يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الكشف عن النقل الغريب الحيوي وتأثيراته في الميتوكوندريا المعزولة: رؤى من المقايسات التنفسية والأنزيمية

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67146

⸱

مارس 7, 2025

 ,  , 
1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه الدراسة منهجية لدراسة تأثيرات الأجانب الحيوية على وظيفة الميتوكوندريا عن طريق المقايسات التنفسية والأنزيمية. يفحص تعديل سلسلة نقل الإلكترون في أنواع مختلفة ، ويقدم رؤى لتطوير مبيدات الآفات الحيوية المستهدفة ضد الأمراض التي تنقلها نواقل الحشرات.

الملخص

غالبا ما يشار إلى الميتوكوندريا على أنها قوة الخلية نظرا لدورها الحاسم في إنتاج الطاقة من خلال سلسلة نقل الإلكترون (ETC). ومع ذلك ، فإن أهميتها تمتد إلى ما هو أبعد من إنتاج الطاقة. يمكن أن يؤدي خلل تنظيم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا إلى شلالات داخل الخلايا تؤثر على الصحة والوظيفة الخلوية. نظرا لأهميتها الفسيولوجية ، هناك اهتمام متزايد باستكشاف الإمكانات الدوائية لوظيفة الميتوكوندريا لتطوير علاجات ومنتجات حيوية جديدة. يمكن أن يوفر تعديل الطاقة الحيوية للميتوكوندريا نهجا مبتكرة لمواجهة تحديات مثل الاضطرابات التنكسية العصبية وأمراض التمثيل الغذائي والسرطان ، فضلا عن تطوير منتجات حيوية لمكافحة الآفات والأمراض المنقولة بالنواقل.

يقدم هذا العمل طريقة لتقييم تأثيرات الكائنات الغريبة الحيوية على سلسلة نقل الإلكترون (ETC) باستخدام ركائز مختلفة ، بما في ذلك الغلوتامات و NADH للمركب الأول ، والسكسينات للمركب الثاني ، والسيتوكروم ج (المؤكسد والمخفض على حد سواء) للمجمعات III و IV. تسمح هذه المنهجية بتنشيط أو تثبيط نقل الإلكترون عبر مجمعات الميتوكوندريا ليتم تقييمها باستخدام مقياس التنفس ومقياس الطيف الضوئي. يمكن الحصول على الميتوكوندريا من الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا المجزأة أو الأنسجة المتجانسة من أنواع مختلفة.

في المختبر ، تم تحليل وظيفة الميتوكوندريا في فئران الزاعجة المصرية والوستار ، ولكن هذه الطريقة تنطبق أيضا على الأنواع الأخرى ، مثل Rhipicephalus microplus و Rhodnius prolixus. يوفر هذا النهج الأساس للتنظير حول وجود بروتينات غير مقترنة وتفضيلات الركيزة المؤكسدة الخاصة بالأنواع المتأثرة بمتطلباتها النشطة الفريدة. تقدم النتائج الحديثة رؤى قيمة حول استراتيجيات تصميم المبيدات الحشرية الحيوية المبتكرة التي تستهدف وظيفة الميتوكوندريا ، وتحمل إمكانات كبيرة للسيطرة الفعالة على الأمراض المنقولة بالنواقل وتفشي الآفات.

المقدمة

لطالما كانت الميتوكوندريا تسمى محطة توليد الطاقة للخلايا بسبب توليد الطاقة الكيميائية أثناء عملية الفسفرة المؤكسدة1،2. بالإضافة إلى وظائف التمثيل الغذائي الأساسية الرئيسية ، تتورط الميتوكوندريا أيضا في العديد من العمليات الخلوية الأخرى ، بدءا من مستويات تنظيم Ca2+ داخل الخلايا ، والعمليات الالتهابية ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية إلى عمليات تحريض موت الخلايا3. ارتبطت الطاقة الحيوية للميتوكوندريا وعدم تنظيمها بالعمليات داخل الخلايا التي تؤثر على الوظيفة الخلوية والصحة العامة. وقد أثار هذا اهتماما متزايدا بالبحث عن الإمكانات الصيدلانية لاستهداف وظيفة الميتوكوندريا لتطوير علاجات مبتكرة ومنتجات حيوية آمنة4،5،6. بالإضافة إلى ذلك ، يعد فهم التفاعل المعقد لعمليات الميتوكوندريا وتأثيرها على الوظيفة الخلوية أمرا بالغ الأهمية لتطوير علاجات مستهدفة وتقديم فرص لتصميم منتجات حيوية للسيطرة على الأمراض المنقولة بالنواقل وتفشي الآفات7،8.

