يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

معالجة الخلايا المساعدة للووزتين T المسامية الفعالة والتحليل الوظيفي من خلال قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد

957 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67188

⸱

يوليو 11, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Signaling and Immunity Section, Laboratory of Immune System Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Rheumatology Fellowship Training Program, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 4Division of Pediatric Otolaryngology, Children's National Hospital, 5Division of Otolaryngology, Department of Surgery, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لجمع عينات اللوزتين ومعالجتها ، والتنميط الظاهري باستخدام قياس التدفق الخلوي الطيفي عالي الأبعاد ، وإجراء تحليل غير خاضع للإشراف.

الملخص

الخلايا المساعدة التائية (Tfh) هي مجموعة فرعية من الخلايا المساعدة CD4 + T التي تساعد في تبديل النمط النظير للخلايا البائية ، وتكوين المركز الجرثومي (GC) ، وفرط الطفرة الجسدية ، ونضج التقارب ، مما يساعد على تنظيم الاستجابات المناعية الخلطية التكيفية في الأنسجة اللمفاوية الثانوية أثناء العدوى والمناعة الذاتية والتطعيم. يعد فهم تطور خلايا Tfh ووظيفتها أمرا بالغ الأهمية لتصميم لقاحات فعالة وتطوير استراتيجيات علاج مستهدفة للأمراض التي تشمل هذه الفئة من السكان. خلايا اللوزتين البشرية هي أعضاء ليمفاوية مخاطية يمكن الوصول إليها. إنها توفر فرصة فريدة لتمييز مجموعات المناعة المتميزة مثل خلايا Tfh و GC ، واستجواب التفاعلات من خلية إلى أخرى ، وتقييم الوظائف الخلوية الديناميكية ، والكشف عن آلياتها التنظيمية على مستوى الأعضاء. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الثقافات المختبرية لخلايا اللوزتين سهلة المعالجة وتمكين تقييم بيولوجيا الخلية Tfh في ظل ظروف مختلفة. هنا ، نقدم بروتوكولا لجمع خلايا اللوزتين البشرية وعزلها وحفظها واستزراعها. نصف أيضا لوحتين محسنة لقياس التدفق الخلوي الطيفي مصممتين للتوصيف المتعمق لخلايا Tfh. أخيرا ، باستخدام علاج مثبط بروتين الفوسفاتيز 2A (PP2A) كمثال ، نوضح كفاءة وقوة التحليلات غير الخاضعة للإشراف لبيانات قياس التدفق الخلوي عالية الأبعاد ، والكشف بشكل فعال عن الاختلافات الناجمة عن العلاج على نطاق عالي الأبعاد.

المقدمة

الخلايا التائية المساعدة (Tfh) هي مجموعة فرعية مميزة من الخلايا التائية المساعدة CD4 + الضرورية لتكوين ووظيفة المراكز الجرثومية (GCs) وإنتاج الأجسام المضادة للخلايا البائية. تنشأ خلايا Tfh من خلايا CD4 + T الساذجة من خلال التفاعلات مع الخلايا العارضة للمستضد وتكامل العوامل الجوهرية والخارجية ، بما في ذلك إشارات مستقبلات الخلايا التائية ، والتفاعلات التكلفة مع الخلايا البائية ، والسيتوكينات ، والكيموكينات1. تعبر خلايا Tfh عن CXCR5 و PD-1 ، والتي توجه موضعها داخل GC أو بالقرب منه. BCL-6 هو عامل النسخ الرئيسي الحاسم لتطوير Tfh وصيانته وداظيفته1،2. تعتبر خلايا Tfh محورية في زيادة الاستجابات المناعية الخلطية ، لا سيما في استجابات اللقاح وفي الدفاع ضد مسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية. تتورط استجابات الخلايا غير الطبيعية لخلايا Tfh في اضطرابات مختلفة ، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية ، ونقص المناعة ، وربما بعض أشكال السرطان3،4،5،6. لذلك ، فإن فهم وظيفتها وتنظيمها مهم لتطوير استراتيجيات فعالة للقاحاتوالعلاجات 7.

على عكس الخلايا المساعدة CD4 + T الأخرى مثل Th1 و Treg و Th17 ، والتي تكون أنظمة التمايز في المختبر راسخة8 ، فإن خلايا Tfh أكثر تعقيدا في الدراسة لأن تطورها ينطوي على تفاعلات ديناميكية من خلية إلى خلية وهياكل تشريحيةمتخصصة 7. وبالتالي ، اعتمدت الدراسات التي أجريت على خلايا Tfh إلى حد كبير على التنميط الظاهري خارج الجسم الحي لخلايا Tfh المحيطية البشرية (cTfh) ونماذج الفأر في الجسم الحي . لذلك فإن التحقيق في تنظيم جزيئات معينة على خلايا Tfh يمثل تحديا ، خاصة بالنسبة لخلايا Tfh البشرية9. وبالتالي ، فإن دراسة متعمقة خارج الجسم الحي لخلايا Tfh المشتقة من الأنسجة اللمفاوية ضرورية لتعزيز فهمنا لخلايا Tfh البشرية.

