مقالة منهجية

تصور استجابة تلف الحمض النووي في خلايا بركنجي باستخدام الثقافات العضوية المخيخية

DOI:

10.3791/67167

⸱

ديسمبر 27, 2024

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا بركنجي المخيخية (PCs) حساسة بشكل خاص لأوجه القصور في استجابة تلف الحمض النووي. يتم تقديم بروتوكول للتقييم البصري لديناميكيات استجابة الكمبيوتر الشخصي لتلف الحمض النووي ، والذي يتضمن تلطيخ سلاسل البولي (ADP-ribose) المرتبطة بالبروتين داخل الثقافات العضوية المخيخية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر خلايا بركنجي المخيخية (PCs) تفاعلا فريدا بين معدلات الأيض العالية ، وبنية الكروماتين المحددة ، ونشاط النسخ المكثف ، مما يجعلها عرضة بشكل خاص لتلف الحمض النووي. هذا يتطلب استجابة فعالة لتلف الحمض النووي (DDR) لمنع تنكس المخيخ ، وغالبا ما يبدأ بسبب خلل أو فقدان الكمبيوتر. ومن الأمثلة البارزة على ذلك متلازمة عدم استقرار الجينوم ، الرنح وتوسع الشعيرات (AT ) ، والتي تتميز بنضوب الكمبيوتر التدريجي وتدهور المخيخ. يعد التحقيق في آليات نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج في أجهزة الكمبيوتر أمرا حيويا لتوضيح المسارات المؤدية إلى انحطاطها في مثل هذه الاضطرابات. ومع ذلك ، فإن تعقيد عزل وزراعة أجهزة الكمبيوتر في المختبر قد أعاق منذ فترة طويلة جهود البحث. تقدم مزارع النمط العضوي المخيخي الفئران (الشريحة) بديلا عمليا ، حيث تحاكي عن كثب بيئة الأنسجة في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن هذا النموذج مقيد بمؤشرات نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج القابلة للتصوير المجهري. لقد قمنا بتحسين بروتوكول ثقافة النمط العضوي ، مما يدل على أن التصوير الفلوري لسلاسل البولي (ADP-ribose) (PAR) المرتبطة بالبروتين ، وهو مؤشر DDR سريع ومبكر ، يكشف بشكل فعال عن ديناميكيات DDR في أجهزة الكمبيوتر داخل هذه الثقافات ، استجابة للإجهاد الجيني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتعرض سلامة الحمض النووي الخلوي للتهديد باستمرار من العوامل الضارة بالحمض النووي ، والتي يغلب عليها المنتجات الثانوية الأيضية مثل أنواع الأكسجين التفاعلية ، والتي تسبب عشرات الآلاف من آفات الحمض النووي لكل خلية يوميا1. يعد الحفاظ المستمر على استقرار الجينوم أمرا ضروريا للتوازن الخلوي2،3. حجر الزاوية في هذه الصيانة هو استجابة تلف الحمض النووي (DDR) - وهي شبكة إشارات معقدة ذات طبقات تبدأ مسارات محددة لإصلاح الحمض النووي مع ضبط العديد من العمليات الخلوية الأخرىبعناية 4،5. يتجلى العجز في نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج عادة على أنه "متلازمات عدم استقرار الجينوم" ، والتي تتميز بعدم استقرار الكروموسومات ، وتدهور الأنسجة التدريجي ، وضعف النمو أو التطور ، والاستعداد للإصابة بالسرطان ، وزيادة الحساسية لعوامل معينة ضارة بالحمض النووي6،7،8،9. والجدير بالذكر أن التنكس العصبي ، الذي غالبا ما يتضمن ضمور المخيخ ، هو سمة مميزة للعديد من متلازمات عدم استقرار الجينوم7،10،11،12.

الاضطراب الوراثي المتنحي ، الرنح وتوسع الشعيرات (AT ) ، هو مثال موثق جيدا لاضطراب عدم استقرار الجينوم13،14،15. تنشأ هذه الحالة من طفرات فارغة في جين ATM (A-T ، متحول) ، المسؤول عن ترميز بروتين كيناز المحوري ، ATM ، والذي يعرف في المقام الأول باسم محفز DDR استجابة لفواصل الحمض النووي المزدوج (DSBs) 16،17. يتجلى A-T على أنه اضطراب متعدد الأجهزة ، يتميز في الغالب بالتنكس المخيخي التدريجي ، مما يؤدي إلى ضعف حركي حاد ، ونقص المناعة ، وضمور الغدد التناسلية ، والاستعداد للسرطان ، والحساسية الشديدة للإشعاع المؤين. تظهر الخلايا المستنبتة من الأفراد المصابين ب A-T عدم استقرار الكروموسومات وزيادة الحساسية للعوامل السامة للجينات ، خاصة تلك التي تسبب DSBs15،18،19. الأهم من ذلك ، يلعب ATM أيضا دورا في إصلاح آفات الحمض النووي الأخرى ، مما يؤكد أهميته الواسعة في الحفاظ على استقرار الجينوم20،21،22.