ظهر استهداف مكونات محددة من سلسلة نقل الإلكترون باستخدام الكائنات الغريبة الحيوية كاستراتيجية لتعديل وظيفة الميتوكوندريا لتوليد المبيدات الحيوية. ثبت أن المركبات الطبيعية والاصطناعية المدرجة في تركيبات المبيدات الحشرية ، مثل مبيدات الآفات التي تستهدف الميتوكوندريا القائمة على الجسيمات النانوية ، تؤثر على وظيفة الميتوكوندريا عن طريق تقليل إمكانات الميتوكوندريا وتخليق ATP في S. frugiperda9.

بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن معظم الكربامات والمنتجات القائمة على البيرثرويد كمثبطات معقدة من النوع الأول في البعوض. ومع ذلك ، فقد أدى تعرضها الممتد إلى إنشاء بعض المجموعات المقاومة للبيرثرويد في Anopheles gambiae ، وغالبا ما ترتبط بمستويات مرتفعة من P450s التي يمكنها استقلاب هذه الركائز10،11. وبالمثل ، تم توثيق النباتات وزيوتها الأساسية ومستخلصاتها ومستقلبات الأيض الثانوية كمبيدات حشرية محتملة لها نطاق واسع من الوفيات في مراحل الحشرات المختلفة12،13. قد يرتبط نشاط المبيدات الحشرية لهذه المركبات الطبيعية بتثبيط نقل الإلكترون في نقطة معينة في سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا عن طريق تعديل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، وإمكانات الميتوكوندريا ΔΨm ، وتخليق ATP الذي يمكن أن يؤدي إلى عمليات موت الخلايا6،8.

تلعب المركبات الطبيعية ، كمصادر لصياغة مبيدات الآفات ، وتأثيراتها على الميتوكوندريا دورا حاسما في تصميم مبيدات الآفات الحيوية الجديدة والآمنة. في هذا السياق ، تصف هذه المخطوطة منهجية لتحديد قدرة الكائنات الغريبة الحيوية على تنشيط أو تثبيط نقل الإلكترون عبر مجمعات الميتوكوندريا. يسمح هذا النهج الشامل بالقياس الدقيق لتأثيرات الكائنات الغريبة الحيوية على وظيفة الميتوكوندريا باستخدام مجموعة متنوعة من الركائز ، باستخدام كل من طرق قياس إعادة التكوين وقياس الطيف الضوئي. تم تطبيق هذه المنهجية لتحليل وظيفة الميتوكوندريا لأنواع النواقل الرئيسية ، بما في ذلك الزاعجة المصرية ، مما أدى إلى التنظير لوجود بروتينات غير مقترنة وتفضيلات ركيزة متميزة قابلة للأكسدة خاصة بكل نوع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الأساليب المبينة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات "لجنة البحوث العلمية في التحقيق في سانتاندير": لجنة أخلاقيات البحث العلمي التابعة لجامعة سانتاندير الصناعية. علاوة على ذلك ، امتثلت هذه المقايسات لإرشادات Arrive واتبعت القانون الكولومبي لعام 1989 84 (الفصل الرابع ، المواد 23-26) والقرار 8430 (1993 ، الباب الرابع ، المواد 83-93) الذي ينظم البحوث على في كولومبيا.

ملاحظة: يوصى بشدة بقراءة فصل الفسفرة المؤكسدة في أي كتاب كيمياء حيوية قبل البدء في هذا البروتوكول.

