يوفر هذا البروتوكول دليلا لعزل الجلد باستخدام cyanoacrylate لمنع امتصاص البول عن طريق الفراء والجلد. يتضمن تعليمات لتطبيق الغراء على الجلد ، وزرع قسطرة المثانة ، وأقطاب لقياس المثانة وتسجيلات تخطيط كهربية العضلة العاصرة للإحليل الخارجية في الفئران المستيقظة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحسين تقنيات ديناميكا البول للماوس لتحسين الدقة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد القياس الدقيق للمعلمات البولية في الفئران المستيقظة أمرا بالغ الأهمية لفهم الخلل الوظيفي في المسالك البولية السفلية (LUT) ، خاصة في حالات مثل إصابة الحبل الشوكي بعد الصدمة في المثانة العصبية (SCI). ومع ذلك ، فإن إجراء تسجيلات قياس المثانة في الفئران يمثل تحديات ملحوظة. عندما تكون الفئران في وضع منبطح ومقيد أثناء جلسات التسجيل ، يميل الفراء والجلد إلى امتصاص البول ، مما يؤدي إلى التقليل من حجم الفراغ (VV). كان الهدف من هذه الدراسة هو تعزيز دقة قياسات المثانة وتسجيلات تخطيط كهربية العضلة العاصرة الخارجية (EUS-EMG) في الفئران المستيقظة. لقد طورنا طريقة فريدة باستخدام لاصق cyanoacrylate لإنشاء حاجز جلدي مقاوم للماء حول صماخ مجرى البول والبطن ، مما يمنع امتصاص البول ويضمن قياسات دقيقة. تظهر النتائج أنه بعد تطبيق cyanoacrylate ، ظل مجموع VV و RV متسقا مع حجم المحلول الملحي المشبع ، ولم تكن هناك مناطق رطبة لوحظت بعد التجربة ، مما يشير إلى نجاح منع امتصاص البول. بالإضافة إلى ذلك ، قامت الطريقة في وقت واحد بتثبيت الأقطاب الكهربائية المتصلة بالعضلة العاصرة الخارجية للإحليل (EUS) ، وضمان إشارات تخطيط كهربية العضل (EMG) المستقرة ، وتقليل القطع الأثرية الناتجة عن حركة الفأر المستيقظ والتلاعب بالمجرب. تتم مناقشة التفاصيل المنهجية والنتائج والآثار المترتبة ، مع تسليط الضوء على أهمية تحسين تقنيات ديناميكا البول في البحوث قبل السريرية.
المقدمة
يعتمد تخزين البول وإطلاقه على النشاط المنسق للمثانة البولية والعضلة العاصرة الخارجية لمجرى البول (EUS). في بعض الأمراض مثل المثانة العصبية، يمكن أن تصبح كل من عضلات نافصة المثانة والعضلة العاصرة مختلة، مما يؤدي إلى مشاكل كبيرة في المثانة، خاصة بعد إصابة الحبل الشوكي الرضحية (SCI)1.
تستخدم القوارض الصغيرة بشكل شائع كنموذج تجريبي لدراسة الوظيفة قبل السريرية للمسالك البولية السفلية (LUT)2. يمكن أن توفر تقنيات تسجيل قياس المثانة (FC) وتخطيط كهربية العضل بالموجات فوق الصوتية (EUS-EMG) معلومات موضوعية دقيقة اعتمادا على اختيار الطرق والقياس الدقيق وتفسير النتائج3. تستخدم اختبارات ديناميكا البول بشكل شائع لتقييم حجم الإفراغ (VV) وكفاءة الإفراغ (VE) وسعة المثانة4. يقيس التطرف العنيف مدى فعالية المثانة في إفراغ نفسها. يتم حسابه بقسمة الحجم المفرغ على مجموع الأحجام الملغاة والمتبقية (VV + RV). من ناحية أخرى ، يتم حساب سعة المثانة عن طريق إضافة VV (كمية البول المطرود أثناء التبول) إلى RV (كمية البول المتبقية في المثانة بعد التبول)5. لذلك ، فإن قياس VV و RV هما مفتاحا استنتاج المعلمات الأخرى.
