مقالة منهجية

تحسين تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني المبرد

DOI:

10.3791/67237

⸱

أبريل 11, 2025

 ,  , 
1Department of Precision Medicine, Graduate School of Basic Medical Science (GSBMS), Institute for Antimicrobial Resistance Research and Therapeutics, Sungkyunkwan University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طريقة عملية باستخدام Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) كمثال لمعالجة التوزيع غير المتكافئ للجسيمات من خلال تحسين تحضير العينة ، مما يوفر مرجعا للباحثين لتوضيح الهياكل الجزيئية بكفاءة باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحدث المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) ثورة في البيولوجيا الهيكلية من خلال تمكين دراسة الهياكل الجزيئية الكبيرة في الظروف شبه الأصلية ، المعلقة في الجليد الزجاجي. تسمح هذه التقنية بالتصور عالي الدقة للبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى دون الحاجة إلى التبلور ، مما يوفر رؤى مهمة حول وظيفتها وآليتها. جعلت التطورات الحديثة في تحليل الجسيمات المفردة ، إلى جانب المعالجة الحاسوبية المحسنة للبيانات ، cryo-EM أداة لا غنى عنها في البيولوجيا الهيكلية الحديثة. على الرغم من اعتماده المتزايد ، يواجه cryo-EM تحديات مستمرة يمكن أن تحد من فعاليته ، لا سيما التوزيع غير المتكافئ للجسيمات. غالبا ما تؤدي هذه المشكلة إلى ضعف الدقة وانخفاض الدقة في هياكل البروتين المعاد بناؤها. توضح هذه المقالة نهجا بسيطا وعمليا لمواجهة هذا التحدي ، باستخدام بروتين الصدمة الحرارية الصغير من Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) كمثال. تعمل الطريقة على تحسين تحضير العينة لتقليل الامتزاز التفضيلي ، مما يضمن توزيعا أكثر تجانسا للجسيمات وهياكل بروتين cryo-EM عالية الجودة. تقدم هذه التقنية إرشادات قيمة للباحثين الذين يهدفون إلى التغلب على تحديات مماثلة في الدراسات الهيكلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع التطورات الحديثة في كل من أجهزة الأجهزة1،2 وبرامج معالجة الصور3،4،5 ، ظهر المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) كأداة شائعة وقوية في البيولوجيا الهيكلية الحديثة. على الرغم من هذه الاختراقات ، لا تزال الاختناقات مستمرة في تحقيق هياكل جزيئية عالية الدقة باستخدام cryo-EM. أحد هذه التحديات الكبيرة هو التوزيع غير المتكافئ للجسيمات ، بما في ذلك ظاهرة تفضيل الاتجاه ، والتي يتم ملاحظتها في الغالب في السطح البيني بين الهواء والماء6،7،8،9.

أثناء تزجيج العينة ، تظهر بعض الجزيئات ميلا لمحاذاة نفسها على طول محاور محددة على الشبكة. هذا يؤدي إلى توزيع غير متساو لطرق عرض الجسيمات في مجموعة البيانات النهائية. قد يتم تمثيل بعض التوجهات بشكل مفرط بينما يكون البعض الآخر ممثلا تمثيلا ناقصا أو غائبا تماما ، مما يؤدي إلى أخذ عينات غير مكتملة من بنية البروتين الإجمالية. ستظهر مناطق البروتين الموجهة بشكل تفضيلي نحو شعاع الإلكترون أكثر بروزا في خريطة الكثافة ، بينما قد تكون المناطق الموجهة بعيدا عن الحزمة سيئة الحل أو مفقودة تماما10،11. وبالتالي ، فإن التوزيع غير المتكافئ للجسيمات يقدم تحيزات وتحفا محتملة في الهيكل النهائي ثلاثي الأبعاد (3D) المعاد بناؤه. والجدير بالذكر أن العناصر الهيكلية الرئيسية مثل حلزونات ألفا وألواح بيتا قد تصبح منحرفة ، وقد تظهر سلاسل الأحماض الأمينية أو النيوكليوتيدات مجزأة ، وقد تظهر كثافات أجزاء معينة من البروتين أو الحمض النووي تشوها12. في النهاية ، تشكل هذه التحريفات تحديا كبيرا لكشف بنية ووظيفة الجزيئات البيولوجية بدقة.

