهضم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتسخين إنزيم التقييد المعطل .
   3. أضف 50 ميكرولتر من صبغة التحميل 6x إلى التفاعل من الخطوة 1.2.2. رحلان كهربائي جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي في هلام أغاروز-تاي 1.5٪ (وزن / حجم) يحتوي على صبغة dsDNA فلورية عند 120 فولت لمدة 2 ساعة أو حتى يتم حل النطاقات بشكل كاف.
   4. تصور مضان على نظام توثيق هلام (الشكل 2D).
   5. قم باستئصال ركيزة المراسل (~ 1.7 كيلو بايت) من الجل باستخدام مشرط نظيف ، مع الحرص على عدم التلوث بالعمود الفقري المتجه (~ 2.6 كيلو بايت).
   6. استخرج الجزء الأساسي للمراسل باستخدام مجموعة استخراج الجل ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (الشكل 2E).
   7. قياس تركيز الحمض النووي وجودته (A_260/280) عن طريق القياس الطيفي.
3. إعداد ركائز مراسل I-SceI (الشكل 1)
   ملاحظة: تتضمن هذه الركائز MMEJ المعتمدة على الاستئصال (الشكل 2F) ، و NHEJ غير الحاد (الشكل 2G) ، و HR طويل القالب (الشكل 2H) ، و HR للقالب القصير (الشكل 2I) ، و SSA (الشكل 2J).
   1. امزج 100 ميكروغرام من البلازميد الأساسي للمراسل مع 50 ميكرولتر من I-SceI (5 U / μg plasmid) و 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x. ارفع الحجم الكلي إلى 600 ميكرولتر مع ddH₂O واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ليلة وضحاها لهضم البلازميد.
      ملاحظة: لهضم كميات أكبر أو أصغر ، قم بقياس التفاعل بشكل متناسب. يمكن أيضا هضم NHEJ غير الحاد ، و MMEJ المعتمد على الاستئصال ، وبلازميدات HR ذات القالب الطويل و SSA باستخدام HindIII ، والتي ستولد نهايات متماسكة تكميلية.
   2. احتضان تفاعل الهضم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتسخين I-SceI. اضبط درجة الحرارة على 80 درجة مئوية خلال هذه الخطوة إذا تم استخدام HindIII للهضم بدلا من ذلك.
   3. تنقية الحمض النووي من تفاعل الهضم المعطل في الخطوة 1.3.2 باستخدام الطريقة المفضلة (على سبيل المثال ، طريقة قائمة على حبة أو قائمة على العمود) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   4. قياس تركيز الحمض النووي ونقاوته A_260/280) عن طريق القياس الطيفي.
4. مراقبة جودة ركائز المراسل
   1. رحلان كهربائي 200 نانوغرام من ركيزة المراسل جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي في هلام أغاروز-تاي بنسبة 0.7٪ (وزن / حجم) يحتوي على صبغة dsDNA فلورية عند 120 فولت لمدة 2 ساعة أو حتى يتم حل النطاقات بشكل كاف. قم بتحميل بلازميد المراسل الأصلي غير المصقول جنبا إلى جنب كعنصر تحكم.
   2. تحقق من ملاحظة النطاقات المحددة بالحجم الصحيح لكل ركيزة مراسل (راجع الجدول 1 والشكل 2F-J).

الشكل 2: تحليلات الهلام الكهربائي لتوليد الركيزة مراسل DSBR. (أ-ج) صور تمثيلية من التحليل الكهربائي الهلامي للمواد الوسيطة والبناء النهائي المطلوب لتوليد ركيزة مراسل MMEJ المستقلة عن الاستئصال. الصور المجاورة في اللوحتين (A) و (C) مأخوذة من نفس المواد الهلامية ؛ تم حذف الممرات غير ذات الصلة. (د، ه) صور تمثيلية من تحليل الهلام الكهربائي لبلازميد المصدر ، ومنتجات EcoRV المهضومة ، والبناء النهائي المستخرج من الهلام المطلوب لتوليد ركيزة مراسل NHEJ الحادة. (ف-ج) صور تمثيلية من التحليل الكهربائي الهلامي لبلازميدات المصدر وتركيبات DSBR الخطية لركائز مراسل I-SceI-digested: MMEJ المعتمد على الاستئصال ، NHEJ غير الحاد ، قالب HR الطويل ، قالب قصير HR ، SSA. الاختصارات: DSBR = إصلاح كسر حبلا مزدوج ؛ MMEJ = الانضمام النهائي بوساطة microhomology ؛ NHEJ = الانضمام النهائي غير المتماثل ؛ HR = إعادة التركيب المتماثل ؛ SSA = تلدين حبلا واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. نقل عابر لركائز مراسل DSBR

ملاحظة: نظرة عامة على سير العمل التجريبي للمقايسات وبعض التباديل المحتملة موضحة في الشكل 3. يصف البروتوكول أدناه تجربة باستخدام خلايا HEK-293 ، حيث يتم نقلها عكسيا مع ركيزة المراسل. يمكن زيادة أو تقليل الأرقام أدناه وفقا لعدد الآبار التي سيتم استخدامها لكل لوحة. يتم حساب الخطوات التالية للفحص الذي يتم إجراؤه في لوحة واحدة من 96 بئرا ؛ انظر المناقشة للحصول على اعتبارات إضافية.