على الرغم من البحث الشامل في الأدوار العديدة لأجهزة الصراف الآلي ، إلا أن الآلية المحددة التي تؤدي إلى تنكس المخيخ في A-T لا تزال موضوعا للنقاش النشط ، مع نماذج مختلفة مقترحة لتوضيح هذه العملية23،24،25،26،27،28،29،30. يشير نموذجنا28 إلى أن التنكس المخيخي لدى مرضى A-T يبدأ بالخلل الوظيفي وفقدان خلايا بركنجي (PCs) في نهاية المطاف. بالنظر إلى الدور الحاسم لأجهزة الصراف الآلي في الحفاظ على استقرار الجينوم في مواجهة تلف الحمض النووي المستمر ، فإن أجهزة الكمبيوتر معرضة بشكل خاص لغياب أجهزة الصراف الآلي. نعزو هذا الضعف إلى مزيج من نشاطها الأيضي العالي ، وبنية الكروماتين المميزة ، ونشاط النسخ الواسع. في النهاية ، يقترح أن فقدان وظيفة الكمبيوتر الشخصي ، وبالتالي تنكسها ، يرجع إلى التعطيل العشوائي والوظيفي للجينات ، نتيجة لإنتاج نصوص معيبة28.

تعيق دراسة بيولوجيا الكمبيوتر الشخصي في المختبر التحديات في زراعة أجهزة الكمبيوتر المعزولة ، حيث تعتمد هذه الخلايا بشكل كبير على بيئتها الطبيعية والخلايا المجاورة للبقاء والوظيفة ، مما يجعلها غير متوافقة مع نمو الثقافة المنفصلة. ومع ذلك ، يمكن أن تظل أجهزة الكمبيوتر قابلة للحياة لفترات طويلة في مزارع شرائح الأنسجة. تحافظ الثقافات العضوية المخيخية ، وهي شرائح نسيجية مشتقة عادة من مخيخ القوارض ، على التنظيم الهيكلي للأنسجة وتدعم العديد من التلاعبات التجريبية المماثلة لتلك الممكنة مع الخلايا المستنبتة. لذلك ، تسمح هذه الثقافات بإجراء دراسات المخيخ ضمن بيئة خاضعة للرقابة31،32،33،34،35،36،37،38،39،40،41،42،43. على وجه التحديد ، في سياق AT ، أثبتت ثقافات النمط العضوي المخيخي للفئران أنها مفيدة في استكشاف DDR في أجهزة الكمبيوتر التي تعاني من نقص في أجهزة الصراف الآلي40،41،42،43. في حين أن الفئران التي تعاني من نقص في أجهزة الصراف الآلي لا تعرض سوى نمط ظاهري مخيخيخفي 44،45،46،47 ، ويفترض أن يكون ذلك بسبب الاختلافات بين فسيولوجيا المخيخ البشري والفأر ، فإن الافتراض هو أن أدوار أجهزة الصراف الآلي محفوظة إلى حد كبير عبر هذه الأنواع. هذه الفكرة مدعومة بملاحظاتنا بأن الاستجابة الضعيفة ل DNA DSBs في أجهزة كمبيوتر الفئران الآلية - / - تتوافق مع تلك التي لوحظت في أنواع الخلايا الأخرى التي تعاني من نقص أجهزة الصراف الآلي / أجهزة الصراف الآليالبشرية 40،41،42،43.

أحد القيود في تحليل استجابات الكمبيوتر الشخصي لمختلف المحفزات أو الضغوط داخل ثقافات النمط العضوي هو ضرورة الاعتماد على التصوير المجهري للقراءات. عادة ما تتم دراسة DDR باستخدام قراءات كيميائية حيوية بالجملة ، على الرغم من استخدام علامات الفلورسنت المناعي الشائعة أيضا ، مثل اتباع ديناميكيات تكوين وحل البؤر النووية للهيستون H2AX الفسفوري (γH2AX) وبروتين 53BP1 ، والتي تعتبر مؤشرات DSBs48،49. مقياس أوسع هو التصوير الفلوري لتكوين سلسلة بولي (ADP-ribose) (PAR) على البروتينات ، وهي استجابة سريعة وقوية لتلف الحمض النووي المبكر ، خاصة لكسر الخيط7،50. قمنا بتعديل البروتوكول بواسطة Komulainen et al.51 لتلوين PAR في الثقافات العضوية المخيخية. لاحظنا استجابة PAR واضحة في النوى الكبيرة لأجهزة الكمبيوتر.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل المواد والمعدات والأجسام المضادة. تم استخدام الإجراءات الحيوانية بموجب المبادئ التوجيهية الأخلاقية للجنة الأخلاقيات في جامعة تل أبيب بعد الموافقة. يتم تنفيذ الإجراء على صغار الفئران البالغة من العمر 10 أيام ، بغض النظر عن جنسهم. إذا لزم الأمر ، يتم إجراء التنميط الجيني في اليوم السابق باستخدام خزعة الذيل والطرق القياسية. المحاليل معقمة ومخزنة في درجة حرارة 4 درجات مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك ؛ انظر الجدول 1.

1. تحضير الثقافات

ملاحظة: قم بإجراء الإجراء في بيئة معقمة وقم بتطهير سطح العمل مسبقا باستخدام 70٪ من الإيثانول.

