Method Article

عزل وتوصيف وتحليل البروتينات للحويصلات خارج الخلية المشتقة من البلازما لاكتشاف المؤشرات الحيوية للقلب والأوعية الدموية

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المقالة منهجية لعزل وتوصيف وقياس الحويصلات خارج الخلية المشتقة من البلازما البشرية (EV) وتقدم سير عمل للتحليل الخالي من الملصقات لبروتين EV باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي الكروماتوغرافيا السائل (LC-MS / MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EV) هي جسيمات نانوية مشتقة من الخلايا ، محاطة بطبقة ثنائية الدهون ، غير قابلة للتكرار. تكتسب EV حاليا اهتماما في أبحاث القلب والأوعية الدموية نظرا لدورها في تنظيم الاتصال بين الخلايا ، ومن المحتمل أن تكون بمثابة مؤشرات حيوية قيمة لأمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن بروتين EV وإمكاناته كمؤشر حيوي في تشخيص القلب والأوعية الدموية لا يزالان غير مفهومين جيدا. يقدم هذا البروتوكول طريقة موحدة لعزل وقياس كمية EV المشتق من البلازما وتحليل شحنة البروتين الخاصة بهم باستخدام عينات البلازما من المرضى الذين يقدمون إلى وحدة آلام الصدر في مستشفى جامعي كبير. بعد الفصد الروتيني ، يتم عزل EV عن البلازما عن طريق الطرد المركزي الفائق. يتم تصور إثراء بروتينات علامة EV المحددة في عزلات EV عن طريق النشاف المناعي ، ويتم قياس متوسط توزيع الحجم وتركيزات EV في البلازما عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية. أخيرا ، يتم استخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء لتحليل بروتين EV الخالي من الملصقات. وبالتالي يوفر هذا البروتوكول نهجا شاملا لدراسة واستخدام EV المشتق من البلازما كناقلات محتملة للمعلومات البيولوجية الهامة وكذلك لاستكشاف إمكاناتها كمؤشرات حيوية جديدة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EV) ، حسب التسمية غير المحددة بشكل موحد ، هي جسيمات نانوية محاطة بطبقة ثنائية دهنية وتطلقها أنواع مختلفة من الخلايا ، وتفتقر إلى القدرة على التكرار1. تشمل هذه المجموعة المتنوعة الإكسوسومات ، وهي مجموعة سكانية فرعية من EV من أصل داخلي ، تتراوح عادة من حوالي 40 نانومتر إلى 160 نانومتر في القطر2. يمكن اكتشافها في العديد من سوائل الجسم3 ، تسهل EVs الاتصال بين الخلايا عن طريق نقل الجزيئات الحيوية النشطة المختلفة مثل البروتينات و mRNA و microRNA والدهون. وبالتالي ، توفر EV معلومات حول خليتها الأصلية من خلال علامات السطح والجزيئات الحيوية الخاصة با....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم تجنيد مجموعة نموذجية من المرضى تتألف من ثلاثة مرضى أصحاء لا يعانون من علامات على أمراض القلب والأوعية الدموية الظاهرة أو الكامنة ومريضين يعانون من احتشاء عضلة القلب المرتفع غير ST (NSTEMI). تم منح الموافقة المسبقة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لكلية الطب بجامعة هايدلبرغ (موافقة مجلس المراجعة المؤسسية #S-351/2015) ، وتم الحصول على موافقة خطية من جميع المرضى قبل التجنيد. تم تجنيد المرضى من وحدة آلام الصدر في قسم أمراض القلب في مستشفى هايدلبرغ الجامعي بناء على العرض السريري الأولي والتاريخ الطبي ونتائج الاختبارات التشخيصية.

