تسلط الدراسة الحالية الضوء على مزايا استخدام الطريقة التي طورها جيفري وهمفري لاستخراج وقياس الأصباغ القابلة للذوبان في الدهون من الطحالب الدقيقة. تعمل هذه الطريقة كأداة قيمة لتقييم تأثير عوامل النمو على إنتاج الكلوروفيل والمحتوى الخلوي في هذه الكائنات الحية.
مقالة منهجية
تقييم تأثير عوامل النمو على إنتاج الكلوروفيل أ و ب من الطحالب الدقيقة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحتوي الطحالب الدقيقة على مجموعتين رئيسيتين من الأصباغ: الكلوروفيل والكاروتينات. الكلوروفيل هو صبغة خضراء تمتص الطاقة الضوئية وتحولها إلى طاقة كيميائية لتسهيل تخليق المركبات العضوية. تعمل هذه الصبغة كمصدر أساسي قيم لمنتجات مدخلات التكنولوجيا الحيوية في الصناعات الغذائية والأدوية ومستحضرات التجميل نظرا لخصائصها المضادة للأكسدة العالية وقدرات التلوين. كان الهدف من هذا البحث هو تقييم تأثير عوامل النمو (تركيز ثاني أكسيد الكربون2 ، ولون الضوء ، وشدة الضوء) من خلال تصميم تجريبي Taguchi L4 على نمو الخلايا والمحتوى الخلوي للكلوروفيل أ و ب في الكلوريلا سوروكينيانا ، متبوعا بالتحقق من صحة الطريقة باستخدام المكورات الدموية البلوفياليس. الطحالب الدقيقة كنموذج دراسة إضافي. تم قياس نمو الخلية باستخدام تقنية القياس الطيفي الضوئي للكثافة الضوئية بطول موجي 550 نانومتر. لتقدير كمية الكلوروفيل ، تم الحصول على مستخلص خلوي باستخدام محلول أسيتون نقي بنسبة 90٪ ، وبعد ذلك ، تم قياس تركيزات الكلوروفيل أ و ب باستخدام تقنيات القياس الطيفي بأطوال موجية تبلغ 647 نانومتر و 664 نانومتر ، وفقا للطريقة التي وصفها جيفري وهمفري. أشارت النتائج التجريبية إلى أن التحكم في ظروف إضافة ثاني أكسيد الكربون المنخفض ، والضوء الأرجواني ، وشدة الضوء المنخفضة يزيد من نمو الخلايا وتركيز الكلوروفيل أ و ب داخل الخلايا. يسمح تنفيذ طريقة القياس الكمي للكلوروفيل هذه بتحديد سريع وبسيط ودقيق لمحتوى الكلوروفيل ، حيث أن الأطوال الموجية المستخدمة تكون في ذروة الامتصاص لكلا النوعين من الكلوروفيل ، مما يجعل هذه التقنية قابلة للتكرار بسهولة لأي طحالب دقيقة قيد الدراسة.
المقدمة
وفي السنوات الأخيرة، أدت المشاكل البيئية المتزايدة الناجمة عن الأنشطة البشرية المنشأ وآثارها السلبية على صحة النظم الإيكولوجية وتوازنها إلى البحث عن نظم إنتاج أكثر كفاءة وصديقة للبيئة. وقد أدى ذلك إلى تسريع العمليات في الصناعات وتعزيز تنفيذ علاجات المعالجة الحيوية وتطوير المركبات الحيوية للتخفيف من هذه الآثارالضارة 1.
أدى هذا السياق إلى نمو كبير في دراسة الطحالب الدقيقة ، مدفوعا بالحاجة إلى إيجاد حلول مبتكرة للتحديات البيئية والاقتصادية الحالية. تزدهر الطحالب الدقيقة في البيئات المائية ، باستخدام ضوء الشمس وثاني أكسيد الكربون كمصادر للطاقة والكربون ، على التوالي. هذه الخاصية تجعلها بديلا مستداما وواعدا لإنتاج العديد من المنتجات القيمة. ركزت الأبحاث في هذا المجال على فهم فسيولوجيا التمثيل الغذائي لهذه الخلايا ، بالإضافة إلى تطوير تقنيات فعالة لزراعتها ومعالجتها2.
هناك حاجة واضحة لتطوير أدوات يمكن الوصول إليها وموثوقة لدراسة الطحالب الدقيقة لتسريع عمليات البحث وتعميق فهم علم وظائف الأعضاء والتمثيل الغذائي والتطبيقات المحتملة. وينبغي أن تمكن هذه الأدوات من إجراء تحليل سريع لتأثير العوامل البيئية وعوامل الإنتاج على البارامترات الرئيسية، مثل تركيز الكلوروفيل، الذي يعد مؤشرا أساسيا على صحة هذه الكائنات وتطورها. قد يشير انخفاض محتوى الكلوروفيل إلى الإجهاد البيئي أو نقص التغذية أو الأمراض.