تحتوي اللوزتان ، كأعضاء ليمفاوية ثانوية ، على مجموعات خلايا فريدة غير موجودة في الدم المحيطي ، مثل خلايا ما قبل Tfh (CXCR5intPD-1int CD4 +) و GC-Tfh (CXCR5hiPD-1hi CD4 +) ، وكلاهما مفيد في تكوين GCs. علاوة على ذلك ، تعد اللوزتان الحنكية من أكثر الأنسجة التي تتم إزالتها شيوعا في جراحات الأطفال ويمكن الوصول إليها بسهولة ، مما يجعلها مصدرا لا يقدر بثمن للأنسجة البشرية لاستكشاف آليات المناعة المعقدة التي تشمل خلايا Tfh. نظرا لوجودها في مجرى الهواء العلوي ، وهو موقع أساسي للالتهابات الفيروسية التنفسية ، توفر اللوزتان نسيجا مفيدا للتحقيق في الاستجابات المناعية لمثل هذه الالتهابات الفيروسية. على سبيل المثال ، قام مختبرنا سابقا بتمييز خلايا Tfh في اللوزتين واللحمية للأطفال الذين تعافوا من COVID-19 وقارن هذه الأنسجة بتلك الموجودة في الضوابط غير المصابة10. هنا ، نحدد بروتوكولنا لمعالجة خلايا اللوزتين وتخزينها. باستخدام اللوزتين المعالجة بمثبطات PP2A كمثال ، نقوم بالتفصيل كيفية توصيف هذه الخلايا من خلال قياس التدفق الخلوي الطيفي عالي الأبعاد وتحليل البيانات باستخدام تحليل غير خاضع للإشراف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم اتباع مدونة أخلاقيات الجمعية الطبية العالمية (إعلان هلسنكي) في جميع الأبحاث البشرية في هذه الدراسة. تم الحصول على عينات اللوزتين البشرية من المرضى الذين يعانون من تضخم الغدانوتونسيل الذي يسبب اضطراب التنفس أثناء النوم أو انقطاع النفس الانسدادي النومي ، مصدره قسم طب الأنف والأذن والحنجرة للأطفال ، المستشفى الوطني للأطفال ، واشنطن العاصمة ، الولايات المتحدة الأمريكية. حصلت هذه الدراسة على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في مستشفى الأطفال الوطني (بروتوكول IRB رقم 00009806). تم التوقيع على الموافقة المستنيرة من قبل الوالدين أو الأوصياء على جميع المشاركين المسجلين ، وتم الحصول على الموافقة من المشاركين القاصرين الذين تتراوح أعمارهم بين 7 سنوات وما فوق.

