مقالة منهجية

الثقافة الدبقية المعوية للخيول وتطبيقها على دراسة آلية الالتهاب العصبي في مغص الخيول

1.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67244

⸱

أكتوبر 4, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

في هذه المقالة

ملخص

أصبحت الخلايا الدبقية المعوية معروفة بشكل متزايد لأدوارها في التوازن المعوي وعمليات المرض ، بما في ذلك مضاعفات ما بعد الجراحة. يعاني مرضى الخيول الذين يتعافون من شق البطن الاستكشافي الطارئ من مخاطر عالية للإصابة بحالات التهابية بعد الجراحة ، مما يسلط الضوء على أهمية إنشاء ثقافة الخلايا الدبقية الدبقية المعوية المعوية القابلة للتكرار للدراسة.

الملخص

لا تساهم الحالات الالتهابية بعد الجراحة لمغص الخيول (البطن الحاد) في زيادة تكلفة العميل ، وعدم الراحة للمريض ، ووقت الاستشفاء ، ولكن في كثير من الحالات ، تثبت أنها مهددة للحياة. يتم التعرف بشكل متزايد على مجموعة فريدة من الخلايا المعوية ، الخلايا الدبقية المعوية ، لدورها في استشعار بيئة الجهاز الهضمي والتواصل مع أنواع الخلايا المحيطة. قد تكون التفاعلات بين الخلايا الدبقية المعوية والظهارة المعوية حاسمة في تحديد كيف يمكن للدبقية المعوية للخيول تغيير الحاجز المخاطي لتعديل الالتهاب في الصحة والمغص.

لدراسة هذا التفاعل ، نقدم طريقة لإنشاء الثقافات الدبقية المعوية الأولية للخيول من صائم الخيول وتعريض الثقافات لحالات التهابية معروفة بوجودها في المغص. تم الحصول على الثقافات الدبقية المعوية الأولية من الخيول البالغة التي تم قتلها لأسباب لا علاقة لها بالمغص. تم تشريح الزغابات المعوية والصفيحة المخصوصة بشكل دقيق لفضح تحت الغشاء المخاطي. خضع تحت الغشاء المخاطي المعزول للهضم الأنزيمي مع الكولاجيناز والبروتياز وألبومين مصل الأبقار لمدة 2-3 ساعات. بعد ذلك ، أسفر الهضم الميكانيكي الذي يتضمن الطرد المركزي ، والماصات ، ومصافي الخلايا (40-100 ميكرومتر) عن حبيبات تستخدم للطلاء على 0.05 مجم / مل من الآبار المطلية ب poly-L-lysine بتركيز ~ 400,000 خلية / 300 ميكرولتر من الوسائط.

بعد التقاء والمرور الأول ، تعرضت الخلايا الدبقية المعوية بعد ذلك لمؤتلف الخيول IL-1β (0 ، 10 ، 25 نانوغرام) لمدة 24 ساعة. لنمذجة التفاعلات الظهارية الدبقية في وقت المغص ، تمت إضافة الوسط المشروط إما عن طريق التحكم أو الخلايا الدبقية المعوية المعالجة مباشرة إلى الطبقات الأحادية الصائمية للخيول المتجمعة أثناء قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) باستخدام غرفة EndOhm مزدوجة القطب. توضح هذه البيانات واحدا فقط من العديد من التطبيقات المؤثرة المحتملة للثقافة الدبقية المعوية للخيول.

المقدمة

مغص الخيول هو أكثر الشكوى الطبية انتشارا للاستشارة الطارئة1. مع ما يصل إلى 17٪ من تلك الخيول التي تتطلب تصحيحا جراحيا ، يجب أن تكون الجهود المبذولة لزيادة نتائج ما بعد الجراحة في طليعة الأبحاث الطبية للخيول2. حاليا ، يعاني مرضى المغص بعد الجراحة من مخاطر عالية للعديد من الاضطرابات التي تهدد الحياة بما في ذلك الإنتان / صدمة التسمم الداخلي (12.3٪ من المرضى) واللفائص بعد الجراحة (13.7٪ من المرضى)3. على الرغم من التقدم المحرز في علاج مضاعفات ما بعد الجراحة، لا تزال هناك حاجة إلى علاجات متقدمة للوقاية من هذه الحالات أو علاجها.