يمثل القياس الدقيق ل VV في الفئران أثناء اختبارات ديناميكا البول تحديات مختلفة. يميل بول القوارض ، عند تقييده جسديا في وضعية الانبطاح ، إلى السحب لأسفل من خلال جدار البطن البطني بسبب تأثير الجاذبية6. يمكن أن تؤدي هذه الظاهرة إلى امتصاص البول بواسطة فرو البطن والجلد ، والذي بدوره يقلل من حجم البول الذي يفرز. بالنظر إلى كمية البول الصغيرة التي ينتجها الماوس ، فإن تأثير هذا الامتصاص على دقة النتائج يكون أكثر وضوحا7. علاوة على ذلك ، في نماذج اصابات النخاع الشوكي ، غالبا ما يكون VV أقل منه في الفئران العادية بسبب تأثير خلل تآزر العضلة العاصرة النافصة (DSD) ، مما يزيد من خطر ضغوط نقطة التسرب وامتصاص البول بواسطة الفراء8. هذه العوامل لها تأثير كبير على النتائج. لذلك ، فإن القياس الدقيق ل VV و RV أثناء دراسات ديناميكا البول النهائية في الفئران أمر بالغ الأهمية9. حاليا ، هناك نقص في التفاصيل في المنهجيات المقدمة في الأدبيات المنشورة حول كيفية قياس حجم البول بدقة في نماذج الفئران.
لاصق Cyanoacrylate هو نوع من الغراء يستخدم بشكل شائع في العمليات الجراحية في النماذج البشرية والحيوانية نظرا لخصائص الترابط السريعة والفعالة10،11،12. هذه المادة اللاصقة مفيدة بشكل خاص لإغلاق الجروح والتمزقات ، لأنها تشكل رابطة قوية ومرنة عند وضعها على الجلد13. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون حاجزا كبيرا ضد البول والرطوبة التي قد تتلامس مع الفراء والجروح11.
في هذه المقالة ، قمنا بتطوير تقنية جديدة وفعالة من حيث التكلفة تستخدم لاصق cyanoacrylate لتحقيق نتائج دقيقة في قياس المثانة وتسجيلات EUS-EMG في الفئران المستيقظة. ستكون هذه الطريقة مفيدة في فهم الأسباب الكامنة وراء ضعف المثانة وابتكار علاجات أكثر فعالية لاضطرابات LUT.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على بروتوكول دراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في كلية الطب بجامعة إنديانا. رمز الموافقة: 21098MD / R / MSS / HZ تاريخ الموافقة: 29 سبتمبر 2021.
1. إعداد القسطرة
- قطع أنبوب بولي إيثيلين PE-30 30 سم (.017 بوصة × .030 بوصة). استخدم ولاعة لإشعال أحد طرفي الأنبوب ، وتأكد من أنه لا يلمس اللهب ، واسحب الولاعة بمجرد أن يشكل الأنبوب طرفا مستديرا بشكل مناسب على شكل جرس.
- أدخل بعناية حوالي 3/4 إبرة 25G في الطرف الآخر من الأنبوب. تحضير حقنة 1 مل وملء مع معقمة 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم. قم بتوصيل المحقنة بإبرة 25 جرام.
- قم بنقع المحلول الملحي برفق للتحقق من وجود طرف دائري مناسب وعدم وجود تسرب من نهايات الإبرة. تأكد من عدم الشعور بأي ضغط وأن المحلول الملحي يتدفق بسلاسة عبر القسطرة.
2. إعداد الأقطاب الكهربائية
- تحضير 2 أسلاك فولاذية بطول 20 سم. خذ الأسلاك الفولاذية وقم بتطبيق طلاء الرمل على طرفي منطقة الطلاء لتجريد 5 مم من السلك.
- خذ إبرة 25G وأدخلها على جانب واحد من السلك. تأكد من إدخال الإبرة بعناية لتجنب إتلاف السلك. ثني الجزء المجرد من السلك مثل الخطاف. سيساعد الخطاف على توصيل السلك بعضلة EUS.
- استخدم اللحام لتوصيل الدبوس بالطرف الآخر من السلك المخطط. سيساعد اللحام في تثبيت الدبوس بالسلك وضمان اتصال قوي. تأكد من تسخين لحام القصدير والرصاص حتى يذوب ويغطي السلك والدبوس.
3. إعداد
- منزل أنثى الفأر C57BL / 6 (8 أسابيع من العمر ، 18-20 جم من وزن الجسم) في منشأة وفقا لرعاية المؤسسية مع دورة 12 ساعة من الضوء والظلام والوصول غير المحدود إلى الماء وكريات الطعام القياسية.