يتم حاليا استخدام مناهج تجريبية مختلفة للتغلب على مثل هذه التحديات ، بما في ذلك تحسين إعدادالعينة 13،14،15 ، ومعالجة الشبكة16،17،18،19،20،21،22 ، واستراتيجية جمعالبيانات 23. والجدير بالذكر أنه ينصح بمعالجة التحدي في مرحلة إعداد العينة كلما أمكنذلك 7. تشمل التحسينات الشائعة في تحضير العينة تعديل تكوين المخزن المؤقت ، وإدخال شركاء ربط جزيئي أو جزيئي صغير ، وتوليد روابط متشابكة داخل الجزيئات ، ومنظفات مختلفة. هذا ينطبق أيضا على بروتينات الغشاء24،25 ، على الرغم من أنه يجب استخدام المنظفات خصيصا لأغراض التنقية والتثبيت. من بين هذه ، فإن قابلية التخصيص والفعالية من حيث التكلفة وإمكانية الوصول على نطاق واسع لتحسين مخزن البروتين يجعلها استراتيجية مفضلة في معظم المختبرات. يسمح هذا النهج بإجراء تعديلات دقيقة وفورية للمعلمات المختلفة لتتناسب مع المتطلبات المحددة لكل عينة بروتين. من خلال التحسين التكراري ، يمكن للباحثين اختبار ظروف المخزن المؤقت المتنوعة بشكل منهجي وضبط المعلمات المختلفة التي تهدف إلى تقليل الاتجاهات المفضلة وتحسين الجودة الشاملة لبيانات cryo-EM. أظهر تغيير مكونات البروتين المؤقت وضبط تركيزاتها فعاليته في التأثير على استقرار البروتين عن طريق تعديل الشحنة السطحية ، وبالتالي التأثير على سلوك البروتين داخل الجليدالزجاجي 25. لذلك ، يعتبر تحسين تكوين المخزن المؤقت للبروتين أحد أكثر الطرق ملاءمة ومباشرة لمعالجة التحديات الشائعة في cryo-EM.

هنا ، يقترح بروتوكول لمعالجة عقبة شائعة في cryo-EM - التغلب على التوزيع غير المتكافئ للجسيمات. في هذا البروتوكول ، يتم تحديد الإجراءات الرئيسية لتحضير البروتين وفحص المخزن المؤقت ، مع استكمالها بإعداد الشبكة ، باستخدام بروتين صدمة حراري صغير من Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) 26 كدراسة حالة (الشكل 1). هذا sHSP مستقر أصلا ، وله كتلة جزيئية تبلغ 16.5 كيلو دالتون لكل مونومر ، ويتجمع في قفص ثماني السطوح24 mer 26،27 ، مما يجعله مرشحا جذابا للتحليل الهيكلي بواسطة cryo-EM. ومع ذلك ، لم يكن من المتوقع ملاحظة التوزيع غير المتكافئ للجسيمات أثناء جمع بيانات cryo-EM ، وظهر كتحد كبير أثناء التجارب. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة الأساليب المحتملة المفيدة للباحثين الذين يتعاملون مع تحديات مماثلة ، وبالتالي تسهيل التوضيح الفعال للهياكل الجزيئية الكبيرة باستخدام cryo-EM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تنقية البروتين