تلعب هذه الأصباغ الخضراء دورا مهما في عملية التمثيل الضوئي ، حيث تلتقط طاقة ضوء الشمس لتحويل ثاني أكسيد الكربون والماء إلى جلوكوز وأكسجين وتشكل ما بين 0.5٪ و 5٪ من الكتلة الحيوية للطحالب الدقيقة3. بالإضافة إلى دورها الأساسي في الحفاظ على عمليات الحياة ، وجدت الكلوروفيل تطبيقات في مختلف الصناعات. تستخدم مستخلصات الكلوروفيل في معالجة الأغذية والمشروبات كملونات طبيعية ، مما يضفي ألوانا خضراء نابضة بالحياة على المنتجات مع توفير خصائص مضادة للأكسدة. علاوة على ذلك ، تكتسب المكملات الغذائية القائمة على الكلوروفيل شعبية في قطاع الصحة والعافية بسبب آثارها المزعومة لإزالة السموم والمضادة للالتهابات. من خلال تسخير الخصائص متعددة الأوجه للكلوروفيل ، يمكن للصناعات تطوير منتجات مبتكرة تساهم في كل من الجاذبية البصرية ورفاهية المستهلك1.
في هذا الصدد ، فإن الطحالب الدقيقة ذات الأهمية الكبيرة في التكنولوجيا الحيوية هي C. sorokiniana. تتميز هذه الكائنات الحية الدقيقة بمعدل نموها السريع ، مما يجعلها عالية الكفاءة في إنتاج الكتلة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، C. sorokiniana يعرض محتوى متنوعا من المركبات الغذائية العالية ، بما في ذلك البروتينات والدهون والفيتامينات ، مما يجعله ذا قيمة لمختلف التطبيقات في إنتاج الغذاء والأعلاف والوقود الحيوي2. علاوة على ذلك ، وجد أن هذه الأنواع من الطحالب الدقيقة تنتج إنزيمات خارج الخلية ذات وظائف متنوعة ، مما يفتح إمكانيات لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية مثل معالجة مياه الصرف الصحي والمعالجة الحيوية والمستحضرات الصيدلانية4. بالإضافة إلى نموه السريع وتطبيقاته المتنوعة ، يظهر C. sorokiniana أيضا إمكانات كبيرة لإنتاج الكلوروفيل. ككائن حي دقيق ضوئي ، C. sorokiniana تمتلك الآلات اللازمة لتخليق الكلوروفيل ، والذي يشكل ما بين 0.5٪ و 5٪ من الكتلة الحيوية للطحالبالدقيقة 3. هذه القدرة تجعل C. sorokiniana مرشحا جذابا لإنتاج الكلوروفيل على نطاق تجاري وتعد بأن تكون حلا مستداما للتحديات البيئية والتغذويةالملحة 5.
من ناحية أخرى ، هناك أنواع أخرى من الطحالب الدقيقة ذات الأهمية الكبيرة هي H. pluvialis. تشتهر هذه الطحالب الدقيقة بإنتاجها للأستازانتين ، وهو صبغة قوية مضادة للأكسدة لها العديد من التطبيقات الصناعية. يعمل أستازانتين كآلية وقائية للنظام الضوئي H. pluvialis ، مما يحميه من الإجهاد التأكسدي الناجم عن العوامل البيئية. هذه الصبغة مطلوبة بشدة في مستحضرات التجميل والمغذيات وتربية الأحياء المائية ، نظرا لخصائصها المضادة للأكسدة وفوائدها الصحية المحتملة. بفضل قدرته الوفيرة على إنتاج أستازانتين ، يقدم H. pluvialis وسيلة واعدة لتطوير منتجات مبتكرة تلبي مختلف الاحتياجات الصناعيةوالاستهلاكية 6.
كما أبرزت الدراسات الحديثة إمكانية إنتاج H. pluvialis1 لإنتاج الكلوروفيل ، مما يزيد من أهميته الصناعية. على سبيل المثال ، بحثت دراسة في محتوى الكلوروفيل في H. pluvialis في ظل ظروف نمو متفاوتة ووجدت أنه في ظل معايير الزراعة المثلى ، أظهر H. pluvialis معدلات إنتاج الكلوروفيل الملحوظة ، متجاوزة تلك الموجودة في أنواع الطحالب الدقيقةالأخرى 7. وتؤكد هذه النتيجة على إمكانات الملوية البلوفيالية كمصدر مستدام للكلوروفيل، مما يتيح فرصا جديدة لاستخدامه في مختلف القطاعات الصناعية.
