Method Article

تسجيلات حادة أحادية الوحدة متعددة الأقطاب الكهربائية من جذع دماغ الفئران الثابتة بالرأس

DOI:

10.3791/67205

⸱

October 11th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia, 2Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 3Department of Pharmacology, University of Virginia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة للحصول على تسجيلات خلية عصبية واحدة عالية الكثافة في الجسم الحي من جذع دماغ الفئران الثابتة بالرأس. يتم نشر هذا النهج لقياس إطلاق جهد الفعل للخلايا العصبية في الرمادي البطني الوحشي حول القناة - منطقة جذع الدماغ غير نشطة أثناء نوم حركة العين السريعة (REM) - قبل وأثناء التخدير العام.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحظى التسجيلات القائمة على أقطاب السيليكون متعددة بشعبية متزايدة لدراسة النشاط العصبي عند الدقة الزمنية لإمكانات الفعل في العديد من مناطق الدماغ. ومع ذلك ، فإن تسجيل النشاط العصبي من الهياكل الذيلية العميقة مثل جذع الدماغ باستخدام مجسات متعددة القنوات لا يزال يمثل تحديا. يتمثل أحد المخاوف الكبيرة في إيجاد مسار لإدخال المسبار الذي يتجنب الأوعية الدموية الكبيرة ، مثل الجيوب الأنفية الوريدية السهمية العلوية والجيب الوريدي المستعرض. يمكن أن يتسبب إصابة هذه الأوردة الكبيرة في حدوث نزيف حاد وتلف أنسجة المخ الأساسية وربما الوفاة. يصف هذا النهج استهداف هياكل جذع الدماغ عن طريق اقتران الإحداثيات الأمامية بنهج بزاوية ، مما يسمح لمسبار التسجيل باختراق الدماغ أسفل هياكل الأوعية الدموية عالية الخطورة. بالمقارنة مع النهج الرأسي الصارم ، فإن النهج الزاوي يزيد من عدد مناطق الدماغ التي يمكن استهدافها. باستخدام هذه الإستراتيجية ، يمكن الوصول إلى اللون الرمادي البطني الوحشي حول القناة (vlPAG) ، وهي منطقة جذع الدماغ المرتبطة بنوم حركة العين السريعة ، بشكل متكرر وموثوق للحصول على تسجيلات أحادية الوحدة متعددة الأقطاب الكهربائية في الفئران الثابتة بالرأس قبل وأثناء تخدير سيفوفلوران. تعد القدرة على تسجيل النشاط العصبي في vlPAG والنوى المحيطة بها بدقة زمنية عالية خطوة إلى الأمام في تعزيز فهم العلاقة بين نوم حركة العين السريعة والتخدير.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت التسجيلات المستندة إلى أقطاب كهربائية متعددة من السيليكون شائعة بشكل متزايد لقياس النشاط العصبي عبر العديد من مناطق الدماغ بدقة جهد الفعلالفردي 1،2،3،4. على مدى العقد الماضي ، نمت تقنية التسجيل عالية الكثافة بشكل كبير. يمكن أن تستوعب أقطاب التسجيل الحالية القائمة على السيليكون عدد القنوات العالية والألياف الضوئية وأجهزة تسجيل القشرة الكهربائية (ECoG)5،6. علاوة على ذلك ، يسمح الزرع المزمن لهذه الأقطاب الكهربائية بتسجيلات طويلة المدى7،8.

على الرغم من التطورات التكنولوجية الحديثة ، لا يزال استهداف الهياكل الذيلية العميقة مثل جذع الدماغ باستخدام مجسات متعددة القنوات أمرا صعبا. عند استهداف هياكل جذع الدماغ مثل الرمادي البطني الوحشي حول القناة (vlPAG) ، تتمثل إحدى العقبات المهمة في تحديد مسار المسبار الذي يتجنب الأوعية الدموية الرئيسية ، على سبيل المثال ، الجيوب الأنفية الوريدية السهمية العلوية والجيب الوريدي المستعرض. يمكن أن تسبب إصابة هذه الأوردة الكبيرة نزيفا حادا ، وتلفا في أنسجة المخ الأساسية ، وحتى الموت9،10. نقترح استهداف هياكل جذع الدماغ من الإحداثيات الأمامية بزاوية ، مما يسمح لمسبار التسجيل باختراق الدماغ أسفل هياكل الأوعية الدموية عالية الخطورة (انظر الشكل 1). هذا النهج الزاوي ، مقارنة بالنهج الرأسي ، يزيد من عدد مناطق الدماغ التي يمكن الوصول إليها للتسجيل. بالإضافة إلى ذلك ، في الظروف التجريبية التي تكون فيها تسجيلات ECoG مطلوبة ، يوفر النهج الأمامي الزاوي مزيدا من سطح الجمجمة المتاح لزرع سماعة الرأس ECoG ، حيث يتم وضع نافذة حج القحف لإدخال المسبار في الأمام10،11.