  1. تحفيز التعبير عن MjsHSP16.5 المؤتلف في بكتريا قولونية BL21 (DE3) وتنقية البروتين باستخدام عمود كروماتوغرافيا مخلب النيكل كما هو موضحسابقا 26. بعد التنقية على عمود26 لكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، افحص نقاء البروتين عن طريق تحميل 5 ميكرولتر من كسور الذروة على هلام SDS-PAGE بنسبة 12.5٪ وتصورها بواسطة تلطيخ Coomassie الأزرقالقياسي 28 (الشكل 2).
  2. قم بتركيز كسور البركة التي تحتوي على MjsHSP16.5 عند 4 درجات مئوية إلى حوالي 65 مجم / مل باستخدام مرشحات الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 50 كيلو دالتون ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: قم بتنظيف محلول البروتين الماصة برفق كل 5 دقائق أثناء الطرد المركزي لمنع تراكم البروتين.
  3. بعد التركيز ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الركام ، وتقسيم المادة الطافية إلى أحجام 50 ميكرولتر في أنابيب PCR رقيقة الجدار سعة 0.2 مل ، وتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل ، وتخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.

2. تحضير البروتين للتصوير المجهري الإلكتروني (TEM)

  1. قم بإذابة أنبوبين من البروتين المجمدين على الثلج. بمجرد إذابته ، امزج المحلول برفق عن طريق تحريك الأنبوب عدة مرات لضمان التجانس والطرد المركزي لمحلول البروتين عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الركام.
  2. حقن المادة الطافية على عمود SEC واجمع 0.5 مل من كسور الشطف.
  3. اجمع كسور الشطف المقابلة للذروة التي تظهر أعلى امتصاص للأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر وقم بقياس تركيز البروتين في هذه الكسور باستخدام مقايسة برادفورد29.
    ملاحظة: لضمان تركيز كاف للبروتين في جزء ذروة واحد للتطبيقات النهائية ، من الضروري تحميل كمية عالية من عينة البروتين على عمود SEC مع البقاء ضمن السعة الموصى بها للعمود.

3. تبادل العازلة

  1. قم بإعداد المحلول العازل المطلوب (9 ملي مولار من MOPS-Tris (الرقم الهيدروجيني 7.2) ، و 50 ملم من كلوريد الصوديوم ، و 0.1 ملي مولار من EDTA) ، وقم بتقسيم المخازن المؤقتة إلى أكواب سعة 50 مل ، واحتفظ بأكواب العازلة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بناء على المعرفة المسبقة بالكيمياء الحيوية للبروتين المستهدف ، قم بإعداد مجموعة متنوعة من المحاليل العازلة بتركيبات مختلفة (أنواع العازلة ، ودرجة الحموضة ، والقوة الأيونية) ، مثل 20 ملي مولار من HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، و 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، و 0-5 ملي مولار من DTT ، لتحديد الظروف التي تعزز الذوبان الأمثل للبروتين ، والتجانس ، والاستقرار في إعداد الشبكة النهائية.
  2. قم بإعداد غشاء غسيل الكلى باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  3. قطع غشاء غسيل الكلى إلى قطع 30 مم × 30 مم باستخدام المقص. قم بموازنة هذه الأغشية عن طريق احتضانها في الماء المقطر أو المحاليل العازلة (الشكل 3 أ).
  4. أضف 55 ميكرولتر من محلول البروتين (حوالي 2.5 مجم / مل) إلى حجرة أزرار غسيل الكلى المجهري سعة 50 ميكرولتر (الشكل 3 ب).
  5. أمسك غشاء غسيل الكلى عموديا باستخدام الملقط ولمس إحدى حواف الغشاء برفق مقابل المناديل الورقية لتصريف السوائل الزائدة (الشكل 3 ج). قم بتغطية زر غسيل الكلى المجهري بعناية بالغشاء ، مع التأكد من عدم إدخال فقاعات هواء في غرفة غسيل الكلى المجهري (الشكل 3 د). ضع الحلقة O فوق غشاء غسيل الكلى. قم بلف الحلقة O برفق في الأخدود الموجود على حافة الزر.
  6. الطريقة البديلة: ضع الحلقة O على طول محور نقطة الإنطلاق للجولف وضع نقطة الإنطلاق الجولف رأسا على عقب على الغشاء (الشكل 3E). حرك الحلقة O برفق لأسفل نقطة الإنطلاق الجولف حتى تنزلق على حافة الزر (الشكل 3F). قم بتوجيه الحلقة O بعناية إلى الأخدود الموجود على حافة الزر (الشكل 3G).
  7. اغمر كل زر غسيل الكلى في دورق منفصل يحتوي على المخزن المؤقت للوجهة بحيث يكون جانب الغشاء متجها لأعلى (الشكل 3H).
  8. احتفظ بالأكواب عند 4 درجات مئوية أثناء عملية غسيل الكلى. قم بتغيير المخزن المؤقت لغسيل الكلى بعد ساعتين واستمر في غسيل الكلى طوال الليل.
  9. استخدم حقنة بإبرة رفيعة (على سبيل المثال ، حقنة هاميلتون أو حقنة الأنسولين) لكمة الغشاء بعناية واستعادة محلول البروتين من غرفة غسيل الكلى المجهري (الشكل 3I). قم بتخزين عينة البروتين في أنبوب طرد مركزي دقيق على الثلج حتى الاستخدام الآخر. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام اختبار برادفورد29.