سلطت الأبحاث الحديثة الضوء على الحالة الالتهابية الموضعية والجهازية لمرضى المغص4. على سبيل المثال ، ثبت أن البروتينات المسببة للالتهابات مثل عامل نخر الورم (TNF) ألفا ، وإنترلوكين 1β (IL-1β) ، وإنترلوكين 6 (IL-6) ، وبروتين الجذب الكيميائي أحادي الخلية -1 ، قد زادت بشكل كبير في التعبير في الغشاء المخاطي للأمعاء المغص مقابل أنسجة الأمعاءالطبيعية 4. من وجهة نظر جهازية ، فقد ثبت أن زيادة عامل نخر الورم ألفا في أنسجة الأمعاء يرتبط بزيادة خطر الإصابة بالارتجاع الأنفي المعدي بعد الجراحة أكبر من 2 لتر ، وهو قياس عام لخلل الحركة بعد الجراحة4. من المعروف أيضا أن إعطاء الإنترلوكين IL-1β و TNF alpha قادر على إحداث علامات سريرية للصدمة الإنتانية5.

التفسير المحتمل للحالة الالتهابية للأنسجة المعوية المغصية وعلاقتها بمضاعفات ما بعد الجراحة هو الحاجز الظهاري المعوي. في الصحة ، توفر مجمعات الوصلات الضيقة التي تربط الطبقة المفردة من الظهارة العمودية التي تبطن الأمعاء حاجزا وظيفيا للحد من المحتوى اللمعي ومكوناته البكتيرية من الوصول إلى الفضاء تحت المخاطي ومجرى الدم. ومع ذلك ، فإن الانتفاخ والضرر الناجم عن انسداد الأمعاء المرتبط بالمغص والتلاعب المعوي أثناء الجراحة قد يعطل وظيفة الحاجز المعوي هذه.

فيما يتعلق بالمكونات الوظيفية لجدار الأمعاء ككل ، فقد ثبت أن الشبكة الدبقية المعوية تحت المخاطية داخل الجهاز العصبي المعوي حاسمة في التطور الفيزيولوجي المرضي لمضاعفات ما بعد الجراحة المرتبطة بالمسارات الالتهابية وقد توفر هدفا علاجيا محددا6،7،8،9. لا توجد الخلايا الدبقية المعوية في جميع أنحاء الجهاز الهضمي بأكمله فحسب ، بل إنها تعمل كأجهزة استشعار للبيئة المعوية ، وتؤثر على الإشارات مع العديد من أنواع الخلايا في جدار الأمعاء ، وتنظم الحاجز المعوي بشكل مباشر6. لذلك ، من المبرر افتراض أن هذه المستشعرات القوية للأمعاء سيتم تنشيطها عن طريق الإصابة والالتهاب ويمكن أن تنتج استجابة حادة مثل التغيرات في نفاذية الحاجز.

هذه الدراسة هي الأولى التي تصف ثقافة الخلايا الدبقية المعوية للخيول ، وبشكل أكثر تحديدا ، دور الخلايا الدبقية المعوية الالتهابية للخيول على وظيفة الحاجز المعوي. هنا ، نقدم طرق الاستزراع الأولي للخلايا الدبقية المعوية تحت المخاطية للخيول واستجابتها للتعرض ل IL-1β الالتهابي ، وتقييم تأثير المنتجات الدبقية المعوية بعد التعرض ل IL-1β على نفاذية الطبقات الأحادية للخلايا المعوية للخيول ، والحصار المحتمل من خلال تطبيق مصل الخيول.

البروتوكول

تم الحصول على الثقافات الدبقية المعوية للخيول الأولية من ثلاثة خيول قتلت رحيما إنسانيا بجرعة زائدة من الباربيتورات لأسباب لا علاقة لها بهذه الدراسة. كانت الخيول المختارة لدراسات الاستزراع عبارة عن خيول بالغة ليس لها تاريخ حالي من أمراض الجهاز الهضمي.