يظل تحديد مجموعات الخلايا والدوائر المحددة المسؤولة عن تغيرات نوم حركة العين السريعة الناجمة عن التخدير هدفا رئيسيا لأبحاث التخدير. وبالتالي ، كان الهدف هنا هو الوصول بشكل متكرر وموثوق به إلى vlPAG - منطقة جذع الدماغ المرتبطة بنوم حركة العين السريعة - للحصول على وحدة واحدة ، تسجيلات متعددة الأقطاب الكهربائية في الفئران الثابتة بالرأس قبل وأثناء تخدير سيفوفلوران12،13. استخدمت الدراسات السابقة قياسات إمكانات المجال المحلي الكهربية (LFP) ل vlPAG في الفئران المستيقظة لتحديد تغيرات الحالة العصبية المرتبطة بالتخدير14،15. ومع ذلك ، فإن قياسات LFP حساسة في المقام الأول للنشاط المشبكي ، وليس إمكانات العمل ، داخل المنطقة المسجلة16. وبالتالي ، لا يزال هناك فهم محدود لكيفية تأثير التخدير بشكل مباشر على أنماط النشاط العصبي التي تنتجها الخلايا العصبية vlPAG. هنا ، يتم وصف طريقة للحصول على تسجيلات خلية عصبية مفردة عالية الكثافة من جذع دماغ الفئران الثابتة بالرأس. يمكن أيضا تكييف هذه الطريقة لتسجيل نشاط الخلايا العصبية المفردة من مختلف هياكل جذع الدماغ العميقة والخلفية الأخرى.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الدراسات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة فيرجينيا (شارلوتسفيل ، فيرجينيا). تم استخدام خمسة ذكور من الفئران C57BL / 6J ، تتراوح أعمارهم بين 3-7 أشهر ، ويزن 25-30 جم. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة هنا مدرجة في جدول المواد.

1. زرع غطاء الرأس وسماعة الرأس

  1. اصنع سماعة رأس ECoG عن طريق لحام سلك الفولاذ المقاوم للصدأ المطلي بالبيرفلورو ألكوكسي (PFA) برأس موصل مكون من 3 سنون (الشكل 2 أ).
  2. تحديد إحداثيات الإدراج استنادا إلى أطلس الماوسالتجسيمي 17. يعد استخدام نظرية فيثاغورس لحساب زاوية وعمق إدخال المسبار - خاصة عندما يكون هناك القليل من المعلومات في الأدبيات - نقطة انطلاق معقولة (الشكل 1) 18.
    ملاحظة: في النهاية ، سيتم تعديل الإحداثيات عن طريق التجربة والخطأ. لاستهداف vlPAG ، تم استخدام الإحداثيات التالية في الفئران البالغة: الأمامي الخلفي (AP) -3.6 مم ، الوسيط الوحشي (ML) +0.5 مم ، الظهري البطني (DV) -4 مم. تم إدخال المسبار بزاوية 20 درجة (AP).
  3. تحفيز التخدير العام عن طريق وضع الفأر في غرفة الحث (1.5٪ -3٪ إيزوفلوران في الأكسجين). بمجرد التخدير ، ضع الماوس في الإطار التجسيمي ، ووضع أنف في مخروط الأنف وتثبيت الرأس بقضبان الرأس.
  4. ضع مرهم العين على العينين لمنع تلف القرنية. استخدم نظام التحكم في درجة الحرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية.
  5. ضعي كريم إزالة الشعر أو حلق الفراء على فروة الرأس ، ثم عقميه باليود بوفيدون و 70٪ كحول. استخدم تقنية التعقيم "النصائح فقط" للحفاظ على مجال جراحي معقم.