4. إعداد الشبكة

  1. اختر نوع الشبكة المناسب.
    ملاحظة: يشيع استخدام فيلم الكربون غير المتبلور على دعامة نحاسية. يجب اختيار سمك فيلم الكربون وحجم الثقب ورقم الشبكة بناء على سمك الجليد المطلوب. تم استخدام شبكات هولي المطلية بالكربون لتحضير عينات MjsHSP16.5.
  2. أمسك الشبكات برفق عند الحواف باستخدام ملاقط لتجنب إتلاف فتحات الشبكة. ضع الشبكات على حامل شبكي بحيث يكون جانب الكربون متجها لأعلى. ضع حامل الشبكة في غرفة نظام تفريغ التوهج.
  3. قم بإجراء تفريغ التوهج لمدة 60 ثانية عند 15 مللي أمبير لجعل الشبكة محبة للماء. يوصى باستخدام شحنة سالبة خلال هذه العملية.
    ملاحظة: تعمل المعلمات الموصى بها كنقطة انطلاق لنظام تفريغ التوهج المستخدم في هذه الدراسة. قد يكون التحسين ضروريا اعتمادا على نوع أداة تفريغ التوهج ولتحقيق المستوى المطلوب من المحبة للماء لمواد شبكية معينة. لتنظيف البلازما ، ضع في اعتبارك اختبار الغازات البديلة أو مخاليط الغاز مثل مخاليط الهيدروجين أو الأرجون والأكسجين.
  4. الخطوة الاختيارية: أدخل محاليل كيميائية إضافية ، مثل 99٪ من الأميلامين في زجاجة زجاجية مفتوحة ، في غرفة مجاورة لحامل الشبكة لإنتاج شحنة موجبة صافية على الشبكة على وجه التحديد.
  5. استخدم الشبكات المفرغة في غضون 0.5-1 ساعة لضمان الأداء الأمثل.

