تم تصميم هذا البروتوكول للتحقيق في مدى تلف الحمض النووي الذي يحدث أثناء تكرار الحمض النووي. في ظل ظروف محايدة ، يمكن تقييم تحريض فواصل الحمض النووي بسهولة في إطار زمني قصير. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتوكول قابل للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى وكواشف إجهاد النسخ المتماثل المختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن فواصل الحمض النووي في تقسيم الخلايا البشرية بواسطة مقايسة المذنب المحايد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يواجه تكرار الحمض النووي باستمرار تحديا من خلال مجموعة واسعة من الضغوطات الداخلية والخارجية التي يمكن أن تلحق الضرر بالحمض النووي. يمكن لمثل هذه الآفات التي تصادف أثناء تكرار الجينوم أن توقف الردود وتحول شوكات النسخ المتماثل إلى فواصل مزدوجة الخيوط. إذا تركت دون إصلاح ، يمكن أن تؤدي فواصل الحمض النووي السامة هذه إلى إعادة ترتيب الكروموسومات ، مما يؤدي إلى زيادة عدم استقرار الجينوم وزيادة احتمال التحول الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الخلايا السرطانية إجهادا مستمرا للتكرار ، مما يجعل استهداف نقاط ضعف شوكة النسخ المتماثل في الخلايا السرطانية استراتيجية جذابة للعلاج الكيميائي. تقنية متعددة الاستخدامات وقوية للغاية لدراسة فواصل الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل هي مقايسة المذنب. تكتشف تقنية الرحلان الكهربائي الهلامي هذه بشكل موثوق تحريض وإصلاح فواصل الحمض النووي على مستوى الخلية الواحدة. هنا ، تم تحديد بروتوكول يسمح للمحققين بقياس مدى تلف الحمض النووي في تقسيم الخلايا البشرية انقساميا باستخدام عوامل توقف الشوكة عبر أنواع متعددة من الخلايا. إن اقتران ذلك بتسجيل المذنبات الآلي يسهل التحليل السريع ويعزز الموثوقية في دراسة تحريض فواصل الحمض النووي.
المقدمة
مقايسة المذنب هي طريقة رحلان كهربائي هلامي تستخدم للكشف عن فواصل الحمض النووي على مستوى الخلية الواحدة. يعتمد على مبدأ أن فواصل الحمض النووي المفتوحة تهاجر في ظل ظروف الرحلان الكهربائي ، بينما يظل الحمض النووي السليم ثابتا إلى حد كبير. يهاجر الحمض النووي المكسور لأن الفواصل تؤدي إلى استرخاء الحمض النووي الفائق ، مما يتسبب في انتقاله المكاني التدريجي نحو الأنود في غرفة الرحلان الكهربائي ، مما يؤدي إلى ظهور يشبه المذنب لوحظ بواسطة التألق المناعي 1,2. ثم يتم قياس مدى تلف الحمض النووي عن طريق تحديد كمية الحمض النووي المكسور التي هاجرت بالنسبة إلى الحمض النووي المضغوط.
طريقتا فحص المذنبا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يستخدم هذا البروتوكول (الشكل 1) بشكل أساسي خطوط الخلايا السرطانية U2OS الملتصقة ولكنه قابل للتكيف مع مجموعة متنوعة من الخلايا الملتصقة والمعلقة المزروعة في زراعة الأنسجة. وترد في الجدول 1 تفاصيل الحلول والمخازن المؤقتة المستخدمة في هذه الدراسة. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.
1. تحضير المواد
- قبل يوم التجربة ، ضع الزجاجة المرفقة مع أغاروز منخفض الذوبان (1٪ أغاروز منخفض الذوبان في PBS) في حمام ماء ساخن لمدة 5-10 دقائق للتأكد من ذوبان الأغاروز تماما.
ملاحظة: لا تسخن الزجاجة في الميكروويف. - بمجرد ذوبانها ، قم بسرعة بتقسام 100 ميكرولتر من....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحليل تحريض الكسر بواسطة كواشف الإجهاد المتماثلة
تمت معالجة خلايا U2OS باستخدام DMSO ، 4 من mM hydroxyurea (HU) ، أو 100 نانومتر من CPT لمدة 4 ساعات وتم تحليلها لتراكم الكسر بواسطة مقايسة NC (الشكل 6A). بينما يحفز CPT فواصل خلال المرحلة S عن طريق منع topoisomerase-113 ، فإن استنفاد برك النوكليوتيدات الناجم عن HU يوقف شوكات النسخ المتماثل التي يتم تحويلها تدريجيا إلى DSBs28. تشير البيانات إلى أن التعرض إما ل HU أو CPT يؤدي إل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يحدد هذا البروتوكول مقايسة NC لتقييم فواصل الحمض النووي في الخلايا البشرية التي تخضع للتكرار النشط. البروتوكول سهل التنفيذ نسبيا ، ويمكن للباحثين تكييفه بسهولة مع ظروف الأس الهيدروجيني العالية للتحليلات القلوية8. ويتضمن خطوتين حاسمتين، كما هو موضح في الخطوتين 3-7 و4-5. في الخطوة 3.7 ، من الضروري نشر الأغاروز الذائب مع الخلايا بشكل موحد عبر البئر لمنع المذنبات من التداخل أثناء التحليل. تأكد من إذابة الركام الخلوي قبل تعليق الخلايا في الأغاروز. منع إطلاق طرف الماصة أثناء نشر الأغاروز سيساعد على تقلي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر أعضاء مختبر Dungrawala على مدخلاتهم وتعليقاتهم. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35GM137800 إلى HD.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | |
| Camptothecin | Selleckchem | S1288 | |
| Comet LMAgarose (LMA) | R & أنظمة D | 4250-050-02 | |
| نظام الرحلان الكهربائي لمقايسة المذنب الثاني | R & أنظمة D | 4250-050-ES | يتضمن خزان الرحلان الكهربائي ، وغطاء الأمان ، والكابلات ، وصواني منزلقة 2/20 آبار وتراكب صينية الشرائح |
| برنامج CometScore | TriTek | مفتوح المصدر | |
| CometSlide | R & أنظمة D | 4250-050-03 | |
| DMEM, ارتفاع الجلوكوز | Gibco | 11965092 | |
| DMEM / F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | FisherSci | D128-4 | |
| مجهر Epifluorescence | Keyence | BZ-X810 | |
| مصل الأبقار الجنينية - Premium | Bio-Techne | S11150 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمر | Gibco | 25300054 | |
| GraphPad Prism 10.0 | GraphPad | ||
| خلايا HEK293T | ATCC | CRL-11268 | |
| hTERT-RPE-1 الخلايا | ATCC | CRL-4000 | |
| هيدروكسي يوريا | Millipore Sigma | H8627 | |
| PARP مثبط Olaparib | Selleckchem | S8096 | |
| PowerPac | FisherSci | FB300Q | |
| ثقافة الأنسجة المعقمة المعالجة بالسطح | FisherSci | FB012927 | |
| SYBR Green I صبغة جل الحمض النووي (10،000x) خلايا | FisherSci | S7567 | |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | |
| UVP ؛ HB-1000 حاضنة التهجين | FisherSci | UVP95003001 |
المراجع
- Olive, P. L. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids. Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