  1. أضف 1 مل من BME إلى كل بئر من 6 أطباق آبار. باستخدام ملقط معقم ، ضع إدراج مزرعة خلية واحدة في كل بئر واحتضان الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعتين على الأقل قبل إجراء التشريح.
  2. قم بإعداد منطقة تشريح داخل غطاء بيولوجي ، تحتوي على مفرمة الأنسجة ، وألواح زراعة 30 مم ، ومجهر مجهر ، ومصدر ضوء.
  3. اغمر الأدوات الجراحية في 70٪ من الإيثانول طوال العملية. استخدم كوبا بوليا مملوءا بنسبة 70٪ من الإيثانول للغمر ، وكوبا بوليا منفصلا به 1x PBS لغسل الإيثانول قبل الاستخدام.
  4. لكل تشريح (أي لكل مخيخ) ، قم بإعداد لوحين للاستزراع مقاس 30 مم مملوءين بوسط تشريح بارد واتركهما على الجليد.
  5. رش بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  6. باستخدام مقص حاد ، قم بقطع رأس بسرعة. لفضح الدماغ ، قم بعمل شق صغير بالمقص بعيدا عن المخيخ. باستخدام ملاقط ذات نهايات مستديرة ، قشر الجمجمة برفق. قم بإزالة الجمجمة إلى قطع صغيرة لتجنب إتلاف الأنسجة المخيخية.
  7. انقل الدماغ على الفور إلى وسط تشريح بارد أو قم بإزالة المخيخ مباشرة من داخل الجمجمة. للقيام بذلك ، قم بتعريض المخيخ وفصل القشرة المخيخية عن جذع الدماغ عن طريق فصل الأزواج الثلاثة من سيقان الزهور ، باستخدام ملعقة قزحية منحنية دقيقة. لتحديد السويقات ، انظر من المنقاري إلى الذيلي: تربط سيقان الزهور المخيخية العلوية المزدوجة الدماغ المتوسط بكل جانب من المخيخ. تربط سيقان المخيخ الوسطى المزدوجة الجسر بكل جانب من المخيخ. وتتصل سيقان الزهور المخيخية السفلية المزدوجة بالنخاع إلى كل جانب من جوانب المخيخ. بمجرد أن يصبح المخيخ مرئيا ، افصله عن المخ باستخدام نفس الملعقة: حرك الملعقة بين المخيخ والقولون العلوي وجذع الدماغ.
    ملاحظة: لا تبذل جهدا خاصا لإزالة السحايا لأنها تنفصل بسهولة بعد تقطيع المخيخ.
  8. اضبط مفرمة المناديل على سمك شريحة 350 ميكرومتر.
  9. قبل وضع المخيخ على قاعدة المروحية ، قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد للتشريح من الأنسجة. سيؤدي ذلك إلى تحسين التصاق الأنسجة بقاعدة المروحية.
  10. ضع المخيخ على منصة القطع في اتجاه رأسي وقم بإجراء التقطيع الطفيلي السهمي بسمك شريحة 350 ميكرومتر. افصل الشرائح برفق باستخدام ملعقة قزحية دقيقة وضعها في وسط تشريح بارد.
  11. انقل الأنسجة المقطعة مرة أخرى إلى مخزن مؤقت طازج للتشريح البارد. استخدم طرفا سعة 1,000 ميكرولتر لتوجيه شرائح الأنسجة بدقة إلى الطبق الذي يحتوي على عازلة للتشريح البارد.
  12. تحت مجهر ، استخدم ملعقتين منحنتين للقزحية لفصل شرائح الأنسجة بعناية عن بعضها البعض. بالنسبة للثقافات ، استخدم شرائح مشتقة من الدودة المخيخية الموجودة في المنطقة القشرية النووية الإنسية للعضو.
  13. انقل كل شريحة من الأنسجة إلى ملحق مزرعة باستخدام ملعقة عريضة وانقل كل ملحق يحمل شريحة من الأنسجة إلى بئر في ألواح مكونة من 6 آبار تحتوي على الوسط الدافئ مسبقا. اترك الأطباق في الحاضنة.
  14. استبدل الوسيط كل يومين: استنشق الوسط المستخدم باستخدام ماصة زجاجية معقمة، وباستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل، أضف 1 مل من الماصة الطازجة مع ميل طرف الماصة على جدار البئر. تأكد من عدم توجيه التدفق المتوسط إلى الأنسجة.
    ملاحظة: ستظهر شريحة الأنسجة مظهرا يشبه الالتهاب لأول 5-7 أيام في الثقافة وستكون جاهزة للتجارب بمجرد اختفاء هذه الظاهرة وحتى أسبوعين بعد إنشاء الثقافة.