1. جمع اللوزتين البشرية وعزل الخلية المفردة وتخزينها

  1. عزل الخلايا المفردة للوزتين
    1. جمع العينات الجراحية
      1. الحصول على اللوزتين من المرضى الذين يخضعون لاستئصال اللوزتين وجمع قطع الأنسجة الطازجة في غرفة العمليات في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مملوء ب 25-35 مل من وسط اللوزتين المعقمات المثلجة: RPMI مكمل بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 5٪ ، 0.05 مجم / مل جنتاميسين ، 10 ملي جلوتامين ، ومزيج من المضادات الحيوية ومضادات الفطريات (100 وحدة / مل ستربتومايسين ، 100 وحدة / مل بنسلين ، و 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب).
        ملاحظة: يمكن تخزين اللوزتين في الوسط أعلاه عند 4 درجات مئوية طوال الليل ومعالجتها في اليوم التالي. لوحظ الحد الأدنى من الخسارة في صلاحية الخلية مع التخزين الليلي مقابل المعالجة في نفس اليوم (الشكل 1 أ). يمكن أيضا شحن اللوزتين بين عشية وضحاها على الجليد.
    2. معالجة اللوزتين
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع الوسائط والمخازن المؤقتة والأدوات الجراحية معقمة ، ويجب إجراء عزل خلايا اللوزتين على الجليد في غطاء السلامة الحيوية.
      1. ضع اللوزتين على طبق زراعة خلايا بلاستيكية مقاس 60 مم يحتوي على 5 مل من وسط اللوزتين المبرد. العمل على الجليد. باستخدام ملاقط ومقصات معقمة أو مشرط ، قم بإزالة أي جلطات دموية ودهون وأنسجة ضامة مرئية بعناية (الشكل 1 ب ، ج).
      2. انقل اللوزتين إلى طبق زراعة خلوي جديد مقاس 60 مم مع 5 مل من وسط اللوزتين المثلج. قطعي قطع اللوزتين إلى شظايا 3-5 مم.
      3. قم بإعداد طبق ثقافة خلية جديد مقاس 60 مم مع 10 مل من وسط اللوزتين البارد وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر في الطبق.
      4. انقل شظايا اللوزتين إلى المصفاة وقم بتحطيم شظايا اللوزتين باستخدام نهاية المكبس لمحقنة معقمة سعة 3 مل من خلال المصفاة.
      5. اجمع الخلايا التي تحتوي على الوسط خارج المصفاة في الطبق وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
      6. أضف 10 مل إضافية من وسط اللوزتين إلى الطبق باستخدام المصفاة ، وقم بتحطيم شظايا اللوزتين باستخدام المكبس ، واجمع الوسط في الأنبوب المخروطي. بالنسبة للوزتين الكبيرتين ، كرر هذه الخطوة 2-3 مرات أكثر حتى تترك شظايا النسيج الضام فقط في المصفاة. ضع الأنسجة المتبقية والأطباق المستخدمة في كيس بيولوجي وفي النفايات الطبية.
      7. املأ الأنبوب المخروطي سعة 50 مل إلى الأعلى بوسط اللوزتين.
      8. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: قد يؤدي تمديد الطرد المركزي إلى 20 دقيقة إلى زيادة العائد.
      9. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط أو سحب العينة بعناية وإعادة تعليق الحبيبات في 5 مل من محلول الأمونيوم وكلوريد البوتاسيوم (ACK) في درجة حرارة الغرفة (RT) لتحلل خلايا الدم الحمراء. احتضن لمدة 5 دقائق في RT ، ثم أضف 35 مل من PBS المبرد لمنع المزيد من التحلل. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      10. يغسل مرة واحدة ب 50 مل من PBS المبرد وأجهزة الطرد المركزي. أعد التعليق ب 10 مل من PBS وقم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة بلاستيكية 70 ميكرومتر. عد الخلايا.
  2. الحفظ بالتبريد لخلايا اللوزتين
    1. تحضير وسط التجميد (90٪ FBS معطل بالحرارة و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)).
      ملاحظة: يمكن تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    2. الطرد المركزي معلق الخلية (الخطوة 1.1.2.10) عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية بوسط التجميد.
      ملاحظة: ننصح بتجميد الخلايا بكثافة 10 × 106 إلى 50 × 106 خلايا / مل من وسط التجميد11.
    3. Aliquot 0.5-1 مل من تعليق الخلية إلى cryovials معقمة. قم بتجميد القوارير في حاويات تجميد يتم التحكم فيها في ثلاجة -80 درجة مئوية. انقل القوارير إلى خزان تخزين يحتوي على النيتروجين السائل في غضون أسبوع واحد لحفظها على المدى الطويل.
  3. إذابة الخلايا المجمدة
    ملاحظة: يتم توضيح نهج الذوبان بالتخفيف المتسلسل المشار إليه من بروتوكول تحضير العينة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أدناه12. قد تعمل طرق الذوبان الأخرى أيضا ، لكننا وجدنا قابلية أكبر للخلية مع هذا النهج مقارنة بوضع الخلايا على الفور في مخزن مؤقت دافئ للذوبان (الشكل 1 د). يمكن تحضير مخزن الغسيل المؤقت في وقت مبكر. يتكون المخزن المؤقت ذوبان الجليد من مخزن مؤقت للغسيل بالإضافة إلى 0.1 مجم / مل DNase I (يجب إضافة DNase I قبل بدء الذوبان مباشرة). تعد زيادة وقت الطرد المركزي إلى 1 دقيقة / مل (لأنابيب 15 مل) اختيارية لزيادة إنتاجية الخلية.
    1. قم بتسخين حمام مائي إلى 37 درجة مئوية. قم بتسخين الذوبان وغسل المخزن المؤقت في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يتم إجراء جميع عمليات غسل الخلايا في RT.
    2. قم بإذابة الجليد في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق مباشرة بعد إزالته من التخزين. تجنب غمر القارورة بالكامل في الحمام المائي. قم بإزالة القارورة من الحمام المائي بينما تظل بلورة ثلجية صغيرة مرئية.
    3. انقل الخلايا المذابة برفق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة عريض التجويف في غطاء السلامة الحيوية. اشطف الكريفيال ب 0.5 مل من محلول الذوبان الدافئ مسبقا ، وأضف الشطف قطرة قطرة (قطرة واحدة كل 5 ثوان) إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل ، مع رج الأنبوب برفق للخلط.
    4. قم بتخفيف الخلايا بالتتابع في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل عن طريق إضافة 2 مل ثم 4 مل من الوسط مع ~ 1 دقيقة من وقت الانتظار بين الإضافات. أضف متوسطا بمعدل 1 مل كل 3-5 ثوان إلى الأنبوب ، مع لفه برفق حتى يمتزج.
    5. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
    6. إزالة المادة الطافية إعادة تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للذوبان ؛ واحتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    7. أضف 10 مل من مخزن الغسيل المؤقت (بدون DNase I). جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
    8. اغسل مرة أخرى: قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من محلول الغسيل. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند RT.
    9. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 70 ميكرومتر. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق عند 400 × جم في RT وعد الخلايا. التعليق في وسط الثقافة.

2. قياس التعبير عن السيتوكينات داخل الخلايا وعوامل النسخ بعد العلاج خارج الجسم الحي

ملاحظة: هنا ، نقوم بتفصيل طريقتنا لتوصيف النمط الظاهري لخلايا Tfh للوزتين باستخدام لوحتين لقياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد. بالنظر إلى أن نشاط PP2A ضروري للتعبير الأمثل عن بروتين BCL-6 وتمايز Tfh4 ، فإننا نوضح تقييمنا لصيانة خلايا Tfh ووظائفها من خلال فحص خلايا اللوزتين المعالجة بمثبط PP2A cantharidin (CAN).