1. الكواشف والحلول

  1. لعزل الميتوكوندريا في كبد الفئران ، قم بإعداد 250 مل من عازلة عزل الميتوكوندريا: 250 ملي مولار D-mannitol ، و 10 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.2 ، و 1 ملي مولار EGTA. أخرج 50 مل من المخزن المؤقت للعزل (سيسمى هذا المخزن المؤقت للعزل بدون BSA) ثم أضف 0.2 جم من BSA إلى 200 مل الأخرى (سيسمى هذا المخزن المؤقت للعزل مع BSA).
  2. لتجانس يرقات الزاعجة المصرية ، قم بإعداد 100 مل من العازلة: 250 ملي من السكروز ، 10 ملي مولار HEPES ، 1 ملي مولار EGTA درجة الحموضة 7.2.
  3. تحضير المخزن المؤقت للتفاعل: 80 ملي مولار محلول عازلة لفوسفات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.4 ، 50 ميكرومتر EDTA.
  4. قم بإعداد مخزون من الكواشف المستخدمة في الأنشطة الأنزيمية عند درجة الحموضة 7.2 كما هو موضح أدناه: 25 ملي مولار NADH (محضر طازجا لكل فحص) ، 2 م سكسينات الصوديوم ، 4 ملي مولار سيتوكروم ج (محضر طازجا لكل فحص) ، 200 ميكرومتر روتينون ، 0.5 ملي KCN ، 6 ملي مولار 2،6-ثنائي كلورو فينوليندوفينول (DCPIP) ، 100 ملي مولار فينازين ميثوسلفات (PMS) ، و 60 ملي مولار فيريسيانيد البوتاسيوم.
    ملاحظة: تم استخدام الماء فائق النقاء بمقاومة 18.2 MΩ·cm عند 25 درجة مئوية لجميع التجارب وإعداد الكواشف. تم توليد هذه المياه باستخدام نظام تنقية Milli-Q ، مما يضمن إزالة الملوثات العضوية وغير العضوية والميكروبية إلى مستويات أقل من الحدود التي يمكن اكتشافها ، مما يجعلها مناسبة لتطبيقات البيولوجيا الكيميائية الحيوية والجزيئية عالية الحساسية.

2. تشريح الكبد ، والتجانس ، وعزل الميتوكوندريا من كبد الفئران

  1. قبل البدء ، ضع جميع المواد والمخازن المؤقتة على الجليد ، مع التأكد من أن جميع المواد باردة أثناء الفحص بأكمله لتجنب تلف الميتوكوندريا.
  2. ضع 10 مل من عازلة عزل الميتوكوندريا في أنبوب مخروطي بارد.
  3. قتل فأر الويستار الذكر عن طريق قطع رأس عنق الرحم ، وتجنب استخدام ثاني أكسيد الكربون2 الذي يمكن أن يتداخل مع فحوصات التنفس. لهذا الغرض ، وافقت لجنة أخلاقيات البحث العلمي التابعة لجامعة سانتاندير الصناعية (CEINCI) على الأساليب الواردة في القرار 13 لعام 2022.
    ملاحظة: يجب ألا يزيد وزن الفئران عن 170 جم ؛ يمكن أن تؤثر الدهون أيضا على تحليلات التنفس.
  4. قم بعمل شق (حوالي 4-5 سم) بمشرط معقم من خلال قسم الفئران البطنية.
  5. قم بتشريح الكبد تماما بمجرد ظهور منطقة البطن. كبد الفئران هو عضو متعدد الفصوصات ، أحمر غامق حوالي 10 سم × 5 سم.
  6. ضع الكبد بحذر داخل عازلة العزل المثلجة واشطفها مرتين باستخدام هذا الوسيط.
  7. افرم الكبد جيدا (حجم أقل من 1 سم) بمقص حاد في طبق بتري مع 10 مل من وسط العزل.
  8. ضع المحلول في أنبوب تخالط الأنسجة Potter Elvehjem وقم بتجانس بعناية عشر مرات على الأقل ، بسرعة منخفضة (~ 390 دورة في الدقيقة).
  9. انقل المحلول إلى أنبوب مخروطي الشكل وجهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية بعناية في أنبوب مخروطي جديد. تخلص من الحبيبات مع جزء من الأنسجة, الدم, والمكونات الخلوية السليمة.
  11. املأ الأنبوب بمزيد من عازلة العزل (~ 35 مل) وجهاز الطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  12. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات (الميتوكوندريا) بعناية في مخزن عازل جديد بدون BSA.
    ملاحظة: لإعادة تعليق الميتوكوندريا ، يوصى باستخدام فرشاة ناعمة.
  13. بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي عند 7000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الميتوكوندريا المعزولة في 2 مل من المخزن المؤقت للعزل بدون BSA.
  14. حدد تركيز البروتين باستخدام طريقة برادفورد أو ما شابهذلك 14.

3. مستعمرة الزاعجة المصرية وتجانس اليرقات.

ملاحظة: لهذا الإجراء Ae. تم الاحتفاظ بمستعمرة المصرية داخل أقفاص التكاثر (40 سم × 40 سم × 40 سم) في ظل ظروف حشرية مثل الرطوبة (70٪ ± 5٪) ، والفترة الضوئية (12:12) ، ودرجة الحرارة (27 ± 5 درجة مئوية). تم جمع البيض على ورق ترشيح.