  6. قم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم للتحقق من عمق التخدير.
  7. تطبيق تسكين الألم: كاربروفين 2.5 ملغ/كغ، يعطى تحت الجلد في الظهر.
  8. قم بعمل شق 5 مم في فروة الرأس لإزالة بقعة دائرية من الجلد فوق العظام الجداري والقذالي. قم بإزالة السحايا برفق عن طريق كشطها بشفرة المشرط.
  9. استخدم شفرة المشرط لقطع مرفقات العضلات وفضح العظام الجدارية والقذالية19. ضع بيروكسيد الهيدروجين حسب الحاجة للسيطرة على النزيف وتجفيف سطح الجمجمة. من الأهمية بمكان وضع أسمنت الأسنان والراتنج على الجمجمة الجافة لتحقيق رابطة قوية.
  10. أولا ، حدد معالم بريجما ولاجدا على الجمجمة20. بعد ذلك ، اضبط موضع مخروط الأنف لتسوية الوضع الأمامي الخلفي للجمجمة ، مع التأكد من عدم وجود فرق ارتفاع يزيد عن 100 ميكرومتر بين المعلمين.
  11. لتسوية الوضع الإنسي الجانبي للجمجمة ، اختر نقطتين متقابلتين بين بريجما ولاجدا ، كل واحدة 1 مم من الخيط السهمي وتحقق من مستواها. إذا كان هناك فرق ارتفاع بينهما يزيد عن 100 ميكرومتر ، فاضبط الموضع الجانبي الإنسي للجمجمة عن طريق معالجة قضبان الرأس.
  12. قم بقياس المسافة بين بريجما ولاجدا ومقارنتها بالمسافة المبلغ عنها في أطلس فرانكلين باكسينوس التجسيمي (عادة 4.2 مم)17. استخدم الفرق بين المسافات المقاسة والمبلغ عنها لقياس إحداثيات نقطة الوصول بشكل متناسب. مارك ينسق حج القحف على الجمجمة بقلم رصاص معقم.
    ملاحظة: إذا كانت مسافة بريجما-لامدا المقاسة تختلف عن 4.2 مم ، فيجب قياس الإحداثيات بشكل متناسب. وتتوافق جميع إحداثيات نقطة الوصول المبلغ عنها في أطلس تجسيمي مع مسافة بريجما - لامدا المعيارية. نظرا لأن حجم جمجمة الماوس متغير ، فمن المهم ضبط إحداثياتك وفقا لذلك.
  13. باستخدام أداة معالجة دقيقة تجسيمية ، ضع الصفيحة الأمامية مباشرة فوق خياطة لامدا ، وثبتها على الجمجمة عن طريق وضع الأسمنت السني على الصفيحة الأمامية وحولها (الشكل 3 أ ، ب). اترك 10 دقائق على الأقل حتى يجف الأسمنت.
  14. حفر ثقوب لدغ (قطرها 0.5 مم) لقطبين قشريين (القشرة الأمامية والجدارية ) ولقطب كهربائي يعمل كقطب مرجعي (المخيخ). ضع الأطراف المجردة (0.5 مم) من أقطاب الأسلاك الفضية المطلية داخل فتحات الأزيز وقم بتثبيتها باستخدام الراتنج المنشط بالأشعة فوق البنفسجية.
  15. قم بتغطية الأسلاك المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ المطلية بالكامل بالأسمنت للأسنان حتى لا ينكشف أي سلك. قم بتغطية الجانب السفلي والجوانب من سماعة الرأس بأسمنت الأسنان بحيث يكون ثابتا في مكانه. تأكد من بقاء خيوط بريجما ولاجدا مرئية بمجرد تثبيت سماعة الرأس في مكانها (الشكل 2 ب).
  16. دع الفأر يتعافى لمدة لا تقل عن 7 أيام ، وافحص موقع والجراحة يوميا بحثا عن أي مخالفات. تطبيق المسكنات (كاربروفين 2.5 ملغ/كغ، SC) حسب الحاجة.