الشكل 3: سير العمل التجريبي لمقايسات مراسل DSBR. يتم نقل الخلايا ذات الأهمية مع ركيزة DSBR الخطية (ترميز NanoLuc ORF الذي يحتاج إلى إصلاح من خلال حدث إصلاح الحمض النووي المحدد) وبلازميد اليراع (التحكم في النقل). بعد ذلك ، بعد 6-24 ساعة من النقل ، يمكن قراءة تلألؤ اليراع وتلألؤ NanoLuc بالتتابع بعد إضافة كواشف Nano-Glo Dual-Luciferase . يمكن استخدام أمثلة التباديل للخطوات الأساسية (الموضحة داخل المربعات الزرقاء الفاتحة) لاختبار كيفية تأثير التعديل الجيني (الضربة القاضية أو الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير) أو العلاج الدوائي على كفاءة مسار DSBR في الخلايا. الاختصارات: DSBR = إصلاح كسر حبلا مزدوج ؛ نانولوك = نانولوسيفيراز. WT = النوع البري ؛ KO = خروج المغلوب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. (اختياري) في حالة تقييم تأثير المركبات على مقايسة المراسل ، قم بتوزيع المركبات الذائبة في السيارة (على سبيل المثال ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) في آبار صفيحة 96 بئرا وفقا لتخطيط تجريبي محدد مسبقا. تطبيع تركيز المركبات في جميع الآبار.
   ملاحظة: يوصى باستخدام النسخ المتماثل الفني. قم بتضمين آبار التحكم (على سبيل المثال ، المركبات فقط).
2. في أنبوب سعة 1.5 مل ، يتم تخفيف بلازميد التحكم في Firefly (التحكم في luciferase) وركيزة مراسل NanoLuc DSBR (مراسل luciferase) المتولدة في الخطوات 1.1 أو 1.2 أو 1.3 ، في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنقل. استخدام 0.66 ميكروغرام من السيطرة لوسيفيراز البلازميد لكل 1 × 10⁶ خلايا. انظر الجدول 3 لمعرفة كميات الركيزة مراسل NanoLuc DSBR التي يجب استخدامها.
   ملاحظة: يمكن استخدام بلازميد التحكم الإيجابي الذي يعبر بشكل أساسي عن لوسيفيراز المراسل للتحقق من صحة إعداد الأداة وظروف النقل أو للتحقق من وجود تأثيرات غير محددة على لوسيفيراز المراسل نفسه. كنقطة انطلاق ، نوصي ب 0.1 ميكروغرام من بلازميد لوسيفيراز المراسل و 0.66 ميكروغرام من بلازميد لوسيفيراز للتحكم لكل 1 × 10⁶ خلايا.
3. أضف كاشف النقل القائم على الدهون إلى الحمض النووي المخفف من الخطوة 2.2 عند النسبة الموصى بها من الشركة المصنعة (على سبيل المثال ، 1: 2 ، ميكروغرام DNA: كاشف ميكرولتر للكاشف الموصوف في جدول المواد) ، واخلطه جيدا عن طريق الدوامة لفترة وجيزة ، واحتضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. حصاد الخلايا عن طريق التربسين ، وإعادة تعليقها في وسط جديد يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، وعدها.
5. نقل 3 × 10⁶ خلايا في أنبوب 15 مل وإعادة تعليقها في 8.5 مل من المتوسط.
6. أضف مزيج نقل الحمض النووي من الخطوة 2.3 إلى تعليق الخلية واخلطه عدة مرات عن طريق الانقلاب.
7. لوحة 80 ميكرولتر من تعليق الخلية (حوالي 2.7 × 10⁴ خلايا) لكل بئر.
   ملاحظة: يمكن توزيع الخلايا المحتوية على المعلق ومزيج نقل الحمض النووي على اللوحة إما عن طريق السحب يدويا أو باستخدام معالج سائل آلي لإجراء تجارب إنتاجية أعلى.
8. احتضان في 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO₂ لمدة 24 ساعة.