1. تحت المخاطية الخيول المزرعة الدبقية المعوية الأولية

  1. قم بزراعة طبقات أحادية ظهارية للخيول من الخبايا الصائمة التي تم الحصول عليها من ثلاثة خيول خيول بالغة منفصلة.
    1. قم بتغطية الألواح المكونة من 24 بئرا بمحلول الطلاء لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة ، واغسلها مرتين بالماء المعقم ، وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح الخلايا جاهزة للطلاء.
    2. بعد القتل الرحيم الإنساني ، في غضون 60 دقيقة ، قم بإزالة جزء من الصائم وضعه في محلول رينجر البارد على الجليد.
    3. قم بإزالة جزء 10 سم من الصائم وافتحه عند الحدود المعوية للحفاظ على المناطق غير اللمفاوية في وسط الأنسجة. قم بقص الجزء إلى قسم 7 سم × 7 سم تقريبا. اشطف المنديل جيدا بمحلول رينجر الطازج قبل التشريح.
    4. قم بتثبيت الأنسجة على طبق بتري مغطى بالسيليكون المطاط الصناعي في محلول Ringer البارد أو الجانب المخاطي PBS لأعلى ، مع تمديد الأنسجة قدر الإمكان (الشكل 1 أ).
    5. قم بإزالة الزغابات المعوية باستخدام ملقط منحني (الشكل 1 ب) متبوعة بطبقة الصفيحة المخصوصة من المنطقة غير اللمفاوية التي يبلغ حجمها حوالي 5 سم × 5 سم (الشكل 1 ج).
      ملاحظة: تنفصل هذه الطبقات بسهولة عن تحت الغشاء المخاطي (الشكل 1 ب).
    6. قم بإزالة الغشاء المخاطي في ورقة واحدة عن طريق تحريره بمقص التشريح المجهري في إحدى الزوايا ولاحظ الفصل الطبيعي أثناء تقشير تحت الغشاء المخاطي بعيدا عن الطبقة العضلية الدائرية الداخلية للصائم (الشكل 1 د).
    7. قم بفرم الطبقة تحت المخاطية المجمعة إلى قطع 2-5 مم وضعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 5 مل من "Organo-FBS" (الجدول 1) ، و 0.825 مجم من الكولاجيناز ، و 5 مجم من البروتياز ، و 20 مجم من ألبومين مصل الأبقار. احتضان الأنسجة لمدة 2-3 ساعات عند 37 درجة مئوية للهضم الأنزيمي.
    8. بعد الحضانة ، أضف 10 مل من درجة حرارة الغرفة "Organo + FBS" لإيقاف عمل الإنزيم. قم بتقطيع خليط الأنسجة لأعلى ولأسفل بمقدار 15 مرة تقريبا باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل لفصل الخلايا عن الأنسجة ثم جهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    9. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 10 مل من PBS بدرجة حرارة الغرفة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل مرة أخرى حوالي 15 ضعفا باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل لفصل الخلايا عن الأنسجة.
    10. جهاز الطرد المركزي للأنبوب المخروطي عند 3,000 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بمقدار 10 مل من درجة حرارة الغرفة "Organo + FBS" عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 15 مرة تقريبا باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل لفصل الخلايا عن الأنسجة.
    11. قم بتصفية الخلايا بشكل متسلسل من خلال 100 ميكرومتر ، و 70 ميكرومتر ، ثم مصفاة خلية بحجم المسام 40 ميكرومتر.
    12. الطرد المركزي للخلايا والوسائط المفلترة عند 3,000 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من "Organo + FBS".
    13. صبغة باستخدام التريبان الأزرق لتحديد الخلايا الحية وحسابها باستخدام مقياس الدم.
    14. قم بزرع ما يقرب من 400,000 خلية في 300 ميكرولتر من "Organo + FBS" في كل بئر من صفيحة 24 بئرا وأضف عوامل النمو إلى كل بئر: N2 5 ميكرولتر / بئر ، G5 5 ميكرولتر / بئر ، و B27 10 ميكرولتر / بئر. ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 للسماح للخلايا بالالتصاق. بعد أربع وعشرين ساعة ، قم بتغيير الوسائط إلى "وسائط الدبقية" (الجدول 1) مع عوامل النمو المذكورة أعلاه وقم بالتغيير كل 48 ساعة (الشكل 2).