2. وضع مسبار السيليكون وتسجيله

  1. اعتاد الماوس على جهاز التسجيل وتثبيت الرأس (1.5 ساعة على الأقل في يومين منفصلين) (الشكل 2 د).
  2. في يوم التسجيل ، ضع الفأر في غرفة التخدير (إيزوفلوران 1.5٪ -3٪ في الأكسجين).
  3. ضع الماوس في إطار تجسيمي ، واضبط مخروط الأنف وأشرطة الرأس كما هو موضح في 1.3. الحفاظ على التخدير (الأيزوفلوران 1.5٪ -3٪ في الأكسجين) طوال الجراحة التجسيمية. قم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم للتحقق من عمق التخدير.
  4. ضع مرهم العين على العينين وحافظ على درجة حرارة الجسم المناسبة.
  5. حدد بريجما ولاجدا ، مع التأكد من عدم وجود فرق ارتفاع يزيد عن 100 ميكرومتر بين المعلم التشريحي.
  6. ابحث عن الإحداثيات المحسوبة على الجمجمة وقم بتمييزها بقلم رصاص معقم ، ثم قم بإنشاء مخطط تفصيلي لنافذة حج القحف 2 مم × 2 مم حول الإحداثيات.
  7. قم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم للتحقق من عمق التخدير.
  8. استخدم مثقابا عالي السرعة لإنشاء نافذة حجم قحف مقاس 2 مم × 2 مم. ضع 0.5-1 مل من المحلول الملحي العادي لمنع سطح الدماغ من الجفاف. قم بإزالة الجافية باستخدام إبرة حقنة وملقط دقيق.
    ملاحظة: راقب الأوعية الرئيسية (الجيوب السهمية العلوية ، الجيوب الأنفية المستعرضة) لتجنب النزيف المفرط (الشكل 3).
  9. استخدم مثقابا عالي السرعة لإنشاء فتحة نتوءات منفصلة للقطب المرجعي لمسبار السيليكون ، بشكل عام ~ 1-2 مم من نافذة الجمجمة.
  10. ضع لاصق سيليكون منخفض السمية سعة 0.2 مل على الجمجمة لإغلاق حج القحف تماما باستخدام أداة التطبيق المرفقة.
  11. دع الماوس يتعافى لمدة 1 ساعة تقريبا.
  12. قم بتثبيت رأس الماوس على جهاز تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية باستخدام الصفيحة الأمامية والبراغي (الشكل 2 د).
  13. قم بتغطية ساق مسبار السيليكون بصبغة الفلورسنت DiI (1: 4 DiI: Ethanol) بحيث يمكن إعادة بناء مسار المسبار بعد التجربة.
  14. قم بتركيب المسبار على المناور واضبط الزاوية المطلوبة. لاستهداف vlPAG ، تم تطبيق زاوية AP من 15-20 درجة.
  15. اخفض مسبار التسجيل إلى سطح الدماغ داخل منتصف نافذة الجمجمة. أولا ، أدخل المسبار يدويا على عمق ~ 300 ميكرومتر. بمجرد إدخاله إلى هذا العمق ، قم بخفض المسبار ببطء تلقائيا (على سبيل المثال ، 200 ميكرومتر / دقيقة) إلى العمق المستهدف لتقليل تلف الأنسجة21 (الشكل 2 ج).
    ملاحظة: يوصى في البداية بالإدخال اليدوي للمسبار. يضمن إدخال المسبار اليدوي القدرة على إيقاف المسبار وسحبه في حالة انحنيه عند الإدخال الأولي. بمجرد أن يخترق المسبار الأنسجة بالكامل ، يكون من الآمن عموما الاستمرار في نزول المسبار في الوضع التلقائي.
  16. ضع الزيت المعدني على سطح الدماغ داخل نافذة حج القحف لمنع الجفاف.
  17. دع مسبار التسجيل يستقر لمدة 10 دقائق بعد الإدخال.
  18. سجل البيانات من مسبار السيليكون و ECoG بسرعة 30 كيلو هرتز باستخدام وحدة التحكم في التسجيل Intan.
  19. بعد 1-2 ساعة من التسجيل ، استخدم تقنية التروية عبر القلب لإصلاح الدماغ في 4٪ بارافورمالدهيد22.
    ملاحظة: بسبب الأسمنت ، قد يكون من الصعب إزالة الجزء المنقاري من الجمجمة. لهذا السبب يفضل استئصال الدماغ عن طريق إزالة الأجزاء الظهرية من الجمجمة.
  20. اقطع رأس الفأر ، وقطع الجلد بعد خط الوسط على الجانب الظهري ، من الرقبة إلى الفك السفلي. قم بإزالة العضلات والأنسجة المرتبطة بالجمجمة ، وقطع الفك السفلي لتسهيل الوصول إلى الدماغ.
  21. إذا تم التروية بشكل صحيح ، يجب أن يتقلص الدماغ قليلا ، مما يترك مساحة كافية لإدخال مقص ناعم في الجزء الظهري من الثقبة العظمية. قم بعمل قطع وسطي واحد ، وواحد جانبي وواحد مقابل ، بحجم حوالي 1 مم ، في العظم القذالي.
  22. قم بإزالة الجزء الظهري من الجمجمة بعناية باستخدام ملقط العين. ابدأ من العظم القذالي ، وقم بإزالة جميع شظايا الجمجمة حتى ينكشف الجزء الظهري بالكامل من الدماغ.
  23. حرك ملعقة صغيرة أسفل الدماغ ، بدءا من البصيلات الشمية لإخراج الدماغ.
  24. بمجرد نقعه وإزالته ، يمكن تخزين الدماغ في 4٪ بارافورمالدهيد عند 4 درجات مئوية لمدة 24-48 ساعة.

3. علم الأنسجة لإعادة بناء مسار المسبار

  1. قسم الدماغ إلى أقسام إكليلية 70 ميكرومتر باستخدام اهتزاز.
  2. قم بتركيب الأقسام على الشرائح باستخدام وسيط تركيب DAPI الذي يلطخ نوى الخلايا. قم بتغطية الشرائح وإغلاقها بطلاء أظافر شفاف.
  3. صور الشرائح على المجهر الفلوري. اضبط التباين / السطوع بحيث تكون مسارات المسبار مرئية بوضوح. تأكد من أن أحجام ملفات صورة tiff الناتجة أقل من 10 ميجابايت، بحيث تعمل أكواد MATLAB بسلاسة. أعد بناء مسارات المسبار باستخدام كود MATLAB23.

