Method Article

عزل وتوصيف وتحليل البروتينات للحويصلات خارج الخلية المشتقة من البلازما لاكتشاف المؤشرات الحيوية للقلب والأوعية الدموية

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المقالة منهجية لعزل وتوصيف وقياس الحويصلات خارج الخلية المشتقة من البلازما البشرية (EV) وتقدم سير عمل للتحليل الخالي من الملصقات لبروتين EV باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي الكروماتوغرافيا السائل (LC-MS / MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EV) هي جسيمات نانوية مشتقة من الخلايا ، محاطة بطبقة ثنائية الدهون ، غير قابلة للتكرار. تكتسب EV حاليا اهتماما في أبحاث القلب والأوعية الدموية نظرا لدورها في تنظيم الاتصال بين الخلايا ، ومن المحتمل أن تكون بمثابة مؤشرات حيوية قيمة لأمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن بروتين EV وإمكاناته كمؤشر حيوي في تشخيص القلب والأوعية الدموية لا يزالان غير مفهومين جيدا. يقدم هذا البروتوكول طريقة موحدة لعزل وقياس كمية EV المشتق من البلازما وتحليل شحنة البروتين الخاصة بهم باستخدام عينات البلازما من المرضى الذين يقدمون إلى وحدة آلام الصدر في مستشفى جامعي كبير. بعد الفصد الروتيني ، يتم عزل EV عن البلازما عن طريق الطرد المركزي الفائق. يتم تصور إثراء بروتينات علامة EV المحددة في عزلات EV عن طريق النشاف المناعي ، ويتم قياس متوسط توزيع الحجم وتركيزات EV في البلازما عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية. أخيرا ، يتم استخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء لتحليل بروتين EV الخالي من الملصقات. وبالتالي يوفر هذا البروتوكول نهجا شاملا لدراسة واستخدام EV المشتق من البلازما كناقلات محتملة للمعلومات البيولوجية الهامة وكذلك لاستكشاف إمكاناتها كمؤشرات حيوية جديدة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EV) ، حسب التسمية غير المحددة بشكل موحد ، هي جسيمات نانوية محاطة بطبقة ثنائية دهنية وتطلقها أنواع مختلفة من الخلايا ، وتفتقر إلى القدرة على التكرار1. تشمل هذه المجموعة المتنوعة الإكسوسومات ، وهي مجموعة سكانية فرعية من EV من أصل داخلي ، تتراوح عادة من حوالي 40 نانومتر إلى 160 نانومتر في القطر2. يمكن اكتشافها في العديد من سوائل الجسم3 ، تسهل EVs الاتصال بين الخلايا عن طريق نقل الجزيئات الحيوية النشطة المختلفة مثل البروتينات و mRNA و microRNA والدهون. وبالتالي ، توفر EV معلومات حول خليتها الأصلية من خلال علامات السطح والجزيئات الحيوية الخاصة بالخلية ، مع تأثر خصائصها بشدة بحالة الخلية الأم وبيئتها4. أدت هذه الخصائص إلى اهتمام متزايد بالدور المحتمل للمركبات الكهربائية كمؤشرات حيوية ، لا سيما في سياق أمراض القلب والأوعية الدموية.

أظهرت العديد من الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي أن إجهاد نقص الأكسجين في عضلة القلب يؤدي إلى زيادة إطلاق EV5،6،7. ركزت الأبحاث المعاصرة على شحن المركبات الكهربائية إلى حد كبير على microRNA المرتبط بالمركبات الكهربائية ، والذي لديه القدرة على العمل كمؤشر حيوي في تشخيص أمراض القلب والأوعية الدموية المختلفة8،9،10. في المقابل ، لا تزال الأدلة على بروتين EV المتداول نادرة نسبيا ، مع وجود عدد أقل من الدراسات التي تبحث في البلازما EV في مرضى القلب والأوعية الدموية. في دراستين شاملتين حول EV المشتق من البلازما من المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب ، حدد المؤلفون ملف تعريف بروتين EV محدد ناتج عن نقص التروية مع أهمية تشخيصية محتملة6،11.

