خلايا بركنجي المخيخية (PCs) حساسة بشكل خاص لأوجه القصور في استجابة تلف الحمض النووي. يتم تقديم بروتوكول للتقييم البصري لديناميكيات استجابة الكمبيوتر الشخصي لتلف الحمض النووي ، والذي يتضمن تلطيخ سلاسل البولي (ADP-ribose) المرتبطة بالبروتين داخل الثقافات العضوية المخيخية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصور استجابة تلف الحمض النووي في خلايا بركنجي باستخدام الثقافات العضوية المخيخية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تظهر خلايا بركنجي المخيخية (PCs) تفاعلا فريدا بين معدلات الأيض العالية ، وبنية الكروماتين المحددة ، ونشاط النسخ المكثف ، مما يجعلها عرضة بشكل خاص لتلف الحمض النووي. هذا يتطلب استجابة فعالة لتلف الحمض النووي (DDR) لمنع تنكس المخيخ ، وغالبا ما يبدأ بسبب خلل أو فقدان الكمبيوتر. ومن الأمثلة البارزة على ذلك متلازمة عدم استقرار الجينوم ، الرنح وتوسع الشعيرات (AT ) ، والتي تتميز بنضوب الكمبيوتر التدريجي وتدهور المخيخ. يعد التحقيق في آليات نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج في أجهزة الكمبيوتر أمرا حيويا لتوضيح المسارات المؤدية إلى انحطاطها في مثل هذه الاضطرابات. ومع ذلك ، فإن تعقيد عزل وزراعة أجهزة الكمبيوتر في المختبر قد أعاق منذ فترة طويلة جهود البحث. تقدم مزارع النمط العضوي المخيخي الفئران (الشريحة) بديلا عمليا ، حيث تحاكي عن كثب بيئة الأنسجة في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن هذا النموذج مقيد بمؤشرات نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج القابلة للتصوير المجهري. لقد قمنا بتحسين بروتوكول ثقافة النمط العضوي ، مما يدل على أن التصوير الفلوري لسلاسل البولي (ADP-ribose) (PAR) المرتبطة بالبروتين ، وهو مؤشر DDR سريع ومبكر ، يكشف بشكل فعال عن ديناميكيات DDR في أجهزة الكمبيوتر داخل هذه الثقافات ، استجابة للإجهاد الجيني.
المقدمة
تتعرض سلامة الحمض النووي الخلوي للتهديد باستمرار من العوامل الضارة بالحمض النووي ، والتي يغلب عليها المنتجات الثانوية الأيضية مثل أنواع الأكسجين التفاعلية ، والتي تسبب عشرات الآلاف من آفات الحمض النووي لكل خلية يوميا1. يعد الحفاظ المستمر على استقرار الجينوم أمرا ضروريا للتوازن الخلوي2،3. حجر الزاوية في هذه الصيانة هو استجابة تلف الحمض النووي (DDR) - وهي شبكة إشارات معقدة ذات طبقات تبدأ مسارات محددة لإصلاح الحمض النووي مع ضبط العديد من العمليات الخلوية الأخرىبعناية 4،5. يتجلى العجز في نزع السلاح ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل المواد والمعدات والأجسام المضادة. تم استخدام الإجراءات الحيوانية بموجب المبادئ التوجيهية الأخلاقية للجنة الأخلاقيات في جامعة تل أبيب بعد الموافقة. يتم تنفيذ الإجراء على صغار الفئران البالغة من العمر 10 أيام ، بغض النظر عن جنسهم. إذا لزم الأمر ، يتم إجراء التنميط الجيني في اليوم السابق باستخدام خزعة الذيل والطرق القياسية. المحاليل معقمة ومخزنة في درجة حرارة 4 درجات مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك ؛ انظر الجدول 1.