البروتوكول
1. إعداد وسائط الثقافة وإعداد اللقاح
- تحضير 1 لتر من وسط النمو 3N-BBM + V (CCAP) (المغذيات الكبيرة: NaNO3 [0.75 جم L-1] ، CaCl2 [0.019 جم L-1] ، MgSO4 [0.019 جم L-1] ، K2HPO4 [0.057 جم L-1] ، كلوريد الصوديوم [0.025 جم L-1] ، KH2PO4 [0.175 جم L-1] ؛ المغذيات الدقيقة: Na2 EDTA [0.0186 جم L-1] ، FeCl3 [0.0024 جم L-1] ، MnCl2 [0.001 جم L-1] ، ZnCl2 [1.25 × 10-4 جم L-1] ، CoCl2 [5 × 10-5 جم L-1] ، Na2MoO4 [9.98 × 10-5 جم L-1]) 8 وتعقيمها لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية و 1.5 رطل لكل بوصة مربعة.
- تلقيح قارورة ب 1 لتر من وسط النمو بتركيز تقريبي 3 × 106 خلايا مل مل -1 للطحالب الدقيقة C. sorokiniana. أو أضف 5٪ إلى 10٪ (v / v) من اللقاح إلى وسط النمو.
ملاحظة: للحفاظ على الظروف المعقمة ، يوصى باستخدام غطاء التدفق الصفحي والقفازات ومعطف المختبر وقناع الوجه. - احتضان القارورة الملقحة تحت مصادر الضوء الأحمر بكثافة تقريبية تتراوح من 3,600 إلى 4,200 لوكس ، عند درجة حرارة تتراوح بين 22-26 درجة مئوية ، مع فترة ضوئية تبلغ 12 ساعة من الضوء و 12 ساعة من الظلام ل C. sorokiniana وفترة ضوئية من 16 ساعة ضوء و 8 ساعات من الظلام ل H. pluvialis ، وتحريك يدويا كل 24 ساعة ، تقريبا لمدة 7 أيام لكلتا السلالتين.
ملاحظة: حافظ على ظروف النمو لمدة 7-10 أيام على الأقل (حتى الحصول على لون أخضر كثيف) ل C. sorokiniana و 10-12 يوما ل H. pluvialis. للحصول على تركيز الطحالب الدقيقة الذي سيكون بمثابة لقاح في الحركية ، من الضروري إزالة الوسط الطافي من الطحالب المنتجة. - في بيئة معقمة ، املأ أنابيب الطرد المركزي المخروطية المعقمة سعة 15 مل بحوالي 10 مل من الوسط الملقح وأجهزة الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 20 دقيقة تحت 25-30 درجة مئوية.
- في ظل ظروف معقمة ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة أو عن طريق صب وتركيز الكتلة الحيوية في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 مل.
- كرر هذه العملية حسب الضرورة حتى يتم الحصول على الحجم المطلوب من اللقاح للحركية.
- قم بقياس الكثافة الضوئية (OD550 نانومتر) لللقاح لتحديد تركيز الخلية للطحالب الدقيقة وتخزينها عند درجة حرارة 3-4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
ملاحظة: تم إجراء العد الخلوي المباشر في البداية لربط تركيز الخلية بالامتصاص. بمجرد العد ، يمكن تخزين اللقاح في الثلاجة لمدة لا تزيد عن 4 أيام.
2. دراسة حركية النمو
- إعداد الحجم المطلوب من 3N-BBM + V (CCAP) المناسب لكل تجربة (8 لتر لاختبارات مستوى المفاعل الضوئي ل C. sorokiniana و 0.5 لتر لاختبارات مستوى القارورة ل H. pluvialis) وفقا للإجراءات المختبرية القياسية ، مما يضمن التعقيم المناسب.
- لكل من المفاعل الضوئي والقوارير ، قم بتكوين مصدر الضوء على طيف الألوان المطلوب (أزرق عند 460 نانومتر ، أرجواني ، مزيج من 460 نانومتر و 630 نانومتر ل C. sorokiniana وأحمر عند 630 نانومتر ل H. pluvialis) ؛ قم بتغطية كلا النظامين لتجنب تداخل الضوء الخارجي.
ملاحظة: نظرا للتباين في الطول الموجي المنبعث من كل صمام ثنائي باعث للضوء ، تم إجراء قياس الطيف باستخدام مقياس طيف على مصادر الضوء لتحديد الطول الموجي وقوة الانبعاث لكل صمامثنائي 9. تم تحقيق الضوء الأرجواني من خلال الجمع بين مصابيح LED الحمراء والزرقاء ، مما أدى إلى أطوال موجية تبلغ 460 نانومتر مع قوة انبعاث تبلغ 1.65 واط نانومتر -1 لمصابيح LED الزرقاء و 630 نانومتر مع قوة انبعاث تبلغ 0.6 واط نانومتر -1 لمصابيح LED الحمراء. تم استخدام هذه القياسات في الاختبارات التي أجريت فقط تحت الضوء الأزرق والأحمر. - قم ببرمجة المؤقت للتناوب بين 12 ساعة من الدورات الفاتحة و 12 ساعة الظلام ل C. sorokiniana و 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات الدورات المظلمة ل H. pluvialis.