أثبتت المعالجة المنهجية للمركبات الكهربائية تاريخيا أنها صعبة ، وفي الوقت الحالي ، لا توجد توصية نهائية للنهج الأمثل لعزل المركبات الكهربائية وتوصيفها وقياسها كميا. تشمل الطرق شائعة الاستخدام لعزل EV الطرد المركزي الفائق التفاضلي ، والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، وطرق الترشيح مثل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم1. وفقا لإرشادات الإجماع الحالية ، يجب أن يتضمن توصيف عزلات EV دليلا على ثلاث علامات بروتين سطحي نموذجية على الأقل ، مثل التتراسبانين أو الملحقات ، جنبا إلى جنب مع طريقة التصوير1. لفحص شحنة المركبات الكهربائية على مستوى البروتين ، يتم استخدام الطرق القائمة على الأجسام المضادة مثل اللطخة الغربية أو ELISA بشكل متكرر.

نظرا للتحديات المنهجية المرتبطة بعزل ومعالجة المركبات الكهربائية المنتشرة ، يقدم هذا البروتوكول مسارا شاملا من تجنيد المرضى وجمع العينات إلى عزل EV اللاحق وتوصيف وقياس عزلات المركبات الكهربائية البلازمية. بالإضافة إلى ذلك ، تعرض هذه الدراسة سير عمل للعزل الفوري للمركبات الكهربائية المشتقة من البلازما من المرضى الذين يقدمون إلى قسم الطوارئ (وحدة آلام الصدر) في مركز رعاية من الدرجة الثالثة في جنوب غرب ألمانيا ، متبوعا بتحليل خال من الملصقات لبروتين EV في البلازما الخاص بالمرض باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS). الهدف من ذلك هو تسهيل تحليل عالي الإنتاجية لتحديد البروتينات المخصبة تفاضليا المرتبطة بالمركبات الكهربائية عبر مجموعة كبيرة من المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية الإقفارية أو الخلقية أو المناعية المتنوعة عند التشخيص الأولي وطوال تطور المرض و / أو حله. يسعى نهج الفحص البروتيني هذا إلى تحديد أنماط إثراء البروتين الخاص بالمركبات الكهربائية المرتبطة بمسارات الأمراض المميزة ، مع الهدف النهائي المتمثل في الكشف عن المؤشرات الحيوية للبروتين الجديدة المرتبطة بالمركبات الكهربائية لتعزيز التشخيص الحالي والمراقبة العلاجية في أمراض القلب والأوعية الدموية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم تجنيد مجموعة نموذجية من المرضى تتألف من ثلاثة مرضى أصحاء لا يعانون من علامات على أمراض القلب والأوعية الدموية الظاهرة أو الكامنة ومريضين يعانون من احتشاء عضلة القلب المرتفع غير ST (NSTEMI). تم منح الموافقة المسبقة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لكلية الطب بجامعة هايدلبرغ (موافقة مجلس المراجعة المؤسسية #S-351/2015) ، وتم الحصول على موافقة خطية من جميع المرضى قبل التجنيد. تم تجنيد المرضى من وحدة آلام الصدر في قسم أمراض القلب في مستشفى هايدلبرغ الجامعي بناء على العرض السريري الأولي والتاريخ الطبي ونتائج الاختبارات التشخيصية.

تضمنت معايير الإدراج للمرضى ذوي المراقبة الصحية عرضا سريريا غير نمطي أو غير محدد ، ومستويات المؤشرات الحيوية للقلب ضمن الحدود الطبيعية ، وعدم وجود تاريخ لأمراض القلب والأوعية الدموية ، والنتائج الطبيعية في أي اختبارات تشخيصية أخرى. تضمنت معايير الاستبعاد تاريخا من الأورام الخبيثة أو العلاج التثبيط الخلوي خلال السنوات الخمس الماضية ، وغسيل الكلى ، ومتلازمات فرط شحميات الدم العائلية ، وأي تاريخ من أمراض القلب والأوعية الدموية. تم تشخيص NSTEMI باتباع الإرشادات الحالية12 ، مع تضيق الشريان التاجي ذي الصلة من الناحية الدموية التي تم تأكيدها بواسطة تصوير الأوعية التاجية. لكل مريض ، تم جمع ما يصل إلى 36 مل من الدم من الوريد الأمامي إلى أنابيب تجميع مكملة بالسترات عبر الفصدالقياسي 13 ، وتم نقل عينات الدم على الفور عند 4 درجات مئوية لمزيد من المعالجة. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. عزل EV باستخدام الطرد المركزي التفاضلي

ملاحظة: تم استخدام بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي لعزل EV من عينات البلازما البشرية. تم إجراء دورتين للطرد المركزي الفائق (UC) مع زيادة قوة الطرد المركزي لزيادة نقاء حبيبات EV الناتجة.

  1. عزل البلازما
    1. ابدأ في معالجة عينات الدم الكاملة ، المبردة عند 4 درجات مئوية ، في غضون 120 دقيقة من التجميع لضمان سلامة المركبات الكهربائية في البلازما. استخدم أنابيب جمع الدم المكملة بالسترات (0.106 مول/لتر سيترات) لمنع التخثر.
    2. خفف 9 مل من الدم الكامل المقشر 1: 1 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) لتقليل اللزوجة. أضف 5 مل من وسط تدرج الكثافة (1.077 جم / مل) للفصل أثناء الطرد المركزي.
    3. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 25-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بإخراج جزء البلازما بعناية من أعلى كل عمود إلى أنابيب طرد مركزي متخصصة. انتقل إلى الخطوات التالية أو قم بالتجميد عند -80 درجة مئوية.
  2. إزالة بقايا الخلايا والأجسام موت الخلايا المبرمج
    1. قم بالطرد المركزي للبلازما عند 20,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي فائق مع دوار بزاوية ثابتة ، دون فرملة. يجب أن تتشكل حبيبات مرئية من بقايا الخلايا والأجسام موت الخلايا المبرمج في قاع الأنبوب.
  3. عزل المركبات الكهربائية
    1. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. جهاز طرد مركزي فائق عند 100,000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية ، بدون فرملة ، لعزل EV ، والذي سيشكل حبيبات مرئية على جدار الأنبوب.
    2. قم بإزالة الماصة الطافية بعناية باستخدام ماصة إلكترونية، مع ترك حوالي 1 مل من البلازما المستنفدة من المركبات الكهربائية الكهروضوية. قم بالتبديل إلى ماصة سعة 1000 ميكرولتر للبلازما المتبقية، مع سحب العينة ببطء لتجنب إزعاج حبيبات EV. قم بإمالة الأنبوب تدريجيا أثناء سحب العينات لضمان عدم بقاء البلازما في الأنبوب.
  4. التحضير لتحليل المصب
    1. أعد تعليق حبيبات EV المعزولة وفقا لمتطلبات التحليل النهائي: لتتبع الجسيمات النانوية ، أعد تعليق حبيبات EV من 9 مل من الدم الكامل في 200 ميكرولتر من PBS ؛ بالنسبة ل LC-MS / MS ، قم بإعادة تعليق EV المعزول من 36 مل من الدم الكامل في 50 ميكرولتر من 1x RIPA مع مثبط البروتياز / الفوسفاتيز 1٪
    2. انقل حبيبات EV المعلقة إلى أنبوب 1.5-2 مل. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل أو المتابعة حسب الحاجة.

2. تحليل تتبع الجسيمات النانوية

ملاحظة: تم إجراء القياس الكمي لمتوسط توزيع حجم EV في عينات البلازما البشرية باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، وهي طريقة كشف قائمة على الليزر تحلل الحركة البراونية للجسيمات النانوية.

  1. تخفيفات العمل ل NTA
    1. قم بتخفيف محلول مخزون EV (حبيبات EV المعلقة في 200 ميكرولتر PBS) باستخدام PBS المثلج بنسب 1:10 و 1:50 و 1:100 و 1:200. قم بإنشاء تخفيفات عمل مختلفة لتحديد التخفيف الأنسب لتحقيق العد النهائي من 10-100 جسيم نانوي لكل إطار أثناء تتبع الجسيمات النانوية.
  2. تشغيل NTA
    1. قم بتشغيل أداة NTA وقم بتشغيل البرنامج القابل للتطبيق على الكمبيوتر المتصل. ضع الغرفة داخل تابوت الليزر وانقر فوق بدء تشغيل الكاميرا لتنشيطها.
    2. ارسم 1 مل من PBS في حقنة. قم بتوصيل المحقنة بالأنبوب الأمامي وقم بشطف نظام الأنابيب جيدا ، مع ضمان عدم وجود هواء في الغرفة. راقب الكاميرا لاكتشاف أي فقاعات هواء أو جزيئات ملوثة.
    3. ارسم مخفف عمل EV المحضر في حقنة سعة 1 مل وحقنها في الغرفة.
    4. اضبط كسب الشاشة لمطابقة سطوع الشاشة في علامتي التبويب الالتقاط والمعالجة . قم بتعديل مستوى الكاميرا للتمييز بين الجسيمات النانوية بوضوح على الشاشة.
    5. قم بتعيين عتبة اكتشاف مناسبة في علامة التبويب عملية لضبط الحساسية للتمييز بين الجسيمات وضوضاء الخلفية. حافظ على ثبات هذه القيمة لجميع القياسات داخل نفس التجربة.
    6. قم بتركيز الكاميرا باستخدام العجلة على كل جانب من جوانب الجهاز حتى تظهر الجسيمات النانوية حادة على الشاشة.
    7. اضبط درجة حرارة ثابتة (من الناحية المثالية 22 درجة مئوية) لجميع القياسات في إعدادات الأجهزة ، حيث تعتمد الحركة البراونية على درجة الحرارة.
    8. انقر فوق الزر " تشغيل " لبدء القياس. أدخل معرف العينة والمذيب في النافذة المنبثقة.
    9. سجل ما لا يقل عن ثلاثة مقاطع فيديو مدتها 30 ثانية لكل عينة تشغيل. تقدم العينة بين القياسات لالتقاط عينة تمثيلية لمحلول الجسيمات النانوية. إذا كانت مضخة الحقنة متوفرة ، فقم بضبطها بسرعة ثابتة وقم بالتسجيل باستمرار.
    10. بعد التسجيل ، يقوم البرنامج تلقائيا بحساب تركيز وتوزيع حجم الجسيمات النانوية. انقر فوق تغيير لإدخال عامل التخفيف المستخدم للعينة، ثم احفظ النتائج بالنقر فوق تصدير.
  3. تحليل البيانات
    1. تحليل النتائج باستخدام ملفات الإخراج في برنامج إحصائي.

تحليل خال من الملصقات لبروتين EV باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS)

ملاحظه: تم إجراء تحليل بروتين EV الخالي من الملصقات باستخدام الفصل الأولي للبروتين من خلال الرحلان الكهربائي للهلام لبروتينات EV بعد تحلل الغشاء. بعد هضم البروتين داخل الهلام مع التربسين ، تم تحليل الببتيدات باستخدام LC-MS / MS ، مع مطابقة الأطياف الفردية مع قاعدة بيانات البروتين البشري. والجدير بالذكر أنه إذا كان هناك حاجة إلى تحليل غير مستهدف لمحاللات EV ، يوصى باستخدام بروتينات البندقية دون اختيار مسبق لنطاق وزن جزيئي محدد ، مما يجعل الخطوات 3.1.1-3.1.7 من هذا البروتوكول غير ضرورية.

  1. هضم التربسين داخل الجل
    1. قم بإعداد محلول EV معلق في 1x RIPA buffer عن طريق إضافة المخزن المؤقت لتحميل Laemmli وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). تغلي العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. قم بتحميل عينات EV ، مع استكمال المخزن المؤقت للتحميل ، جنبا إلى جنب مع سلم البروتين على 4٪ -12٪ من المواد الهلامية Bis-Tris للرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) 14. قم بتلطيخ الجل باستخدام Coomassie Blue لمدة 1-4 ساعات لتصور نطاقات البروتين. قم بإزالة بقع الجل بالماء عن طريق احتضانه طوال الليل.
    3. استئصال العصابات الملطخة بالكوماسي من مناطق الهلام التي تحتوي على بروتينات ذات أهمية باستخدام شفرة مشرط.
    4. اغسل قطع الجل ب 60 ميكرولتر من 1: 1 (حجم / حجم) 50 ملي مولار ثلاثي إيثيل أمونيوم بيكربونات (TEAB) وأسيتونيتريل (ACN) ، درجة الحموضة 8.5 ، لمدة 10 دقائق. تقليص قطع الجل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها 60 ميكرولتر من ACN. يغسل مرة أخرى ب 60 ميكرولتر 50 ملي TEAB ، درجة الحموضة 8.5.
    5. قلل البروتينات باستخدام 10 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) في 100 ملي مولار من TEAB عند 57 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتجفيف قطع الجل.
    6. يؤلكل البروتينات ب 10 ملي مولار يودوأسيتاميد (IAA) في 100 ملي مولار من TEAB عند 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.
    7. اغسل قطع الجل ب 60 ميكرولتر من 100 ملي TEAB وقم بتقليصها مرتين لمدة 10 دقائق لكل منها في 60 ميكرولتر من ACN.
    8. أضف 50 ملي مولار من محلول التربسين TEAB ، المركز وفقا لذلك ، إلى قطع الجل الجافة. احتضان لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. قم بإخماد التفاعل بإضافة 20 ميكرولتر من 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA).
    9. استخرج الببتيدات الناتجة عن طريق احتضانها ب 30 ميكرولتر من 1: 1 (حجم / حجم) 0.1٪ TFA و ACN لمدة 30 دقيقة. جفف المواد الهلامية ب 20 ميكرولتر من ACN لمدة 20 دقيقة ، ثم اغسلها مرة أخرى ب 30 ميكرولتر من 100 ملي TEAB لمدة 20 دقيقة.
    10. قلص الجل مرتين باستخدام 20 ميكرولتر من ACN لمدة 20 دقيقة لكل منهما.
    11. قم بتركيز المادة الطافية التي تم جمعها من كل خطوة من خطوات الاستخراج في جهاز طرد مركزي مفرغ وقم بإذابة العينة في 15 ميكرولتر من 0.1٪ TFA.
  2. تحليل LC-MS / MS
    1. قم بإجراء تحليل LC-MS / MS النانوي باستخدام مطياف كتلة كروماتوغرافيا سائل عالي الدقة مقترنا بمحلل مصيدة الأيونات الكهروستاتيكية.
    2. استخدم 0.1٪ حمض الفورميك (FA) / 1٪ ACN كمذيب A و 0.1٪ FA / 89.9٪ ACN كمذيب B.
    3. افصل الببتيدات في تدرج خطي مدته 25 دقيقة: ابدأ من 3٪ مذيب B ، وقم بزيادة B إلى 23٪ خلال 21 دقيقة ، ثم إلى 38٪ خلال 4 دقائق ، واستمر في الغسيل عند 95٪ B.
    4. قم بتشغيل مطياف الكتلة في وضع الاستحواذ المعتمد على البيانات ، بالتناوب تلقائيا بين MS و MS2. الحصول على أطياف MS (m/z 400-1600) بدقة 60,000 عند m/z 400، مما يولد أطياف MS2 لما يصل إلى 15 سلائفا باستخدام طاقة تصادم طبيعية تبلغ 27 وعرض عزل يبلغ 1.4 m/z.
  3. البحث في قاعدة بيانات البروتين
    1. ابحث في أطياف MS / MS مقابل قاعدة بيانات البروتين Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640 ، يونيو 2020) وقاعدة بيانات ملوثات مخصصة (جزء من MaxQuant ، MPI Martinsried15،16) باستخدام Proteome Discoverer 2.5 مع Sequest HT.
    2. قم بتكوين إعدادات البرنامج على النحو التالي: اضبط تحمل كتلة أيون الشظية على 0.02 دالتون وتحمل كتلة الأيونات الأصلية إلى 5 جزء في المليون. حدد التربسين باعتباره الإنزيم المستخدم للهضم ، وقم بتعيين كارباميدوميثيل كتعديل ثابت للسيستين ، مع الأكسدة (الميثيونين) وإزالة التدمير (الأسباراجين والجلوتامين) كتعديلات متغيرة. تشمل الأستلة وفقدان الميثيونين ومزيجها كتعديلات متغيرة لنهاية البروتين.
    3. حدد كمية الببتيدات باستخدام وضع الكمي لأيون السلائف ، باستخدام طريقة Top N Average (n = 3) لحساب وفرة البروتين17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل EV من عينات البلازما (ن = 3) للمرضى الذين لا يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية العلنية ، وكذلك من المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب غير المرتفع ST (NSTEMI ؛ ن = 2) ، باستخدام بروتوكول الطرد المركزي الفائق التفاضلي المعمول به. تم تأكيد الفصل الكافي للبلازما EV عن طريق النشاف المناعي للبروتينات المخصبة بالمركبات الكهربائية TSG-101 ، الملحق 5 (Anx5) ، و CD9 في عزلات EV مقارنة بالبلازما المستنفدة من EV من نفس المرضى (الشكل 1 أ). تم العثور على Transferrin ، الذي يعمل كعنصر تحكم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول منهجية واقعية ، خطوة بخطوة ، جاهزة للاستخدام لفصل وتوصيف البلازما EV ، بالإضافة إلى مقدمة لتحليل البروتين غير المسمى المناسب للاندماج في الممارسة السريرية الروتينية. يعد الوصف التفصيلي والالتزام الصارم بمنهجية موحدة لعزل المركبات الكهربائية من عينات البلازما أمرا مهما لضمان استنساخ النتائج التي تم الحصول عليها. تشير الأدبيات الحالية إلى أن ظروف ما قبل التحليل يمكن أن تؤثر بشكل كبير على القياسات اللاحقة والتحليلات النهائية لعزلات المركبات الكهربائية. لذلك ، من الأهمية ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصلت EG على أتعاب مكربة للمحاضرين من Roche Diagnostics و BRAHMS Thermo Scientific و Bayer Vital GmbH و AstraZeneca و Lilly Deutschland و Boehringer Ingelheim. حصل على منح بحثية مؤسسية من Roche Diagnostics و Daiichi Sankyo ، ويعمل كمستشار لشركة Roche Diagnostics و BRAHMS Thermo Scientific و Astra Zeneca و Novartis و Boehringer Ingelheim ، خارج العمل المقدم. تلقت JBK تمويلا متعلقا بالمشروع من المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK) و Roche Diagnostics. يعلن المؤلفون الباقون عدم وجود تضارب في المصالح فيما يتعلق بالمصنف المقدم.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون هايدي ديجينتاش وأميلي ويرنر وإليزابيث ميرتز على دعمهم التنظيمي خلال هذا المشروع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli عينة BuffferBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
26.3 مل زجاجة بولي كربونات مع مجموعة غطاء للطرد المركزي الفائقبيكمان كولتر355654
5810R أجهزة الطرد المركزيEppendorf5811000015
Acetonitrile (ACN)Biosolve0001204101BS
ديثيوثريتول (DTT)سيجما ألدريتش43816-10 مل
ملحي مخزن بالفوسفات من دولبيكو (PBS)سيجما ألدريتشD8537
حمض الفورميك 99٪ ULC / MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
مطياف الكتلة Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS تشغيل العازلةThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 SoftwareMalvern Panalytical 
NuPAGE 4  مكرر 12   ؛ ٪ ، جل بروتين بيس تريسInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 جهاز طرد مركزي فائق قائم على الأرضبيكمان كولتر521-4180
PageRuler Plus سلم بروتين ملونThermo Fisher Scientific26619
كوكتيل مثبط البروتياز / الفوسفاتيز (100X)تقنية إشارات الخلية5872S
البروتينThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Hybrid رباعي الأقطاب Orbitrap مطياف الكتلةThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
وصمة عار سريعة coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 & micro; م 1 زدكتور مايشr119.aq.0001
جل تجاري SDS-PAGEThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette   ؛ Citrat 9NC 0.106 مول / لتر 3،2٪Sarstedt02.1067.001
مكثف السرعة vacSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640 ، يونيو 2020) قاعدة بيانات البروتينUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
المخزن المؤقت لبيكربونات ثلاثي إيثيل الأمونيوم (TEAB)Sigma-AldrichT7408
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) ل HPLC >99٪ ، 100 ملسيجما ألدريتش302031-100 مل
تريبسين MS-GradeThermo Fisher90058
نوع 50.2 Ti دوار بزاويةثابتة بيكمانكولتر 337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
WaterBiosolve0023214102BS
محلول علامة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367, 6478(2020).
  3. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (22), 2180-2181 (2018).
  4. Zara, M., Amadio, P., Campodonico, J., Sandrini, L., Barbieri, S. S. Exosomes in cardiovascular diseases. Diagnostics (Basel). 10 (11), 943(2020).
  5. Ontoria-Oviedo, I., et al. Extracellular vesicles secreted by hypoxic ac10 cardiomyocytes modulate fibroblast cell motility. Front Cardiovasc Med. 5, 152(2018).
  6. Zara, M., et al. Plasma exosome profile in st-elevation myocardial infarction patients with and without out-of-hospital cardiac arrest. Int J Mol Sci. 22 (15), (2021).
  7. Anselmo, A., et al. Myocardial hypoxic stress mediates functional cardiac extracellular vesicle release. Eur Heart J. 42 (28), 2780-2792 (2021).
  8. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: A systematic review. Cardiovasc Res. 111 (4), 322-337 (2016).
  9. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: Novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circ Res. 110 (3), 483-495 (2012).
  10. Deddens, J. C., et al. Circulating microRNAs as novel biomarkers for the early diagnosis of acute coronary syndrome. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 884-898 (2013).