1. تحضير الثقافات
ملاحظة: قم بإجراء الإجراء في بيئة معقمة وقم بتطهير سطح العمل مسبقا باستخدا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 1 المظهر العام لثقافات النمط العضوي المخيخي. يظهر الصف العلوي في الشكل 1 أ أوراق المخيخ ، والتي يتم الحفاظ عليها في الثقافة ، بينما يظهر الصف السفلي أجهزة الكمبيوتر الملطخة ب Calbindin D-28k (أخضر) والنوى العصبية الملطخة ب NeuN (أحمر). في الشكل 1 ب ، يتم تلطيخ الخلايا النجمية في أجهزة الكمبيوتر (باللون الأحمر) ل GFAP (الأخضر) ، وهو بروتين وسيط من النوع الثالث من الفتيل. يوضح الشكل 2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تعليقات عامة
تتمثل الميزة الرئيسية لنظام الثقافة العضوية في أنه يسهل الدراسات باستخدام أنسجة القشرة المخيخية ، مما يحافظ على تنظيمه الهيكلي لعدة أسابيع في إعداد طبق الثقافة. هذا النظام مفيد لإجراء تحليلات مورفولوجية متعمقة لخلايا بركنجي (PCs) ، بما في ذلك الفحوصات التفصيلية للأشواك المتغصنة وميزات البنية التحتية52،53،54،55،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه الدراسة.
شكر وتقدير
يتم دعم العمل في مختبرنا من قبل مؤسسة الدكتورة ميريام وشيلدون جي أديلسون للأبحاث الطبية والجمعية الإسرائيلية لمكافحة مرض AST.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كاشف ومعدات< / قوي> | |||
| 150 × 30 سم طبق بتري | Corning Inc. | 3261 | |
| 35 × 10 مم طبق بتري | Corning Inc. | 3294 | |
| Acetone | Invitrogen | 25030081 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| شرائح مجهر لاصق | Marienfeld | 48187 | 76 × 26 × 1 مم |
| شفرات للمروحية | TED PELLA | موديل TC752-1 | ؛ شفرات حلاقة ستايل |
| BME | GIBCO | 41010-026 500ml. | لا L-Glut |
| إدراج ثقافة الخلية | Millipore | PICM0RG50 | |
| D-Glucose | Biological Indo. | 02-015-1A | |
| HBSS ث / س الفينول الأحمر | سيجما ألدريتش | H-1138-500L | لا الكالسيوم +,لا ملغ + |
| HBSS مع الفينول الأحمر | Sartorius | 02-015-1A | |
| مصل الحصان | جيبكو | ملقط قزحية معطلة بالحرارة | |
| 26050088 CellPath | GZX-0100-00A | 130 مم | |
| قزحية | حادة FST | 10092-12 | |
| L-Glutamine (200 ملم) | Gibco | 41010026 | |
| ميثانول | سيجما-ألدريتش | 322412-1L | |
| ميثانول | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| مجهر | أوليمبوس | ||
| تصاعد المتوسطة بدون | GRIGENE. المحدودة ، إسرائيل | K239320A | |
| باراكوات | سيجما ألدريتش | 856177-250 مجم | ثنائي كلوريد باراكوات (ميثيل فيولوجين) PARG |
| - بولي (ADP-ريبوز) مثبط جليكوهيدرولاز | توكرس بيوساينس ، المملكة المتحدة | PDD 00017273 | حساسة للضوء ؛ |
| عازلة الفوسفات | الهند البيولوجية. | 02-018-1A | |
| مقص ، أنسجة | |||
| ستة ألواح | كورنينج مدمجة | CLS3516 | |
| أقراص تقطيع احتياطية ؛ | TED PELLA | موديل 10180-01 | |
| مروحية الأنسجة | ماكلوين | موديل TC752 | 10180-220 |
| أكواب | |||
| بولية مدببة | |||
| <قوية >أجسام مضادة < / قوية > أليكسا | |||
| فلور 488 حمار مضاد للأرانب IgG | & nbsp ؛ Invitrogen | A21206 | 1:500 ؛ الثانوية AB ؛ المخزن المؤقت للتخفيف الثانوي ؛ حضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة |
| البروتين الحمضي الليفي الدبقي | Milliphore | MAB3402 | 1: 1500 ؛ أب الأولي ؛ حجب ؛ المضيف: الماوس |
| المضاد للكالبيندين-D-28K | Swant | CB300 | 1: 2000 ؛ ابتدائي أب ؛ حجب ؛ المضيف: rabbit ؛ |
| مكافحة calbindin-D-28K | Swant | CB-38a | 1: 2000; ab الابتدائية; الحظر |
| كاشف مضاد للعموم ADP-الريبوز | ميليفور | MABE1016 | 1: 800 ؛ أب أولي ؛ حجب ؛ حضانة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة |
| DAPI (4'، 6-Diamidine-2'-فينيليندول ثنائي هيدروكلوريد) | الخلية | 4084 | 1: 1000 ؛ مخزن مؤقت للتخفيف الثانوي ؛ حضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة |
المراجع
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