  1. تأكد من أن البيض يفقس في صواني بماء مفلتر ومنزوع الكلور قبل أسبوع واحد من التجربة. حدد الطور من خلال عملية طرح الريش في دورة اليرقات. راقب كل عملية طرح للتحقق من حالتها L1 و L2 و L3. عندما تدخل اليرقة L3 ، انتظر 12 ساعة كحد أقصى لجمع المادة.
  2. اجمع ما لا يقل عن 100 Ae. aegypti يرقات في الطور L3-L4 في الماء الخالي من الكلور (~ 30 مل من الماء). خذ اليرقات بماصة باستور.
  3. قم بتصفية اليرقات باستخدام ورق الترشيح ، واشطف اليرقات المجمعة ، وأعد تعليقها في مخزن التجانس الزاعجة المصرية (~ 2 مل).
  4. انقل المحلول مع اليرقات إلى أنبوب مجانس الأنسجة Potter Elvehjem وقم بتجانس بعناية عشر مرات على الأقل عند ~ 390 دورة في الدقيقة.
  5. انقل الأنسجة المتجانسة وقم بتصفيتها من خلال حقنة من الصوف الزجاجي لإزالة بقايا الهيكل الخارجي الكبيرة.
  6. حدد تركيز البروتين باستخدام طريقة برادفورد أو ما شابهذلك 15.
    ملاحظة: ليس من الضروري عزل الميتوكوندريا عن يرقات البعوض. من الممكن تقييم تأثير xenobiotics باستخدام مستخلص البروتين الذي تم الحصول عليه في هذه الخطوة.

4. تحديد تأثيرات الكائنات الغريبة الحيوية على سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا

ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لتقييم تأثير الكائنات الغريبة الحيوية على الطاقة الحيوية للميتوكوندريا على الميتوكوندريا المعزولة من كبد الفئران وأنسجة الحشرات المتجانسة.

تنقسم المقايسات إلى قسمين: بولاروغرافي (NADH وأوكسيداز السكسينات) والقياس الطيفي الضوئي (نازعة هيدروجين NADH - المركب الأول ، نازعة هيدروجين السكسينات - المركب الثاني ، اختزال السيتوكروم ج - المركب الثالث والسيتوكروم ج أوكسيديز - المركب الرابع).

