تحسين تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني المبرد

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة عملية باستخدام Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) كمثال لمعالجة التوزيع غير المتكافئ للجسيمات من خلال تحسين تحضير العينة ، مما يوفر مرجعا للباحثين لتوضيح الهياكل الجزيئية بكفاءة باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM).

Abstract

أحدث المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) ثورة في البيولوجيا الهيكلية من خلال تمكين دراسة الهياكل الجزيئية الكبيرة في الظروف شبه الأصلية ، المعلقة في الجليد الزجاجي. تسمح هذه التقنية بالتصور عالي الدقة للبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى دون الحاجة إلى التبلور ، مما يوفر رؤى مهمة حول وظيفتها وآليتها. جعلت التطورات الحديثة في تحليل الجسيمات المفردة ، إلى جانب المعالجة الحاسوبية المحسنة للبيانات ، cryo-EM أداة لا غنى عنها في البيولوجيا الهيكلية الحديثة. على الرغم من اعتماده المتزايد ، يواجه cryo-EM تحديات مستمرة يمكن أن تحد من فعاليته ، لا سيما التوزيع غير المتكافئ للجسيمات. غالبا ما تؤدي هذه المشكلة إلى ضعف الدقة وانخفاض الدقة في هياكل البروتين المعاد بناؤها. توضح هذه المقالة نهجا بسيطا وعمليا لمواجهة هذا التحدي ، باستخدام بروتين الصدمة الحرارية الصغير من Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) كمثال. تعمل الطريقة على تحسين تحضير العينة لتقليل الامتزاز التفضيلي ، مما يضمن توزيعا أكثر تجانسا للجسيمات وهياكل بروتين cryo-EM عالية الجودة. تقدم هذه التقنية إرشادات قيمة للباحثين الذين يهدفون إلى التغلب على تحديات مماثلة في الدراسات الهيكلية.

Introduction

مع التطورات الحديثة في كل من أجهزة الأجهزة^1،2 وبرامج معالجة الصور^3،4،5 ، ظهر المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) كأداة شائعة وقوية في البيولوجيا الهيكلية الحديثة. على الرغم من هذه الاختراقات ، لا تزال الاختناقات مستمرة في تحقيق هياكل جزيئية عالية الدقة باستخدام cryo-EM. أحد هذه التحديات الكبيرة هو التوزيع غير المتكافئ للجسيمات ، بما في ذلك ظاهرة تفضيل الاتجاه ، والتي يتم ملاحظتها في الغالب في السطح البيني بين الهواء والماء^6،7

Protocol

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تنقية البروتين

1. تحفيز التعبير عن MjsHSP16.5 المؤتلف في بكتريا قولونية BL21 (DE3) وتنقية البروتين باستخدام عمود كروماتوغرافيا مخلب النيكل كما هو موضح^{سابقا 26}. بعد التنقية على عمود²⁶ لكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، افحص نقاء البروتين عن طريق تحميل 5 ميكرولتر من كسور الذروة على هلام SDS-PAGE بنسبة 12.5٪ وتصورها بواسطة تلطيخ Coomassie الأزرق^{القياسي 28} (الشكل 2).
2. قم بتركي....

Results

لتحديد ظروف الشبكة المثلى ل MjsHSP16.5 ، تم إجراء فحص أولي للتبريد EM ، مع التركيز بشكل أساسي على فحص ظروف المخزن المؤقت للبروتين المختلفة: (1) المخزن المؤقت للتنقية النهائي ، والذي يضمن استقرار وتجانس MjsHSP16.5 وهو مهم لتبلوره³⁰ ؛ (2) مخازن مؤقتة تتكيف مع الظروف اللازمة لنمو بلورات MjsHSP16.5 عالية الجودة³⁰ ؛ و (3) المخازن المؤقتة المستخدمة سابقا في دراسات المجهر الإلكتروني (EM) ل MjsHSP16.5^31،32.

Discussion

تبدأ جميع الدراسات الهيكلية للبروتين بتنقية البروتين ، وهي عملية تكرارية لتحقيق التوازن بين عزل أهداف البروتين ذات النقاء العالي والتجانس مع الحفاظ على وظائفها الأصلية. على الرغم من أن التركيبات العازلة لتنقية عينات البروتين والحفاظ عليها يتم اختيارها بعناية أثناء عملية التنقية ، إلا أن هذه المخازن المؤقتة غالبا ما تشكل تحديات أثناء إعداد عينة cryo-EM اللاحقة والتصوير⁶. تنشأ هذه المشكلة من عدم التطابق بين مكونات المخزن المؤقت والمتطلبات الأساسية لتحليل cryo-EM الأ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 مل أنبوب دائري سفلي	SPL علوم الحياة	40114
250 & L حقنة Gastight نموذج 1725 LTN	هاميلتون	81100	إبرة أسمنتية ، مقياس 22 ثانية ، 2 بوصة ، نمط نقطة 2
50 ومايكرو ؛ L زر غسيل الكلى	هامبتون للأبحاث	HR3-326
50 مل دورق زجاجي	DIAMOND	HA.1010D.50
& Auml ؛ KTA نقي 25 لتر	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 وحدة تصفية الطرد المركزي	Millipore		UFC905024 50-KDa NMWL
Bradford Reagent	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
1.5 مل	HD Micro	H23015
أنابيب PCR 0.2 مل ، غطاء مسطح	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiوحدة تفريغ التوهج	التوهج تيد بيلا	91000
PELCO TEM كتلة حامل الشبكة	تيد بيلا	16820-25
Quantifoil R 1.2 / 1.3 200 شبكة ، مجهر إلكتروني النحاس	العلوم	Q2100CR1.3
Spectra / Por 3 RC أنابيب غشاء غسيل الكلى	فيشر ساينتفيك	086705B	3500 دالتون MWCO
Superose 6 زيادة 10/300 GL	Cytiva	29091596
أسيتات Uranyl	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase مجموعة فحص العازلة والمنظفات	ThermoFisher Scientific	A49856