  1. تلطيخ قياس التدفق الخلوي
    1. تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا
      ملاحظة: يتم إجراء الحضانات في الظلام. يتم سرد الكواشف والأجسام المضادة والكميات الخاصة بها لكل بئر مستخدم في كلا اللوحتين في جدول المواد. لتقييم تحلل الخلايا التائية ، تتم إضافة الجسم المضاد المضاد ل CD107a أثناء خطوة العلاج لتقليل النتائج السلبية الكاذبة الناتجة عن استيعابها13.
      1. اللوحة 2 × 106 خلايا لوزتين مع 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع (1 × 107 خلايا / مل) في بئر سفلي U مكون من 96 بئرا مع الكميات التالية من مثبط PP2A CAN لمدة 16 ساعة: التحكم في السيارة ، 3 ميكرومتر ، و 6 ميكرومتر.
        ملاحظة: تم إعادة تشكيل CAN عند 0.1 متر مع 1٪ DMSO.
      2. أضف مونينسين (0.7 ميكرولتر / مل) ، بريفيلدين (1: 1،000) ، أسيتات فوربول ميريستات (50 نانوغرام / مل ، PMA) ، الأيونوميسين (1،000 نانوغرام / مل) ، و 2 ميكرولتر مضاد CD107a لكل بئر لمدة 2.5 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5 ٪ عند 37 درجةمئوية. الحجم الكلي للاستزراع هو 200 ميكرولتر لكل بئر.
      3. الأجسام المضادة لتلطيخ أجهزة الطرد المركزي عند ~ 16,000 × جم لمدة 3-5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة مجاميع الأجسام المضادة. قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة السطحية للخطوة 2.1.1.8 ، والتي تشمل جميع الأجسام المضادة السطحية باستثناء مستقبلات الكيموكين ، و Brilliant Stain Buffer Plus ، و FACS buffer (حجم كل منها مذكور في جدول المواد ، إجمالي 112 ميكرولتر من المزيج لكل تفاعل).
      4. بعد الانتهاء من 2.5 ساعة في المزرعة ، اغسل الخلايا 2x ب 200 ميكرولتر من PBS المثلج عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. بين الغسلات ، تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة بسرعة. أداء تلطيخ في نفس اللوحة.
      5. احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر / بئر من 1: 800 صبغة LIVE / DEAD Blue المخففة في PBS لمدة 15 دقيقة في RT. اغسل 2x ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
      6. أعد تعليق الخلايا باستخدام حاصرات الخلايا الأحادية الحقيقية للبقع (مانع أحادي الخلايا 5 ميكرولتر + 45 ميكرولتر عازلة FACS لكل بئر) لمدة 5 دقائق في RT.
      7. أضف بالتسلسل الأجسام المضادة لمستقبلات الكيموكين مباشرة إلى تفاعل التلوين (أولا ، مضاد ل CXCR3 ومضاد ل CCR7 لمدة 10 دقائق لكل منهما ، متبوعا بمزيج من مضاد CXCR5 ومضاد CCR6 جنبا إلى جنب مع 10 ميكرولتر من Brilliant Stain Buffer Plus لمدة 5 دقائق في RT). تخلط جيدا بعد كل إضافة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. انظر جدول المواد لمعرفة أحجام الأجسام المضادة.
      8. أضف مزيج الأجسام المضادة السطحية المحضر في الخطوة 2.1.1.3 مباشرة إلى تفاعل التلوين واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند RT. إجمالي حجم التلوين لكل تفاعل هو 180 ميكرولتر: 50 ميكرولتر حاصرات أحادية الخلية في المخزن المؤقت (انظر الخطوة 2.1.1.6) + 18 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمستقبلات الكيموكين (انظر الخطوة 2.1.1.7) + 112 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة السطحية (انظر الخطوة 2.1.1.3).
      9. اغسل 2x مع 200 ميكرولتر من عازلة FACS الباردة.
      10. أعد تعليق الخلايا واحتضانها ب 80 ميكرولتر / بئر من المخزن المؤقت للتثبيت القائم على بارافورمالدهايد في RT لمدة 20 دقيقة.
      11. أضف 160 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للنفاذية إلى كل بئر ، والذي يحتوي بالفعل على مخزن مؤقت للتثبيت. قم بالطرد المركزي للوحة عند 400 × جم لمدة دقيقتين في RT وغسل 1x ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية.
      12. قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة للسيتوكين داخل الخلايا (ICS) ، والذي يتضمن الأجسام المضادة للسيتوكين ، و Brilliant Stain Buffer Plus ، ومخزن النفاذية (الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر / بئر ، جدول المواد). احتضان الخلايا بمزيج الأجسام المضادة للسيتوكين داخل الخلايا في RT لمدة 30 دقيقة.
      13. اغسل 2x مع 200 ميكرولتر / مخزن مؤقت نفاذية البئر. أعد التعليق باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من المخزن المؤقت FACS.
      14. قم بتخزين الخلايا الملطخة عند 4 درجات مئوية في الظلام واحصل على بيانات على مقياس التدفق الخلوي الطيفي في غضون 24 ساعة لتقليل فقدان شدة التلوين14.
    2. تلطيخ عامل النسخ النووي
      1. زراعة الخلايا باستخدام CAN كما في الخطوة 2.1.1.1 (دون تحفيز الخلايا).
      2. أضف الجسم المضاد CD40 المضاد للإنسان (0.5 ميكروغرام / مل) إلى وسط المزرعة وزراعته بالخلايا لمدة 15 دقيقة قبل البدء في التلوين. إذا تم تحفيز الخلايا ، أضف هذا الجسم المضاد قبل 15 دقيقة من بدء التحفيز لمنع استيعاب CD40L عند التنشيط15،16.
      3. قم بالطرد المركزي للأجسام المضادة الملطخة وقم بإعداد مزيج الأجسام المضادة السطحية على غرار الخطوة 2.1.1.3: الأجسام المضادة السطحية في جدول المواد ، و 10 ميكرولتر / بئر من Brilliant Stain Buffer Plus ، و 54.1 ميكرولتر / بئر من FACS المؤقت.
        ملاحظة: إجمالي حجم التلوين لكل بئر هو 180 ميكرولتر: 50 ميكرولتر من حاصرات الخلايا الوحيدة في المخزن المؤقت + 13 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمستقبلات الكيموكين + 117 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة السطحية.
      4. اغسل الخلايا وقم بإجراء تلطيخ LIVE / DEAD Blue وتلطيخ السطح وغسله كما في الخطوات 2.1.1.5-2.1.1.8.
        ملاحظة: لا يتم تضمين الجسم المضاد المضاد ل CXCR3 في هذه اللوحة.
      5. قم بإصلاح الخلايا باستخدام 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتثبيت عامل النسخ النووي من FoxP3 / Transcription Factor Staining Buffer Set. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT.
      6. اغسل الخلايا بمخزن مؤقت للنفاذية كما في الخطوة 2.1.1.11.
      7. قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة لعامل النسخ داخل الخلايا (TF) ، والذي يتضمن الأجسام المضادة لعامل النسخ المدرجة في جدول المواد ، و 10 ميكرولتر من Brilliant Stain Buffer Plus ، و 16 ميكرولتر من مخزن النفاذية (الحجم الإجمالي 40 ميكرولتر / بئر). احتضان الخلايا بهذا المزيج لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
      8. اغسل واحصل على مقياس خلوي طيفي كما في الخطوات 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. تحليل غير خاضع للإشراف لبيانات قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد

ملاحظة: البرامج والحزم وإصداراتها المستخدمة للتحليل مدرجة في جدول المواد. توجد لقطات الشاشة من الخطوات 3.2 إلى 3.4 في الملف التكميلي 1. توجد البرامج النصية النموذجية من الخطوات 3.5 إلى 3.7 فيالملف الإضافي S 2 والملف التكميلي 3 ، والخطوات من 3.8 إلى 3.9 في الملف التكميلي 4 والملف التكميلي 5. يتم توفير ملفات ICS الأولية وملفات TF الأولية للنصوص في الملف التكميلي 6 والملف التكميلي 7 ، على التوالي.

  1. افتح مساحة عمل برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي حيث يتم تخزين ملفات ".fcs" وأكمل البوابات كما هو موضح في الشكل 1E.
  2. انقر بزر الماوس الأيمن فوق العقدة المستهدفة (خلايا CD4 + T في هذه الحالة). اختر تحديد العقد المكافئة.
  3. انقر بزر الماوس الأيمن على العقدة المستهدفة مرة أخرى. حدد تصدير/تسلسل السكان.
  4. انتظر حتى تفتح نافذة Populations: Export أو Concatenate ، واختر قيم قناة CSV، واختر وجهة الملفات المصدرة. قم بتضمين جميع الخلايا في المربع تضمين الأحداث وحدد جميع المعلمات المعوضة في مربع المعلمات . قم بتوسيع الخيارات المتقدمة، واكتب بادئة لإعادة تسمية الملفات، ثم انقر فوق تصدير لتصدير الملفات إلى المجلد الوجهة (تصدير ملف .csv واحد لكل عينة).
  5. اقرأ ملفات "*.csv" المصدرة باستخدام R (واحد لكل عينة). قم بتعيين معرف عينة لكل خلية ودمج الخلايا من جميع العينات في إطار بيانات واحد.
  6. إضافة بيانات تعريف أو دمجها (معلومات إضافية حول العينات) في إطار البيانات.
  7. قم بتقليل عدد متساو من الخلايا لكل عينة بشكل عشوائي للتحليل التالي. هذه الخطوة اختيارية.
    ملاحظة: في هذا المثال، تم تقليل عينات 8,000 من خلايا CD4+ T من إجمالي خلايا CD4+ T لكل حالة، وهو ما يمثل ما لا يقل عن 1/7 من إجمالي عدد خلايا CD4+ T.
  8. إنشاء كائن Seurat: تفسير قيم القناة لعلامات الأجسام المضادة كمستويات تعبير جيني عند إنشاء كائن Seurat.
    1. قم بإنشاء كائن Seurat باستخدام إطار البيانات الذي تم إنشاؤه من الخطوة 3.6. تخطي خطوة NormalizeData واحفظها مباشرة كمقايسة "بيانات".
    2. حدد علامات السطح من لوحة التدفق لاستخدامها كميزات متغيرة في التجميع غير الخاضع للإشراف.
    3. قم بتشغيل ScaleData و RunPCA و FindNeighbors و FindClusters و RunUMAP كمسار قياسي تم تقديمه من Seurat باستثناء الخطوة 17 من NormalizeData.
    4. اضبط معلمة الدقة في خطوة FindClusters لتعديل عدد المجموعات، مما يضمن أنها تعكس السياق البيولوجي الأساسي بشكل أكثر دقة.
  9. استخدم أدوات التصور مثل DimPlot و FeaturePlot المتوافقة مع حزمة Seurat. لمقارنة المجموعات التي تحتوي على عينات متعددة لكل مجموعة، احسب النسبة المئوية لكل مجموعة على أساس كل موضوع وقم بإجراء مقارنات إحصائية. بعد ذلك ، استخدم النماذج الرياضية لتحليلات إحصائية أكثر تعقيدا10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لمقارنة قابلية الخلية الإجمالية للبقاء ، قمنا بتقطيع اللوزتين إلى ثلاث قطع متشابهة وقمنا بمعالجتها باستخدام بروتوكولنا في ظل ثلاثة شروط: (1) المعالجة في نفس اليوم ، (2) التخزين طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، و (3) التخزين طوال الليل على الجليد. كانت الجدوى بين هذه الظروف الثلاثة متشابهة تماما دون أي اختلاف كبير (الشكل 1 أ). قمنا أيضا بتقييم تأثير عملية الذوبان على صلاحية الخلايا. أدت طريقة الذوبان المتدلية التي استخدمناها إلى قابلية أعلى بكثير للخلية مقارنة بطريقة ذوبان الوسائط المباشرة بعد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على عكس التقارير السابقة التي تفيد بضرورة معالجة اللوزتين الطازجة في غضون 3 ساعات بعد الجراحة19 ، وجدنا أن عينات اللوزتين الطازجة يمكن أن تحتفظ بصلاحيتها عند تخزينها عند 4 درجات مئوية ومعالجتها في غضون 24 ساعة. لتحسين صلاحية الخلية من أنسجة اللوزتين عند الذوبان من تخزين النيتروجين السائل ، اعتمدنا طريقة الذوبان المتدلية الموصى بها في تسلسل الخلية المفردة ، حيث تقدر قيمة عالية للخلية12. سمح هذا النهج بالتعافي الأمثل للخلايا الحية مقارنة بطرق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل قسم البحوث الداخلية في NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوية > آلات وأدوات< / قوية>
3 مل حقنة بلاستيكيةBD309657
96 Well U اللوحة السفليةالحرارية العلمية163320
1.2 مل قوارير مبردةكورنينج430487
مصفاة خلية 70 وميكرو ؛ م نايلونفالكون352350
صحن ثقافة الخلية (60 مم)VWR10062-890