3. الكشف عن التلألؤ

1. تحضير الكواشف
   1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد وإضافة كواشف لوسيفيراز المراسل (NanoLuc) والتحكم (Firefly) ، والتي توفر ركائز لكل من luciferases (Furimazine و 5'-Fluoroluciferin ، على التوالي):
   2. إعداد كاشف التحكم لوسيفيراز. أعد تكوينها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة واخلطها عن طريق الانقلاب حتى تذوب ركيزة لوسيفيراز تماما.
   3. قم بإعداد كاشف لوسيفيراز مراسل جديد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احسب كمية الكاشف اللازمة لإضافة 80 ميكرولتر / بئر وإضافة الركيزة إلى حجم مناسب من المخزن المؤقت للفحص بنسبة 1: 100 (ركيزة لوسيفيراز: عازلة). بالنسبة للوحة واحدة مكونة من 96 بئرا ، قم بتخفيف 88 ميكرولتر من ركيزة لوسيفيراز إلى 8800 ميكرولتر من المخزن المؤقت واخلطها عن طريق الانقلاب.
      ملاحظة: تتضمن هذه الكميات زيادة تقريبية بنسبة 10٪. بمجرد إعادة تشكيله ، يمكن تخزين كاشف التحكم luciferase وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للاستخدام في المستقبل. يجب تحضير كاشف لوسيفيراز المراسل طازجا لكل استخدام.
2. الكشف التسلسلي عن التلألؤ من التحكم و luciferases المراسل (لوحة 96 بئر)
   1. اسمح للوحة وكواشف لوسيفيراز بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
   2. أضف 80 ميكرولتر من كاشف التحكم لوسيفيراز لكل بئر.
   3. هز اللوحة لمدة 3 دقائق على شاكر مداري عند 450 دورة في الدقيقة.
   4. قم بقياس إشارة تلألؤ لوسيفيراز للتحكم باستخدام قارئ لوحة التلألؤ.
      ملاحظة: اقرأ الانبعاث عند 580 نانومتر (مرشح تمرير النطاق 80 نانومتر) أو التلألؤ الكلي لكل بئر. يستخدم هذا التلألؤ كمقياس لكفاءة النقل وكثافة الخلايا ويمكن أن يبلغ أيضا عن السمية الخلوية التي تسببها علاجات الاختبار.
   5. أضف 80 ميكرولتر من كاشف لوسيفيراز المراسل لكل بئر.
      ملاحظة: هذا الكاشف سوف يمنع لوسيفيراز السيطرة. كما أنه يحتوي على الركيزة للمراسل لوسيفيراز.
   6. هز اللوحة لمدة 3 دقائق على شاكر مداري عند 450 دورة في الدقيقة.
   7. اترك الطبق يرتاح لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   8. قم بقياس إشارة تلألؤ لوسيفيراز للمراسل باستخدام قارئ لوحة التلألؤ.
      ملاحظة: اقرأ الانبعاث عند 470 نانومتر (مرشح تمرير النطاق 80 نانومتر) أو ، بدلا من ذلك ، التلألؤ الكلي لكل بئر. يعطي هذا التلألؤ معلومات عن مقدار ركيزة المراسل التي تم إصلاحها بواسطة مسار DSBR محل الاهتمام.
   9. تصدير قراءات التلألؤ لتحليل المصب.

4. تحليل البيانات

1. اقسم إشارة تلألؤ لوسيفيراز (NanoLuc) للمراسل على إشارة تلألؤ لوسيفيراز (Firefly) التي تنشأ من نفس البئر لحساب إشارة الفحص. طبق هذا الحساب على جميع الآبار كما هو موضح في المعادلة (1).
   (1)
2. احسب متوسط إشارات الفحص لآبار التحكم (على سبيل المثال ، السيارة فقط).
3. تطبيع إشارات الفحص لآبار الاختبار إلى متوسط بئر التحكم باستخدام المعادلة (2) لحساب الإصلاح (٪) لكل بئر.
   (2)
4. (اختياري ، تركيب المنحنى) في حالة اختبار جرعات مركبة متعددة ، ارسم الإصلاح المحسوب (٪) مقابل تركيز المركب وقم بملاءمة منحنى استجابة الجرعة باستخدام نموذج الانحدار غير الخطي. استخدم هذا المنحنى لاستيفاء EC₅₀ اللاحق.

النتائج

يمكن الكشف عن إصلاح كل من فحوصات المراسل وقياسها باستخدام نفس الإجراء. سيؤدي الإصلاح الصحيح للركيزة من خلال مسار الإصلاح المشابه لها في الخلايا إلى إعادة تكوين ترميز ORF وظيفي سليم NanoLuc. يمكن اكتشاف إشارة التلألؤ هذه باستخدام قارئ اللوحة.

يعمل النقل المشترك مع ترميز البلازميد السليم Firefly luciferase كعنصر تحكم في النقل. يخدم عنصر التحكم هذا غرضين. أولا ، يوفر معيارا لتطبيع إشارة NanoLuc ، حيث يجب أن يكون غير منزعج من تعديل DSBR بالوسائل الوراثية أو الدوائية. ثانيا ، يمكن أن يوفر مؤشرا على الاضطرابات الخلوية خارج الهدف التي تؤثر على إشارة لوسيفيراز ، مثل تعديل دورة الخلية ، أو التأثيرات على النسخ / الترجمة ، أو السمية العامة.

تعمل نسبة NanoLuc إلى Firefly كقراءة بديلة للإصلاح. يمكن تصدير قيم التلألؤ وتحليلها عن طريق تطبيع إشارتي لوسيفيراز من داخل نفس البئر. في حالة دراسات الاضطراب الجيني (على سبيل المثال ، مقارنة النوع البري و KO أو عدم الاستهداف و siRNA المستهدف) ، عادة ما يتم تطبيع الإصلاح للعينة الأبوية (الخلايا من النوع البري أو الخلايا المعالجة ب siRNA غير المستهدف). في حالة التعديل الدوائي ، يتم تطبيع القيم من عينة معالجة مركبة إلى القيمة الناتجة عن معالجة السيارة.

تم مؤخرا نشر التحقق الكامل من مجموعة المراسلين الموصوفة⁷. يتم عرض البيانات التي توضح توصيف التعديل الجيني والدوائي ل DSBR في الشكل 4 (مقتبس من ⁷). Polθ هو الوسيط الرئيسي ل MMEJ ومن المتوقع أن يؤدي فقدان أو تثبيط هذا الإنزيم إلى استئصال^{MMEJ 3,10} الخلوي على وجه التحديد. باستخدام خط الخلية الذي تم فيه التخلص من POLQ ، الجين المشفر Polθ ،¹¹ ، يوضح اختبار مراسل MMEJ المستقل عن الاستئصال أن MMEJ قد تم قمعه بالكامل تقريبا. يظهر تقييم إشارات تلألؤ NanoLuc و Firefly المكونة أن عيب الإصلاح المرصود مدفوع بانخفاض في إشارة NanoLuc (المشفرة بواسطة ركيزة المراسل) بينما إشارة Firefly (التحكم) غير مضطربة (الشكل 4A-C). في المقابل ، يوضح تقييم كفاءة NHEJ باستخدام مراسل NHEJ الحاد أن خروج المغلوب POLQ لا يمنع إصلاح ركيزة المراسل (الشكل 4D-F). تدعم هذه البيانات الجينية معا الدور المحدد ل Polθ في الإصلاح بوساطة MMEJ. تم تلخيص هذه الملاحظات بشكل كامل دوائيا باستخدام ART558^12,13 ، وهو مثبط قوي للغاية ومحدد تم الإبلاغ عنه مؤخرا لمجال البلمرة في Polθ (الشكل 4G) ، حيث لوحظ تثبيط قابل للمعايرة من MMEJ ، والذي يستمد من انخفاض محدد في NanoLuc وليس إشارة Firefly (الشكل 4H). علاوة على ذلك ، وبالاتفاق مع البيانات الجينية ، لا يوجد أي تأثير على NHEJ (الشكل 4I ، J). تسلط هذه البيانات مجتمعة الضوء على كيفية استخدام هؤلاء المراسلين لتوصيف التعديل الجيني لمسارات DSBR وإظهار الفعالية الخلوية وخصوصية الهدف / المسار للجزيئات الصغيرة.