5. إعداد شبكة وصمة عار سلبية

  1. قم بتحميل 5 ميكرولتر من العينة (50-300 نانومتر أو 20-120 نانوغرام / مل) على الشبكة المتوهجة. اسمح للعينة بالراحة دون إزعاج على سطح الشبكة لمدة 1 دقيقة لتسهيل ترسيب البروتينات.
  2. قم بإعداد ثلاث قطرات ماء سعة كل منها 50 ميكرولتر على لوح فيلم البارافين. اغسل العينة برفق على الشبكة عن طريق فرك سطح الشبكة على سطح قطرة الماء الأولى. كرر خطوة الغسيل مع قطرتي الماء المتبقيتين.
    ملاحظة: يمكن تحسين أوقات الغسيل وفقا للمتطلبات المحددة لكل تجربة.
  3. قم بتحميل 5 ميكرولتر من محلول أسيتات اليورانيل المصفى بنسبة 1٪ (وزن / حجم) على الشبكة وقم بإزالة محلول أسيتات اليورانيل على الفور.
  4. قم بتحميل 5 ميكرولتر أخرى من محلول أسيتات اليورانيل 1٪ (وزن / حجم) على الشبكة. اسمح للشبكة بالتحتضن في محلول أسيتات اليورانيل لمدة 90 ثانية للتلطيخ.
    ملاحظة: يمكن تعديل وقت التلوين وتحسينه وفقا لعينات محددة.
  5. المس برفق جانب الملقط من الشبكة بورق الترشيح لإزالة محلول التلوين الزائد. اترك الشبكة تجف تماما في الهواء في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين الشبكة المجففة في وعاء شبكي في درجة حرارة الغرفة حتى المراقبة.

6. تزجيج العينة

  1. خفف عينة البروتين إلى التركيز المطلوب.
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز البروتين مرتفعا بما يكفي لزيادة عدد الجسيمات في كل ثقب ، ولكن منخفضا بما يكفي لضمان توزيع الجسيمات المفردة. تتراوح تركيزات بروتين Cryo-EM عادة من 0.5 إلى 2 مجم / مل. ومع ذلك ، قد تتطلب بعض البروتينات ، اعتمادا على وزنها الجزيئي وظروف تحضير العينة المحددة ، تركيزات خارج هذا النطاق.
  2. الطرد المركزي للعينة عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي ركام.
  3. قم بتشغيل أداة تجميد الغاطس. املأ خزان المرطب بالماء المقطر. قم بتركيب أوراق الترشيح بحلقات على وسادات اللطخ. اضبط معلمات التزجيج (درجة الحرارة: 4 درجات مئوية ، الرطوبة: 100٪ ، وقت اللطخة: 6 ثوان ، قوة اللطخة: 5 وحدات ، وقت الانتظار: 10 ثوان).
    ملاحظة: يعد وقت اللطخة والقوة من المعلمات المهمة لتحسين جهاز التزجيج ، حيث يمكن أن تؤدي إزالة الماء من الشبكة والتعرض للجسيمات إلى واجهة الهواء والماء إلى الانفصال أو تحيز الاتجاه.
  4. قم بتجميع مكونات حاوية التبريد ، بما في ذلك الكوب النحاسي ، وحامل الصندوق الشبكي ، ووحدة العنكبوت ، والحلقة المضادة للتلوث ، في صينية القاعدة. قم بتبريد مجموعة الحاوية عن طريق ملء الصينية بالنيتروجين السائل. املأ الكوب النحاسي بالتبريد (الإيثان السائل). قم بإزالة وحدة العنكبوت بمجرد وصول المبرد إلى درجة حرارة الانصهار.
  5. قم بتركيب الملقط ومجموعة الشبكة على الجهاز ، وقم بتحميل العينة (عادة 4 ميكرولتر) على جانب الكربون من الشبكة ، وابدأ عملية التجميد بالغرق.
  6. قم بفك الملقط بعناية من الجهاز ، ضع الشبكة على صندوق شبكة تخزين ، وأغلق الصندوق بالغطاء. قم بتخزين صندوق الشبكة الذي يحتوي على العينات المزججة في النيتروجين السائل.