2. العلاج بالعوامل الضارة بالحمض النووي ، والتثبيت ، والتلوين ، والتصوير المجهري

  1. أضف المواد الكيميائية الضارة بالحمض النووي مباشرة إلى وسط الاستزراع بتركيزات نهائية مناسبة ، لفترات محددة مسبقا. بعد فترة التعرض ، قم بإزالة المواد الكيميائية عن طريق استبدال الوسط بوسط ثقافة طازج.
  2. إذا كانت قراءة DDR تتضمن تلطيخا PAR ، فأضف مثبطا للجليكوهيدرولاز بولي (ADP-ribose) (PARG) إلى وسط المزرعة بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر ، قبل 30 دقيقة من التثبيت.
    ملاحظة: هذا العلاج بالغ الأهمية لأن تعديل PAR قصير الأجل ويتحلل باستمرار بواسطة PARG.
  3. قبل التثبيت مباشرة ، قم بشفط الوسط واستبدله ب 1 مل من محلول الفوسفات 0.1 M في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قد يتسبب المخزن المؤقت البارد في انفصال شرائح الأنسجة عن الحشوة.
  4. قم بإصلاح الشرائح على الفور عن طريق استبدال المخزن المؤقت بالأسيتون المبرد مسبقا (-20 درجة مئوية): مزيج الميثانول (1: 1) بحيث يتم غمر شريحة الأنسجة في هذا المزيج وتترك لمدة 20 دقيقة عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: من الممكن التوقف في هذه المرحلة والمضي قدما في التلوين المناعي لاحقا. للقيام بذلك ، اغسل الأنسجة 3 مرات باستخدام محلول فوسفات 0.1 M مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية ، مع التأكد من غمر الأنسجة في المخزن المؤقت. يمكن تخزين الأنسجة الآن في محلول فوسفات 0.1 متر لمدة تصل إلى أسبوعين عند 4 درجات مئوية.
  5. انقل شريحة المناديل إلى بئر في طبق 48 بئر.
  6. استخدم مشرطا ولوح تقطيع لإزالة هوامش الملحق ، وقطع حول شريحة الأنسجة. ضع كل شريحة في بئر من طبق 48 بئر. أضف 100 ميكرولتر من محلول الفوسفات 0.1 مو.
  7. من أجل النفاذية ، قم بشفط المخزن المؤقت ، وأضف إلى البئر 100 ميكرولتر من 0.1 M من المخزن المؤقت للفوسفات الذي يحتوي على 1٪ Triton X-100 ، واتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. استنشق المحلول وأضف 100 ميكرولتر من محلول الحجب (انظر الجدول 1) لكل بئر. يرج برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  9. أثناء خطوة الحجب ، قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي أو الكاشف المضاد ل PAR (1: 800) في محلول الحظر.
  10. قم بإزالة محلول الانسداد (لا حاجة للغسيل) وأضف 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر. ضع رج لطيف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
  11. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في مخزن الفوسفات 0.1 M الذي يحتوي على 0.2٪ Triton X-100 (1: 500) مع تقليل تعرضها للضوء.
  12. استنشق محلول الجسم المضاد الأساسي واغسل الشرائح 3 × 5 دقائق باستخدام عازلة فوسفات 0.1 M تحتوي على 0.2٪ Triton X-100 ، في درجة حرارة الغرفة ، مع رج لطيف.
  13. استبدل محلول الغسيل ب 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية (تخفيف 1: 500). استمر في الرج اللطيف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في الظلام (قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم).
  14. لتحضير محلول DAPI ، قم بتخفيف محلول المخزون (2 مجم / مل) إلى 1 ميكروغرام / مل في 1x PBS.
  15. قبل عشرين دقيقة من نهاية الحضانة لمدة ساعتين مع الجسم المضاد الثانوي ، أضف 20 ميكرولتر من محلول DAPI النهائي لكل بئر واستمر في الاهتزاز لمدة 20 دقيقة. شفط السائل واغسله بمحلول الغسيل لمدة 3 × 5 دقائق مع رج لطيف.
  16. للتركيب ، ضع المنديل على شريحة زجاجية مجهرية بحيث يكون النسيج متجها لأعلى ، وأضف وسيط التثبيت ، وقم بتغطيته بغطاء زجاجي. ضع الشرائح على سطح مستو واتركها تجف طوال الليل في الظلام ، في درجة حرارة الغرفة (تجنب استخدام وسيط التثبيت الذي يحتوي على DAPI لمنع التشويش).
  17. قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية في صندوق مقاوم للضوء.
  18. التقط صورا مجهرية باستخدام مجهر متحد البؤر والمرشحات المناسبة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 المظهر العام لثقافات النمط العضوي المخيخي. يظهر الصف العلوي في الشكل 1 أ أوراق المخيخ ، والتي يتم الحفاظ عليها في الثقافة ، بينما يظهر الصف السفلي أجهزة الكمبيوتر الملطخة ب Calbindin D-28k (أخضر) والنوى العصبية الملطخة ب NeuN (أحمر). في الشكل 1 ب ، يتم تلطيخ الخلايا النجمية في أجهزة الكمبيوتر (باللون الأحمر) ل GFAP (الأخضر) ، وهو بروتين وسيط من النوع الثالث من الفتيل. يوضح الشكل 2 والشكل 3 تلطيخ PAR الذي لوحظ بعد معالجة هذه الثقافات بعاملين مدمرين للحمض النووي ، وكلاهما مؤكسدان قويان: برومات البوتاسيوم (تركيز نهائي 10 ملي مولار لمدة 12 ساعة) والباراكوات. تم تمييز استجابة PAR في أجهزة الكمبيوتر المعالجة في الأوراق المخيخية مقارنة بالشاهد.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على الثقافات العضوية المخيخية الفئرانية. (أ) يوضح الصف العلوي أوراق المخيخ ، والتي يتم الحفاظ عليها في الثقافة. يركز الصف السفلي على طبقة الكمبيوتر. يتم تمييز أجهزة الكمبيوتر بواسطة Calbindin D-28k (أخضر). يحدد تلطيخ NeuN (الأحمر) النوى العصبية عبر الطبقات. (ب) نظرة فاحصة على أجهزة الكمبيوتر (باللون الأحمر). GFAP (أخضر) ، بروتين وسيط من النوع الثالث ، يسلط الضوء على الخلايا النجمية. أشرطة المقياس = 968.8 ميكرومتر (أ ، الصف العلوي) ، 42.1 ميكرومتر (أ ، الصف الثاني) ، 72.7 ميكرومتر (ب ، الصف العلوي) ، 18.2 ميكرومتر (ب ، الصف الثاني). الاختصارات: PC = خلايا بركنجي. GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي ؛ DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تلطيخ PAR في شريحة مخيخية معالجة ببرومات البوتاسيوم. تمت معالجة شريحة المخيخ ببرومات البوتاسيوم (KBrO3) - وهو عامل مؤكسد قوي ، بتركيز نهائي قدره 10 ملي مولار لمدة 12 ساعة. أشرطة المقياس = 775 ميكرومتر. الاختصارات: PAR = بولي (ADP-ribose) ؛ DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: استجابة PAR في شرائح المخيخ المعرضة للباراكوات ، وهو منتج قوي لأنيونات الأكسيد الفائق. (أ) منظر عام لورقة المخيخ. لاحظ استجابة PAR القوية خاصة في أجهزة الكمبيوتر مقارنة بعنصر التحكم. (ب) يظهر الفحص الدقيق استجابة PAR في أجهزة الكمبيوتر وأنواع الخلايا الأخرى. أشرطة المقياس = 193.8 ميكرومتر (أ) ، 18.2 ميكرومتر (ب). الاختصارات: PAR = بولي (ADP-ribose) ؛ DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الحلول والمخازن المؤقتة
حل  المكونات
وسيط التشريحمحلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) يحتوي على 0.5٪ D-glucose. أضف 0.5 مل من محلول D-glucose بنسبة 50٪ إلى 50 مل من HBSS بدون Mg2+ و Ca2+.
وسط ثقافة BMEامزج 100 مل من النسر القاعدي المتوسط (BME) الذي يحتوي على الفينول الأحمر ولكن ليس L-glutamine أو HEPES ، مع 50 مل من HBSS مع الفينول الأحمر ، و 50 مل من مصل الحصان المعطل بالحرارة ، و 2 مل من 50٪ D-glucose ، و 1 مل من 200 مل L-glutamine. امزج وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر في بيئة معقمة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية
حجب الحل للتلطيخ المناعيفي 0.1 متر من الفوسفات: أضف 0.5٪ تريتون X-100 ، 10٪ مصل الماعز
المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة الثانوية0.1 متر عازلة فوسفات ، 0.2٪ تريتون X-100
عازلة الغسيل0.1 متر عازلة فوسفات ، 0.2٪ تريتون X-100
حل مثبتالأكتينو: الميثانول (1: 1 فولت: ف)
حل النفاذيةعازلة فوسفات 0.1 متر ، 1٪ تريتون X-100
حل DAPIمحلول المخزون (2 مجم / مل) مخفف إلى 1 ميكروغرام / مل في 1x PBS
عازلة الفوسفاتقم بإعداد اثنين من الروحيات A و B (انظر أدناه). امزج المحاليل وفقا للنسب المحددة أدناه لعمل عازلة فوسفات 0.2 M. ثم قم بتخفيف محلول 0.2 متر باستخدام DDW (1: 1) لعمل عازلة فوسفات 0.1 M (محلول عمل).
الحل أ (ل 0.2 م)12 جم من فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة اللامائي (Na2HPO4 FW 141.96)
500 مل من DDW
الحل ب (ل 0.2 متر)14.2 جم من فوسفات الصوديوم اللامائي (Na2HPO4 FW 141.96)
500 مل من DDW
محاليل مختلطة لصنع 0.2 مترتحضير 1 لتر: 230 مل من المحلول أ و 770 مل من المحلول ب
0.1 م عازلة الفوسفاتتخفيف المحلول المختلط باستخدام DDW (1: 1)