الشكل 4: آثار الضربة القاضية الجينية والتثبيط الدوائي ل Polθ على إشارات مراسل MMEJ و NHEJ. تم نقل خلايا eHAP1 WT و POLQ ^(-) باستخدام بلازميد التحكم في Firefly ومع (A-C) مراسل MMEJ المستقل عن الاستئصال أو مراسل NHEJ ذو النهاية الحادة (D-F). النسبة المئوية لإصلاح MMEJ أو NHEJ هي نسبة تلألؤ NanoLuc على تلألؤ Firefly ، والتي تم تطبيعها إلى التحكم المعالج DMSO ، بعد 24 ساعة من النقل. تمثل البيانات متوسط ± SEM لثلاث نسخ بيولوجية ، يبلغ متوسط كل منها 8 نسخ مكررة تقنية. تم نقل خلايا HEK-293 باستخدام بلازميد التحكم في Firefly و (G ، H) مراسل MMEJ المستقل عن الاستئصال أو مراسل NHEJ (I ، J) الحاد ومعالجتها بمثبط بوليميراز Polθ ART558. النسبة المئوية للإصلاح هي نسبة تلألؤ NanoLuc على تلألؤ Firefly ، الذي تم تطبيعه إلى التحكم المعالج DMSO ، بعد 24 ساعة من النقل. تم حساب النسبة المئوية لتثبيط إشارات التلألؤ الفردية في (G) و (I) بالنسبة إلى التحكم المعالج ب DMSO والموضحة على التوالي في (H) و (J). تمثل البيانات متوسط ± SEM من 2 مكررات بيولوجية ، كل منها بمتوسط 4 نسخ مكررة تقنية. تم تكييف هذا الرقم من Rajendra et ^al.7. الاختصارات: نانولوك = نانولوسيفيراز. MMEJ = الانضمام النهائي بوساطة microhomology ؛ NHEJ = الانضمام النهائي غير المتماثل ؛ WT = النوع البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تثبيط إشارة مراسل الموارد البشرية بواسطة مثبط RAD51 CAM833. (أ) تم نقل خلايا HEK-293 باستخدام الركيزة الطويلة لمراسل الموارد البشرية ، وهي بلازميد التحكم في اليراع لوسيفيراز ، وعولجت بمثبط RAD51 CAM833¹⁴. تمت قراءة تلألؤ NanoLuc و Firefly بعد 16 ساعة من النقل. النسبة المئوية لإصلاح الموارد البشرية هي نسبة تلألؤ NanoLuc على تلألؤ Firefly ، والتي تم تطبيعها إلى التحكم المعالج DMSO. تبرز الخطوط المتقطعة النسبة المئوية لتثبيط الموارد البشرية وتركيز CAM833 عند المنحنى EC₅₀. تمثل البيانات متوسط ± SEM من 2 مكررات بيولوجية ، كل منها بمتوسط 4 نسخ مكررة تقنية. (B) تم حساب النسبة المئوية لتثبيط إشارات التلألؤ الفردية في (A) بالنسبة إلى التحكم المعالج ب DMSO. تبرز الخطوط المتقطعة النسبة المئوية لتثبيط NanoLuc و Firefly عند 3.33 ميكرومتر CAM833 (EC₅₀). يدل الانخفاض في إشارة اليراع عند تركيزات CAM833 ≥ 10 ميكرومتر على سمية المركبة عند الجرعات العالية. ومع ذلك ، لوحظ انخفاض إشارة NanoLuc عند التركيزات التي لا تتأثر فيها إشارة Firefly ، مما يشير إلى أن CAM833 يحفز تثبيط الموارد البشرية على الهدف. تم تكييف هذا الرقم من Rajendra et ^al.7. الاختصارات: نانولوك = نانولوسيفيراز. HR = إعادة التركيب المتماثل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الركيزة مراسل		مصدر البلازميد (الحجم بالكيلوبايت ، المقاومة)	جيل DSB			الحجم المتوقع لركيزة المراسل النهائي (kb)
MMEJ مستقلة عن الاستئصال		4.0, كان	قطع ذيول 3 'من خلال ربط القبعات			1.6
MMEJ المعتمد على الاستئصال		6.5 ، كان	I-SceI (غير متماسك) ، HindIII (متماسك)			6.5
بلانت نهيج		4.3 ، كان	ينتهي حادة عند الاستئصال من البلازميد بواسطة EcoRV			1.7
غير حادة NHEJ		6.7 ، كان	I-SceI (غير متماسك) ، HindIII (متماسك)			6.5
قالب طويل للموارد البشرية		9.2 ، كان	I-SceI (غير متماسك) ، HindIII (متماسك)			9.2
قالب قصير للموارد البشرية		9.3 ، أمبير	I-SceI (متماسكة)			9.3
عظا		9.5 ، كان	I-SceI (غير متماسك) ، HindIII (متماسك)			9.5

الجدول 1: بلازميدات الركيزة المراسل. الاختصارات: DSB = فاصل حبلا مزدوج ؛ MMEJ = الانضمام النهائي بوساطة microhomology ؛ NHEJ = الانضمام النهائي غير المتماثل ؛ HR = إعادة التركيب المتماثل ؛ SSA = تلدين حبلا واحد ؛ كان = كاناميسين. أمبير = الأمبيسلين.

التسلسل (5'-3')			مورد	تنقيه	دالة
5'[فوس]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTCTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT			سيغما	صفحة	الغطاء الأيسر ، قليل النوكليوتيد الطويل
5'[فوس] GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC			سيغما	صفحة	الغطاء الأيسر، قليل النوكليوتيد القصير
5'[فوس]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG			سيغما	صفحة	الغطاء الأيمن ، قليل النوكليوتيد الطويل
5'[فوس]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA			سيغما	صفحة	الغطاء الأيمن ، قليل النوكليوتيد القصير

الجدول 2: قليل النيوكليوتيدات للأغطية لتوليد ركيزة مراسل MMEJ المستقلة عن الاستئصال. الاختصارات: ssDNA = الحمض النووي أحادي الشريط ؛ dsDNA = الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل ؛ MMEJ = الانضمام النهائي بوساطة microhomology ؛ PAGE = بولي أكريلاميد هلام الكهربائي. يتم وضع خط تحت التماثلات الدقيقة.

فحص المراسل	نانولوك مراسل الركيزة الحمض النووي (ميكروغرام الحمض النووي / 1x106 خلايا)	اليراع التحكم في لوسيفيراز بلازميد (ميكروغرام DNA / 1x106 خلايا)
MMEJ مستقلة عن الاستئصال	0.5	0.66
MMEJ المعتمد على الاستئصال	1	0.66
بلانت نهيج	0.5	0.66
غير حادة NHEJ	0.5	0.66
قالب طويل للموارد البشرية	1	0.66
قالب قصير للموارد البشرية	2	0.66
عظا	1	0.66

الجدول 3: كميات الحمض النووي للانتقال العابر لركائز مراسل NanoLuc وبلازميد لوسيفيراز للتحكم في اليراع (HEK-293 ، تنسيق لوحة 96 بئرا). الاختصارات: MMEJ = الانضمام النهائي بوساطة التماثل الدقيق ؛ NHEJ = الانضمام النهائي غير المتماثل ؛ HR = إعادة التركيب المتماثل ؛ SSA = تلدين حبلا واحد.

المناقشة

هنا ، وصفنا بروتوكولات لتوليد وتنفيذ مجموعة من المراسلين القائمين على التلألؤ خارج الكروموسومات لقياس الكفاءة الخلوية لمسارات DSBR الرئيسية الأربعة (HR و NHEJ و MMEJ و SSA)⁷. يمكن إدخال ركائز المراسل في الخلايا عن طريق النقل العابر واستخدامها لتقييم نشاط DSBR باستخدام قراءات حساسة وقوية قائمة على اللوحة من تلألؤ NanoLuc ، والتي يتم إعادة تشكيلها عند التعامل مع مسارات DSBR الخلوية المماثلة.

تعد عدة مراحل من توليد الركيزة للمراسل ، ونقل الركائز إلى الخلايا ، وتفسير البيانات أمرا بالغ الأهمية للتنفيذ الناجح لهذه المقايسات. على الرغم من استخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية لتوليد ركائز المراسل ، فإن تصور العملية عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي يضمن أعلى جودة ونقاء للركائز قبل النقل. نظرا لأن هذه المقايسات تعتمد على النقل العابر ، تنطبق الاعتبارات الشائعة لهذه الطرق. ويشمل ذلك تحسين كثافة البذر ، وظروف النقل (بما في ذلك الكواشف وكميات الحمض النووي) ، وتقييم الملاءمة في تنسيقات النقل الأمامية والعكسية. تم إجراء فحوصات المراسلين هذه بنجاح باستخدام مجموعة من بروتوكولات التثقيب الكهربائي و lipofection ، ويجب استكشاف الخيارات بشكل كامل قبل إجراء هذه المقايسات. يجب أيضا توخي الحذر لفحص إشارات NanoLuc و Firefly المكونة بدلا من مجرد إشارة الإصلاح المركبة المشتقة من تطبيع إشارة NanoLuc (ركيزة المراسل) إلى إشارة Firefly (التحكم). يمكن أن تنشأ القطع الأثرية من النسبة التي تحركها التغييرات في إشارة Firefly. على سبيل المثال ، يجب أن يؤدي تقييم التثبيط في وضع الاستجابة للجرعة باستخدام مركب محدد للغاية إلى قمع إشارة NanoLuc بطريقة قابلة للمعايرة دون إزعاج إشارة Firefly ، والتي يجب أن تظل مستقرة (الشكل 4G ، H). ومع ذلك ، في الحالات التي تكون فيها إشارات Firefly مضطربة ، لا يزال من الممكن تحديد التأثيرات المفيدة على الإصلاح من خلال تحديد نافذة الجرعة حيث لا تتأثر إشارة Firefly (الشكل 5).