جهاز طرد مركزيحراري علميسورفال ليجند XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L معيار حمام مائيB2000-2
مقص فاين - شاربFST14060-11
علب الأدوات البلاستيكيةFST20830-05
مقياس التدفق الطيفي الخلوي ، AuroraCytek5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
ملقط النمط القياسيFST11000-13
ملقط النمط القياسيFST11000-20
الجدوى لخلية Blu Vi-cell   ؛بيكمان كولترC19201
< قوي > الكواشف < / قوي >
0.5 م EDTA درجة الحموضة 8.0جودة بيولوجيا351-027-101
2-MercaptoethanolGibco21985-023
ACK محلول التحللالمؤقت GibcoA10492-01
مزيج المضادات الحيوية ومضادات الفطريات (تعليق البنسلين - الستربتومايسين - الأمفوتريسين B ، 100x)Gibco15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD566385
CantharidinSigmaC7632-25MG
Cytofix Fixation BufferBD554655
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)SigmaD8418-250ml
DNAase IRoche10104159001
Fetal مصل الأبقار (FBS)VWR97068-085
FoxP3 / مجموعة العازلة لتلطيخ عامل النسخeBioscience00-5523-00
جنتاميسين (50 مجم / مل)جيبكو15750-060
جولجي بلاجBD555029
جولجيستوبBD554724
هيبس (1 م)جيبكو15630-080
IonomycinSigma  I0634-1mg
L-Glutamine (200 ملليمتر)Gibco25030-081
MEM NEAA (100x)Gibco11140-050
محلول بارافورمالدهيد 16٪ ، درجة EM (PFA)المجهر الإلكتروني
  ؛ Science		15710تمييع مع PBS
PBS ، درجة الحموضة 7.4Gibco10010072
البنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)جيبكو15140-122
فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA)سيجماP8139-1 ملغ
حاويات التجميد التي يتم التحكم فيها بالمعدلMilliporeCorning CoolCell FTS30
RPMI (+ L-Glutamine)جيبكو11875-085
بيروفات الصوديوم (100 ملم)جيبكو11360-070
حاصرات أحادية الصبغةحقيقية BioLegend426103
<قوي > مخازن مؤقتة < / قوي >
متوسطثقافة 10٪ FBS معطل بالحرارة (VWR) ،
2 نانومتر جلوتامين ،
0.055 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول ،
1٪ بنسلين / الستربتومايسين ،
1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ،
10 ملي مولار HEPES ،
1٪ أحماض أمينية غير أساسية
في RPMI (+ L-Glutamine) FACS
buffer2 ملي مولار EDTA و 2٪ FBS معطل بالحرارة في PBS
وسطالتجميد 90٪ FBS معطل بالحرارة و 10٪ DMSO
ذوبان عازلمخزن غسيل + 0.1 مجم / مل DNaseI
وسطاللوزتينRPMI مكمل بنسبة 5٪ FBS معطل بالحرارة ،
10 ملي مولار جلوتامين ،
0.05 مجم / مل جنتاميسين ،
1٪ مزيج مضاد حيوي ومضاد للفطريات
  ؛ (البنسلين والستربتومايسين والأمفوتريسين ب).
محلول الغسيل المخزنالمؤقت RPMI (+ L-Glutamine) المكمل بنسبة 10٪   FBS المعطل بالحرارة و 10 ملي مولار هيبس
قوي > أجسام مضادة ووصفي أخرى للوحة السيتوكين   ؛ < / قوي >
البيوتين مضاد للإنسان CD107a (LAMP-1) الأجسام المضادةBioLegend3286042 & L في 200 مو ؛ ل وسط ثقافة كاملة لكل بئر.
تمت إضافة هذا الجسم المضاد مع الخلايا أثناء تحفيز PMA / ionomycin.
<قوي > تلطيخ ميت حي < / قوي >100 مو ؛ L مزيج لكل بئر
LIVE DEAD BlueThermoL23105  ؛ 1 : 800 ، 0.125 مو ؛ L في 100 مو ؛ L PBS لكل بئر. 
<قوي>كتلة أحادية الخلية< / قوي>50 & مزيج L لكل بئر
مانع MonocyteBioLegend4261035 & L True Stain حاصرات أحادية الخلايا و 45 مو ؛ L FACS عازلة لكل
بئر <قوي > الأجسام المضادة السطحية للوحة السيتوكين < / قوية >
مزيج& L / well 
CCR6-BV711 BioLegend المضاد للإنسان3534361
مضاد للإنسان CCR7-BV421BioLegend3532081
مضاد للإنسان CXCR3-PE-Cy5BD 5511285
مضاد للإنسان CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
         18 و مو ؛ مزيج ل لكل بئر لمستقبلات الكيموكين.
إضافة موجهة إلى الخلايا ذات المخزن المؤقت
< قوي > مزيج الأجسام المضادة السطحية الأخرى < / قوي >& L / well 
مضاد للإنسان CD103-BUV661BD7499932.5
مضاد للإنسان CD14-Spark Blue 550BioLegend3671482.5
مضاد للإنسان CD19-Spark NIR 685BioLegend3022702.5
مضاد للإنسان CD25-BB515 BD56446710
مضاد للإنسان CD27- سوبر برايت 436ثيرمو62-0279-425
مضاد للإنسان CD3-BV510BioLegend3448282.5
مضاد للإنسان CD38 APC-Fire810BioLegend3035501
مضاد للإنسان CD4 CF YG584CytekR7-200412.5
مضاد للإنسان CD45RA-BUV395ديناربحريني 7403150.6
مضاد للإنسان CD56-BUV737BD6127663.5
مضاد للإنسان CD57-FITCBioLegend3596041.2
مضاد للإنسان CD69-BUV563BD7487641
مضاد للإنسان CD8-BUV805BD 6128891.2
مضاد للإنسان FAS-BB700BD5665420.6