4. تحليل البيانات الفيزيولوجية الكهربية

  1. تحليل الإشارات العصبية المسجلة من مسبار السيليكون باستخدام برنامج الكشف والفرز التلقائي خارج الاتصال (Kilosort) 24.
  2. تصنيف المجموعات المكتشفة يدويا باستخدام Phy على أنها وحدات متعددة أومفردة 25. صنف العناقيد على أنها وحدات مفردة عندما يكون لها شكل موجة سبايك فسيولوجي ، وتظهر فترة مقاومة للحرارة في الرسم القياسي المتقاطع ، والتوزيع الطبيعي لعرض السعة.
  3. استيراد بيانات وحدة واحدة إلى MATLAB وتحليل23.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم زرع خمسة ذكور C57BL / 6J بسماعة رأس ECoG وغطاء رأس (الشكل 4 أ). بعد الشفاء ، اعتادت الفئران على تثبيت الرأس وجهاز تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية خلال جلستين لمدة 1.5 ساعة في أيام منفصلة (الشكل 4 ب). بعد ذلك ، تم إنشاء نافذة حج القحف مقاس 2 مم × 2 مم (الشكل 4C) وتم إدخال مسبار من السيليكون مع استيقاظ الماوس وتثبيته على الرأس (الشكل 4 د). تم استخدام نوعين من مجسات السيليكون UCLA: (1) 64 م: مسبار واحد ، 64 قطبا كهربائيا. و (2) 256 ANS: مسبار بأربعة سيقان ، 256 قطب. تم إعطاء سيفوفلوران والأكسجين باستخدام مخروط أنف مثبت على جهاز الفيزيولوجيا الكهربية. تمت مراقبة مستويات الأكسجين والسيفوفلوران كل 5 دقائق باستخدام محلل غاز مضمن. بعد نضح القلب ، تم حصاد الدماغ (الشكل 4E) وتقييمه لمسار المسبار (الشكل 4F). ثم تم تنسيق إمكانات الفعل المسجلة في بيانات وحدة واحدة (الشكل 4G).

تم إجراء خمسة تسجيلات حيث تم التحقق من صحة وضع المسبار باستخدام خوارزميات إعادة بناء المسبار المتاحة التي تم تطويرها في MATLAB23. باستخدام هذه الخوارزميات ، تم توطين كل قطب كهربائي من مسبار السيليكون في بنية دماغية معينة بحيث تم الحصول على منظور ثلاثي الأبعاد لوضع المسبار داخل الدماغ (الشكل 5). اقترنت خوارزميات إعادة البناء هذه بعلامات كيميائية مناعية لمزيد من التحقق من صحة مسارات المسبار (الشكل 6). ثم تمت مطابقة البيانات مع وحدات مفردة منسقة (الشكل 7).

تم التقاط ما مجموعه 64 خلية عصبية مفردة ، منها 13 كانت موجودة في vlPAG. كانت الخلايا العصبية ال 51 المتبقية في النوى القريبة: الدماغ المتوسط ، والنواة الشبكية في منتصف الدماغ ، والنواة المجاورة للقنابل ، والنواة المسمارية ، والنواة السعيرية اللاحقة ، والنواة المجاورة للعظة ، والسويقات المخيخية العلوية. يتم تقديم نشاط إطلاق الخلايا العصبية في كل فأر كخرائط حرارية (الشكل 7). تم استبعاد Mouse 3 من التحليل بسبب ضعف جودة التسجيل في وحدة واحدة. قللت معظم الخلايا العصبية المسجلة من إطلاقها أثناء تخدير سيفوفلوران.

تمت مقارنة متوسط إطلاق الخلايا العصبية vlPAG لكل فأر عند 5 دقائق من خط الأساس (أي 10-15 دقيقة في التسجيل) و 5 دقائق أثناء سيفوفلوران (أي 40-45 دقيقة في التسجيل). انخفض إطلاق vlPAG بشكل كبير (الشكل 8 أ) وعلاوة على ذلك ، كانت هذه الزيادة متسقة عبر جميع الخلايا العصبية vlPAG (الشكل 8 ب).