4. التخدير أثناء الجراحة
- ضع في غرفة إيزوفلوران 2٪ وأكسجين نقي (1 لتر / دقيقة). تأكد من التخدير الكامل للحيوان باستخدام فحص إصبع القدم السلبي قبل نقله إلى القناع. بمجرد التأكيد ، قم بتغيير حالة الغاز إلى قناع.
- تأكد من تثبيت قناع التخدير في الموضع المناسب في المجال الجراحي المعقم. ضع مستلق على الستارة المعقمة مع أنفه في قناع صغير للاستنشاق (0.8-1 لتر / دقيقة مع 2٪ إيزوفلوران) لمواصلة إعطاء التخدير.
5. التحضير الجراحي
- إصلاح أطراف مع الشريط. استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق فراء أسفل البطن وحول صماخ مجرى البول (المنطقة التناسلية).
- ضع مرهما للعين لمنع أي جفاف محتمل في العينين. تحضير المنطقة المحلوقة باستخدام محلول البوفيدون اليود ومسح الحل مع الإيثانول 70 ٪. ضع ستارة معقمة على منطقة الجراحة.
6. الإجراء الجراحي
- زرع قسطرة المثانة
- تحت المجهر الجراحي ، باستخدام مقص Metzenbaum المستقيم وغير الحاد ، قم بعمل شق 1-2 سم في خط الوسط من جلد البطن والحوض. المضي قدما في شق اللفافة والعضلات في خط الوسط لكشف المثانة من خلال الجرح الجراحي.
- بمجرد أن تصبح المثانة مرئية من خلال الجرح الجراحي ، تابع سحب أي أعضاء أو أنسجة محيطة حسب الحاجة للحصول على رؤية واضحة للمجال الجراحي. احرص على تجنب أي تلاعب أو توتر غير ضروري في المثانة ، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى مضاعفات مثل تسرب البول أو إصابة الهياكل المحيطة.
- أمسك قبة المثانة وضع خيطا محفظا باستخدام خيوط أحادية الشعيرات غير قابلة للامتصاص 5-0 بإبرة مستدقة.
- باستخدام مقص صغير ، قم بإنشاء فغر المثانة الصغير داخل سلسلة المحفظة وقم بعمل ثقب حتى يتدفق البول.
- أمسك الطرف المستدير للقسطرة وأدخله من خلال الفتحة. بمجرد مرور طرف الأنبوب عبر الفتحة ، قم بخياطة خيط المحفظة حول الأنبوب. ثم اسحب الأنبوب برفق للخارج حتى يتم الشعور بالطرف تحت الخيط.
- قم ببث 1 مل من المحلول الملحي ببطء من الطرف الآخر من الأنبوب لتفريغ المثانة. تحقق من وجود أي تسرب حول القسطرة. في حالة وجود تسرب ، ضع خيطا إضافيا.
- بمجرد خروج المحلول الملحي من مجرى البول ، اسحب المحلول الملحي لفك ضغط المثانة.
- زرع أقطاب كهربائية EUS (الشكل 1)
- استخدم المقص الجراحي لتمديد شق البطن حتى قاع الحوض.
- تماشيا مع المثانة ، انقل العضلات والأغشية إلى القنوات الفرجية وحدد موقع مجرى البول والعضلة العاصرة الخارجية. احرص على عدم إيذاء الأوعية الذيلية الحرقفية والوسطى والأعصاب الفرجية.
- ثقب الجلد بشكل ثنائي ، على بعد 1 سم من صماخ مجرى البول ، باستخدام الإبرة التي تحتوي على القطب.
- أمسك طرف الخطاف بعناية بالملقط واسحب الإبرة برفق بعيدا عن الجلد.
- باستخدام طرف القطب ، قم بتوصيل عضلة EUS بعناية بشكل ثنائي. تجنب اللكم العميق جدا ، لأن هذا قد يضر العضلات ، مما قد يؤدي إلى تسرب البول المحتمل.
- استخدم الشعيرات الأحادية 3-0 غير القابلة للامتصاص لخياطة عضلات الحوض والبطن والجلد.
- تسرب المياه من الجلد
- ضع طبقة رقيقة من غراء cyanoacrylate على الجلد حيث تخرج الأقطاب الكهربائية لتثبيت الأقطاب الكهربائية في مكانها.
- ضع غراء cyanoacrylate على بعد 1 سم حول صماخ مجرى البول ويمتد 3 سم إلى البطن والمنطقة المخيطة. لتجنب ملامسة الغراء ، أمسك الصماخ بعناية بالملقط.