مضاد للإنسان HLA-DR APC-FIRE 750BioLegend3076582
PD1-BV785 BioLegend3299291.2
Anti-human-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS buffer61
                                             112 و مو ؛ ل مزيج لكل بئر للأجسام المضادة السطحية الأخرى.
أضف مباشرة إلى المخزن المؤقت لكتلة الخلية الأحادية (50 & mu; L) ومزيج مستقبلات الكيموكين (18 & mu; لتر ، 50 + 18 + 112 = 180 مو ؛ L في المجموع لكل بئر)
<قوي>الأجسام المضادة للسيتوكين داخل الخلية للوحة السيتوكين < / قوية >& L / well 
Granzyme B-PEBD1
المضاد للإنسان IL10-PE-Dazzle 594BioLegend5068121
المضاد للإنسان IL17A-BV605BioLegend5123261
IL2-BV650BioLegend5003343
المضاد للإنسان IL21- Alexa Fluor 647BD560493 10
IL4-PerCP Cy5.5BD5612341
Perforin-APC BioLegend3533122.5
مضاد للإنسان TNFa-PE-Cy7BioLegend5029300.1
Anti-IFNγ-Pacific BlueBioLegend5025221
SAv-BUV615BD6130130.25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD566385 10
1x المخزن المؤقت للنفاذية   ؛eBioscience00-5523-0019.15
       (50 & مو ؛ مزيج L لكل بئر)
<قوي > الأجسام المضادة والحكام الآخرين للوحة عامل النسخ < / قوي >
CD40 الجسم المضاد ، المضاد للإنسانMiltenyi Biotec130-094-1330.5 & mu ؛ جم / مل من وسط الثقافة لتركيز
العمل <قوي > تلطيخ ميت حي < / قوي >100 مو ؛ L مزيج لكل بئر
LIVE DEAD BlueThermoL23105  ؛ 1 : 800 ، 0.125 مو ؛ L في 100 مو ؛ L PBS لكل بئر. 
المخزن المؤقت لمانع الخلايا الأحاديةBioLegend4261035 & mu ؛ L True Stain حاصرات أحادية الخلايا و 45 مو ؛ L عازلة FACS لكل بئر
<قوي> الأجسام المضادة السطحية للوحة عامل النسخ < / قوية >
< قوية > مزيج مستقبلات كيموكين < / قوي >& L / well 
CCR6-BV711BioLegend353436المضاد
CCR7-BV421BioLegend3532081
مضاد للإنسان CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
               13 & مزيج L لكل بئر
<قوي > مزيج الأجسام المضادة السطحية الأخرى < / قوي >& L / well 
مضاد للإنسان 4-1BB-PE-CY7BioLegend3098182.5
مضاد للإنسان CD14-Spark Blue 550BioLegend3671482.5
مضاد للإنسان CD19-Spark NIR 685BioLegend3022702.5
مضاد للإنسان CD200-PerCP-eFluor 710ThermoFisher46-9200-422.5
مضاد للإنسان CD25-PE-Cy5BioLegend3026085
مضاد للإنسان CD3-BV510BioLegend3448282.5
مضاد للإنسان CD38-APC-Fire810BioLegend3035501
مضاد للإنسان CD4-Pacific BlueBioLegend3174231
مضاد للإنسان CD40L-PEBD15
مضاد للإنسان CD45RA-BUV395BD7403150.6
مضاد للإنسان CD56-BUV737BD6127663.5
مضاد للإنسان CD69-BUV650BioLegend3109342.5
مضاد للإنسان CD8-BUV805BD6128891.2
مضاد للإنسان HLA-DR APC-FIRE 750BioLegend3076582
مضاد للإنسان ICOS-BUV563BD7414211.2
مضاد للإنسان OX40-APCBioLegend3500085
مضاد للإنسان PD1-BV785BioLegend3299291.2
مضاد للإنسان-CD45-PerCPحراريMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS buffer54.1
                 117  μ ل مزيج لكل بئر للأجسام المضادة السطحية الأخرى.
أضف مباشرة إلى كتلة monocyte  عازلة (50 & mu; L) ومزيج مستقبلات الكيموكين (13 & mu ؛ لتر ، 50 + 13 + 117 = 180 مو ؛ L في المجموع لكل بئر)
<قوي> الأجسام المضادة لعامل النسخ لوحة < / قوية >& L / well 
مضاد للإنسان T-bet-BV605BioLegend6448174
مضاد للإنسان Bcl6-PE-CF594BD5624014
مضاد للإنسان FoxP3-Alexa فلور 488ديناربحريني 5608871.6
مضاد للإنسان GATA3-BB700BD5666422
مضاد للإنسان Ki67-Alexa فلور 700ديناربحريني 5612770.4
مضاد للإنسان رورجت-أليكسا فلور 647دينار بحريني5636202
بريليانت البقع العازلة بلس (RUO)BD56638510
1 × عازلة نفاذية eBioscience00-5523-0016
                                 40 و مو ؛ مزيج L لكل
برنامج وحزم جيدة <قوية> لتحليل غير خاضع للإشراف< / قوي >
<قوي>برنامج / حزمة < / strong> Version< / strong>Source< / strong>
1data.table1.16.2شبكة أرشيف R الشاملة
2FlowJO10.9.0Becton ، ديكنسون وشركاه
3خريطة المسح التصويري1.0.12شبكة أرشيف R الشاملة
4R4.3.2شبكة أرشيف R الشاملة
5readxl1.4.3شبكة أرشيف R الشاملة
6Rstudio2023.12.1+402Posit PBC
7Seurat5.1.0شبكة أرشيف R الشاملة
8SeuratData0.2.2.9001شبكة أرشيف R الشاملة
9SpectroFlo3.0Cytek
10tidyverse2.0.0شبكة أرشيف R الشاملة
11viridis0.6.5شبكة أرشيف R الشاملة
رقمي محلل < مانع مستقبلات الكيموكين لكتلة الخلية الأحادية 561142 للإنسان 557299