- قم بتوصيل نظام تهوية ثاني أكسيد الكربون2 بوعاء استزراع المفاعل الحيوي الضوئي لتوفير إمدادات ثاني أكسيد الكربون على فترات 12 ساعة ل C. sorokiniana.
- تلقيح وعاء الاستزراع بحجم كاف من اللقاح المسبق لتحقيق كثافة خلية بداية تبلغ 3 × 105 خلايا مل ليتر -1 أو ما يعادلها في الكثافة الضوئية (OD550 نانومتر) = 0.180.
ملاحظة: تأكد من تقنية التعقيم أثناء التلقيح لمنع التلوث. - أخذ عينات من الثقافة على فترات منتظمة من 12 ساعة ل C. sorokiniana و 8 ساعات ل H. pluvialis لمراقبة نمو الخلايا والمعلمات الفسيولوجية. جمع العينات باستخدام تقنيات معقمة للحفاظ على سلامة الثقافة.
3. القياس الكمي للكلوروفيل
ملاحظة: يتم توفير بيانات القياس الكمي الخلوي في الملف التكميلي 1.
- ضع 40 مل من العينة في أنابيب الطرد المركزي المخروطية البلاستيكية.
- جهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 15 درجة مئوية وتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب أو باستخدام ماصة باستور.
- انقل حبيبات الخلية إلى أنبوب زجاجي مغطى بورق الألمنيوم وغطاء لولبي لمنع الأكسدة.
- أعد تعليق حبيبات الخلية ب 3 مل من محلول الأسيتون النقي بنسبة 90٪ باستخدام دوامة.
- قم بتقطيع العينة المعلقة في حمام جليدي لمدة دورتين مدة كل منهما 5 دقائق واتركها ترتاح عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعةو 10.
- بعد 16 ساعة ، صوتنة مرة أخرى في ظل نفس الظروف المذكورة في الخطوة السابقة (الخطوة 3.5) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في ظل الظروف الموصوفة سابقا (الخطوة 3.2).
- افصل مستخلص الصبغة باستخدام ماصة باستور وانقله إلى أنبوب نظيف آخر محمي من الضوء.
- ضع مستخلص الصبغة في خلية كوارتز للقراءة في مقياس الطيف الضوئي عند أطوال موجية 630 نانومتر و 647 نانومتر و 664 نانومتر.
ملاحظة: قم بمعايرة مقياس الطيف الضوئي مسبقا باستخدام 90٪ من الأسيتون. - لحساب تركيزات الكلوروفيل ، استخدم المعادلات التالية11:
الكلوروفيل أ = 11.93 أ664 - 1.93 أ647
الكلوروفيل ب = 20.36 أ647 - 5.50 أ664
ملاحظة: يتم التعبير عن النتائج في ميكروغرام مل -1 من المستخلص ، والتي يتم ضربها في حجم المستخلص ومقسومة على عدد مل من العينة للحصول على تركيزات الكلوروفيل في ميكروغرام مل -1 من المزرعة. - للحصول على قيم في μg chl cell-1 ، استخدم الصيغة التالية:
ميكروغرام خلية chl -1 = ميكروغرام chl في 1 مل من الثقافة / [خلايا mL-1] تركيز الخلايا في الثقافة.
النتائج
لمراقبة كفاءة تقنية الكشف عن الاختلافات في تركيز خلايا الكلوروفيل وتقييم تأثير عوامل النمو في C. sorokiniana ، تم إنشاء تصميم تجريبي Taguchi L4 ، لتقييم إضافة حجم ثاني أكسيد الكربون2 ، ولون الضوء ، وشدة الضوء. تم تقييم كل عامل عند مستويات منخفضة وعالية ، كما هو موضح في الجدول 1 ، وفقا للشروط المحددة في التصميم التجريبي في الجدول 2.
بمجرد الانتهاء من العملية التجريبية ، أظهرت النتائج أن الجمع بين الإضافة المنخفضة لثاني أكسيد الكربون2 ، والضوء الأرجواني ، وشدة الضوء العالية (C1 ، P ، I2) المقابلة للمعالجة 2 ، زاد من نمو الميكروبات إلى 7.83 × 105 خلايا مل مل -1. من ناحية أخرى ، كان محتوى الكلوروفيل أعلى في العلاج 4 في ظل الظروف C2 ، P ، I2 ، ووصل إلى تركيز 5.92 × 10-7 ميكروغرام cel-1 عند 132 ساعة (الشكل 1) بالتزامن مع الضوء الأرجواني وشدة الضوء العالية كمستويات مثالية للعوامل في كلتا التجربتين.