الجدول 1: الحلول وتكوينها.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعليقات عامة
تتمثل الميزة الرئيسية لنظام الثقافة العضوية في أنه يسهل الدراسات باستخدام أنسجة القشرة المخيخية ، مما يحافظ على تنظيمه الهيكلي لعدة أسابيع في إعداد طبق الثقافة. هذا النظام مفيد لإجراء تحليلات مورفولوجية متعمقة لخلايا بركنجي (PCs) ، بما في ذلك الفحوصات التفصيلية للأشواك المتغصنة وميزات البنية التحتية52،53،54،55،56،57،58،59. تشير ملاحظاتنا إلى أن استجابة تلف الحمض النووي (DDR) نشطة بشكل ملحوظ في أجهزة الكمبيوتر داخل هذه الثقافات. ومع ذلك ، فإن القيود الرئيسية لهذا النظام تشمل المدة المحدودة لاستخدامه واعتماده على التصوير المجهري لمراقبة العمليات الخلوية ، مما يسلط الضوء على الحاجة المستمرة لتطوير أو تكييف تقنيات التصوير المناسبة.

كلمة تحذير أخرى تتعلق بالجزء المخيخي الذي يتم تشريحه لتحضير شرائح الأنسجة. لقد لاحظنا أن الفصوص المخيخية المختلفة يمكن أن تنتج ثقافات ذات تنظيم داخلي مختلف بشكل ملحوظ وجودة عامة. لذلك ، نفضل إنشاء ثقافات من الشرائح التي تم الحصول عليها عبر الأقسام المتوسطة السهمية من الدودة المخيخية. في هذه الشرائح ، تظهر أوراق القشرة المخيخية بشكل ملائم.

ينصح باستخدام شرائح الأنسجة التي تم الحصول عليها من الدودة المخيخية ، والتي تظهر الأوراق المميزة للقشرة المخيخية. تحافظ هذه الشرائح على هيكلها التنظيمي في الثقافة لعدة أسابيع. علاوة على ذلك ، يوصى ببدء الإجراءات التجريبية مع المزارع بعد حوالي 7-12 يوما من التأسيس. تتضمن التجربة النموذجية المصممة لتقييم استجابة تلف الحمض النووي في هذه الثقافات بدء الضرر عن طريق التشعيع أو عن طريق إضافة مواد كيميائية ضارة بالحمض النووي إلى وسط الاستزراع. بعد ذلك ، يتم إجراء تثبيت الأنسجة وتلطيخها على فترات زمنية مختلفة. لتقييم التعافي من الضرر الناجم عن المواد الكيميائية ، يتم تضمين فترة حضانة في وسط جديد. ينصح ببدء تجارب طويلة الأجل في أقرب فرصة ، من الناحية المثالية بعد حوالي 7 أيام من تأسيس الثقافة.