تضمنت معايير الإدراج للمرضى ذوي المراقبة الصحية عرضا سريري....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل EV من عينات البلازما (ن = 3) للمرضى الذين لا يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية العلنية ، وكذلك من المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب غير المرتفع ST (NSTEMI ؛ ن = 2) ، باستخدام بروتوكول الطرد المركزي الفائق التفاضلي المعمول به. تم تأكيد الفصل الكافي للبلازما EV عن طريق النشاف المناعي للبروتينات المخصبة بالمركبات الكهربائية TSG-101 ، الملحق 5 (Anx5) ، و CD9 في عزلات EV مقارنة بالبلازما المستنفدة من EV من نفس المرضى (الشكل 1 أ). تم العثور على Transferrin ، الذي يعمل كعنصر تحكم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول منهجية واقعية ، خطوة بخطوة ، جاهزة للاستخدام لفصل وتوصيف البلازما EV ، بالإضافة إلى مقدمة لتحليل البروتين غير المسمى المناسب للاندماج في الممارسة السريرية الروتينية. يعد الوصف التفصيلي والالتزام الصارم بمنهجية موحدة لعزل المركبات الكهربائية من عينات البلازما أمرا مهما لضمان استنساخ النتائج التي تم الحصول عليها. تشير الأدبيات الحالية إلى أن ظروف ما قبل التحليل يمكن أن تؤثر بشكل كبير على القياسات اللاحقة والتحليلات النهائية لعزلات المركبات الكهربائية. لذلك ، من الأهمية .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصلت EG على أتعاب مكربة للمحاضرين من Roche Diagnostics و BRAHMS Thermo Scientific و Bayer Vital GmbH و AstraZeneca و Lilly Deutschland و Boehringer Ingelheim. حصل على منح بحثية مؤسسية من Roche Diagnostics و Daiichi Sankyo ، ويعمل كمستشار لشركة Roche Diagnostics و BRAHMS Thermo Scientific و Astra Zeneca و Novartis و Boehringer Ingelheim ، خارج العمل المقدم. تلقت JBK تمويلا متعلقا بالمشروع من المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK) و Roche Diagnostics. يعلن المؤلفون الباقون عدم وجود تضارب في المصالح فيما يتعلق بالمصنف المقدم.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون هايدي ديجينتاش وأميلي ويرنر وإليزابيث ميرتز على دعمهم التنظيمي خلال هذا المشروع.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli عينة BuffferBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
26.3 مل زجاجة بولي كربونات مع مجموعة غطاء للطرد المركزي الفائقبيكمان كولتر355654
5810R أجهزة الطرد المركزيEppendorf5811000015
Acetonitrile (ACN)Biosolve0001204101BS
ديثيوثريتول (DTT)سيجما ألدريتش43816-10 مل
ملحي مخزن بالفوسفات من دولبيكو (PBS)سيجما ألدريتشD8537
حمض الفورميك 99٪ ULC / MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
مطياف الكتلة Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS تشغيل العازلةThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 SoftwareMalvern Panalytical 
NuPAGE 4  مكرر 12   ؛ ٪ ، جل بروتين بيس تريسInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 جهاز طرد مركزي فائق قائم على الأرضبيكمان كولتر521-4180
PageRuler Plus سلم بروتين ملونThermo Fisher Scientific26619
كوكتيل مثبط البروتياز / الفوسفاتيز (100X)تقنية إشارات الخلية5872S
البروتينThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Hybrid رباعي الأقطاب Orbitrap مطياف الكتلةThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
وصمة عار سريعة coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 & micro; م 1 زدكتور مايشr119.aq.0001
جل تجاري SDS-PAGEThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette   ؛ Citrat 9NC 0.106 مول / لتر 3،2٪Sarstedt02.1067.001
مكثف السرعة vacSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640 ، يونيو 2020) قاعدة بيانات البروتينUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
المخزن المؤقت لبيكربونات ثلاثي إيثيل الأمونيوم (TEAB)Sigma-AldrichT7408
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) ل HPLC >99٪ ، 100 ملسيجما ألدريتش302031-100 مل
تريبسين MS-GradeThermo Fisher90058
نوع 50.2 Ti دوار بزاويةثابتة بيكمانكولتر 337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
WaterBiosolve0023214102BS
محلول علامة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

Related Articles