في الوقت نفسه ، لوحظ سلوك مماثل عبر الخطوط الأربعة التي تم تقييمها. ومع ذلك ، لوحظ تفضيل واضح في الاختبارات التي أجريت تحت الضوء الأرجواني. يشير هذا النمط إلى أن الضوء الأرجواني قد يؤثر بشكل إيجابي على النتائج ، مما قد يعزز الظروف المثلى للنمو الخلوي أو النشاط. تؤكد هذه النتائج على أهمية النظر بعناية في ظروف الإضاءة في التجارب البيولوجية.
من التحليل الإحصائي ، تم الحصول على مخطط التأثيرات الرئيسية. في الشكل 2 ، يمكن ملاحظة كيف يؤثر كل مستوى من العوامل المقيمة على إنتاج الكلوروفيل في C. sorokiniana. كانت أفضل الظروف لإنتاج الكلوروفيل هي الإضافة العالية لثاني أكسيد الكربون2 ، والضوء الأرجواني ، وشدة الضوء العالية (C2 ، P ، I2) ، حيث يظهر تركيز اللون وثاني أكسيد الكربون قيم أهمية قريبة جدا ، وفي الوقت نفسه تظهر شدة الضوء تأثيرا أقل دلالة إحصائية على متغيرات الاستجابة المقيمة.
بالإضافة إلى ذلك ، تم إنشاء مخطط تباين (الشكل 3) ، يوضح سلوك تركيز الكلوروفيل الخلوي وفقا لتأثيرإضافة حجم ثاني أكسيد الكربون 2 ولون الضوء الذي تعرضوا له.
لوحظ أن الضوء الأرجواني (مزيج من الضوء الأزرق والأحمر) وشدة الضوء العالية تعزز بشكل كبير نمو الميكروبات وإنتاج الكلوروفيل. وفي الوقت نفسه ، فإن الإضافة العالية لثاني أكسيد الكربون2 تؤثر على كل من المعلمات بشكل إيجابي وسلبي ، على التوالي ، حيث تزيد من تركيز خلايا الكلوروفيل إلى الحد الأقصى أثناء التجربة ولكنها تعيق نمو الميكروبات. ومع ذلك ، من الملاحظ أنه تحت الضوء الأرجواني ، فإن إضافة حجم ثاني أكسيد الكربون2 من نبضات 20 ثانية من ثاني أكسيد الكربون2 كل 12 ساعة بمعدل تدفق 8.5 قدم مكعب ساعة -1 تسمح باستجابة إيجابية لكلتا المعلمتين.
للتحقق من صحة الطريقة والنتائج التي تم الحصول عليها من C. sorokiniana ، تم إجراء اختبار تأكيد على مستوى القارورة على H. pluvialis تحت الضوء الأحمر نظرا لخصائصه الطبيعية المتمثلة في تحلل الكلوروفيل لتصنيع الأستازانتين في ظل ظروف الإجهاد ، والتي تم إحداثها عند 168 ساعة عن طريق زيادة ملوحة الوسط. تم إنشاء رسم بياني للتركيز (الشكل 4) حيث تم الحصول على الحد الأقصى لتركيز الكلوروفيل عند 0 ساعة مع 1.41 × 10-7 ميكروغرام سل-1. في هذه الحالة ، بسبب سلوك الطحالب الدقيقة الطبيعية ، لوحظ انخفاض في تركيز الكلوروفيل ، مما يشير إلى تغيرات فسيولوجية محتملة في النموذج البيولوجي قيد الدراسة. يتضح هذا بشكل أكبر في الشكل 5 ، والذي يوضح صورة مجهرية ل C. sorokiniana (الشكل 5 أ) واثنين من الرسوم المجهرية ل H. pluvialis: أحدهما في المرحلة الخضراء (الشكل 5 ب) والآخر في مرحلة التغيير وإنتاج الأستازانتين (الشكل 5 ج). ومن المثير للاهتمام ، على الرغم من هذا الانخفاض ، أنه لم يحدث أي تدخل من وجود مركبات الكاروتينويد ، والتي بدورها أصباغ قابلة للذوبان في الدهون موجودة فيها. هذا دليل قوي على انتقائية وقابلية التكاثر لهذه التقنية في الطحالب الدقيقة ذات القدرات والسلوكيات المتنوعة.