بالمقارنة مع مقايسات مراسل DSBR الأكثر استخداما ، فإن فحوصات المراسل القائمة على التلألؤ خارج الكروموسومات لها بعض المزايا المميزة. نظرا لأن مسارات DSBR محفوظة بشكل كبير ، حتى لو كانت الآلات الخلوية تختلف بين نماذج الخلايا ، فلا يزال بإمكان المقايسات الإبلاغ عن كفاءة DSBR واختيار المسار. هذا يفتح تقييم DSBR لأي نموذج يهم المستخدم ، طالما تم تحديد ظروف النقل العابر المثلى مسبقا.

يوفر استخدام Nanoluciferase كجين مراسل أيضا مزايا على خيارات الفلورسنت ، والتي تم استخدامها تقليديا في فحوصات مراسل DSBR. NanoLuc سريع النضج ويتم الكشف عن التلألؤ بحساسية عالية باستخدام قارئ لوحة⁸. إلى جانب سرعة إصلاح الركيزة (حيث يتم نقل ركائز المراسل إلى خلايا ذات نهايات DSB جاهزة للإصلاح) ، يعد هذا الشكل من مقايسة مراسل DSBR مثاليا للتحول السريع والمتانة الكمية المطلوبة لفحص الجزيئات الصغيرة كجزء من سلسلة اكتشاف الأدوية الصناعية. في الواقع ، لقد وصفنا مؤخرا تنفيذ مقايسة مراسل MMEJ المستقلة عن الاستئصال في سلسلة الاكتشاف المستخدمة لتحديد مثبطات الجزيئات الصغيرة في مجال Polθ polymerase¹³.

هناك أيضا مرونة في تنفيذ مقايسات المراسل لمعالجة أسئلة محددة حول الاضطرابات الجينية والدوائية ل DSBR (الشكل 3). على سبيل المثال ، قبل نقل ركائز المراسل ، يمكن نقل الخلايا باستخدام siRNA ضد جين مهم لمدة 48-72 ساعة. بدلا من ذلك ، يمكن اختبار آثار الإفراط في التعبير الجيني على مسارات DSBR عن طريق إجراء نقل البلازميد 24-48 ساعة قبل نقل ركائز المراسل. بالنسبة للدراسات الدوائية ، يصف البروتوكول الحالي بالفعل كيف يمكن دمج استخدام الجزيئات الصغيرة في سير العمل القياسي ، ولكن قد تتضمن الأشكال البديلة تغييرات في أنظمة المعالجة المركبة ، مثل الحضانة المسبقة أو الانجرافات.

يمكن أن تدعم قابلية التوسع في النقل العابر أيضا مناهج الفحص واسعة النطاق التي يتم فيها إجراء نقل دفعي لركائز المراسل قبل الفحص. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا أن تختلف مدة الفحص من النقل إلى القراءة. على الرغم من أن الفترات القياسية قد تكون 16-24 ساعة ، إلا أنه يمكن قراءة بعض المقايسات في أقل من 6 ساعات^{و 7}. يجب أيضا مراعاة المخاوف بشأن السمية من الجزيئات الصغيرة أو siRNA التي يمكن أن تعرض بقاء الخلية للخطر عند تحديد مدة الفحص.