  1. فحوصات بولاروغرافيا: لهذا الغرض ، استخدم قياس إعادة التنفس عالي الدقة لقياس الأكسدة الكاملة ل NADH والسكسينات بواسطة استهلاك O2 ، والإبلاغ عن النتائج على أنها NADH وأوكسيداز السكسينات.
    1. قم بمعايرة الجهاز كل يوم قبل بدء الفحوصات. قد تختلف هذه الخطوة حسب الأوكسجرافراف المستخدم. اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
      1. لمعايرة Oroboros ، أضف وسط التفاعل إلى الغرف التي يزيد فيها عن 0.2 مل فوق حجم الغرفة التجريبية (2 مل) ، لملء الغرفة والحقن الشعري بالوسط.
    2. قم بتشغيل أدوات التقليب بعد الإضافة المتوسطة.
    3. انتظر حتى تستقر إشارة تركيز الأكسجين وقم بتسجيلها.
    4. لمعايرة الأكسجين الصفرية ، أضف الميتوكوندريا أو معلقات الخلايا أو خميرة الخباز أو الديثيونيت (يوصى باستخدام خميرة بيكر) التي تسمح بنضوب الأكسجين ، وسجلها. انتظر حتى تصل الإشارة إلى مستويات الخلفية (عادة ± 2 بمول / مل / ثانية لنظام O2k).
    5. قم بإجراء أنشطة NADH وأوكسيداز السكسينات من خلال مراقبة استهلاك الأكسجين عند إضافة عازلة التفاعل ، و 0.1 مجم من البروتين (الميتوكوندريا أو اليرقات المتجانسة) ، والركيزة (0.17 ملي مولار NADH أو 10 ملي مولار سكسينات الصوديوم) إلى الغرفة.
    6. استخدم مثبطات بروتين نقل الإلكترون للتأكد من أن استهلاك الأكسجين الملحوظ يرجع إلى سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا. الشائعة هي rotenone 1 μM و KCN 1mM16. في خلية الأوكسجراف، أضف الكواشف وفقا للجدول 1 (التسلسل مهم).
  2. المقايسات الطيفية الضوئية
    ملاحظة: لتقييم نقل الإلكترون عبر مجمعات الميتوكوندريا ، تم إجراء فحوصات إنزيمية وقياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي ومستقبلات الإلكترون الاصطناعية مثل PMS و DCPIP و cytochrome c. يوصى بقياس إنزيم واحد يوميا. قم بإعداد المخازن المؤقتة والكواشف قبل يوم واحد على الأقل من المقايسات. بعض المركبات قابلة للضوء. رأى الجدول 2 لمزيد من التوصيات.
    1. بالنسبة لنشاط نازعة هيدروجين NADH ، تحتوي أنظمة التفاعل على 50 ملي مولار من محلول الفوسفات المخزن الهيدروجيني 7.4 ، و 2 ملي مولار EDTA ، و 0.1 مجم / مل من بروتين الميتوكوندريا ، و 1 ميكرومتر روتينون ، و 1 ملي مولار KCN. في خلية مقياس الطيف الضوئي ، أضف الكواشف وفقا للجدول 2 (التسلسل مهم)17. الخطوات الموصى بها هي كما يلي:
      1. قم بإعداد 100 مل من الفوسفات العازل الممزوج ب EDTA ، وتحقق جيدا من عدم تغير الرقم الهيدروجيني. احتفظ بالمخزن المؤقت في الثلاجة ، ولكن من الضروري الاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة (RT ؛ حوالي 25 درجة مئوية) أثناء الفحصات.
      2. تحضير محاليل مخزون طازجة من روتينون ، KCN ، NADH ، وفيريسيانيد البوتاسيوم (مستقر حتى 4 ساعات). الحجم المقترح هو 1 مل من المحاليل المركزة (انظر العمود الأول من الجدول).
      3. إذا كان المركب المختبر ذوبان منخفض في الماء ، فقم بتضمين عنصر تحكم إضافي لنشاط الإنزيم في التصميم التجريبي باستخدام مذيب المركب فقط.
      4. أولا ، راقب نشاط نازعة هيدروجين NADH عن طريق تقليل فيريسيانيد البوتاسيوم عند 420 نانومتر. احسب تركيزه بمعامل الانقراض المولي البالغ 1.04 mM-1 سم -1. يحتوي مقياس الطيف الضوئي على خيار لحساب الحد الأقصى للنشاط في التفاعل. تحقق من دليل المستخدم. بعد ذلك ، قسم النشاط المبلغ عنه على تركيز البروتين المستخدم للحصول على النشاط المحدد للإنزيم.