- استخدم ماصة دقيقة 0.5-10 ميكرولتر لسحب سائل المسرع لتجفيف الغراء.
تنبيه: سائل المسرع سائل قابل للاحتراق. - أضف سائل المسرع لضمان تفاعل لاصق مناسب. سيساعد ذلك على تجفيف الغراء بسرعة أكبر والتأكد من ضبطه بشكل آمن.
- إعداد ديناميكا البول
- قم بإعداد قارب وزن بوليسترين مقلوب بطول وعرض وعمق 4.5 سم. قم بتقطيعه إلى شكل مثلث بقاعدة 4 سم لوضع صماخ مجرى البول للفأر في هذه المساحة. ضع القالب الأساسي القابل للتصرف ، 37 مم × 24 مم × 5 مم ، تحت المساحة لجمع البول.
- أعد وضع الماوس في وضع الانبطاح وانقله بعناية إلى لوحة مصنوعة خصيصا مزودة بقناع غاز.
- تأكد من وضع صماخ مجرى البول بشكل صحيح داخل الأخدود. قم بتقييد رأس وطرف الماوس برفق بشريط لاصق وضع اللوحة على وسادة تدفئة حتى يستعيد الماوس وعيه الكامل (الشكل 2).
- قم بإجراء قياس المثانة فقط عندما يكون الماوس مستيقظا تماما ، وهو ما لا يقل عن 40 دقيقة بعد الشفاء من التخدير.
7. قياس المثانة وإعداد تسجيل EUS-EMG
- قم بإعداد ومعايرة مضخة التسريب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- خذ حقنة 20 مل بقطر 19.05 مم واملأها بسائل كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ في درجة حرارة الغرفة. تأمين حقنة لمضخة التسريب. اضبط سرعة التسريب على 0.01 مل / دقيقة.
- قم بتوصيل المحقنة بواسطة أنبوب PE-30 بجانب واحد من الموصل ثلاثي الاتجاهات. قم بتوصيل قسطرة المثانة بالجانب الآخر بمحول الضغط. قبل توصيل قسطرة المثانة ، تأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء.
- ثبت محول الضغط على نفس مستوى مثانة الماوس. يتم توصيل محول الضغط عبر مكبر للصوت بنظام الحصول على البيانات.
- قم بتوصيل خطاف خط أرضي واحد بالجلد والآخر بمواقع موصل القطب. سجل الضغط في البرنامج.
- بعد بدء تشغيل البرنامج ، تحقق من إشارات الضغط داخل المثانة (IVP) و EUS-EMG. احفظ اسم العينة واضبط الوقت.
- ابدأ ضخ المضخة. سجل الإشارات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم استخدام قياس المثانة وتتبع نشاط EUS-EMG لتحليل البيانات. تتضمن طريقة قياس المثانة المستمر ضخ محلول ملحي في المثانة وقياس تغيرات الضغط والحجم في المثانة في نفس الوقت. لقياس VV ، تم غرس 0.4 مل من المحلول الملحي بسرعة 0.01 مل / دقيقة ، وتم جمع البول على مدى 40 دقيقة في غطاء. يمكن الحصول على بقايا ما بعد الفراغ (PVR) عن طريق استنشاق المحلول الملحي من خلال القسطرة. في الفئران العادية بدون غراء ، كان مجموع VV و RV في كثير من الأحيان أقل من 0.4 مل. بعد التجربة ، كان الفراء في البطن ومحيط الصماخ رطبا بسبب امتصاص البول (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تصف تقنية ديناميكا البول هذه إجراء محسنا لقياس حجم البول وإشارة EUS- EMG في الفئران المستيقظة والمقيدة. يمكن أن يتداخل وجود الفراء حول صماخ مجرى البول ومنطقة البطن مع دقة قياس VV عن طريق امتصاص البول. على الرغم من أن الفراء المحيط بصماخ مجرى البول والبطن قد تم حلقه بعناية قبل الجراحة ، إلا أن الفراء الصغير المتبقي داخل هذه المناطق والجلد لا يزال يمتص البول ، وعادة ما يترك منطقة رطبة في البطن بعد التسجيل. هذه المشكلة ملحوظة بشكل خاص في إناث القوارض بسبب المسافة القصيرة للغاية بين صماخ مجرى البول والجلد المحيط
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH-NINDS (R21NS130241) و IND DEPT HLTH (55051 ، 74247 ، 74244) ، والجيش الأمريكي (HT94252310700).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مسرع | بوب سميث للصناعات | BSI-152 | |
| سيانواكريليت | TED PELLA، Inc | 14478 | |
| قالب قاعدة يمكن التخلص منه | TED PELLA، Inc | 27147-4 | |
| مضخة التسريب | Harvard Apparatus PHD ULTRA | 70-3006 | |
| Isoflurane | Henry Schein Inc | 1182097 | |
| PIN | World Precision Instruments | 5482 | |
| أنابيب البولي إيثيلين 30 | Braintree Scientific Inc | PE30 | |
| قارب وزن معقم | HEATHROW SCIENTIFIC | 797CK2 | |
| Windaq / Lite | أدوات DATAQ | 249022 |
المراجع
- Leslie, S. W., Tadi, P., Tayyeb, M. Neurogenic bladder and neurogenic lower urinary tract dysfunction. Statpearls. , (2024).