يتم الحفاظ على ثقافات النمط العضوي المخيخي في وسط خال من المضادات الحيوية. وبالتالي ، فإن الحفاظ على بيئة معقمة أثناء إنشائها أمر حتمي. يعد عمر الجراء التي يتم حصاد المخيخ منها أمرا بالغ الأهمية ، مع نطاق موصى به من 9 إلى 12 يوما. هذه الفئة العمرية مثالية حيث تم تطوير القشرة المخيخية بشكل كاف للتقسيم. والجدير بالذكر أنه في الأكبر سنا ، تميل الأنسجة إلى الالتصاق بالشفرة. من الضروري إبقاء المخيخ مغمورا في محلول تشريح بارد حتى يتم تشريحه.

خلال الأيام ال 5-7 الأولى في الثقافة ، قد تظهر على شرائح الأنسجة علامات تذكرنا بالالتهاب ، وتتميز بالتورم وتغير اللون اللبني. يمكن أن تؤثر هذه السمات على قياس المعلمات الفسيولوجية وفعالية تقنيات التلوين المناعي.

يوصى بشدة بعدم تقطيع المخيخ إلى شرائح أرق من 350 ميكرومتر لتجنب عدم الاتساق في السماكة أثناء التقطيع. ضع في اعتبارك أن الأنسجة المكونة من 350 ميكرومتر تصبح أرق بكثير بعد 7 أيام في المزرعة إلى حوالي 90 ميكرومتر (بناء على قياس مكدس Z).