figure-results-1
الشكل 1: حساب الإحداثيات التجسيمية لإدخال المسبار. اللوحة اليسرى: استخدام الهندسة لحساب النهج الزاوي لإدخال المسبار. تم تحديد المكونات التالية للمثلث القائم الزاوية: (أ) عمق DV للهيكل المستهدف من سطح الدماغ (تم الحصول عليه باستخدام الأطلس التجسيمي) ، (ب) المسافة بين إحداثيات AP بافتراض الهبوط الرأسي الصارم وإحداثيات AP للهيكل المستهدف. اللوحة اليمنى: باستخدام (أ) و (ب) ، يمكن للمرء استخدام نظرية فيثاغورس لحساب زاوية AP (β) وطول (ج) لإدخال المسبار. تم استخدام الإحداثيات التالية لاستهداف vlPAG: (AP) -3.6 مم ، (ML) +0.5 مم ، (DV) -4 مم. تم استخدام زاوية AP (β) تبلغ 20 درجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: زرع الصفيحة الأمامية وتسجيل وحدة واحدة. (أ) وضع سلك سماعة الرأس ECoG أثناء الزرع. (ب) منظر علوي لجمجمة الماوس بعد زرع سماعة الرأس ولوحة الرأس ECoG. (ج) سيقان مسبار السيليكون التي يتم إدخالها في الدماغ. (د) الماوس المثبت على الرأس أثناء تسجيل مسبار السيليكون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: وضع نافذة الجمجمة بالنسبة للأوعية الدموية الرئيسية. تمثيل تخطيطي للأوعية الدموية على سطح دماغ الفأر مع وجود علامة على الجيب السهمي العلوي والجيب المستعرض. يشير المربع الأبيض إلى موقع نافذة الجمجمة وتمثل النقطة الحمراء نقطة إدخال المسبار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التصميم التجريبي. تم زرع خمسة فئران من الذكور C57BL / 6J بسماعة رأس ECoG وغطاء رأس (A). بعد التعافي ، اعتادوا على تثبيت الرأس وجهاز التسجيل (B). بعد ذلك ، تم إجراء بضع القحف (C) وإدخال مسبار السيليكون مع استيقاظ الماوس وفي وضع ثابت للرأس. تم إعطاء التخدير المتطاير والأكسجين باستخدام مخروط الأنف (D). بعد التسجيل ، تم حصاد الدماغ (E) وتحليله باستخدام تقنيات الكيمياء المناعية لإعادة بناء مسار المسبار (F). ثم تم تنسيق إمكانات الفعل المسجلة في بيانات وحدة واحدة (G). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: نموذج ثلاثي الأبعاد للدماغ مع مسارات مسبار معاد بناؤها. يمثل كل خط ملون مستقيم مسارا للتحقيق. تشير كل نقطة إلى موقع صبغة DiI المرئية على شرائح الدماغ الإكليلية. يتم إعادة بناء مسار المسبار لكل ساق من مسبار السيليكون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: إعادة بناء ما بعد تخصيص لوضع المسبار داخل vlPAG. شريحة دماغ إكلية تمثيلية لكل فأر مسجل (1-5) ملطخة ب DAPI (أزرق) تظهر مسارات المسبار ((DiI ، أحمر ، مميز بأسهم خضراء) مع مخطط لمناطق الدماغ. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. تم تسجيل الفأر 1-3 باستخدام مجسات سيليكون أحادية الساق (أي 64 قناة) ، بينما تم تسجيل الماوس 4 و 5 باستخدام مجسات سيليكون رباعية السيقان (أي 256 قناة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: نشاط إطلاق النار قبل وأثناء تخدير سيفوفلوران. تمثل الخرائط الحرارية عدد إمكانات العمل التي يتم إطلاقها بواسطة 64 خلية عصبية مفردة على فترات دقيقة واحدة. تم تعيين بنية أصل للخلايا العصبية المفردة بناء على إعادة بناء مسار المسبار. يشير الخط الأبيض المتقطع إلى بدء إعطاء سيفوفلوران ، ن = 4 فئران. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: إلغاء إطلاق الخلايا العصبية vlPAG أثناء تخدير سيفوفلوران. (أ) متوسط عدد إمكانات الفعل التي تم إطلاقها قبل وأثناء التخدير لكل فأر. (ب) عدد إمكانات الفعل التي تطلقها كل خلية عصبية vlPAG (ب). اختبار الطالب t المقترن ، ** P = 0.0036 ، P = 0.0053 على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9
الشكل 9: مثال على كيفية تأثير وضع الصفيحة الأمامية غير المتساوي على مسار المسبار. (أ) وضع غير متساو للصفيحة الأمامية على رأس الماوس. (B ، C) إعادة بناء دماغ الفأر ثلاثي الأبعاد مع مسار المسبار حيث توجد زاوية وسطية جانبية غير مقصودة ناتجة عن وضع غير متساو لألواح الرأس على رأس الماوس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتوسط نوى جذع الدماغ الوظائف الأساسية مثل التنفس والوعي والنوم26،27،28. يمثل موقع جذع الدماغ (العميق والخلفي) تحديا في دراسة نشاطه العصبي في الجسم الحي باستخدام التقنيات القياسية. هنا يتم تقديم نهج أمامي بزاوية للسماح بتسجيل وحدة واحدة قابلة للتكرار في الفئران الثابتة بالرأس.

يعد الإدخال الدقيق لمسبار السيليكون متعدد الأقطاب الكهربائية أمرا بالغ الأهمية لضمان الاستهداف المتسق لهياكل جذع الدماغ المتعلقة بنوم حركة العين السريعة ، مع تجنب تلف الأوعية الدموية الرئيسية. مطلوب درجة كبيرة من البراعة والتركيز والصبر لحل أفضل إحداثيات ومسار الدخول13.

نظرا لمسار المسبار الزاوي والمسافة المطلوبة لاستهداف الهياكل العميقة ، فمن المحتمل أن تؤدي التناقضات الطفيفة في الإحداثيات ووضع الصفيحة الأمامية إلى فقدان الهيكل المستهدف. من الضروري أن يكون Bregma و Lambda على نفس المستوى أثناء زرع الصفيحة الأمامية وأن يتم قياس المسافة بينهما بدقة. والجدير بالذكر أنه نظرا لأن العمليات الجراحية يتم إجراؤها على إطار تجسيمي ويتم إجراء التسجيلات على جهاز الفيزيولوجيا الكهربية منفصل ، فمن الأهمية بمكان أن يتم تثبيت الألواح الأمامية على جمجمة مستوية. يؤدي إدخال زوايا إضافية (أي الرأس المائل إليه) إلى زيادة خطر الخطأ ، وهو مرتفع بشكل خاص بالنسبة لهياكل الدماغ الصغيرة والعميقة (الشكل 9).

نظرا لأن مجسات السيليكون هشة ، فمن المهم إزالة الجافية من سطح الدماغ والتأكد من عدم وجود شظايا عظمية تسد نافذة الجمجمة. قد يحدث نزيف خفيف بعد إزالة الجافية ، لذلك من الضروري تنظيف سطح حج القحف من الدم المتجمد الذي قد يتسبب في ثني المسبار. إذا ثبت أن إدخال مسبار السيليكون في الدماغ صعب (على سبيل المثال ، المسبار ينحني) ، فمن المهم التحقق من وجود أي جافية متبقية أو ما إذا كان سطح الدماغ قد جف ، حيث يمكن أن يتشكل غشاء رقيق عند تركه مع القليل من السائل أو بدونه. في البشر27 ، المناطق القريبة من الأوعية الدموية لها جافية أكثر سمكا ، وتوجد مشكلة مماثلة في الفئران ، حيث يمكن أن تكون إزالة الجافية دون تمزق الأوعية أمرا صعبا. على الرغم من أن الإزالة الدقيقة للجافية عادة ما تؤدي إلى إدخال مسبار سلس ، إلا أن زوايا الإدخال الأكبر قد تمثل صعوبات إضافية.

يمكن أن يختلف إنتاجية التسجيلات اختلافا كبيرا بين ويعتمد على العديد من المتغيرات. أحد العوامل المهمة هو كثافة الخلايا العصبية في الهيكل المستهدف. تميل المناطق ذات الكثافة العصبية المنخفضة (على سبيل المثال ، القشرة) إلى الحصول على عائد أقل من الخلايا العصبية المفردة المسجلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تلف الأنسجة ، مثل تمزق الأوعية الدموية تحت سطح الدماغ ، إلى موت الخلايا العصبية أو إصابتها ، مما يقلل من المحصول21،29. تعد جودة التسجيلات أمرا بالغ الأهمية أيضا ، حيث أن التسجيلات عالية الجودة تجعل من السهل التمييز بين الخلايا العصبية المفردة. يمكن أن يؤدي مسار المسبار خارج الهدف أيضا إلى انخفاض الغلة. على الرغم من تطويره للتسجيلات في vlPAG ، إلا أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول للتسجيل من الهياكل القريبة في جذع الدماغ.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة أو أي تضارب في المصالح بمقتضى هذا العمل.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إنشاء الشكل 1 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 8 والشكل 9 باستخدام BioRender.com. نود أن نشكر سكوت كيليانسكي على المساعدة في كود MATLAB ومشاركة نصوصه. نشكر آنا جريس كارنز على المساعدة في إعادة بناء مسار المسبار.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1024 قناة RHD RecordingController Intan Technologies ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةC3008تسجيل مسبار السيليكون ؛ تسجيل الأجهزة والبرامج
24 مم × 50 مم رقم 1.5 VWR coverslipVWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية48393-081علم الأنسجة
4٪ PFA في PBSThermoFisher Scientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةJ61899. AKHistology; محلول التروية
C & مسحوق B metabondPatterson Dental ، ريتشموند ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية: 5533559 ، قاعدة سريعة: 5533492 ، محفز: 55335007غطاء رأس و زرع سماعة
الرأس C57 / 6J الفئران 4-6 أسابيع ، الذكورمختبر جاكسون ، بار هاربور ، مين ، الولايات المتحدة الأمريكية000664
Capnomac UltimaDatex ، هلسنكي ، فنلندا   ؛ULT-SVi-27-07؛ توقف ؛ يمكن شراء محلل الغاز البديل من Bionet America & nbsp ؛
CM-DiIThermoFisher Scientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةV22888صبغة فلورية حمراء لطلاء مسبار السيليكون
رأس موصلDigiKey ، Thief River Falls ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية1212-1788-NDسماعة ECoG
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech ، برمنغهام ، ألاباما ، الولايات المتحدة الأمريكية0100-20علم الأنسجة
iBOND UniversalPatterson Dental ، ريتشموند ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية044-1113غطاء رأس & زرع سماعة الرأس. ل  تأمين أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ للجمجمة
السيليكون منخفض السميةأدوات الدقة العالمية ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكيةKWIK-Silنظام
مناور الصفيحالجديد تقنيات المقياس الجديد ، فيكتور ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكيةمناور متعدد المجسات: XYZ تجميع المرحلة: 06464-0000 ، مجموعة نظام MPM: 06267-3-0001 ، MPM-Platform-360 ، حلقة MPM للأذرع اليدوية MPM ، MPM_Ring-72 درجة: 06262-3-0000تسجيل مسبار السيليكون ؛ إدخال المسبار في الدماغ
Microprobesجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية256 ANS ، 64Mتوقف ؛ يمكن شراء مجسات السيليكون البديلة من Neuropixels
Mineral OilSigma Aldrich ، Saint Luis ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةM8410-100MLتسجيل مسبار السيليكون ؛ منع الأنسجة من الجفاف أثناء التسجيل
Normal SalineThermoFisher Scientific ، Waltham ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةZ1376غطاء رأس & زرع سماعة الرأس. منع الدماغ من الجفاف أثناء الجراحة