7. تحميل الشبكات إلى TEM

  1. قم بتجميع محطة تجميع الشبكة الآلية وتبريدها بالنيتروجين السائل.
  2. ضع صندوق الشبكة الذي يحتوي على شبكات مزججة وفك الغطاء بعناية للوصول إلى الشبكات. ضع صندوق تخزين autogrid فارغ في مكان قريب لسهولة نقل الشبكات المجمعة.
  3. ضع حلقة الشبكة التلقائية في مساحة القطع المخصصة للحلقة في محطة التجميع. حرك الشبكة المزججة بعناية من صندوق الشبكة وقم بتثبيتها داخل حلقة الشبكة التلقائية. تأكد من محاذاة الشبكة والحلقة.
  4. قم بمحاذاة القرص لوضع فتحة الدائرة أعلى حلقة الشبكة التلقائية ومجموعة الشبكة. لإصلاح الشبكة في حلقة الشبكة التلقائية ، ضع أداة إدراج C-clip أعلى الشبكة واضغط لأسفل برفق للنقر فوق المشبك C بالداخل.
  5. قم بتدوير القرص للخلف وانقل الشبكات المجمعة إلى صندوق تخزين الشبكة التلقائية.
  6. قم بتجميع محطة تحميل الكاسيت وتبريد محطة التحميل بالنيتروجين السائل.
  7. ضع صندوق تخزين الشبكة التلقائية في محطة التحميل. انقل مجموعة الشبكة من صندوق تخزين الشبكة التلقائية إلى الكاسيت واضغط على الشبكة برفق لضمان الموضع المناسب.
  8. استخدم المقبض لوضع الدرج في كبسولة التحميل التلقائي. تحقق من الدبوس الموجود في التحميل التلقائي للتأكد من حركته الحرة والتأكد من عدم تجميده.
  9. قم بإرساء كبسولة التحميل التلقائي إلى TEM لمراقبة الشبكة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحديد ظروف الشبكة المثلى ل MjsHSP16.5 ، تم إجراء فحص أولي للتبريد EM ، مع التركيز بشكل أساسي على فحص ظروف المخزن المؤقت للبروتين المختلفة: (1) المخزن المؤقت للتنقية النهائي ، والذي يضمن استقرار وتجانس MjsHSP16.5 وهو مهم لتبلوره30 ؛ (2) مخازن مؤقتة تتكيف مع الظروف اللازمة لنمو بلورات MjsHSP16.5 عالية الجودة30 ؛ و (3) المخازن المؤقتة المستخدمة سابقا في دراسات المجهر الإلكتروني (EM) ل MjsHSP16.531،32.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تبدأ جميع الدراسات الهيكلية للبروتين بتنقية البروتين ، وهي عملية تكرارية لتحقيق التوازن بين عزل أهداف البروتين ذات النقاء العالي والتجانس مع الحفاظ على وظائفها الأصلية. على الرغم من أن التركيبات العازلة لتنقية عينات البروتين والحفاظ عليها يتم اختيارها بعناية أثناء عملية التنقية ، إلا أن هذه المخازن المؤقتة غالبا ما تشكل تحديات أثناء إعداد عينة cryo-EM اللاحقة والتصوير6. تنشأ هذه المشكلة من عدم التطابق بين مكونات المخزن المؤقت والمتطلبات الأساسية لتحليل cryo-EM الأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر المركز التعاوني لمرافق البحوث (CCRF) (جامعة سونغكيونكوان ، كوريا) على منحنا بسخاء إمكانية الوصول إلى منشأة cryo-EM الخاصة بهم. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) إلى K.K.K. (رقم 2021M3A9I4022936). تم دعم استخدام مرافق cryo-EM الخاصة باتحاد NEXUS من خلال منحة مؤسسة البحوث الوطنية الكورية RS-2024-00440289.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
14 مل أنبوب دائري سفليSPL علوم الحياة40114
250 & L حقنة Gastight نموذج 1725 LTNهاميلتون81100إبرة أسمنتية ، مقياس 22 ثانية ، 2 بوصة ، نمط نقطة 2
50 ومايكرو ؛ L زر غسيل الكلىهامبتون للأبحاثHR3-326
50 مل دورق زجاجيDIAMONDHA.1010D.50
& Auml ؛ KTA نقي 25 لترCytiva29018224FPLC
Amicon Ultra-15 وحدة تصفية الطرد المركزيMilliporeUFC905024 50-KDa NMWL
Bradford ReagentSupelcoB6916
Dumoxel Style N5Dumont0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEMThermoFisher ScientificGLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgCytiva28989335
1.5 ملHD MicroH23015
أنابيب PCR 0.2 مل ، غطاء مسطحAxygenPCR-02-C
PELCO easiوحدة تفريغ التوهجالتوهج تيد بيلا91000
PELCO TEM كتلة حامل الشبكةتيد بيلا16820-25
Quantifoil R 1.2 / 1.3 200 شبكة ، مجهر إلكتروني النحاس العلومQ2100CR1.3
Spectra / Por 3 RC أنابيب غشاء غسيل الكلى  فيشر ساينتفيك086705B3500 دالتون MWCO
Superose 6 زيادة 10/300 GLCytiva29091596
أسيتات UranylMerck8473
Vitrobot Mark IVThermoFisher ScientificVITROBOT
VitroEase مجموعة فحص العازلة والمنظفاتThermoFisher ScientificA49856
أنبوب الطرد المركزي الصغير