    2. قم بتقييم نشاط نازعة هيدروجين السكسينات عن طريق إضافة 20 ملي مولار من سكسينات الصوديوم و 1 ملي مولار من ميثوسلفات الفينازين (PMS) مع 60 ميكرومتر 2،6-ثنائي كلورو فينوليندوفينول (DCPIP) كمستقبلات للإلكترون الاصطناعية. في خلية مقياس الطيف الضوئي ، أضف الكواشف وفقا للجدول 3 (التسلسل مهم)17. التوصيات هي كما يلي:
      1. قم بإعداد نفس المخزن المؤقت المستخدم في نازعة هيدروجين NADH. حافظ عليه في نفس الظروف.
      2. قم بإعداد حلول مخزون طازجة من السكسينات و PMS و DCPIP. الحجم المقترح هو 1 مل من المحاليل المركزة. قم بإعداد حلول PMS و DCPIP في نفس يوم الفحص.
      3. إذا كان المركب المختبر منخفض الذوبان في الماء ، فقم بتضمين عنصر تحكم إضافي لنشاط الإنزيم في التصميم التجريبي.
      4. راقب أكسدة السكسينات عن طريق تقليل DCPIP عند 600 نانومتر. احسب تركيزه من خلال معامل الانقراض المولي البالغ 21.0 ملي مولار −1 سم −1 ، بتطبيق قانون بير. بعد ذلك ، قسم النشاط المبلغ عنه على تركيز البروتين المستخدم للحصول على النشاط المحدد للإنزيم.
    3. قم بقياس نشاط اختزال السيتوكروم ج (المركب الثالث) باستخدام NADH أو السكسينات كركائز قابلة للأكسدة. باستخدام هذا الإنزيم ، ينتقل نقل الإلكترون من المركب الأول (باستخدام NADH) أو المركب الثاني (باستخدام السكسينات) إلى يوبيكوينون ثم إلى المركب الثالث ، الذي يمرر الإلكترونات إلى السيتوكروم c. يتبع هذا التفاعل تقليل السيتوكروم c. تحضير نظام التفاعل الذي يحتوي على محلول عازل للفوسفات 50 ملي مولار درجة الحموضة 7.4 ، 2 ملي EDTA ، 0.1 مجم من بروتين الميتوكوندريا ، 50 ميكرومتر NADH ، و 0.1 ملي KCN. في خلية مقياس الطيف الضوئي ، أضف الكواشف وفقا للجدول 4 (التسلسل مهم)18. التوصيات هي كما يلي:
      1. قم بإعداد نفس المخزن المؤقت المستخدم في نازعة هيدروجين NADH. حافظ عليه في نفس الظروف.
      2. استخدم نفس NADH و KCN من نازعة هيدروجين NADH.
      3. إذا كان المركب المختبر منخفض الذوبان في الماء ، فقم بتضمين عنصر تحكم إضافي لنشاط الإنزيم في التصميم التجريبي.
      4. راقب اختزال السيتوكروم ج عند 550 نانومتر واحسب تركيزه من خلال معامل الانقراض المولي البالغ 19.8 ملي مولار −1 سم − 1 ، بتطبيق قانون بير. بعد ذلك ، قسم النشاط المبلغ عنه على تركيز البروتين المستخدم للحصول على النشاط المحدد للإنزيم.
    4. قياس السيتوكروم ج أوكسيديز (المركب IV) معبرا عنه بنشاط السيتوكروم ج أوكسيديز. لهذا الغرض ، قم بإعداد تفاعل نظام يحتوي على محلول عازل للفوسفات 50 ملي مولار ، ودرجة الحموضة 7.4 ، و 2 ملي مولار EDTA ، و 0.1 مجم من بروتين الميتوكوندريا (الجدول 5). بالنسبة لهذه المقايسات الأنزيمية ، قلل السيتوكروم ج عن طريق خلط كميات متساوية المولار من السيتوكروم ج وديثيونيت الصوديوم ، مما يضمن التقليل الكامل للسيتوكروم ج.
    5. بعد ذلك ، قم بتمرير الخليط الناتج من خلال عمود هلام ديكستران متقاطع باستخدام نفس المحلول المخزن بالفوسفات مثل المرحلة المتنقلة. بعد ذلك ، حدد الكسور المجمعة باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 550 نانومتر19. التوصيات هي كما يلي:
      1. استخدم نفس المخزن المؤقت المستخدم لنازعة هيدروجين NADH. حافظ عليه في نفس الظروف.
      2. إذا كان المركب المختبر ذوبان منخفض في الماء ، فيجب تضمين تحكم إضافي لنشاط الإنزيم في التصميم التجريبي.