سلك الفولاذ المقاوم للصدأ المطلي ب PFA - قطر 0.008 بوصة مطلي بنهايات مخططةأنظمة AM ، Sequim ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية791400سماعة رأس ECoG وقطب كهربائي مرجعي ل ECoG & nbsp ؛
سلك بلاتيني 24AWG الآلات الدقيقة العالمية ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكيةPTP201القطب المرجعي لتسجيل مسبار السيليكون  
مجهر شاندون كولور فروست بلسThermoFisher Scientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية99-910-01الأنسجة
الفولاذ المقاوم للصدأ صفيحة الرأسStar Rapid ، الصينجزء مخصصمن غطاء الرأس & زرع سماعة الرأس. التصميم متاح عند الطلب
جهاز تجسيميKOPF ، Tujunga ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةنموذج 940 أداة تجسيمية للحيوانات الصغيرة مع لوحة أمامية لوحدة التحكمو زرع سماعة الرأس
محلل الغاز لاصق الأمامي شرائح الرقمية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, F., et al. Monolithically integrated µLEDs on silicon neural probes for high-resolution optogenetic studies in behaving animals. Neuron. 88 (6), 1136-1148 (2015).
  2. Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nat Rev Neurosci. 20 (6), 330-345 (2019).
  3. Li, N., Daie, K., Svoboda, K., Druckmann, S. Robust neuronal dynamics in premotor cortex during motor planning. Nature. 532 (7600), 459-464 (2016).
  4. Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: New horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
  5. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opinion Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  6. Nunez-Elizalde, A. O., et al. Neural correlates of blood flow measured by ultrasound. Neuron. 110 (10), 1631-1640.e4 (2022).
  7. Yang, L., Lee, K., Villagracia, J., Masmanidis, S. C. Open source silicon microprobes for high throughput neural recording. J Neural Eng. 17 (1), 016036(2020).
  8. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  9. Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protoc. 1 (3), 100194(2020).
  10. Dias, M., et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 8 (4), (2021).
  11. Gao, Z. R., et al. Tac1-expressing neurons in the periaqueductal gray facilitate the itch-scratching cycle via descending regulation. Neuron. 101 (1), 45-59.e9 (2019).
  12. Atluri, N., et al. Anatomical substrates of rapid eye movement sleep rebound in a rodent model of post-sevoflurane sleep disruption. Anesthesiology. 140 (4), 729-741 (2023).
  13. Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature. 538 (7623), 51-59 (2016).
  14. Frontera, J., et al. Bidirectional control of fear memories by cerebellar neurons projecting to the ventrolateral periaqueductal grey. Nat Commun. 11 (1234567890), (2020).
  15. Weber, F., et al. Regulation of REM and Non-REM sleep by periaqueductal GABAergic neurons. Nat Commun. 9 (1), 354(2018).
  16. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  17. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Elsevier, AP. Amsterdam. (2008).
  18. Pythagorean theorem. , Available from: https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Pythagorean_theorem&oldid=1222259845 (2024).
  19. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/chapters/skeleton.shtml (2024).
  20. Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
  21. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Sci Rep. 9, 111(2019).
  22. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), e3988(2021).
  23. Peters, A. petersaj/AP_histology. , https://github.com/petersaj/AP_histology (2024).
  24. Pachitariu, M., Sridhar, S., Stringer, C. Solving the spike sorting problem with Kilosort. , (2023).
  25. Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Sci Rep. 9 (1), 3521(2019).
  26. Leiras, R., Cregg, J. M., Kiehn, O. Brainstem circuits for locomotion. Ann Rev Neurosci. 45 (2022), 63-85 (2022).
  27. Benarroch, E. E. Brainstem integration of arousal, sleep, cardiovascular, and respiratory control. Neurology. 91 (21), 958-966 (2018).
  28. Guyenet, P. G., Bayliss, D. A. Neural control of breathing and CO2 homeostasis. Neuron. 87 (5), 946-961 (2015).
  29. Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. J Neural Eng. 9 (4), 046020(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Electrode RecordingsBrainstem RecordingsHead Fixed MiceSilicon ProbesSingle Unit RecordingStereotaxic SurgeryCraniotomy ProcedureNeuronal ActivitySevoflurane AnesthesiaVentrolateral Periaqueductal Gray

Related Articles