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faruqi, A. R., Mcmullan, G. Electronic detectors for electron microscopy. Q Rev Biophys. 44 (3), 357-390 (2011).
  2. Hamaguchi, T., et al. A new cryo-EM system for single particle analysis. J Struct Biol. 207 (1), 40-48 (2019).
  3. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-Em single-particle analysis in relion-4.0. Biochem J. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  4. Punjani, A., Fleet, D. J. 3Dflex: Determining structure and motion of flexible proteins from cryo-Em. Nat Methods. 20 (6), 860-870 (2023).
  5. Chen, M., Schmid, M. F., Chiu, W. Improving resolution and resolvability of single-particle cryo-EM structures using gaussian mixture models. Nat Methods. 21 (1), 37-40 (2024).
  6. Arnold, S. A., et al. Miniaturizing em sample preparation: Opportunities, challenges, and "visual proteomics". Proteomics. 18 (5-6), e1700176(2018).
  7. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 6), 560-571 (2018).
  8. Han, B. G., Avila-Sakar, A., Remis, J., Glaeser, R. M. Challenges in making ideal cryo-Em samples. Curr Opin Struct Biol. 81, 102646(2023).
  9. Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-em single-particle analysis. J Biol Chem. 294 (13), 5181-5197 (2019).
  10. Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nat Commun. 8 (1), 629(2017).
  11. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  12. Liu, Y. T., Hu, J., Zhou, Z. H. Resolving the preferred orientation problem in cryo-EM reconstruction with self-supervised deep learning. Microsc Microanal. 29 (Supplement_1), 1918-1919 (2023).
  13. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1863 (3), 183533(2021).
  14. Li, B., Zhu, D., Shi, H., Zhang, X. Effect of charge on protein preferred orientation at the air-water interface in cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 213 (4), 107783(2021).
  15. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005(2019).
  16. Da Fonseca, P. C. A., Morris, E. P. Cryo-EM reveals the conformation of a substrate analogue in the human 20s proteasome core. Nature Commun. 6 (1), 7575(2015).
  17. Nguyen, T. H. D., et al. Cryo-EM structure of the yeast u4/u6.U5 tri-snrnp at 3.7 å resolution. Nature. 530 (7590), 298-302 (2016).
  18. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. J Struct Biol. 170 (1), 152-156 (2010).
  19. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-em grids. J Struct Biol. 204 (1), 80-84 (2018).
  20. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Sci Rep. 4 (1), 7084(2014).
  21. Patel, A. B., et al. Structure of human tfiid and mechanism of TBP loading onto promoter DNA. Science. 362 (6421), eaau8872(2018).
  22. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482 (7384), 186-191 (2012).
  23. Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-em. J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).
  25. Xu, Y., Dang, S. Recent technical advances in sample preparation for single-particle cryo-em. Front Mol Biosci. 9, 892459(2022).
  26. Lee, J., Ryu, B., Kim, T., Kim, K. K. Cryo-em structure of a 16.5-kda small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii. Int J Biol Macromol. 258 (Pt 1), 128763(2024).
  27. Kim, K. K., Kim, R., Kim, S. H. Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature. 394 (6693), 595-599 (1998).