يصور الرسم البياني انخفاضا في إجمالي تركيز الكلوروفيل طوال التجربة. والجدير بالذكر أن هناك زيادة في الكلوروفيل أ مقارنة بالكلوروفيل ب عند 50 ساعة ، حيث ينخفض تركيز الكلوروفيل ب بشكل كبير. يحدث أكبر انخفاض في تركيز الكلوروفيل في نهاية مرحلة النمو الأسي. يعزى هذا الانخفاض إلى إنتاج الكاروتينات في H. pluvialis.
وبالمثل ، تم إجراء تحليل تركيبة الكلوروفيل أ و ب للمعالجة بأعلى إنتاج ل C. sorokiniana (C1 ، P ، I2) في الشكل 6. على عكس H. pluvialis ، أظهر إنتاج الكلوروفيل زيادة ثابتة طوال فترة التجربة بأكملها ، والتي تم تحليلها فقط خلال المرحلة الأسية. لوحظ أنه على غرار H. pluvialis ، يوجد الكلوروفيل أ في البداية بنسب أقل من الكلوروفيل ب في بداية التجربة. ومع ذلك ، فإن هذه النسب تخضع لتحول ملحوظ عند علامة 50 ساعة ، حيث يظهر الكلوروفيل أ معدل إنتاج أعلى من الكلوروفيل ب بعد ذلك.
أثبتت التقنية التحليلية المستخدمة في هذه الدراسة أنها فعالة في اكتشاف التغيرات داخل النموذج البيولوجي وعبر النماذج البيولوجية المختلفة. تؤكد هذه النتائج على حساسية ودقة الطريقة التحليلية ، مما يسمح بفهم دقيق لديناميكيات الكلوروفيل داخل الأنظمة البيولوجية وفيما بينها. هذه الأفكار لا تقدر بثمن لكشف الآليات المعقدة التي تحكم تخليق الأصباغ والتمثيل الغذائي ، مما يمهد الطريق لمزيد من التقدم في البحوث البيئية والتكنولوجيا الحيوية.
الشكل 1: المحتوى الخلوي للكلوروفيل تحت معالجات التصميم التجريبي. تم قياس المحتوى الخلوي للكلوروفيل في Chlorella sorokiniana عبر العلاجات التجريبية المختلفة. البيانات المعروضة كانحراف معياري ل n = 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط التأثيرات الرئيسية لمحتوى الكلوروفيل الخلوي. مخطط التأثيرات الرئيسية الذي يوضح تأثير العلاجات المختلفة على محتوى الكلوروفيل الخلوي في Chlorella sorokiniana. البيانات المعروضة كانحراف معياري ل n = 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مخطط كفافي لتركيز الكلوروفيل الخلوي. مخطط كفافي يوضح العلاقة بين تركيز الكلوروفيل الخلوي وتركيز ثاني أكسيد الكربون2 واللون الفاتح. يتم تمثيل اللون الفاتح بالمحور 1 باللون الأزرق والمحور 2 باللون الأرجواني ، مع مستويات وسيطة تشير إلى إضافة الضوء الأحمر. البيانات المعروضة كانحراف معياري ل n = 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تركيز الكلوروفيل أثناء حركية نمو H. pluvialis . تم قياس تركيز الكلوروفيل على حركية نمو المكورات الدموية الجناغية. البيانات المعروضة كانحراف معياري ل n = 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور مجهرية ل C. sorokiniana و H. pluvialis. صور مجهرية ل Chlorella sorokiniana (A) و Haematococcus pluvialis ، توضح عينة واحدة في المرحلة الخضراء (B) وأخرى في المرحلة الحمراء المبكرة (C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تركيز الكلوروفيل أثناء حركية نمو C. sorokiniana . تم قياس تركيز الكلوروفيل على حركية نمو Chlorella sorokiniana. البيانات المعروضة كانحراف معياري ل n = 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عامل | مستوى منخفض | مستوى عال |
| إضافة ثاني أكسيد الكربون2 (لتر) | ج1 | ج2 |
| لون فاتح | أزرق (م) | بنفسجي (ع) |
| شدة الضوء (لوكس) | أنا1 | أنا2 |
الجدول 1: عوامل ومستويات الحركية. نظرة عامة على العوامل الحركية ومستويات كل منها: C1 = 0.078 L; ج2 = 0.15 لتر ؛ ب = الضوء الأزرق. P = ضوء أرجواني. أنا1 = 550 لوكس. أنا2 = 1200 لوكس.
| العلاج | إضافة ثاني أكسيد الكربون2 | لون فاتح | شدة الضوء (لوكس) |
| (ل) | |||
| 1 | ج1 | B | أنا1 |
| 2 | ج1 | P | أنا2 |
| 3 | ج2 | B | أنا1 |
| 4 | ج2 | P | أنا2 |
الجدول 2: التصميم التجريبي والمعالجات. ملخص التصميم التجريبي والمعالجات المطبقة: C1 = 0.078 L; ج2 = 0.15 لتر ؛ ب = الضوء الأزرق. P = ضوء أرجواني. أنا1 = 550 لوكس. أنا2 = 1200 لوكس.