هنا ، نقدم تلطيخ PAR 7,50 إلى مجموعة الأدوات المستخدمة للتحقيق في DDR في أجهزة الكمبيوتر. هذه القراءة سريعة وحساسة وتجسد الطبيعة الديناميكية لعملية نزع السلاح والتسريح والتسريح وإعادة الإدماج ، مما يثبت أنها مفيدة بشكل خاص في تحليلنا لنزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج في أجهزة الكمبيوتر من النوع البري وأجهزة الصراف الآلي. يجب أن تكون البروتوكولات الموضحة هنا مفيدة بشكل خاص للباحثين الذين يدرسون متلازمات عدم الاستقرار الجينومي التي تؤثر على المخيخ.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه الدراسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم العمل في مختبرنا من قبل مؤسسة الدكتورة ميريام وشيلدون جي أديلسون للأبحاث الطبية والجمعية الإسرائيلية لمكافحة مرض AST.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > كاشف ومعدات< / قوي>
150 × 30 سم طبق بتريCorning Inc.3261
35 × 10 مم طبق بتريCorning Inc.3294
AcetoneInvitrogen25030081
AcetoneSigma-Aldrich270725-1L
شرائح مجهر لاصقMarienfeld4818776 × 26 × 1 مم
شفرات للمروحيةTED PELLAموديل TC752-1  ؛ شفرات حلاقة ستايل
BMEGIBCO41010-026 500ml. لا L-Glut
إدراج ثقافة الخليةMilliporePICM0RG50
D-GlucoseBiological Indo.02-015-1A
HBSS ث / س الفينول الأحمرسيجما ألدريتشH-1138-500Lلا الكالسيوم +,لا ملغ +
HBSS مع الفينول الأحمرSartorius02-015-1A
مصل الحصان جيبكوملقط قزحية معطلة بالحرارة
26050088 CellPathGZX-0100-00A130 مم
قزحيةحادة FST10092-12
L-Glutamine (200 ملم)Gibco41010026
ميثانولسيجما-ألدريتش322412-1L
ميثانول  Sigma-AldrichG5767
مجهرأوليمبوس
تصاعد المتوسطة بدونGRIGENE. المحدودة ، إسرائيلK239320A
باراكواتسيجما ألدريتش856177-250 مجمثنائي كلوريد باراكوات (ميثيل فيولوجين) PARG
- بولي (ADP-ريبوز) مثبط جليكوهيدرولازتوكرس بيوساينس ، المملكة المتحدةPDD 00017273حساسة للضوء   ؛
عازلة الفوسفاتالهند البيولوجية.02-018-1A
مقص ، أنسجة
ستة ألواحكورنينج مدمجةCLS3516
أقراص تقطيع احتياطية   ؛TED PELLAموديل 10180-01
مروحية الأنسجةماكلوينموديل TC75210180-220
أكواب
بولية مدببة
<قوية >أجسام مضادة < / قوية > أليكسا
فلور 488 حمار مضاد للأرانب IgG& nbsp ؛
Invitrogen		A212061:500 ؛ الثانوية AB ؛ المخزن المؤقت للتخفيف الثانوي ؛   حضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة
البروتين الحمضي الليفي الدبقيMilliphoreMAB34021: 1500 ؛ أب الأولي ؛ حجب ؛ المضيف: الماوس
المضاد للكالبيندين-D-28KSwant CB3001: 2000 ؛ ابتدائي أب ؛ حجب ؛ المضيف: rabbit   ؛
مكافحة calbindin-D-28KSwantCB-38a1: 2000; ab الابتدائية; الحظر 
كاشف مضاد للعموم ADP-الريبوزميليفورMABE10161: 800 ؛ أب أولي ؛ حجب ؛ حضانة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة
DAPI (4'، 6-Diamidine-2'-فينيليندول ثنائي هيدروكلوريد)الخلية40841: 1000 ؛ مخزن مؤقت للتخفيف الثانوي ؛ حضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة
ملعقة مسننة الجلد ملاقط ، إشارات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
  2. Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (2010).
  3. De Almeida, L. C., Calil, F. A., Machado-Neto, J. A., Costa-Lotufo, L. V. DNA damaging agents and DNA repair: From carcinogenesis to cancer therapy. Cancer Genet. 252-253, 6-24 (2021).
  4. Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: Three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a012724(2013).
  5. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Environ Mol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  6. Taylor, A. M. R., et al. Chromosome instability syndromes. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 64(2019).
  7. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair and human genetic disease. Trends Cell Biol. 32 (9), 733-745 (2022).
  8. Tiwari, V., Wilson, D. M. 3rd DNA damage and associated DNA repair defects in disease and premature aging. Am J Hum Genet. 105 (2), 237-257 (2019).
  9. Rieckher, M., Garinis, G. A., Schumacher, B. Molecular pathology of rare progeroid diseases. Trends Mol Med. 27 (9), 907-922 (2021).
  10. Qing, X., Zhang, G., Wang, Z. Q. DNA damage response in neurodevelopment and neuromaintenance. FEBS J. 290 (13), 3300-3310 (2023).
  11. Scheijen, E. E. M., Wilson, D. M. 3rd Genome integrity and neurological disease. Int J Mol Sci. 23 (8), (2022).
  12. Welch, G., Tsai, L. H. Mechanisms of DNA damage-mediated neurotoxicity in neurodegenerative disease. EMBO Rep. 23 (6), e54217(2022).
  13. Perlman, S. L., Boder Deceased, E., Sedgewick, R. P., Gatti, R. A. Ataxia-telangiectasia. Handb Clin Neurol. 103, 307-332 (2012).
  14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: A review. Orphanet J Rare Dis. 11 (1), 159(2016).
  15. Amirifar, P., Ranjouri, M. R., Yazdani, R., Abolhassani, H., Aghamohammadi, A. Ataxia-telangiectasia: A review of clinical features and molecular pathology. Pediatr Allergy Immunol. 30 (3), 277-288 (2019).
  16. Shiloh, Y., Ziv, Y. The atm protein kinase: Regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (4), 197-210 (2013).
  17. Lee, J. H., Paull, T. T. Cellular functions of the protein kinase atm and their relevance to human disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (12), 796-814 (2021).
  18. Taylor, A. M., et al. Ataxia telangiectasia: A human mutation with abnormal radiation sensitivity. Nature. 258 (5534), 427-429 (1975).
  19. Shiloh, Y., Tabor, E., Becker, Y. Cellular hypersensitivity to neocarzinostatin in ataxia-telangiectasia skin fibroblasts. Cancer Res. 42 (6), 2247-2249 (1982).
  20. Shiloh, Y. Atm: Expanding roles as a chief guardian of genome stability. Exp Cell Res. 329 (1), 154-161 (2014).
  21. Shiloh, Y., Lederman, H. M. Ataxia-telangiectasia (a-t): An emerging dimension of premature ageing. Ageing Res Rev. 33, 76-88 (2017).
  22. Geng, A., et al. Sirt2 promotes base excision repair by transcriptionally activating ogg1 in an atm/atr-dependent manner. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5107-5120 (2024).
  23. Biton, S., Barzilai, A., Shiloh, Y. The neurological phenotype of ataxia-telangiectasia: Solving a persistent puzzle. DNA Repair (Amst). 7 (7), 1028-1038 (2008).
  24. Kanner, S., et al. Astrocytes restore connectivity and synchronization in dysfunctional cerebellar networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (31), 8025-8030 (2018).
  25. Song, X., Ma, F., Herrup, K. Accumulation of cytoplasmic DNA due to atm deficiency activates the microglial viral response system with neurotoxic consequences. J Neurosci. 39 (32), 6378-6394 (2019).
  26. Levi, H., et al. Dysfunction of cerebellar microglia in ataxia-telangiectasia. Glia. 70 (3), 536-557 (2022).