- Doelman, A. W., Streijger, F., Majerus, S. J., Damaser, M. S., Kwon, B. K. Assessing neurogenic lower urinary tract dysfunction after spinal cord injury: Animal models in preclinical neuro-urology research. Biomedicines. 11 (6), 1539(2023).
- Fraser, M. O., et al. Best practices for cystometric evaluation of lower urinary tract function in muriform rodents. Neurourol Urodyn. 39 (6), 1868-1884 (2020).
- Hashimoto, M., et al. Sex differences in lower urinary tract function in mice with or without spinal cord injury. Neurourol Urodyn. 43 (1), 267-275 (2024).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury-a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Lee, J., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. Int Urogynecol J. 14, 31-37 (2003).
- Mann-Gow, T. K., et al. Evaluating the procedure for performing awake cystometry in a mouse model. J Vis Exp. (123), e55588(2017).
- Saito, T., et al. Time-dependent progression of neurogenic lower urinary tract dysfunction after pinal cord injury in the mouse model. Am J Physiol Renal Physioly. 321 (1), F26-F32 (2021).
- Schneider, M. P., et al. A novel urodynamic model for lower urinary tract assessment in awake rats. BJU Int. 115, 8-15 (2015).
- Habib, A., Mehanna, A., Medra, A. Cyanoacrylate: A handy tissue glue in maxillofacial surgery: Our experience in alexandria, egypt. J Maxillofac Oral Surg. 12, 243-247 (2013).
- Sunjic Roguljic, V., Roguljic, L., Jukic, I., Kovacic, V. The influence of wound closure techniques after surgical decompression in patients with carpal tunnel syndrome on sleep disturbance and life quality: A prospective comparison of surgical techniques. Clin Pract. 14 (2), 546-555 (2024).
- Sohn, J. J., Gruber, T. M., Zahorsky-Reeves, J. L., Lawson, G. W. Comparison of 2-ethyl-cyanoacrylate and 2-butyl-cyanoacrylate for use on the calvaria of cd1 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 55 (2), 199-203 (2016).
- Ren, H., et al. Injectable, self-healing hydrogel adhesives with firm tissue adhesion and on-demand biodegradation for sutureless wound closure. Sci Adv. 9 (33), 4327(2023).
- Ito, H., Pickering, A. E., Kanai, A., Fry, C. H., Drake, M. J. Muro-neuro-urodynamics; a review of the functional assessment of mouse lower urinary tract function. Front Physiol. 8, 240395(2017).
- Abdelkhalek, A. S., Youssef, H. A., Saleh, A. S., Bollen, P., Zvara, P. Anesthetic protocols for urodynamic studies of the lower urinary tract in small rodents-a systematic review. PloS One. 16 (6), e0253192(2021).
- Saab, B. J., et al. Short-term memory impairment after isoflurane in mice is prevented by the α5 γ-aminobutyric acid type a receptor inverse agonist l-655,708. J Am Soc Anesthesiol. 113 (5), 1061-1071 (2010).
- Cannon, T. W., Damaser, M. S. Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat. Life Sci. 69 (10), 1193-1202 (2001).
- Weiss, D. A., et al. Morphology of the external genitalia of the adult male and female mice as an endpoint of sex differentiation. Mol Cell Endocrinol. 354 (1-2), 94-102 (2012).
- Leggat, P. A., Kedjarune, U., Smith, D. R. Toxicity of cyanoacrylate adhesives and their occupational impacts for dental staff. Ind Health. 42 (2), 207-211 (2004).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