  11. Gidlof, O., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles reveals additional diagnostic biomarkers for myocardial infarction compared to plasma alone. Sci Rep. 9 (1), 8991(2019).
  12. Byrne, R. A., et al. ESC guidelines for the management of acute coronary syndromes. Eur Heart J Acute Cardiovasc Care. 10, (2023).
  13. Garcia-Castrillo, L., et al. Recommendations for blood sampling in emergency departments from the European Society for Emergency Medicine (EUSEM), European Society for Emergency Nursing (EUSEN), and European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) working group for the pre-analytical phase. Clin Chem Lab Med. 62 (8), 1538-1547 (2024).
  14. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  15. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the maxquant environment. J Proteome Res. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  16. Cox, J., Mann, M. Maxquant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Blein-Nicolas, M., Zivy, M. Thousand and one ways to quantify and compare protein abundances in label-free bottom-up proteomics. Biochim Biophys Acta. 1864 (8), 883-895 (2016).
  18. Lacroix, R., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: Results of the international society on thrombosis and haemostasis SSC collaborative workshop. J Thromb Haemost. 11 (6), 1190-1193 (2013).
  19. Nieuwland, R., Siljander, P. R. A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum. J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).
  20. Lacroix, R., et al. Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles: Towards standardization of protocol. J Thromb Haemost. 10 (3), 437-446 (2012).
  21. Coumans, F. aW., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  22. Clayton, A., et al. Considerations towards a roadmap for collection, handling and storage of blood extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1647027(2019).
  23. Lucien, F., et al. Miblood-EV: Minimal information to enhance the quality and reproducibility of blood extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12385(2023).
  24. Zhang, X., Takeuchi, T., Takeda, A., Mochizuki, H., Nagai, Y. Comparison of serum and plasma as a source of blood extracellular vesicles: Increased levels of platelet-derived particles in serum extracellular vesicle fractions alter content profiles from plasma extracellular vesicle fractions. PLoS One. 17 (6), e0270634(2022).
  25. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12162(2022).
  26. Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position paper from the working group on cellular biology of the heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 114 (1), 19-34 (2018).
  27. Davidson, S. M., et al. Methods for the identification and characterization of extracellular vesicles in cardiovascular studies: From exosomes to microvesicles. Cardiovasc Res. 119 (1), 45-63 (2023).
  28. Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cell Mol Life Sci. 75 (15), 2873-2886 (2018).
  29. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10 (1), 1039(2020).
  30. Palviainen, M., et al. Extracellular vesicles from human plasma and serum are carriers of extravesicular cargo-implications for biomarker discovery. PLoS One. 15 (8), e0236439(2020).
  31. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: A position statement from the international society for extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  32. Gemoll, T., et al. Protein profiling of serum extracellular vesicles reveals qualitative and quantitative differences after differential ultracentrifugation and ExoQuick TM isolation. J Clin Med. 9 (5), 1429(2020).
  33. Kreimer, S., et al. Mass-spectrometry-based molecular characterization of extracellular vesicles: Lipidomics and proteomics. J Proteome Res. 14 (6), 2367-2384 (2015).
  34. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  35. Bateman, N. W., et al. Maximizing peptide identification events in proteomic workflows using data-dependent acquisition (dda). Mol Cell Proteomics. 13 (1), 329-338 (2014).
  36. Pino, L. K., Just, S. C., Maccoss, M. J., Searle, B. C. Acquiring and analyzing data independent acquisition proteomics experiments without spectrum libraries. Mol Cell Proteomics. 19 (7), 1088-1103 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

Related Articles