المراجع

  1. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  2. Choi, J., et al. Bcl-6 is the nexus transcription factor of t follicular helper cells via repressor-of-repressor circuits. Nat Immunol. 21 (7), 777-789 (2020).
  3. Goubet, A. G., et al. Escherichia coli-specific CXCL13-producing TFH are associated with clinical efficacy of neoadjuvant PD-1 blockade against muscle-invasive bladder cancer. Cancer Discov. 12 (10), 2280-2307 (2022).
  4. Jiang, Y., et al. Protein phosphatase 2A propels follicular T helper cell development in lupus. J Autoimmun. 136, 103028(2023).
  5. Overacre-Delgoffe, A. E., et al. Microbiota-specific T follicular helper cells drive tertiary lymphoid structures and anti-tumor immunity against colorectal cancer. Immunity. 54 (12), 2812-2824.e4 (2021).
  6. Patel, P. S., et al. Translational regulation of TFH cell differentiation and autoimmune pathogenesis. Sci Adv. 8 (25), eabo1782(2022).
  7. Alameh, M. G., et al. Lipid nanoparticles enhance the efficacy of mRNA and protein subunit vaccines by inducing robust T follicular helper cell and humoral responses. Immunity. 55 (6), 1136-1138 (2022).
  8. Sekiya, T., Yoshimura, A. In vitro Th differentiation protocol. Methods Mol Biol. 1344, 183-191 (2016).
  9. Ueno, H., Banchereau, J., Vinuesa, C. G. Pathophysiology of T follicular helper cells in humans and mice. Nat Immunol. 16 (2), 142-152 (2015).
  10. Xu, Q., et al. Adaptive immune responses to SARS-CoV-2 persist in the pharyngeal lymphoid tissue of children. Nat Immunol. 24 (1), 186-199 (2023).
  11. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q. Z., Maltzman, J. S., Stee, V. G. T. L. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).
  12. 10x Genomics. Cell thawing protocols for single cell assays. CG000447. , https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1710525012/CG000447_Handbook_CellThawingProtocols_SingleCellAssays_Rev_B.pdf (2024).
  13. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. J Immunol Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
  14. Diks, A. M., et al. Impact of blood storage and sample handling on quality of high dimensional flow cytometric data in multicenter clinical research. J Immunol Methods. 475, 112616(2019).
  15. Poloni, C., et al. T-cell activation-induced marker assays in health and disease. Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).
  16. Dan, J. M., et al. Immunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science. 371 (6529), eabf4063(2021).
  17. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
  18. Ditoro, D., et al. Differential IL-2 expression defines developmental fates of follicular versus nonfollicular helper T cells. Science. 361 (6407), eaao2933(2018).
  19. Assadian, F., et al. Efficient isolation protocol for B and T lymphocytes from human palatine tonsils. J Vis Exp. (105), e53374(2015).
  20. Florek, M., et al. Loss of CD62L expression in CD4+FoxP3+regulatory T cells following freeze-and-thaw prevents protection against gvhd in murine models. Blood. 124 (21), 2427-2427 (2014).
  21. Frigyesi, I., et al. Robust isolation of malignant plasma cells in multiple myeloma. Blood. 123 (9), 1336-1340 (2014).
  22. Anselmo, A., et al. Flow cytometry applications for the analysis of chemokine receptor expression and function. Cytometry Part A. 85 (4), 292-301 (2014).
  23. Berhanu, D., Mortari, F., De Rosa, S. C., Roederer, M. Optimized lymphocyte isolation methods for analysis of chemokine receptor expression. J Immunol Methods. 279 (1-2), 199-207 (2003).
  24. Den Braanker, H., Bongenaar, M., Lubberts, E. How to prepare spectral flow cytometry datasets for high dimensional data analysis: A practical workflow. Front Immunol. 12, 768113(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

PP2A

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.