      3. راقب أكسدة السيتوكروم ج عند 550 نانومتر واحسب تركيزها من خلال معامل الانقراض المولي البالغ 19.8 ملي مولار −1 سم −1 ، بتطبيق قانون بير. بعد ذلك ، قسم النشاط المبلغ عنه على تركيز البروتين المستخدم للحصول على النشاط المحدد للإنزيم.
        ملاحظة: يتم تضمين ملف جدول بيانات يوضح عملية حساب النشاط المحدد للإنزيمات ، والذي يقاس باستهلاك الأكسجين وقياس الطيف الضوئي ، كملف تكميلي 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قبل تحليل النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول ، من الضروري أن نتذكر القليل عن الكيمياء الحيوية لسلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا. أولا ، يزود NADH زوجا من الإلكترونات لمراكز تقليل التأكسد الموجودة في المركب الأول. هناك ، يبدأ نقل الإلكترونات التي تنتقل من المركب الأول إلى اليوبيكوينون ، ثم إلى المركب الثالث ، الذي يتبرع بها للسيتوكروم ج ، وأخيرا إلى المركب الرابع ، حيث يكون الأكسجين هو متقبل الإلكترون النهائي ، مما يؤدي إلى تحويله إلى الماء. من ناحية أخرى ، يزود السكسينات الإلكترونات للمركب الثاني (و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم استخدام طريقة القياس الطيفي والاستبولاري مع O2 عالي الدقة للتحقيق في آثار الكائنات الغريبة الحيوية على وظيفة الميتوكوندريا. قيمت الدراسة على وجه التحديد تأثير زيت Cymbopogon flexuosus العطري والكارفاكرول على NADH وأكسدة السكسينات ، بالإضافة إلى نقل الإلكترون عبر سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا ، باستخدام نموذجين بيولوجيين مختلفين: الميتوكوندريا المعزولة من كبد الفئران ويرقات الزاعجة المصرية المتجانسة. بالإضافة إلى ذلك ، تم فحص انسدادات الإلكترون المحت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون "Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE" التابعة لجامعة سانتاندير الصناعية على تمويل المنحة رقم 3739 المقابلة لمشروع "صياغة مبيد إكسودي وإكسوبيلنت مصمم في المختبر وتم التحقق من صحته في الحقل لمنع الإصابة بالقراد في الماشية".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2،6-ثنائي كلورو فينوليندوفينولميرك119814استعد في نفس يوم الاستخدام.
كاشف برادفوردMerckB6916
BSAMerckA7030
CarvacrolMerckW224511
Cytochrome cMerckC2506Conver حساس للضوء قم بتغطيته بورق الألمنيوم. في المحلول يجب تخزينه في الثلاجة.
D-mannitolMerckM4125
EGTAMerck>E3889
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ملح رباعي الصوديوم ثنائي هيدراتميركE6511
هيبسميركH3375
KCNMerck60178في محلول يعمل ويل لمدة أسبوعين.
KH2PO4 MerckP5655
Multiskan FC Microplate PhotometerThermo Scientific 51119100
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
فينازين ميثوسلفات MerckP9625استعد في نفس يوم الاستخدام.
فيريسيانيد البوتاسيوم Merck244023استعد في نفس يوم الاستخدام.
خالط الأنسجة بوتر Elvehjem
RotenoneMerck557368قابل للذوبان في الإيثانول. كونفير حساس للضوء قم بتغطيته بورق الألمنيوم. في المحلول يجب تخزينه في الثلاجة.
سكسينات الصوديومMerckS9637في المحلول يجب تخزينه في الثلاجة.
السكروزميركS0389
& beta ؛ - نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد ، هيدرات ملح ثنائي الصوديوم المختزلMerckN8129Conver الحساس للضوء تغطيته بورق الألمنيوم. في المحلول يجب تخزينه في الثلاجة.
أنبوب