2. علم الخلايا المناعي الفلوري

  1. قم بتنمية الخلايا الدبقية المعوية من الثقافة الأولية (P0) (الخطوة 2.1.14) إلى 70-80٪ التقاء ومرورها مرة واحدة (P1).
  2. قم بإصلاح خلايا الثقافة الأولية (P0) في الآبار باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 5 دقائق قبل تطبيق أزيد PBS 0.1٪.
  3. تحضير محلول التشبع الذي يتكون من أزيد PBS ، ومصل حمار 4٪ ، و 0.5٪ Triton-X. أضف 300 ميكرولتر من محلول التشبع إلى الآبار لنفاذية الخلايا لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
  4. أضف الجسم المضاد الأساسي للعلامة الدبقية ، والبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، والجسم المضاد الأساسي لعلامة الخلايا الليفية ، أكتين العضلات الملساء ألفا ، عند 1: 1,000 تخفيفات في محلول التشبع للحضانة الليلية عند 4 درجاتمئوية.
  5. اغسل 3x باستخدام PBS قبل إضافة جسم مضاد ثانوي للحمير المضاد للأرانب IgG Alexa Fluor 594 والماعز المضاد للفأر IgG Alexa Flour 488 عند تخفيف 1: 500 في محلول التشبع لمدة 2-3 ساعات.
  6. تلطيخ النوى ب 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) عند تخفيف 1: 1,000 في PBS لمدة 5 دقائق.
  7. بعد ثلاث غسلات باستخدام PBS ، قم بتخزين الخلايا في أزيد PBS بنسبة 0.1٪.

3. تحت المخاطية الخيول الدبقية المعوية الأولية التعرض IL-1β

  1. عندما تصل الخلايا من الممر الأول (P1) إلى التقاء 70-80٪ ، قم بإجراء تجربة التعرض ل IL-1β. تعريض الآبار إلى 0 نانوغرام و 10 نانوغرام و 25 نانوغرام من IL-1β لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، قم بتخزين الوسائط من كل بئر عند -80 درجة مئوية.

4. ثقافة العضوية للخيول لإنتاج الطبقات الأحادية المعوية

ملاحظة: باتباع بروتوكول Stewart et al. المنشور في عام 2018 ، تم توسيع الخبايا المعوية للخيول والبراعم التي تم تبريدها من أجل دراسات معوية ثنائية الأبعاد10.

  1. استخدم ما يقرب من 700-1,000 براعم / شظايا من الخفب (40,000-50,000 خلية عند تفكيكها إلى خلايا مفردة) لكل إدراج عبر البئر. قم بتغطية إدخالات الورسويل ب 42 ميكرولتر من 0.05٪ Matrigel قبل إضافة الخلايا المعوية. اسمح بتثبيت Matrigel على الملحق عن طريق الحضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجةمئوية ، قم بشفط الوسط الإضافي واترك الآبار تجف لمدة 30 دقيقة مكشوفة. أضف 200 ميكرولتر من وسط DMEM-F12 إلى كل إدراج عبر البئر وقم بتخزين اللوحة عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. اغسل فطائر Matrigel التي تحتوي على العضيات باستخدام PBS ثم عرضها إلى 500 ميكرولتر من استعادة الخلايا أثناء وجودها على الثلج. قم بتثبيتها بشكل متكرر لضمان الجمع الكامل للخلايا في أنبوب سعة 15 مل.
  3. الطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وتعليق حبيبات الخلية في الحجم المستهدف لوسط الخلايا الجذعية الظهارية المعوية (IESC). احسب الحجم المستهدف بضرب العدد المطلوب من الطبقات الأحادية في 200 ميكرولتر من الوسط. (الجدول 1).
  4. قم بتغطية حقنة سعة 1 مل مسبقا في وسائط IESC واستنشق معلق الخلية من خلال إبرة 16 جراما. استبدل إبرة 16 G بإبرة 28 G وقم بإخراج معلق الخلية من خلالها لتشجيع فصل العضيات.
  5. ضع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية الناتج في الجانب القمي من الآبار المطلية و 500 ميكرولتر من IESC بالإضافة إلى عوامل النمو الموصوفة سابقا على الجانب القاعدي من إدراج البئر10. قم بتغيير الوسائط وعوامل النمو كل 24-48 ساعة حتى يتم الوصول إلى التقاء. حدد الالتقاء على أنه كثافة الخلية المقابلة ل TEER البالغ 1,000 أوم × سم 2,11. للقياس ، انظر الخطوة 5.1.

5. نفاذية أحادية الطبقة للخلايا المعوية للخيول بعد التعرض للسيتوكينات الالتهابية والمنتجات الدبقية المعوية للخيول

  1. استخدم غرفة قياس TEER مزدوجة القطب لتحديد TEER عبر الطبقات الأحادية وإنشاء قراءة أساسية عبر كل غشاء قابل للاختراق عبر البئر. تأكد من أن وسائط IESC والبئر لديهم 15 دقيقة للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل إجراء القياسات. املأ كوب الاستزراع ب 1.5 مل من وسائط IESC وتأكد من وجود 200 ميكرولتر من الوسائط بالضبط داخل ملحق الوصلة بحيث تتطابق خطوط السوائل في وقت القياس.
  2. تعريض الجانب القاعدي الجانبي لإدخالات transwell إما للسيتوكينات الالتهابية من 25 نانوغرام IL-1β و 10 نانوغرام و 25 نانوغرام إنترلوكين 6 (IL-6) لكل بئر ، أو المنتجات الدبقية للثقافات المعرضة ل 10 نانوغرام أو 25 نانوغرام IL-1β. كشف الجانب القاعدي الجانبي لإدخالات الآبار الصلبة للتحكم في الوسائط الدبقية ، ووسائط الدبقية من الثقافات غير المعرضة ل IL-1β.
  3. قم بقياس TEER لمدة 45 دقيقة على فترات تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة عن طريق وضع كل بئر في كوب الاستزراع.

6. الإحصاء

  1. احسب تغيير الطي ل TEER لكل بئر للنقاط الزمنية: 0 و 10 و 20 و 30 و 45 دقيقة.
  2. باستخدام البرنامج المفضل (انظر جدول المواد) ، قارن الارتباطات بين انخفاض TEER والتعرض القاعدي الجانبي ل IL-1β (25 نانوغرام) ، IL-6 (10 نانوغرام ، 25 نانوغرام ، و 100 نانوغرام) ، ووسائط الدبقية (المعرضة ل 0 نانوغرام IL-1β ، 10 نانوغرام IL-1β ، و 25 نانوغرام IL-1β) للتحكم في الوسائط باستخدام اختبار t أحادي الذيل غير المزاوج.

النتائج

يمكن أن ينتج عن التشريح الدقيق لصائم الخيول إلى الطبقة تحت المخاطية (الشكل 1) مع مزيد من الهضم الأنزيمي والميكانيكي ، مزارع خلايا قابلة للحياة من الخلايا الدبقية المعوية للخيول. أظهرت الخلايا تعدد الأشكال مع هيمنة الخلايا على شكل مغزل بما يتوافق مع الخلايا الدبقية المعوية للأنواع الأخرى (الشكل 2 أ). كانت الثقافات إيجابية للعلامة الدبقية الانتقائية ، البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، مع تلوث منخفض بالخلايا الليفية (alpha SMA ، الشكل 2 ب). في بعض الحالات ، لم يتم التحكم في التشريح المجهري للطبقات تحت المخاطية بدرجة عالية بما فيه الكفاية ، وكانت الثقافات ملوثة بنسب عالية من الخلايا الليفية التي لوحظت من خلال التألق المناعي لأكتين العضلات الملساء لعلامة الخلايا الليفية (الشكل 3).

بعد ذلك ، كمثال على فائدة الثقافة الدبقية المعوية للخيول ، تم تقييم تأثير الخلايا الدبقية المعوية المعرضة ل IL-1β على وظيفة الحاجز الظهاري المعوي. أدى التعرض القاعدي الجانبي للوسائط من مزرعة الدبقية المعوية تحت المخاطية للخيول المعرضة ل 10 نانوغرام و 25 نانوغرام IL-1β لمدة 24 ساعة إلى زيادة النفاذية بشكل ملحوظ (p = 0.05 و 0.04 ، على التوالي ، متوسط وسائط التحكم = 0.9 ، متوسط مجموعة IL-1β الدبقية 10 نانوغرام = 0.8 ، فاصل الثقة 95٪ = -0.2 إلى 0.02 ، متوسط مجموعة الدبقي 25 نانوغرام IL-1β = 0.8 ، فاصل الثقة 95٪ = -0.1995 إلى 0.01060 ، ن = 3-4) (الشكل 4 أ). ومع ذلك ، فإن تعرض الطبقات الأحادية الظهارية للخيول القاعدية الجانبية 10-25 نانوغرام للخيول IL-6 ، وهو سيتوكين التهابي ثبت أنه يتم إنتاجه بواسطة الخلايا الدبقية المعوية المعرضة ل IL-1β وللحث على زيادة نفاذية الخلايا المعوية في نماذج القوارض12 ، لم يزيد بشكل كبير من نفاذية أحادية الطبقة للخلايا المعوية للخيول (الشكل 4 ب)

figure-results-1
الشكل 1: عزل الخلايا الدبقية المعوية عن الصائم الخيلي عن طريق التشريح المجهري والهضم الأنزيمي والميكانيكي. (أ) تم قطع الصائم على طول الحدود المعوية وتثبيت جانب الغشاء المخاطي لأعلى. (ب) تم تصور الزغابات المعوية عن طريق الفحص المجهري وإزالتها بكشط لطيف حتى تم تصور الصفيحة الناعمة. (ج) ثم تمت إزالة طبقة الصفيحة المخصومة حتى أصبحت ألياف العضلات الملساء مرئية فقط من خلال تحت الغشاء المخاطي الشفاف. (د) تم وضع الخيام تحت الغشاء المخاطي وتقشيره من الطبقة العضلية ، مما أدى إلى إجراء جروح في العلامات الليفية حسب الحاجة. تم الحصول على الصور بواسطة مجهر تشريح 10x (B ، C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تصوير ثقافات الخلايا الدبقية المعوية تحت المخاطية للخيول. (أ) تم تقدير التشكل النجمي (الأسهم) والمغزلي (رأس السهم المفتوح) والعقدي (رأس السهم المغلق) للدبقية المعوية للخيول من خلال الفحص المجهري المتباين للطور. (ب) تم تقييم نقاء الثقافات عن طريق تلطيخ GFAP ، وبالنسبة لعلامة الخلايا الليفية ، قضبان مقياس أكتين العضلات الملساء = 100 مم (A) ، 400 مم (B). الاختصارات: GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي. DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تصوير مزارع الخلايا الدبقية المعوية تحت المخاطية غير الناجحة للخيول. تم تقييم نقاء الثقافات عن طريق تلطيخ GFAP (أحمر) ، وعلامة الخلايا الليفية ، أكتين العضلات الملساء (الأخضر) ، مما يدل على نسبة كبيرة من تلوث الخلايا الليفية. يشير رأس السهم الأصفر إلى GFAP وأكتين العضلات الملساء برأس السهم الأبيض. شريط المقياس = 400 مم. اختصار: GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: TEER أحادي الطبقة الظهارية للخيول بعد التعرض للسيتوكين الالتهابي والمنتجات الدبقية الالتهابية. (أ) التعرض القاعدي الجانبي لوسائط من ثقافة الخلايا الدبقية المعوية تحت المخاطية للخيول ، المعرضة ل 10 نانوغرام و 25 نانوغرام من IL-1β لمدة 24 ساعة ، زاد بشكل كبير من النفاذية (* ص = 0.05 و 0.04 ، على التوالي ، ن = 3-4). (ب) لم يؤد التعرض الحاد للخلايا المعوية للخيول أحادية الطبقة إلى القاعدي الجانبي 25 نانوغرام من IL-1β و 10-25 نانوغرام من IL-6 للخيول إلى زيادة كبيرة في نفاذية الطبقة الظهارية الأحادية للخيول (ن = 2-4). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: كواشف العزل والثقافة. تم استخدام الكواشف التالية لصياغة وسائط لعزل الخلايا الدبقية المعوية للخيول ، والثقافة الدبقية المعوية ، وزراعة الخلايا الجذعية الظهارية المعوية للخيول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير طريقة قابلة للتكرار للثقافة الأولية للخلايا الدبقية المعوية تحت المخاطية للخيول وإثبات تطبيقها على نمذجة التفاعلات الظهارية الدبقية في وقت المغص. أثبتت عزل الخلايا الدبقية المعوية وثقافتها ، وهي جديدة في الحصان ، أنها مفيدة في فهم مسارات الأمراض المعوية في نماذج الخنازير والقوارض وفي البشر6،7،13،14. من المحتمل أن تكون دراسة هذه المجموعة من الخلايا مهمة بسبب دورها كأجهزة استشعار تحت الظهارية للبيئة المعوية ، فضلا عن قدرتها على التفاعل مع الخلايا المحيطة داخل جدار الأمعاء والتواصل معها. بفضل قدرتهم على الاستشعار الشديد ، ليس من الصعب تخيل دور حاسم محتمل للدبقية في مغص الخيول ، حيث يتم إجهاد أنسجة الأمعاء بسبب الانتفاخ ونقص التروية وربما التلاعب الجراحي6.

أظهر العمل السابق الذي قام به Lisowski et al. الحالة الالتهابية المتزايدة لأنسجة الأمعاء للخيول في وقت جراحة المغص. يتم تسليط الضوء على أهمية التخفيف من هذه البيئة الالتهابية من خلال مزارع الدبقية المعوية للقوارض التي أثبتت قدرتها على تصنيع المنتجات مع القدرة على تعطيل وظيفة الحاجز المعوي7،12. لن يؤدي تسرب محتويات اللمعة المعوية إلى جدار الأمعاء إلى استجابة التهابية فحسب ، بل سيؤدي أيضا إلى تسلل محتمل إلى الدورة الدموية ، مما قد يؤدي بعد ذلك إلى حدوث صدمة / تعفن الدم. يعاني مرضى مغص الخيول بعد الجراحة للأسف من العديد من المضاعفات الالتهابية القائمة على الجراحة ، بما في ذلك الإنتان والعلص بعد الجراحة ، والتي لا تقلل من البقاء على قيد الحياة وراحة المريض فحسب ، بل تزيد أيضا من تكاليف العميل والضيق العاطفي3. قد يوضح إنشاء نموذج للتفاعلات الظهارية الدبقية في وقت المغص مسارا محتملا لنفاذية الحاجز المعوي للخيول في المغص ، والوقاية المحتملة.

تتضمن ثقافة الخلايا الدبقية المعوية تحت المخاطية للخيول تكيفات وقيودا بسبب خصائص الأنواع. الأهم من ذلك ، أن طول الوقت المطلوب للهضم الأنزيمي الفعال يتطلب المعايرة. وجد المؤلفون أن الحضانة بالإنزيمات لمدة 2-3 ساعات عند 37 درجة مئوية كانت ضرورية للعزل الناجح للخلايا الدبقية المعوية للخيول. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن السماح للمزارع المعوية للخيول بالوصول إلى أكثر من 80٪ من التقاء قبل المرور يضر بصلاحية الثقافة. القيد الرئيسي لهذه الطريقة في هذا التاريخ هو حجم العينة. تضمنت هذه الدراسة فقط الأنسجة / الخلايا التي تم الحصول عليها من الخيول التي تخضع لجراحة المغص أو القتل الرحيم لأسباب غير متعلقة بالدراسة. سيؤدي استمرار استزراع الخلايا الدبقية المعوية للخيول من مواضيع إضافية ، بالإضافة إلى تطوير بروتوكول لتجميد وتخزين الخلايا الدبقية المعوية للخيول إلى زيادة قوة هذه الدراسة بشكل كبير.

تقدم هذه الدراسة الفائدة الجديدة للثقافة الدبقية المعوية تحت المخاطية للخيول والثقافة الأولية للخلايا المعوية للخيول كمنهجيات محتملة للمساعدة في فهم مغص الخيول وأمراض الجهاز الهضمي. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن الطبقات الأحادية الظهارية للخيول المزروعة من الخبايا المعوية المعزولة والعضيات قد تم ترسيخها في الماضي ، فإن هذه الدراسة لم تستمر فقط في عرض فائدتها كنموذج ولكنها تشجع أيضا على إجراء دراسات إضافية لفحص التفاعل مع الخلايا المعوية المعوية للخيول وأنواع الخلايا الأخرى الموجودة داخل جدار الأمعاء.

تحتوي التفاعلات الملحوظة بين هذه الأنواع من الخلايا على تطبيقات محتملة لكل من المغص واضطرابات الجهاز الهضمي الالتهابية الأخرى مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) والتهاب القولون. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التحسين المستمر لطرق استزراع الخلايا الدبقية المعوية والخلايا المعوية سيسمح بإجراء دراسات للزراعة المشتركة في المستقبل. علاوة على ذلك ، بينما تركز الدراسة الحالية على مجموعة الدبق المعوي تحت المخاطية نظرا لقربها من الطبقة الأحادية الظهارية والتركيز على وظيفة الحاجز المعوي ، يمكن إجراء عمل إضافي لثقافة وتقييم وظيفة الدبقي المعوي للخيول من الضفيرة العضلية المعوية لجدار الأمعاء ، مما قد يساعد في تحديد تأثير الخلايا الدبقية المعوية الالتهابية للخيول على الحركة15.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا مؤسسة موريس للحيوانات على تمويلهم لهذا المشروع.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 متر عازلة HEPESGibco15630-080
10 ملي مولار HEPESLife Technologies15630-106
2 ملي مولار GlutaMAXLife Technologies25050-061
4 ' 6-Diaminidino-2-PhenylindolInvitrogenD3571
Advanced DMEM / F12Life Technologies12634-010
Alpha العضلات الملساء الأكتين الجسم المضادAbcam7817
Amphotericin BSigmaAA95294.4 جم / مل مخزون المخزون ، التركيز النهائي 1.1 & micro ؛ جم / مل
مضاد للميكروكات 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
مصل الأبقار الألبومينSigmaAA3311
BSA 50 مجم / مل محلول مخزونSigmaA3311
CaCL2ACROS Organiics206791000مكون من Equine Ringer ' s Stock 1: يمزج مع المكونات الأخرى ، ثم يضاف 100 مل من هذا المرق إلى أسطوانة متدرجة ويخفف إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع 5٪ CO2.
امزجه مع Equine Ringer s Stock 2 لإكمال " رنجر الحل".
الكولاجينازسيجما9891
DMEM-F12 وسائل الإعلامثيرموفيشر 11320033
حمار مضاد للأرانب IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm غرفة قياس TEER مزدوجة القطبEVM-EL-03-01
دليل EVOM لقياس TEERالدقة العالميةEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
محلول جنتاميسينSigmaG1272التركيز النهائي 20 & جم / مل
الأجسام المضادة GFAPAbcam4674
الماعز المضادة للفأر IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1 & beta ؛ ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500مكون من Equine Ringer s Stock 1: يمزج مع المكونات الأخرى ، ثم يضاف 100 مل من هذا المرق إلى أسطوانة متدرجة ويخفف إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع 5٪ CO2.
امزجه مع Equine Ringer s Stock 2 لإكمال " رنجر الحل".
محلول L-glutamineCorning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500مكون من Equine Ringer s Stock 1: يمزج مع المكونات الأخرى ، ثم يضاف 100 مل من هذا المرق إلى أسطوانة متدرجة ويخفف إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع 5٪ CO2.
امزجه مع Equine Ringer s Stock 2 لإكمال " رنجر الحل".
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1مكون من جرس الخيول s Stock 2: يمزج مع المكونات الأخرى ، ثم يضاف 100 مل من هذا المرق إلى أسطوانة متدرجة ويخفف إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع 5٪ CO2.
امزجه مع Equine Ringer s Stock 1 لإكمال " رنجر الحل".
NaClThermo FisherS271-10مكون من Equine Ringer s Stock 1: يمزج مع المكونات الأخرى ، ثم يضاف 100 مل من هذا المرق إلى أسطوانة متدرجة ويخفف إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع 5٪ CO2.
امزجه مع Equine Ringer s Stock 2 لإكمال " رنجر الحل".
NaH2PO4ثيرمو فيشرBP329-500مكون من جرس الخيول s Stock 2: يمزج مع المكونات الأخرى ، ثم يضاف 100 مل من هذا المرق إلى أسطوانة متدرجة ويخفف إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع 5٪ CO2.
امزجه مع Equine Ringer s Stock 1 لإكمال " رنجر الحل".
NaHCO3Thermo FisherS637-212مكون من Equine Ringer s Stock 2: يمزج مع المكونات الأخرى ، ثم يضاف 100 مل من هذا المرق إلى أسطوانة متدرجة ويخفف إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع 5٪ CO2.
امزجه مع Equine Ringer s Stock 1 لإكمال " رنجر الحل".
حل القلم / البكتيريا العقديةالجوزاء400-109
بولي إل ليسينسيجماP26360.5 مجم / مل في 1x عازلة بورات
برنامج منشورGraphPad
ProteaseSigmaP4630
محلول بيكربونات الصوديومSigmaS8761محلول مخزون 7.5٪
الكهربائي العالمية أدوات

المراجع

  1. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).
  2. Morton, A. J., Blikslager, A. T. Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001). Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).
  3. French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications. Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).
  4. Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection. Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).
  5. Sheats, M. K. A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils. Front Vet Sci. 6, 69(2019).
  6. Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols. Front Pharm. 11, 583422(2020).
  7. Stoffels, B., et al. Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia. Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).
  9. Savidge, T. C., et al. Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione. Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).
  10. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).
  11. Hellman, S. Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics. Vet Res. 52 (1), 108(2021).
  12. Al-Sadi, R., et al. Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene. PLoS One. 9 (3), e85345(2014).
  13. Ochoa-Cortes, F., et al. Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).
  14. Ziegler, A. L., et al. Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).
  15. Grubišić, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

1
الثقافة الدبقية المعوية للخيول وتطبيقها على دراسة آلية الالتهاب العصبي في مغص الخيول
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.