الملف التكميلي 1: بيانات القياس الكمي الخلوي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
المناقشة
كشفت الدراسة المقارنة بين H. pluvialis و C. sorokiniana عن اختلافات كبيرة في ديناميات إنتاج الكلوروفيل. بينما أظهر H. pluvialis انخفاضا في تركيز الكلوروفيل طوال التجربة ، C. sorokiniana أظهر زيادة مطردة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك في البداية نسبة أقل من الكلوروفيل أ في كلا النوعين ، لكن هذه النسبة انعكست في ظروف نمو معينة ، مما قد يعطي مؤشرات على تحريض إنتاج الكلوروفيل المذكور من خلال الانتقائية أو التعرض لأطوال موجية معينة. تشير هذه النتائج إلى استجابة فريدة لكل نوع للظروف التجريبية ، مما يسلط الضوء على حساسية التقنية التحليلية المستخدمة للكشف عن التغيرات داخل النماذج البيولوجية وفيما بينها. توفر القدرة على تمييز التغيرات الطفيفة في نسب الكلوروفيل أ و ب رؤى جديدة حول تنظيم تخليق الصبغة في الطحالب الدقيقة ، والتي قد يكون لها آثار كبيرة في مجالات مثل التكنولوجيا الحيوية والبحوث البيئية.
يعد الكشف عن فترات زيادة إنتاج الكلوروفيل أمرا بالغ الأهمية نظرا لدوره كصبغة أساسية في عملية التمثيل الضوئي. الكلوروفيل أ ضروري لالتقاط الطاقة الضوئية وتحويلها إلى طاقة كيميائية ، والتي تستخدم بعد ذلك لدفع النمو الخلوي والتمثيل الغذائي. لذلك ، تشير الزيادة في إنتاج الكلوروفيل أ إلى تعزيز قدرة التمثيل الضوئي للكائنات الحية ، مما يشير إلى الظروف المثلى للنمو الميكروبي12 ؛ هذا يدعم الملاحظة في C. sorokiniana أن الاختبارات التي ولدت تركيزا أعلى من الكلوروفيل كانت تلك التي تم فيها الحصول على نمو أكبر للخلايا ، مما يوفر رؤى قيمة حول الوقت الذي تكون فيه الظروف البيئية أكثر ملاءمة لتطوير وانتشار الكائنات الحية الدقيقة الضوئية.
على وجه الخصوص ، فإن فهم نسب الكلوروفيل في H. pluvialis مثير للاهتمام بشكل خاص لأنها يمكن أن توفر إشارات مهمة فيما يتعلق بحالة إجهاد الطحالب الدقيقة. عندما تصبح الظروف غير مواتية ، مثل الإضاءة العالية أو الحرمان من المغذيات ، قد تقلل الطحالب الدقيقة من إنتاج الكلوروفيل وبدلا من ذلك تصنع أصباغ الكاروتينويد مثل أستازانتين11. هذا الانتقال من مراحل النمو الأخضر ، التي تتميز بتركيزات عالية من الكلوروفيل ، إلى المراحل الغنية بالإجهاد الأستازانتين مفيد لتعظيم غلة الأستازانتين. ويؤكد على أهمية مراقبة مستويات الكلوروفيل كبديل للاستجابة للإجهاد وديناميكيات إنتاج الصبغة في زراعة H. pluvialis .