باختصار ، توفر المقايسات الموضحة في هذه الدراسة والموصوفة بالكامل في منشور حديث⁷ تقييما سريعا وقويا لكفاءة DSBR الخلوية. فهي حساسة للغاية وقابلة للمعايرة ، مما يجعلها قابلة للدراسات الجينية والدوائية. بشكل حاسم ، نظرا لأنه يمكن إدخال ركائز المراسل إلى الخلايا عن طريق النقل العابر ، فإن لديها القدرة على استخدامها في أي نموذج خلية قابل للنقل ذي أهمية ، بدلا من تقييدها بخطوط خلايا محددة من خلال التكامل المستقر كما هو الحال مع مراسلي DSBR الكروموسومات. ومع ذلك ، فإن أحد القيود المميزة لهذه المقايسات خارج الكروموسومات هو أن عدم الاندماج في الجينوم قد لا يلخص بشكل كامل السياق الفسيولوجي والكروماتيني لإصلاح الحمض النووي والإشارات التنظيمية المرتبطة به والتنسيق¹⁵. تحقيقا لهذه الغاية ، تعد مقايسات المراسل خارج الكروموسومات مكملة للطرق الحالية لتقييم DSBR وتوسيع مجموعة أدوات الموارد المناسبة لكل من البحوث الأساسية واكتشاف الأدوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10x TBE عازلة	Thermo Fisher	AM9863
20٪ TBE-acrylamide gel	Invitrogen	EC6315BOX
50x TAE buffer	Fisher Scientific	BP13321
6x Gel Loading Dye ، صفيحة بيضاء أرجوانية		NEB B7024S
96 جيدا (مع قاع وغطاء شفافين)	Porvair	204012
Agarose	كليفر Scientific	CSL-AG500
AMPure XP الخرز	Beckman Coulter	A63881	لتنقية الحمض النووي
الفوسفاتيز في القطب الجنوبي و 10X العازلة	NEB	M0289L
CLARIOstar	BMG Labtech	430-101	قارئ الألواح
الكونتيسة الثانية عداد الخلايا الآلي	Thermo Fisher	AMQAX1000	عداد الخلايا
قليل النوكليوتيدات المخصصة	Sigma-Aldrich	ترتيب مخصص	للركيزة MMEJ المستقلة عن الاستئصال. انظر الجدول 2.
D300e	Tecan	30100152	موزع مركب قائم على DMSO
D300e D4 + كاسيت	Tecan	30097371	كاسيت كبير الحجم لموزع مركب D300e
كاسيت D300e T8 +	كاسيت Tecan	30097370	كاسيت منخفض الحجم لموزع مركب D300e
ثنائي سلفوكسيد ثنائي ميثيل ، درجة ثقافة الخلية	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	مركبة للمركبات ، المستخدمة في الشكل 4 والشكل 5
DSBR المراسل البلازميدات	Artios		المتاحة للمجتمع الأكاديمي عند الطلب
EcoRV-HF و 10x CutSmart buffer	NEB	R3195M
الإيثانول المطلق	VWR	20821.365
مصل الأبقار الجنيني	PAN-Biotech	P30-3031   ؛
سلم الحمض النووي منخفض المدى GeneRuler	Thermo Fisher	SM1211	سلم الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي
HEK-293 خلايا	ATCC	CRL-1573	مثال على خط الخلية المستخدم في بروتوكول
HindIII-HF و 10x CutSmart عازلة	NEB	R3104M
HyClone علم الأحياء الجزيئية من درجة المياه	فيشر 10275262
I-SceI و 10x Tango Buffer	Invitrogen	ER1771
Isopropanol	VWR	20842.33
كاشف JetPRIME والمخزن المؤقت	PolyPlus	114-15	كاشف التعداء القائم على الدهون
MegaStar 1.6	VWR	521-1749	جهاز طرد مركزي لأنابيب 15 أو 50 مل MEM
Eagle	PAN-Biotech	P04-08056	وسط ثقافة لخلايا HEK-293
Microplate شاكر	فيشربراند	15504070	شاكر مداري Microplate
MicroStar 17R	VWR	521-1647	جهاز طرد مركزي لأنابيب 1.5 أو 2 مل MultiDrop
	Thermo Fisher	5840300	موزع كاشف خلية أو مائي
MultiDrop كاسيت قياسي كاسيت	ثيرمو فيشر	24072670	كاسيت لموزع كاشف MultiDrop
NanoDLR Stop & كاشف Glo Buffer and Substrate	Promega	N1630 أو N1650	Reporter luciferase (NanoLuc) لإخماد تلألؤ اليراع واكتشاف تلألؤ NanoLuc. جزء من مجموعة نظام فحص Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate	Promega	N1630 أو N1650	Control luciferase (Firefly) كاشف مقايسة للكشف عن Firefly. جزء من مجموعة نظام فحص Nano-Glo Dual-Luciferase
Reporter PBS (بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم)	PAN-Biotech	P04-36500
pGL4 بلازميد Firefly (أو ما شابه)	Promega	E1310 (أو ما يعادله)	بلازميد التحكم في Firefly
pNL1.1 NanoLuc بلازميد (أو ما شابه ذلك)	Promega	N1091 (أو ما يعادله)	بلازميد التحكم NanoLuc ، لتعديل إعدادات المعدات / تجارب التحسين
طقم استخراج جل QIAquick	Qiagen	28706
سلم الحمض النووي الأرجواني سريع التحميل 1 كيلو بايت	NEB	N0552S	سلم الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي
أسيتات الصوديوم (3 م) ، درجة الحموضة 5.5	ثيرمو فيشر	AM9740	لتعديل الأس الهيدروجيني أثناء استخراج الجل باستخدام طقم استخراج جل QIAquick
SYBR Gold (10،000x)	Invitrogen	S11494	لتصور ssDNA و dsDNA
SYBR Safe (10,000x)	Invitrogen	S33102	لتصور dsDNA فقط
T4 DNA Ligase و 10x Ligase buffer	NEB	M0202L
Trypan Blue stain 0.4٪	Invitrogen	T10282	لقياس الجدوى أثناء عد
الخلايا محلول Trypsin-EDTA ؛ 0.25٪ تريبسين و 0.53 ملي مولار EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
XhoI و 10x CutSmart buffer	NEB	R0146M