  28. Chakavarti, B., Chakavarti, D. Electrophoretic separation of proteins. J Vis Exp. (16), e758(2008).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Kim, K. K., et al. crystallization, and preliminary x-ray crystallographic data analysis of small heat shock protein homolog from Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. J Struct Biol. 121 (1), 76-80 (1998).
  31. Kim, R., et al. On the mechanism of chaperone activity of the small heat-shock protein of Methanococcus jannaschii. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (14), 8151-8155 (2003).
  32. Shi, J., Koteiche, H. A., Mchaourab, H. S., Stewart, P. L. Cryoelectron microscopy and EPR analysis of engineered symmetric and polydisperse hsp16.5 assemblies reveals determinants of polydispersity and substrate binding. J Biol Chem. 281 (52), 40420-40428 (2006).
  33. Kim, R., Kim, K. K., Yokota, H., Kim, S. H. Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (16), 9129-9133 (1998).
  34. Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. J Pharm Sci. 106 (3), 713-733 (2017).
  35. Collins, B., Stevens, R. C., Page, R. Crystallization optimum solubility screening: Using crystallization results to identify the optimal buffer for protein crystal formation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 12), 1035-1038 (2005).
  36. D'arcy, A. Crystallizing proteins - A rational approach. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50 (Pt 4), 469-471 (1994).
  37. Jancarik, J., Pufan, R., Hong, C., Kim, S. H., Kim, R. Optimum solubility (os) screening: An efficient method to optimize buffer conditions for homogeneity and crystallization of proteins. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 9), 1670-1673 (2004).
  38. Zhang, C. Y., et al. A strategy for selecting the ph of protein solutions to enhance crystallization. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69 (Pt 7), 821-826 (2013).
  39. Basanta, B., Hirschi, M. M., Grotjahn, D. A., Lander, G. C. A case for glycerol as an acceptable additive for single-particle cryo-EM samples. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (Pt 1), 124-135 (2022).
  40. Michon, B., et al. Role of surfactants in electron cryo-microscopy film preparation. Biophys J. 122 (10), 1846-1857 (2023).
  41. Chen, S., Li, J., Vinothkumar, K. R., Henderson, R. Interaction of human erythrocyte catalase with air-water interface in cryo-EM. Microscopy (Oxf). 71 (Supplement_1), i51-i59 (2022).
  42. Vinothkumar, K. R., Henderson, R. Single particle electron cryomicroscopy: Trends, issues and future perspective. Q Rev Biophys. 49, e13(2016).
  43. Kim, L. Y., et al. Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow. Front Mol Biosci. 5, 50(2018).
  44. Bagby, S., Tong, K. I., Liu, D., Alattia, J. R., Ikura, M. The button test: A small scale method using microdialysis cells for assessing protein solubility at concentrations suitable for NMR. J Biomol NMR. 10 (3), 279-282 (1997).
  45. Gewering, T., Januliene, D., Ries, A. B., Moeller, A. Know your detergents: A case study on detergent background in negative stain electron microscopy. J Struct Biol. 203 (3), 242-246 (2018).
  46. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  47. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em. Nat Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  48. Earl, L. A., Falconieri, V., Milne, J. L., Subramaniam, S. Cryo-EM: Beyond the microscope. Curr Opin Struct Biol. 46, 71-78 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة