التحليل الكهربائي للنسخ المتماثل من خلال تكرارات الحمض النووي المعرضة للبنية داخل episome البشري القائم على SV40

Summary

هنا ، نحدد إجراء تحليل تطور النسخ المتماثل من خلال التكرارات المسببة للأمراض والمعرضة للهيكل باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد.

Abstract

ظهر الرحلان الكهربائي الهلامي المحايد / المحايد ثنائي الأبعاد (2DGE) كتقنية معيارية لتحليل تكرار الحمض النووي من خلال العوائق الطبيعية. يصف هذا البروتوكول كيفية تحليل تطور شوكة النسخ المتماثل من خلال تكرارات الحمض النووي المعرضة للهيكل والقابلة للتوسيع داخل episome القائم على فيروس simian 40 (SV40) في الخلايا البشرية. باختصار ، عند تعداء البلازميد إلى الخلايا البشرية ، يتم عزل المواد الوسيطة للنسخ المتماثل بواسطة بروتوكول هيرت المعدل ومعالجتها بإنزيم تقييد DpnI لإزالة الحمض النووي غير المكرر. ثم يتم هضم المواد الوسيطة بواسطة إنزيمات التقييد المناسبة لوضع تكرار الاهتمام داخل النصف الأصلي البعيد لجزء من الحمض النووي بطول 3-5 كيلو بايت. يتم فصل وسيطات النسخ المتماثل إلى بعدين متعامدين ، أولا حسب الحجم ثم حسب الشكل. بعد تهجين اللطخة الجنوبية ، يسمح هذا النهج للباحثين بملاحظة توقف الشوكة عند تكرارات مختلفة لتشكيل الهيكل على النصف التنازلي من النسخ المتماثل Y-arc. علاوة على ذلك ، يسمح هذا الوضع لموقع المماطلة بتصور النتائج المختلفة لتوقف الشوكة بوساطة متكررة ، مثل انعكاس الشوكة ، وظهور شوكة متقاربة ، وإعادة تشغيل الشوكة لإعادة التركيب.

Introduction

التكرارات الترادفية القصيرة (STR) هي صغيرة ، عادة ما تكون من 2-9 أزواج أساسية (bp) ، وهي تسلسلات متكررة من الحمض النووي تشكل حوالي 3٪ من الجينوم البشري¹. تلعب STR دورا مهما في تنظيم الجينات². ومع ذلك ، فإن تكوينها المتكرر يجعلها عرضة لتكوين بنية ثانوية للحمض النووي غير المتعارف عليها وعدم الاستقرار الجيني اللاحق^3،4. من الحلزونات اليسرى إلى دبابيس الشعر / الصليبيات ، إلى الحلزونات ثلاثية وأربعة تقطعت بهم السبل ، تسبب هياكل الحمض النووي البديلة هذه تحديات جوهرية للرد. الشرط الأساسي الطبيعي لتكوين الهيكل الثانوي هو فك الحمض النووي ، وهو شرط أساسي لتكرار الحمض النووي. يمثل هذا لغزا فريدا لعمل الجينوم حيث يمكن أن تتشكل العديد من هذه الهياكل أثناء النسخ المتماثل ، مما يعيق التقدم المتكرر ويتسبب في النهاية في توقف شوكة النسخ المتماثل^5،6،7 ، أو في الحالات الشديدة ، انهيار الشوكة وكسر الحمض النووي^8،9. ثبت أن إعادة تشغيل الشوكات المتوقفة ومسارات إصلاح الحمض النووي تؤدي إلى تكرار عدم الاستقرار ، مثل التوسعات المتكررة^10،11 وإعادة ترتيب الجينوم المعقدة (CGR) ^12،13. يمكن أن تؤدي هذه الأحداث إلى تطور ما يقرب من 60 مرضا بشريا تعرف باسم اضطرابات التمدد المتكرر ، بما في ذلك متلازمة X الهشة ، ومرض هنتنغتون ، ورنح فريدريش ، وغيرها^14،15 بالإضافة إلى أمراض CGR ، مثل متلازمة إيمانويل¹⁶. لذلك ، لفهم آليات المرض البشري التي يحركها عدم الاستقرار المتكرر بشكل أفضل ، من الضروري دراسة تفاصيل تقدم شوكة النسخ المتماثل من خلال تلك التكرارات.

ظهرت تقنية لدراسة تقدم النسخ المتماثل في منتصف الثمانينيات عندما سعى بروير وفانجمان إلى تقديم دليل مباشر على أن بدء النسخ المتماثل في خميرة الخميرة يحدث في تسلسل النسخ المتماثل المستقل (المعروف باسم ARS) عناصر¹⁷. من خلال القيام بذلك ، قاموا بفصل هياكل وسيطات تكاثر الخميرة في الاغاروز ، وتكييف طريقة سابقة من Bell and Byers تعرف باسم الرحلان الكهربائي الهلامي المحايد / المحايد ثنائي الأبعاد (2DGE) ¹⁸. استخدمت هذه التقنية حقيقة أن الحمض النووي غير الخطي ينتقل بشكل مختلف في هلام الاغاروز عن ما يعادله الخطي من نفس الكتلة. وبشكل أكثر تحديدا ، في 2DGE ، يتم فصل الحمض النووي المعزول في بعدين متعامدين ، أولا حسب الحجم أولا ثم بشكل أساسي حسب الشكل ، لإنشاء خريطة شاملة للنسخ المتماثل في منطقة معينة ذات أهمية. في ورقتهم الأصلية ، أظهر بروير وفانغمان هذا على أنه قوس يتكون من هياكل "Y بسيطة" أو شوكات النسخ المتماثل التي تربط الحمض النووي غير المكرر بنظرائهم المكررين. يصفون أيضا الوسيطات الأخرى المرصودة بأنها "فقاعات" و "Ys مزدوجة" ، تمثل أصول النسخ المتماثل والشوكات المتقاربة ، على التوالي.

يمكن استخدام 2DGE لدراسة المجموعات النسبية لوسيطات تكرار الحمض النووي في وقت معين. لذلك ، إذا كانت مجموعة واحدة من الوسطاء أكثر انتشارا من أخرى ، فسيكون هذا واضحا عند التصور. هذا يجعل 2DGE أداة مفيدة بشكل خاص لدراسة تقدم النسخ المتماثل من خلال التسلسلات الصعبة ، مثل تكرارات تشكيل الهيكل. على سبيل المثال ، إذا كانت المنطقة التي تم تحليلها تحتوي على تسلسل قادر على إحداث توقف شوكة النسخ المتماثل ، فسيظهر هذا على شكل انتفاخ على القوس (الشكل 1 أ) ، مما يشير إلى تراكم شوكات النسخ المتماثل في هذا الموضع. يمكن ملاحظة ذلك من خلال تكرار كل من تسلسل التكرار لتشكيل دبوس الشعر في الخميرة^19،20،21 والتكرارات المكونة للثلاثية في الخلايا البشرية^22،23،24. بالإضافة إلى التوقف ، يمكن استخدام 2DGE لمراقبة هياكل الحمض النووي التي لا تتوافق مع Ys البسيط القياسي الذي تم تشكيله أثناء النسخ المتماثل ، كما في حالة المواد الوسيطة المؤتلفة²⁵. هذه المواد الوسيطة لها هيكل أثقل وأكثر تشعبا على شكل X ، وبالتالي ، تسافر بشكل أبطأ في كل من البعدين الأول والثاني من شوكات النسخ المتماثل القياسية. يمكن أيضا ملاحظة نتائج مماثلة فيما يتعلق بانعكاس شوكة النسخ^{المتماثل 20،24،26}. استجابة لإجهاد النسخ المتماثل القوي ، ثبت أن الخلايا حقيقية النواة تستخدم انعكاس شوكة النسخ المتماثل لإنقاذ الشوكات المتوقفة. هذه الشوكات المعكوسة لها وزن جزيئي مماثل للشوكات المتوقفة. ومع ذلك ، فإن هيكل قدم الدجاج ينتج عنه حركة كهربائية أبطأ في البعد الثاني بالنسبة إلى المكملات على شكل حرف Y ، مما يؤدي إلى امتداد لأعلى وخارج القوس.

الشكل 1: تحليل الرحلان الكهربائي للهلام 2D لتكرار الحمض النووي. (أ) تخطيطي لنموذج 2DGE يصور النسخ المتماثل من خلال تكرار تشكيل الهيكل القادر على إحداث توقف الشوكة. الحجم والهيكل المتوسط سيؤثران على الحركة الكهربية. (ب) عينة من القوس Y مع أذرع صاعدة وهابطة على التوالي. الاختصار: 2DGE = رحلان كهربائي هلامي محايد / محايد ثنائي الأبعاد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بطبيعة الحال ، يتعلق أحد أهم جوانب 2DGE بجودة وكمية المواد الوسيطة للنسخ المتماثل. ومع ذلك ، فإن دقة تحليل 2DGE للنسخ المتماثل من خلال المواقع الداخلية في خلايا الثدييات غير كافية لتسلسل هدف نسخة واحدة داخل الجينوم البشري ثنائي الصبغيات 6 × 10⁹ نقطة أساس ، على الرغم من أنه تم إجراؤه للجينات متعددة النسخ ، مثل موضع DHFR المضخم^{بشكل كبير 27} أو الحمض النووي الريبي^{الريبوسومي 28}. يعد النسخ المتماثل المستند إلى SV40 وسيلة فعالة وجيدة التميز لدراسة النسخ المتماثل في الخلايا حقيقية النواة²⁹. إنه يوفر نموذجا موثوقا به للتكرار حقيقيات النواة الذي يستخدم معظم آلية المضيف لتكرار الجينوم الفيروسي ، والذي يتم تقسيمه في نيوكليوسومات عند الإصابة^30،31. هناك استثناءان ملحوظان من ثدييات الثدييات هما أن مستضد T (Tag) ، بدلا من مركب CMG المضيف ، يعمل كهليكاز DNA متماثل ، ودلتا بوليميراز الحمض النووي تصنع خيوط الحمض النووي الرائدة والمتأخرة³². لقد استفدنا من هذا النظام من خلال وضع امتدادات مسببة للأمراض من تكرارات تشكيل الهيكل في اتجاه مجرى النهر من أصل SV40 للنسخ المتماثل داخل البلازميد الذي تم إنشاؤه في الأصل في مختبر ماسيمو^{لوبيز 22}. الأهم من ذلك ، أن هذا البلازميد يحتوي أيضا على ترميز الجين ل Tag نفسه ، مما يؤدي إلى تكراره التأسيسي والقوي للغاية عند التعدي إلى مجموعة متنوعة من الخلايا البشرية المستنبتة. تؤدي هذه الميزة إلى ظهور كمية كبيرة من المنتجات ، وهي مثالية لتحليل 2DGE للمواد الوسيطة التي تشكلت أثناء واستجابة لتكرار التكرارات المسببة للأمراض في الخلايا البشرية. هنا ، نصف طريقة مفصلة لتصور تكرار تكرارات تشكيل الهيكل داخل episome البشري القائم على SV40 باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد.

Protocol

ملاحظة: يجب أن يحتوي البلازميد المصمم لتحليل 2DGE الموضح في خلايا الثدييات على أصل SV40 للنسخ المتماثل عدة كيلو بايت من التكرارات المعرضة للهيكل (الشكل 2). يجب أن يؤخذ في الاعتبار التوليف الرائد والمتأخر عند اختيار الاتجاه بالنسبة إلى الأصل الذي يجب استنساخ التكرارات في البلازميد.

الشكل 2: هضم البلازميد المحتوي على تكرار لتحليل 2DGE. يتم تصوير التكرارات المعرضة للهيكل بعدة كيلو بايت في اتجاه مجرى النهر من شوكة النسخ المتماثل المتحركة لليمين. سيضع الهضم باستخدام القواطع الفريدة 1 و 2 تسلسل التكرار على الذراع الهابط للقوس Y ، بالنظر إلى التسلسل الذي يتجاوز نقطة منتصف الطريق للجزء المهضوم. الاختصار: 2DGE = رحلان كهربائي هلامي محايد / محايد ثنائي الأبعاد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. تعداء البلازميد إلى خلايا الثدييات

1. قم بزرع 600,000 خلية HEK293T في صفيحة زراعة الأنسجة مقاس 10 سم قبل التعدي. اسمح للخلايا بالتعافي عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: يمكن استخدام العديد من خطوط الخلايا لهذه التجربة، على الرغم من أن الخلايا التي تحتوي على علامة SV40 موصى بها للحصول على أفضل النتائج. تنبيه: تعتبر الخلايا HEK293T BSL-2 ويجب تنفيذ جميع أعمال الاستزراع في خزانة السلامة الحيوية باستخدام تقنية التعقيم المناسبة ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة.
2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 60٪ ، قم بنقل 8 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد المحتوي على التكرار في الخلايا المصنفة باستخدام كواشف التعداء المناسبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
3. إذا لم يتم عزل المواد الوسيطة في هذه المرحلة الزمنية ، فقم بشفط الوسائط القديمة واستبدلها ب 10 مل من الوسائط الجديدة بعد 24 ساعة.
4. ابدأ في جمع الخلايا 24-48 ساعة بعد التعدي.
   1. قم بشفط الوسائط وغسلها بعناية باستخدام 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). افصل الخلايا واجمعها باستخدام 0.5 مل من التربسين وقم بتدويرها عند 340 × جم لمدة 4 دقائق.
   2. استنشق المادة الطافية واغسل كريات الخلية باستخدام PBS. قم بالدوران مرة أخرى عند 340 × جم لمدة 4 دقائق واستنشق المادة الطافية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا عن طريق تجميد كريات الخلايا عند -80 درجة مئوية. لقد وجدنا أفضل دقة عزل النسخ المتماثل الوسيط 48 ساعة بعد التعدي. ومع ذلك ، فقد أسفرت 24 ساعة عن نتائج قابلة للتطبيق.

2. عزل المواد الوسيطة للنسخ المتماثل

1. أعد تعليق الخلايا في 1.5 مل من محلول تحلل هيرت المعدل [10 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 10 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)] في 50 مل من الأنابيب المخروطية وابدأ تحلل الخلايا.
   1. أضف كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى التركيز النهائي بنسبة 0.6٪ (حوالي 650 ميكرولتر من المخزون 2٪ SDS) والبروتيناز K إلى التركيز النهائي البالغ 100 ميكروغرام / مل (حوالي 10 ميكرولتر من المخزون 20 مجم / مل بروتيناز K) لإزالة نوكليازات.
   2. تخلط برفق عن طريق سحب العينات حتى تصبح متجانسة وتحتضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة على الأقل.
2. قم بزيادة تركيز كلوريد الصوديوم إلى 1 متر (حوالي 540 ميكرولتر من المرق 5 م كلوريد الصوديوم) واخلطه برفق حتى يتجانس. احتضن طوال الليل (18-24 ساعة) عند 4 درجات مئوية للسماح بهطول بقايا الخلية والحمض النووي الريبي والبروتين عن طريق التمليح.
   ملاحظة: سيكون الخليط شديد اللزوجة ، لذا توخ الحذر والتحلي بالصبر أثناء الخلط جيدا.
3. في اليوم التالي ، افصل الحمض النووي عن بقايا الخلية والحمض النووي الريبي والبروتين.
   1. الطرد المركزي الخليط على حرارة 29,500 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   2. انقل المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي ، وأضف حجما واحدا من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل 25:24: 1 (v / v) ، واخلطه لفترة وجيزة حتى يتجانس.
      تنبيه: الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل مادة خطرة ويجب التعامل معها باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة في غطاء الدخان الكيميائي.
   3. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 15,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل الطبقة المائية إلى أنبوب مخروطي جديد.
4. تسريع وغسل الحمض النووي المعزول.
   1. أضف حجما واحدا من الأيزوبروبانول النقي واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقل. قم بتدوير الحمض النووي عند 15,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   2. صب المادة الطافية واغسل الحبيبات بالإيثانول البارد 70٪ لإزالة الملح الزائد.
   3. قم بالدوران مرة أخرى عند 15,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وجفف في الهواء ، وأعد تعليق الحبيبات برفق في المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) (10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملي EDTA).
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا ، ويمكن تجميد العينات عند -20 درجة مئوية ؛ ومع ذلك ، يجب تجنب دورة التجميد / الذوبان لأن هذا يمكن أن يقلل من جودة المواد الوسيطة لتكرار الحمض النووي.

3. إعداد العينة والرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد

1. استيعاب المواد الوسيطة المعزولة لتكرار البلازميد.
   1. أضف 100 وحدة من إنزيمات التقييد المناسبة إلى العينة لهضم الحمض النووي البلازميد ، ووضع التسلسل المحتوي على التكرار على وجه التحديد على النصف الأصلي البعيد من الجزء الخطي (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، أضف DpnI لقطع الحمض النووي الميثيلي ، وبالتالي إزالة أي حمض نووي بلازميد لم يتم تكراره بالكامل في الخلايا البشرية المستنبتة.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن تكون إنزيمات التقييد عبارة عن قواطع فريدة تنتج جزءا من 3-5 كيلو بايت يضع التسلسل المعرض للهيكل على الذراع الهابط للقوس Y.
   2. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 6-10 ساعات للسماح بهضم البلازميد الكامل.
   3. قم بترسيب الحمض النووي إما ب 2.5 حجم من الإيثانول النقي البارد واحتضانه عند -20 درجة مئوية طوال الليل ، أو أضف حجما واحدا من الأيزوبروبانول واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   4. الطرد المركزي العينات المهضومة والمترسبة عند 15,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   5. صب المادة الطافية وغسل العينة بالإيثانول البارد 70٪. تدور مرة أخرى عند 15,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   6. صب المادة الطافية ، وجففها في الهواء لمدة 10 دقائق ، وأعد تعليق العينات في 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.
2. تحضير جل الاغاروز ذو البعد الأول بنسبة 0.4-0.5٪ في 1x Tris-borate-EDTA (TBE) (89 ملي ملي قاعدة تريس ، 89 ملي حمض البوريك ، 2 ملي EDTA). اترك المحلول يتماسك لمدة 1 ساعة على الأقل.
3. ابدأ في تحميل العينات في البعد الأول.
   1. قم بتحميل السلم في أول 3 سم بالنسبة إلى الحافة الموجودة في أقصى يسار الجل. بعد ذلك ، قم بتحميل العينات المحضرة بالكامل ، مع ضمان 3 سم بين كل زوج.
   2. قم بتشغيل الجل في 1x TBE لمدة 19-24 ساعة عند 0.85 فولت / سم لفصل المواد الوسيطة فيما يتعلق بحجمها. تأكد من تغطية الغرفة لحماية العينات من الضوء ، مما قد يتسبب في تلف الحمض النووي.
4. في اليوم التالي ، قم بإزالة الجل من المخزن المؤقت وتقدير موقع الجزء الخطي المهضوم باستخدام المسطرة.
   1. استئصال أول 3 سم من الجل الذي يحتوي على السلم وصمة عار الجزء الجل في 1x TBE يحتوي على 0.3 ميكروغرام / مل من بروميد الإيثيديوم لمدة 10-15 دقيقة. تصور السلم باستخدام نظام توثيق الجل.
   2. أضف 1.3 سم إلى الموقع المقدر ، مما ينتج عنه القيمة أ. ثم اطرح 7.5 سم من القيمة أ ، مما ينتج عنه القيمة ب. قم بمحاذاة المسطرة مقابل جل البعد الأول وقم بقصها أفقيا عند القيمتين a و b. ثم قم بقص المساحة البالغة 3 سم عموديا المخصصة لكل عينة. راجع الشكل 3 للحصول على مخطط مرئي.
   3. في صينية صب جديدة ، قم بتدوير الأجزاء في اتجاه عقارب الساعة وضعها في موضع آبار العينة (الشكل 3).
5. تحضير هلام الاغاروز ذو البعد الثاني بتركيز 1-1.3٪ في 1x TBE عند 0.3 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم.
   1. عند التبريد إلى حوالي 55 درجة مئوية ، اسكب جل البعد الثاني فوق أجزاء البعد الأول المستديرة واتركه يتجمد لمدة 1 ساعة على الأقل.
   2. انقل البعد الثاني إلى غرفة بها 1x TBE عند 0.3 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم ، واترك الجل يتوازن لمدة 30 دقيقة على الأقل.
   3. قم بتشغيل الجل ، مغطى مرة أخرى ، لمدة 9-10 ساعات عند 4.23 فولت / سم عند 4 درجات مئوية لفصل المواد الوسيطة فيما يتعلق بشكلها.

الشكل 3: استئصال المواد الوسيطة من البعد الأول قبل فصل البعد الثاني. بعد تصور السلم ، يمكن تقدير حركة الأجزاء غير المكررة. (ط) يمكن بعد ذلك استخدام هذه القيمة لتحديد مواقع القطع المناسبة (أ و ب) لاستئصالها ونظيراتها المنسوخة (ثانيا). يجب بعد ذلك تدوير قسم الجل ووضعه في موضع الآبار لفصل البعد الثاني. الاختصار: CW = في اتجاه عقارب الساعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. النشاف الجنوبي والتهجين مع مسبار ذو علامات راديوية

1. قم بإزالة جل البعد الثاني من الغرفة وقم بتنقية شظايا الحمض النووي لمدة 10 دقائق في محلول 0.24 M HCl مع هزاز لطيف. اشطف الجل بالماء منزوع الأيونات وانقعه في 0.4 متر هيدروكسيد الصوديوم لمدة 10-15 دقيقة.
   تنبيه: حمض الهيدروكلوريك وهيدروكسيد الصوديوم مسببان للتآكل ويجب التعامل معهما باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة في غطاء الدخان الكيميائي.
2. ابدأ في تجميع اللطخة الجنوبية لتسهيل نقل المواد الوسيطة المنفصلة من الجل إلى الغشاء. راجع الشكل 4 للحصول على مخطط شامل.
   1. املأ وعاءا بحجم كاف ب 1 لتر من 0.4 M هيدروكسيد الصوديوم.
   2. قم بمحاذاة لوح زجاجي طويل عبر الحاوية وقم بطي (على طول الطول) ورقتين طويلتين من ورق الكروماتوغرافيا بشكل عمودي عبر الصفيحة الزجاجية ، وتمتد إلى حاوية هيدروكسيد الصوديوم.
   3. بلل الجزء العلوي من الورقة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وقم بإزالة أي فقاعات هواء تحت سطحها بعناية.
   4. انقع ثلاث أوراق من ورق الكروماتوغرافيا باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وضعها فوق الورق المطوي ، مع إزالة أي فقاعات مرة أخرى.
   5. اقلب جل البعد الثاني رأسا على عقب وانقله فوق الأوراق.
   6. بلل غشاء نايلون موجب الشحنة (حجم المسام 0.45 ميكرومتر) بماء DI وضعه فوق الجل.
   7. أخيرا ، أضف ثلاث أوراق أخرى ، مبللة بماء DI ، فوق الغشاء.
   8. قم بتغطية أي هيدروكسيد الصوديوم المكشوف في الحاوية السفلية بغلاف بلاستيكي لمنع التبخر. ضع كومة من المناديل أو المناشف الورقية فوق البقعة ، مع التأكد من ارتفاعها 0.3-0.5 متر. ضع وزنا في الأعلى ، واضغط على اللطخة بأكملها لتسهيل العمل الشعري الضيق. اترك يومين على الأقل حتى ينتقل الحمض النووي إلى الغشاء.
      ملاحظة: يعتمد طول وعرض ورق الكروماتوغرافيا والغشاء على حجم هلام الاغاروز المستخدم في البعد الثاني. للحصول على النقل الأكثر كفاءة ، استخدم الورق والأغشية بنفس أبعاد الجل.
3. بعد النقل ، قم بربط الحمض النووي بالغشاء باستخدام الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية عند 120 ميكروجول / سم² لمدة دقيقة واحدة.
   ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا عن طريق وضع الغشاء في واقي محكم الإغلاق وجاف ونظيف في درجة حرارة الغرفة.
4. اغسل الغشاء 2x لمدة 5 دقائق باستخدام 2x سترات الصوديوم المالحة (SSC buffer) (0.3 M كلوريد الصوديوم ، 0.03 M سترات الصوديوم).
5. قم بتهجين الغشاء مسبقا باستخدام 0.18 مل / سم² من مخزن التهجين الخاص ب Church & Gilbert [1 ملي مولار EDTA ، 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) ، 0.5 م فوسفات الصوديوم ، 7٪ SDS] عند 65 درجة مئوية ، يدور في حاضنة تهجين لمدة ساعتين على الأقل.
   ملاحظة: قد يتم تهجين الغشاء مسبقا لعدة أيام.
6. قم بإعداد المسبار الملصق بالإشعاع باستخدام ^α-32P dATP أو dCTP ومجموعة وضع العلامات على الحمض النووي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   تنبيه: تعتبر dNTPs ذات العلامات الراديوية خطرة ، ويجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل معها. يجب تنفيذ جميع الأعمال المشعة خلف التدريع ، ويجب مراقبة الأفراد المدربين لامتصاص الإشعاع باستخدام مقاييس الجرعات.
   1. صمم جزءا من الحمض النووي الخطي 400-900 نقطة أساس مكملا للتسلسل المهضوم التقييدي (الشكل 2) وقم بتضخيم الجزء باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
      ملاحظة: نوصي بالحصول على جزء PCR من 50-100 نانوغرام / ميكرولتر
   2. اجمع بين 100 نانوغرام من جزء PCR التكميلي مع DNA Pol I ، وجزء Klenow (3 '5' exo-) ، وأوليغوس ديكانوكليوتيد عشوائي.
   3. قم بتغيير طبيعة الجزء عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   4. أضف 5 وحدات من DNA Pol I ، وجزء Klenow (3 '5' exo-) ، و 50 μCi من ^α-32P dNTP ، و 30-50 ميكرولتر من مزيج dNTP ناقص في نوع dNTP الموسوم بالإشعاع إلى العينة.
   5. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح بالبلمرة ودمج dNTP المليء بالإشعاع.
   6. أضف 30-50 ميكرولتر من نوع dNTP الغائب سابقا إلى العينة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   7. قم بتنقية الجزء الملصق بالإشعاع باستخدام عمود دوران عند 3,000 × جم لمدة دقيقتين.
7. أضف مسبارا مسجلا إلى 50 مل من مخزن التهجين واحتضنه بالغشاء طوال الليل عند 65 درجة مئوية يدور في حاضنة تهجين.
8. في اليوم التالي ، قم بإزالة المسبار واغسل الغشاء 2x بمخزن الغسيل 1 (0.1x SSC ، 0.1٪ SDS) عند 42 درجة مئوية و 2x مع مخزن الغسيل 2 (2x SSC ، 0.1٪ SDS) عند 65 درجة مئوية.
   ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات الغسيل بدورات سريعة لمدة 15 دقيقة في الحاضنة.
9. جفف الغشاء لمدة 10 دقائق وضعه في واقي رقيق وشفاف. قم بتخزين الغشاء المغلق في شريط متحكم فيه ومقاوم للإشعاع مع شاشة حساسة للفوسفور. اترك الغشاء يتعرض للشاشة لمدة 1-10 أيام.
10. تصور النتائج باستخدام جهاز تصوير جزيئي حيوي تم تعيينه على التصوير الفوسفوري. اغسل وأعد تعريضه إذا لزم الأمر.

الشكل 4: تجميع اللطخة الجنوبية. تخطيطي شامل لجهاز نموذجي يستخدم لنقل اللطخة الجنوبية للمواد الوسيطة من البعد الثاني إلى غشاء نايلون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Results

إذا نجحت ، عند التصور ، يمكن ملاحظة قوس حاد من شوكات النسخ المتماثل يمتد لأعلى وخارج من بقعة 1n الضخمة (الشكل 5 أ). يحدد حجم الجزء، أو النسبة المئوية التي يتم نسخها نسخا، إمكانية تنقل الجزء في البعد الأول. عندما تطور الوسطاء بنية أكثر ترابطا ، فإنها ستبدأ في السفر بشكل أبطأ في البعد الثاني. لذلك ، إذا سافر وسيط ببطء في كلا البعدين ، فيمكن التأكيد على أنه جزيء مكرر بدرجة كبيرة مع تباين وصلي كبير عن شوكات النسخ المتماثل التقليدية. في حالة توليف الخيوط المتأخرة لتكرار (GAA) ₁₀₀ ، يشار إلى توقف الشوكة ببقعة محددة مظلمة على القوس (I) ، تمثل تراكما لشوكات النسخ المتماثل عند مواجهة التكرار (الشكل 5 ب) ، على الأرجح بسبب تكوين ثلاثي. ويرافق ذلك مواد وسيطة أثقل وأكثر تشعبا (II و III) فوق موقع المماطلة. لقد وصفنا طبيعة هذه المواد الوسيطة بمزيد من العمق في Rastokina et al. 2023²⁴. باختصار ، من المحتمل أن تمثل هذه مجموعة من الشوكات التي تنعكس استجابة للمماطلة (II) ، بالإضافة إلى ظهور الشوكة المتقاربة (الشكل 5 ب) (III).

إحدى الملاحظات التي يمكن إجراؤها عند التصور هي قوس عريض أقل من مثالي. في أسوأ الأحوال ، قد يقدم هذا بمثابة مضاعفة كاملة للقوس. عادة ما يمثل هذا فصلا ضعيفا للوسيطين في البعد الأول. قد يعزى ذلك إلى عدة عوامل ، على الأرجح هو إما تلوث الملح أو البروتين في العينة الوسيطة للنسخ المتماثل. الفينول: تنقية الكلوروفورم بعد هضم المواد الوسيطة ، متبوعا بغسل واسع النطاق بنسبة 70٪ من الإيثانول ، يمكن أن تقلل من هذا الخطر. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن التعرض الإضافي للفينول يمكن أن يزيد من فرصة تغيير طبيعة المواد الوسيطة ، والتي قد تظهر على شكل كثافة مظلمة للحمض النووي الخطي تحت القوس ، مما يمثل وسيطات النسخ المتماثل المنهارة (الشكل 5 ج).

في أسوأ السيناريوهات ، قد يؤدي التصور إلى الغياب التام لوسيطات النسخ المتماثل ، كما يتضح من نقص القوس (الشكل 5 د). من غير المحتمل أن يعزى غياب القوس إلى وسيطات النسخ المتماثل المشوهة ، حيث لا توجد بقعة مظلمة تحت المنطقة المتوقعة من القوس. نظرا لوجود بقعة صغيرة بشكل خاص 1n (IV) ، فإن الكمية الإجمالية للحمض النووي الموجودة في هذا المثال المصور ضئيلة للغاية ، وبالتالي ، قد تكون هذه المشكلة ناتجة عن نقص النسخ المتماثل للبلازميد أو تعداء ضعيف أو عزل الحمض النووي.

الشكل 5: النتائج المحتملة لتحليل 2DGE. (أ) تحليل ناجح ل 2DGE للنسخ المتماثل من خلال تشكيل الهيكل (GAA) ₁₀₀ تكرار في الخلايا HEK293T. (I) يشير إلى الشوكات المتوقفة عند التكرار ، بينما يشير (II) و (III) إلى المواد الوسيطة الأكثر تنظيما التي تنشأ استجابة للمماطلة. تم تصوير رسم توضيحي للجزء 2.7 كيلو بايت أعلاه. (ب) الوسيطات التمثيلية التي تنشأ أثناء تكرار (GAA)₁₀₀ . باستخدام ضربة قاضية siRNA لعكس شوكة النسخ المتماثل وإعادة تشغيل الجينات ، تم إنشاء ضوابط جينية لتحديد طبيعة هذه الوسيطات. (ج) تصوير المواد الوسيطة للنسخ المتماثل التي لم يتم حلها والتي قد تظهر إذا تم تغيير طبيعة الشوكات أثناء العزل. (د) تجربة 2DGE غير ناجحة كما يتضح من الغياب التام لوسيطات النسخ المتماثل. يمثل IV شظايا خطية غير متماثلة من البلازميد المهضوم. الاختصار: 2DGE = رحلان كهربائي هلامي محايد / محايد ثنائي الأبعاد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يوفر 2DGE صورة شبه كمية وشاملة للمجموعات النسبية للمواد الوسيطة التي تنشأ أثناء تكرار تسلسل معين. بالنظر إلى أنه يجب الحفاظ على الهياكل الجزيئية الهشة لشوكات النسخ المتماثل طوال هذا الإجراء ، يجب توخي الحذر الشديد لمنع القص الفيزيائي والتمسخ الكيميائي. لذلك ، يوصى بشدة بتجنب أي علاج قلوي أثناء عزل البلازميد. لتجنب ذلك ، قمنا نحن وآخرون بتنفيذ شكل معدل لعزل هيرت للحمض النووي ، الذي أنشأه هيرت في عام 1967³³. هنا ، يتم فصل الحمض النووي عن البروتينات والحمض النووي الريبي والحطام الخلوي الآخر عن طريق معالجة محللة الخلية ب 1 M كلوريد الصوديوم عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في حين أن هذه الطريقة أثبتت أنها استثنائية للحفاظ على جودة المواد الوسيطة للنسخ المتماثل ، إلا أنها لا يبدو أنها تفصل الحمض النووي البلازميدي تماما عن الحمض النووي الجيني. يجب أن يؤخذ ذلك في الاعتبار عند تصميم تسلسل التحقيق الإشعاعي ، حيث يجب ألا يكون للمسبار المصمم تشابه كبير في التسلسل مع أي حمض نووي جيني لتجنب الارتباط خارج الهدف بشكل أفضل. علاوة على ذلك ، يمكن زيادة سلامة المواد الوسيطة للنسخ المتماثل بشكل كبير من خلال التشابك بالأشعة فوق البنفسجية. هنا ، يمكن تحضين الخلايا بالسورالين لعدة دقائق في الظلام قبل أن يتم تشعيعها للأشعة فوق البنفسجية عند 366 نانومتر³⁴ ، وبالتالي إنشاء روابط تساهمية بين جزيئات الحمض النووي. بالإضافة إلى تعزيز تماسك الهياكل الوسيطة ، قد يخفف هذا أيضا من أي قلق من تشكل الهياكل أثناء العزلة بدلا من الجسم الحي.

أحد الجوانب التي يجب مراعاتها عند تصميم هذه التجربة هو تكرار التنسيب على القوس النهائي الذي تم حله. يشار إلى النصف الأول من القوس الممتد من بقعة 1n على أنه الذراع الصاعدة ، بينما يعرف النصف الثاني باسم الذراع الهابط (الشكل 1 ب). لمراقبة توقف شوكة النسخ المتماثل ، يجب أن يكون التنسيب المتكرر على أي من ذراعي القوس كافيا. ومع ذلك ، لملاحظة الوسائط الأكثر تنظيما التي تنشأ في التسلسلات المتكررة ، مثل تقاطعات ما بعد التكرار ، نوصي بوضع تسلسل التكرار على الذراع الهابطة. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى الحركة الكهربية البطيئة لهذه الوسائط في كلا البعدين ، مما قد يؤدي إلى الهجرة المشتركة مع هياكل Ys البسيطة على طول تقدمها إذا تم وضع التسلسل المحتوي على التكرار على الذراع الصاعدة ، مما يعيق أي تحليل مفصل. للحصول على أفضل دقة ، نوصي بوضع تسلسل التكرار في مكان ما بين 60٪ و 90٪ داخل جزء الاهتمام بالنسبة لأصل النسخ المتماثل.

يجب استخدام الاهتمام بالتفاصيل أثناء خطوة نقل الحمض النووي والمعالجة اللاحقة للغشاء. من المهم للغاية أن يتم تجميع اللطخة الجنوبية بطريقة تسهل النقل المتساوي والضيق للحمض النووي إلى الغشاء. هذا يعني أن جميع المكونات الموجودة في النقل خالية من فقاعات الهواء وأن الجهاز موحد عبر سطحه. للمساعدة في ذلك ، من المعتاد قلب جل البعد الثاني قبل إضافته إلى اللطخة الجنوبية. يفترض أن يكون الجزء السفلي من الجل أكثر انبساطا من الجزء العلوي. لذلك ، فإن تقليب الجل يضمن نقل الحمض النووي إلى الغشاء بسلاسة.

إذا كانت هناك خلفية قوية في الاستبانة النهائية للبقعة ، فقد يكون هذا مؤشرا على الارتباط غير المحدد للمسبار الملصق بالإشعاع. يمكن التخفيف من ذلك بعدة طرق. أولا ، يجب التحقق من أن المسبار لا يحتوي على تشابه كبير في التسلسل مع أي حمض نووي جيني. يمكن التحقق من ذلك بسهولة باستخدام أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية للنوكليوتيدات (BLAST) ، والتي تتوفر بسهولة من خلال موقع المعاهد الوطنية للصحة³⁵. خلاف ذلك ، يمكن إزالة المجسات غير المرتبطة بشكل محدد من خلال عمليات غسيل صارمة إضافية. نوصي بالبدء بغسلتين إضافيتين من المخزن المؤقت 1 (0.1x SSC ، 0.1٪ SDS) عند 42 درجة مئوية على فترات 15 دقيقة لكل منهما. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من الغسيل. أخيرا ، يمكن أيضا تغيير درجة الحرارة التي يحدث عندها التهجين. بالنسبة لمعظم المجسات التي تحتوي على محتوى G / C من 40-60٪ ، تميل 65 درجة مئوية إلى أن تكون كافية ، على الرغم من أن هذه ليست قيمة ثابتة. يعتمد الربط الفعال للمسبار على درجة حرارة انصهاره ، وبالتالي قد يتطلب تغييرات في درجة حرارة التهجين.

بالنظر إلى أن 2DGE يوفر نظرة عامة على المجموعات النسبية لوسيطات النسخ المتماثل في وقت معين ، فإن أحد أكبر عيوبه هو أنه لا يوفر مقياسا قويا لتوقيت تقدم النسخ المتماثل. لهذا الغرض ، نوصي باستخدام تحليل الجزيء الفردي مثل تمشيط الحمض النووي. علاوة على ذلك ، بينما يسمح 2DGE بتحليل المواد الوسيطة للنسخ المتماثل التي تنشأ استجابة للتباطؤ ، يجب إنشاء ضوابط جينية للكشف عن هويتها الدقيقة ، والتي يمكن أن تكون في الوقت المناسب. على الرغم من أن الفحص المجهري الإلكتروني مكلف ، إلا أنه يظل متفوقا في تحديد التركيب الدقيق لجزيئات الحمض النووي.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T خلايا	ATCC	CRL-3216
a-32< / sup>P dATP ، 3000 Ci / mmol   ؛	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N +	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
Church و Gibert's Hybridization	Buffer Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA مجموعة	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM ، عالية الجلوكتوز ، مكمل GltaMAX ، البيروفات	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	شراء إنزيمات تقييد إضافية أيضا
EDTA 0.5 M ، درجة الحموضة 8	فيشر Scientific	BP2482500
الإيثانول ، 70٪	فيشر Scientific	BP82031GAL
مصل الأبقار الجنينية	VWR	97068-085
محلول حمض الهيدروكلوريك ، 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA و siRNA كاشف تعداء مع Buffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة Nalgene Oak Ridge	ThermoFisher Scientific	3139-0050
محلول ملحي للفوسفات ، درجة الحموضة 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
محلول ملحي للفوسفات ، درجة الحموضة 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
ورق كروماتوغرافيا السليلوز النقي	فيشر Scientific	05-714-4
ورق كروماتوغرافيا السليلوز النقي	فيشر Scientific	05-714-5
حاكم	فيشر Scientific	09-016
مشرط	فيشر Scientific	12-460-451
كبريتات	دوديسيل الصوديومMillipore Sigma	436143-25G
هيدروكسيد الصوديوم	فيشر Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 جهاز طرد مركزي فائق السرعة	ThermoFisher Scientific	75006580
الرحلان الكهربائي الأفقي للخلية	الفرعية Bio Rad	1704401
TH13-6 × 50 دلو متأرجح دوار	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M ، درجة الحموضة 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، أحمر	الفينول ThermoFisher	Scientific 25200056