المراجع

  1. Javadov, S., Kozlov, A. V., Camara, A. K. S. Mitochondria in health and diseases. Cells. 9 (5), 1177(2020).
  2. Kummer, E., Ban, N. Mechanisms and regulation of protein synthesis in mitochondria. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (5), 307-325 (2021).
  3. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (2), 85-100 (2019).
  4. Fulda, S., Galluzzi, L., Kroemer, G. Targeting mitochondria for cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 9 (6), 447-464 (2010).
  5. Liu, Y., Shi, Y. Mitochondria as a target in cancer treatment. MedComm. 1 (2), 129-139 (2020).
  6. Duque, J. E., et al. Insecticidal activity of essential oils from American native plants against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): an introduction to their possible mechanism of action. Sci Rep. 13 (1), 2989(2023).
  7. Kesari, K. K., et al. Plant-derived natural biomolecule picein attenuates Menadione induced oxidative stress on neuroblastoma cell mitochondria. Antioxidants (Basel, Switzerland). 9 (6), 552(2020).
  8. Vanegas-Estévez, T., Duque, F. M., Urbina, D. L., Vesga, L. C., Mendez-Sanchez, S. C., Duque, J. E. Design and elucidation of an insecticide from natural compounds targeting mitochondrial proteins of Aedes aegypti. Pestic Biochem Physiol. 198, 105721(2024).
  9. Hao, Y., et al. Mitochondria-targeted nanocarriers doubled the toxicity of oxidative phosphorylation and ATP synthesis disruptive insecticides against Spodoptera frugiperda. Environ Sci Nano. 9 (10), 3873-3884 (2022).
  10. Lees, R. S., et al. New insecticide screening platforms indicate that Mitochondrial Complex I inhibitors are susceptible to cross-resistance by mosquito P450s that metabolise pyrethroids. Sci Rep. 10 (1), 16232(2020).
  11. Leung, M. C. K., Meyer, J. N. Mitochondria as a target of organophosphate and carbamate pesticides: Revisiting common mechanisms of action with new approach methodologies. Reprod Toxicol. 89, 83-92 (2019).
  12. Al-Harbi, N. A., et al. Evaluation of insecticidal effects of plants essential oils extracted from basil, black seeds and lavender against Sitophilus oryzae. Plants. 10 (5), 829(2021).
  13. Kim, S. -I., Roh, J. -Y., Kim, D. -H., Lee, H. -S., Ahn, Y. -J. Insecticidal activities of aromatic plant extracts and essential oils against Sitophilus oryzae and Callosobruchus chinensis. J Stored Prod Res. 39 (3), 293-303 (2003).
  14. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  15. Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236 (2), 302-308 (1996).
  16. Voss, D. O., Campello, A. P., Bacila, M. The respiratory chain and the oxidative phosphorylation of rat brain mitochondria. Biochem Biophys Res Commun. 4, 48-51 (1961).
  17. Gonçalves, M. J., et al. Composition and biological activity of the essential oil from Thapsia minor, a new source of geranyl acetate. Ind Crops Prod. 35 (1), 166-171 (2012).
  18. Somlo, M. Induction des lactico-cytochrome c reductases (d-et l-) de la levure aerobie par les lactates (d- et l). Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 97 (2), 183-201 (1965).
  19. Mason, T. L., Poyton, R. O., Wharton, D. C., Schatz, G. Cytochrome c Oxidase from Bakers' Yeast. J Biol Chem. 248 (4), 1346-1354 (1973).
  20. Nelson, D. L., Cox, M. Lehninger Principles of Biochemistry: International Edition. , Macmillan Learning. https://play.google.com/store/books/details?id=wZqp0AEACAAJ (2021).
  21. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. 120, e54985(2017).
  22. Maxwell, J. T., Tsai, C. -H., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. Analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells. J Vis Exp. (134), e57225(2018).
  23. Vesga, L. C., Silva, A. M. P., Bernal, C. C., Mendez-Sánchez, S. C., Romero Bohórquez, A. R. Tetrahydroquinoline/4,5-dihydroisoxazole hybrids with a remarkable effect over mitochondrial bioenergetic metabolism on melanoma cell line B16F10. Med Chem Res. 30, 2127-2143 (2021).
  24. Vesga, L. C., Bueno, Y., Stashenko, E., Mendez Sánchez, S. C. Efecto del aceite esencial de Eucalyptus citriodora sobre el metabolismo energético mitocondrial. Rev Colomb Quím. 43 (2), 10-17 (2015).
  25. Borrero-Landazabal, M. A., Duque, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Model to design insecticides against Aedes aegypti using in silico and in vivo analysis of different pharmacological targets. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 229, 108664(2020).
  26. Valmas, N., Zuryn, S., Ebert, P. R. Mitochondrial uncouplers act synergistically with the fumigant phosphine to disrupt mitochondrial membrane potential and cause cell death. Toxicology. 252 (1-3), 33-39 (2008).
  27. Slocińska, M., Rosinski, G., Jarmuszkiewicz, W. Activation of mitochondrial uncoupling protein 4 and ATP-sensitive potassium channel cumulatively decreases superoxide production in insect mitochondria. Protein Pept Lett. 23 (1), 63-68 (2016).
  28. Borrero Landazabal, M. A., Carreño Otero, A. L., Kouznetsov, V. V., Duque Luna, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Alterations of mitochondrial electron transport chain and oxidative stress induced by alkaloid-like α-aminonitriles on Aedes aegypti larvae. Pestic Biochem Physiol. 144, 64-70 (2018).
  29. Castillo-Morales, R. M., Carreño Otero, A. L., Mendez-Sanchez, S. C., Da Silva, M. A. N., Stashenko, E. E., Duque, J. E. Mitochondrial affectation, DNA damage and AChE inhibition induced by Salvia officinalis essential oil on Aedes aegypti larvae. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 221, 29-37 (2019).
  30. Montagut, D. C., Bueno, Y., Vesga, L. C., Stashenko, E. E., Mendez-Sanchez, S. C. Cymbopogon flexuosus (nees ex steud.) w. watson essential oil effect on mitochondrial bioenergetics. J Essent Oil Res. 34 (3), 233-239 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

سلسلة نقل الإلكترونالطاقة الحيوية للميتوكوندريامقايسة قياس التنفسمقايسة إنزيميةعزل الميتوكوندريااستهلاك الأكسجيننشاط نزع هيدروجين NADHسيتوكروم سي أوكسيداز
الكشف عن النقل الغريب الحيوي وتأثيراته في الميتوكوندريا المعزولة: رؤى من المقايسات التنفسية والأنزيمية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.