  27. Bourseguin, J., et al. Persistent DNA damage associated with atm kinase deficiency promotes microglial dysfunction. Nucleic Acids Res. 50 (5), 2700-2718 (2022).
  28. Shiloh, Y. The cerebellar degeneration in ataxia-telangiectasia: A case for genome instability. DNA Repair (Amst). 95, 102950(2020).
  29. Lai, J., et al. Atm-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia. Cell Rep. 43 (1), 113622(2024).
  30. Woolley, P. R., et al. Regulation of transcription patterns, poly(adp-ribose), and rna-DNA hybrids by the atm protein kinase. Cell Rep. 43 (3), 113896(2024).
  31. Santos, G., Barateiro, A., Brites, D., Fernandes, A. S100b impairs oligodendrogenesis and myelin repair following demyelination through rage engagement. Front Cell Neurosci. 14, 279(2020).
  32. Iskusnykh, I. Y., Fattakhov, N., Buddington, R. K., Chizhikov, V. V. Intrauterine growth restriction compromises cerebellar development by affecting radial migration of granule cells via the jamc/pard3a molecular pathway. Exp Neurol. 336, 113537(2021).
  33. Gehmeyr, J., et al. Disabling vegf-response of purkinje cells by downregulation of kdr via mirna-204-5p. Int J Mol Sci. 22 (4), 2173(2021).
  34. Wolters, A., et al. Teriflunomide provides protective properties after oxygen-glucose-deprivation in hippocampal and cerebellar slice cultures. Neural Regen Res. 16 (11), 2243-2249 (2021).
  35. Gorter, R. P., Dijksman, N. S., Baron, W., Colognato, H. Investigating demyelination, efficient remyelination and remyelination failure in organotypic cerebellar slice cultures: Workflow and practical tips. Methods Cell Biol. 168, 103-123 (2022).
  36. Lamoureux, L., et al. Non-productive infection of glial cells with sars-cov-2 in hamster organotypic cerebellar slice cultures. Viruses. 14 (6), 1218(2022).
  37. Frontzek, K., et al. A conformational switch controlling the toxicity of the prion protein. Nat Struct Mol Biol. 29 (8), 831-840 (2022).
  38. Tellios, V., Maksoud, M. J. E., Nagra, R., Jassal, G., Lu, W. Y. Neuronal nitric oxide synthase critically regulates the endocannabinoid pathway in the murine cerebellum during development. Cerebellum. 22 (6), 1200-1215 (2023).
  39. Schroder, L. J., et al. Polysialic acid promotes remyelination in cerebellar slice cultures by siglec-e-dependent modulation of microglia polarization. Front Cell Neurosci. 17, 1207540(2023).
  40. Tzur-Gilat, A., Ziv, Y., Mittelman, L., Barzilai, A., Shiloh, Y. Studying the cerebellar DNA damage response in the tissue culture dish. Mech Ageing Dev. 134 (10), 496-505 (2013).
  41. Tal, E., et al. Inactive atm abrogates dsb repair in mouse cerebellum more than does atm loss, without causing a neurological phenotype. DNA Repair (Amst). 72, 10-17 (2018).
  42. Tal, E., Shiloh, Y. Monitoring the atm-mediated DNA damage response in the cerebellum using organotypic cultures. Methods Mol Biol. 1599, 419-430 (2017).
  43. Dar, I., et al. Investigation of the functional link between atm and nbs1 in the DNA damage response in the mouse cerebellum. J Biol Chem. 286 (17), 15361-15376 (2011).
  44. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: A paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  45. Elson, A., et al. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (23), 13084-13089 (1996).
  46. Xu, Y., et al. Targeted disruption of atm leads to growth retardation, chromosomal fragmentation during meiosis, immune defects, and thymic lymphoma. Genes Dev. 10 (19), 2411-2422 (1996).
  47. Borghesani, P. R., et al. Abnormal development of purkinje cells and lymphocytes in atm mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (7), 3336-3341 (2000).
  48. Rahmanian, N., Shokrzadeh, M., Eskandani, M. Recent advances in gammah2ax biomarker-based genotoxicity assays: A marker of DNA damage and repair. DNA Repair (Amst). 108, 103243(2021).
  49. Furia, L., Pelicci, S., Scanarini, M., Pelicci, P. G., Faretta, M. From double-strand break recognition to cell-cycle checkpoint activation: High content and resolution image cytometry unmasks 53bp1 multiple roles in DNA damage response and p53 action. Int J Mol Sci. 23 (17), 10193(2022).
  50. Duma, L., Ahel, I. The function and regulation of adp-ribosylation in the DNA damage response. Biochem Soc Trans. 51 (3), 995-1008 (2023).
  51. Komulainen, E., et al. Parp1 hyperactivity couples DNA breaks to aberrant neuronal calcium signalling and lethal seizures. EMBO Rep. 22 (5), e51851(2021).
  52. Hendelman, W. J., Aggerwal, A. S. The purkinje neuron: I. A golgi study of its development in the mouse and in culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1063-1079 (1980).
  53. Aggerwal, A. S., Hendelman, W. J. The purkinje neuron: Ii. Electron microscopic analysis of the mature purkinje neuron in organotypic culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1081-1096 (1980).
  54. Hendelman, W. J., Jande, S. S., Lawson, D. E. Calcium-binding protein immunocytochemistry in organotypic cultures of cerebellum. Brain Res Bull. 13 (1), 181-184 (1984).
  55. Seil, F. J., Herndon, R. M., Tiekotter, K. L., Blank, N. K. Reorganization of organotypic cultures of mouse cerebellum exposed to cytosine arabinoside: A timed ultrastructural study. J Comp Neurol. 313 (2), 193-212 (1991).
  56. Tauer, U., Volk, B., Heimrich, B. Differentiation of purkinje cells in cerebellar slice cultures: An immunocytochemical and golgi em study. Neuropathol Appl Neurobiol. 22 (4), 361-369 (1996).
  57. Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. J Vis Exp. (61), 3637(2012).
  58. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. The plasma membrane ca2+-atpase2 (pmca2) is involved in the regulation of purkinje cell dendritic growth in cerebellar organotypic slice cultures. Neural Plast. 2013, 321685(2013).
  59. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. Chronic pharmacological blockade of the na(+) /ca(2+) exchanger modulates the growth and development of the purkinje cell dendritic arbor in mouse cerebellar slice cultures. Eur J Neurosci. 46 (5), 2108-2120 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Ataxia TelangiectasiaATM DeficiencyFluorescent ImagingPoly ADP RiboseGenome InstabilityProtein CorrelationCalbindin Staining

مقالات ذات صلة