علاوة على ذلك ، في حين أن قيود هذه التقنية قليلة بسبب انتقائيتها العالية ، فإن الاحتياطات مثل إبقاء المستخلصات بعيدا عن الضوء لمنع الأكسدة والتعامل مع عينات الطرد المركزي بعناية للتخلص من التعكر من بقايا الكتلة الحيوية ضرورية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عيب الطريقة هو الحاجة إلى أحجام عينات كبيرة نسبيا ، خاصة بالنسبة للوسائط المخففة أو الدراسات الحركية طويلة الأجل على مستوى القارورة ، والتي يمكن أن تشكل تحديات لوجستية. تسلط هذه الاعتبارات الضوء على أهمية التصميم التجريبي الدقيق ومعالجة العينات لتعظيم فعالية تقنيات تحليل الكلوروفيل في أبحاث الطحالب الدقيقة.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يقر المؤلفون بامتنان بالتمويل الجزئي من TecNM بموجب دعوة البحث العلمي والتطوير التكنولوجي والابتكار (16898.23-P) لمعهد Tecnologicos Federales. كما أنهم يقدرون الدعم المقدم من معهد العلوم والتكنولوجيا والابتكار في إستادو ميتشواكان دي أوكامبو (FCCHTI23_ME-4.1.-0001).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| C3< / sub>H6< / sub>O | Meyer | 67-64-1 | الأسيتون 90٪ |
| 15 مل أنبوب | Biologix | 10-9502 | أنبوب |
| الاختبار 2510-DTH | برانسون | D-73595 | Sonicator |
| 5 مل أنبوب اختبار غطاء لولبي | Kimax | 45066-13100 | أنبوب اختبار |
| 50 مل أنبوب الطرد المركزي | Biologix | 10-9151 | اختبار |
| رقائق الألومنيوم | رينولدز | 611 القياسية ، 12 "× 1000 قدم | غطاء أنبوب الاختبار |
| CaCl2 | Meyer | 0925-250 | مركزي لكلوريد الكالسيوم |
| Dynamica | 14 R | الطرد المركزي المبرد | |
| CoCl 2< / sub> | Merck | 1057-100 | ثنائي كلوريد الكوبالت |
| FeCl 3 < / sub> | Merck | 157740 | كلوريد الحديد (III) |
| K2< / sub>HPO4< / sub> | Meyer | 2051-250 | ثنائي البوتاسيوم فوسفات |
| KH2< / sub>PO4 | Meyer | 2055-250 | فوسفات أحادي البوتاسيوم |
| MgSO4 | Meyer | 1605-250 | كبريتات المغنيسيوم |
| LabNet | نموذج بيتا | بيت ماصة دقيقة | |
| MnCl2 | Merck | 429449 | المنغنيز (II) كلوريد |
| Na2 EDTA | ميرك | 200-449-4 | Edatamil ، Edetato ملح ثنائي الصوديوم ثنائي هيدرات |
| Na2< / sub>MoO4< / sub> | Merck | 243655 | موليبدات الصوديوم |
| NaCl | Meyer | 2365-500 | كلوريد الصوديوم |
| NaNO 3< / sub> | Meyer | 2465-250 | نترات الصوديوم |
| RGB شريط LED | صارم | GAD-LED2 | ضوء المصدر |
| مقياس الطيف | PerkinElmer | Model Lambda35 | مقياس الطيف |
| Gigahertz-Optik | نموذج BTS256 | ||
| Vortex | Scientific Industries | Vortex-Genie & reg; 2 | Vortex |
| ZnCl2< / sub> | Merck | 208086 | كلوريد الزنك |
المراجع
- Ramírez, M. E., Rendón, L., Veléz, Y. Microalgas para la industria alimenticia. , 1ra edición, Universidad Pontífica Bolivariana. http://hdl.handle.net/20.500.11912/2306 (2013).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: Current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microb Cell Fact. 17 (1), 36(2018).
- Otero-Paternina, A. S. M., Cruz-Casallas, P. Effect of the hydrocarbon phenanthrene on Chlorella vulgaris (Chlorellaceae) growth. Acta Biol Col. 18 (1), 87-98 (2013).
- Pancha, I., et al. Salinity-induced oxidative stress enhanced the biofuel production potential of microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077. Bioresour Techno. 189, 341-348 (2015).
- Ortiz, M. L., Cortés, C. E., Sánchez, J., Padilla, J., Otero, A. M. Evaluating microalgae Chlorella sorokiniana growth in different culture mediums in autotrophic and mixotrophic conditions. Orinoquia. 16 (1), 11-20 (2012).
- Camacho Kurmen, J. E., González, G., Klotz, B. Astaxanthin production in Haematococcus pluvialis under different stress conditions. Nova. 11 (19), 94-104 (2013).
- Pérez Zambrano, E., Ayala Agudelo, Y. Production of chlorophyll and astaxanthin from Haematococcus pluvialis under nitrogen deficiency stress in a 5-liter Biostat Aplus bioreactor. , Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/2735 (2019).
- Bischoff, H. W., Bold, H. C. Phycological studies IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. University of Texas. 6318, 95(1963).
- Cerezo, R. LED characterization through the use and programming of a spectrometer. Universidad Politécnica de. 22323, (2013).
- Arredondo, B. O. Analytical methods and tools for microalgal biomass evaluation. , CIBNOR. México. http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/1403 (2017).
- Couso, I., Vila, M., Vigara, J., Cordero, B. F., Vargas, M. Á Synthesis of carotenoids and regulation of the carotenoid biosynthesis pathway in response to high light stress in the unicellular microalga Chlamydomonas reinhardtii. Eur J Phycol. 47 (3), 223-232 (2012).
- Vera-López, F., Martínez, A. Pigments in microalgae: Functions, applications, and overproduction techniques. BioTechnology. 25 (5), 35-51 (2021).
إعادة الطباعة والأذونات
