مقالة منهجية

الظهارية المشتقة من iPSC ، واللحمة المتوسطة ، والبطانية ، والزراعة المشتركة للخلايا المناعية لنمذجة سلامة حاجز مجرى الهواء في صحة الرئة وأمراضها

DOI:

10.3791/67247

⸱

ديسمبر 6, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sanford Consortium for Regenerative Medicine, 2Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 3Department of Pediatrics, University of California, San Diego School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المقالة توليد نموذج حاجز مجرى الهواء المعقد متعدد الخلايا الذي يتكون من ظهارة الرئة المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) ، واللحمة المتوسطة ، والخلايا البطانية ، والضامة في ثقافة واجهة الهواء والسائل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون أنسجة الرئة البشرية من شبكة مترابطة من الظهارة واللحمة المتوسطة والبطانة والخلايا المناعية من مجرى الهواء العلوي للبلعوم الأنفي إلى أصغر كيس سنخي. تعتبر التفاعلات بين هذه الخلايا حاسمة في نمو الرئة وأمراضها ، وتعمل كحاجز ضد المواد الكيميائية الضارة ومسببات الأمراض. تستخدم نماذج الزراعة المشتركة الحالية في المختبر خطوط خلايا خالدة ذات خلفيات بيولوجية مختلفة ، والتي قد لا تمثل بدقة البيئة الخلوية أو تفاعلات الرئة. ميزنا iPSCs البشرية إلى عضيات الرئة 3D (تحتوي على كل من الظهارة واللحمة المتوسطة), الخلايا البطانية, والضامة. تم استزراعها بشكل مشترك في شكل واجهة هواء سائلة (ALI) لتشكيل حاجز قمي ظهاري / وسيط مستثمر مع البلاعم والحاجز البطاني القاعدي الجانبي (iAirway). أظهرت iAirways المشتقة من iPSC انخفاضا في سلامة الحاجز استجابة للعدوى بفيروسات الجهاز التنفسي وسموم السجائر. يوفر نظام زراعة الرئة المشترك متعدد السلالات منصة لدراسة التفاعلات الخلوية ومسارات الإشارات والآليات الجزيئية الكامنة وراء نمو الرئة والتوازن وتطور المرض. تحاكي iAirways عن كثب علم وظائف الأعضاء البشري والتفاعلات الخلوية ، ويمكن إنشاؤها من iPSC المشتقة من المريض ، ويمكن تخصيصها لتشمل أنواعا مختلفة من الخلايا في مجرى الهواء. بشكل عام ، توفر نماذج iAirway المشتقة من iPSC أداة متعددة الاستخدامات وقوية لدراسة سلامة الحاجز لفهم الدوافع الجينية للأمراض بشكل أفضل ، والاستجابة لمسببات الأمراض ، والتنظيم المناعي ، واكتشاف الأدوية أو إعادة استخدامها في المختبر ، مع إمكانية تعزيز فهمنا وعلاجنا لأمراض مجرى الهواء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشمل حاجز الدم والهواء في الشعب الهوائية الكبيرة القصبة الهوائية والشعب الهوائية والقصيبات. يلعب دورا مهما في الحفاظ على صحة الجهاز التنفسي ويتكون من ظهارة مجرى الهواء والغشاء القاعدي والأوعية الدموية والخلايا البطانية والخلايا المناعية. تشمل الخلايا الظهارية الأولية في مجرى الهواء الخلايا القاعدية وخلايا النادي والخلايا المهدبة وخلايا الكأس. الخلايا القاعدية ، التي تعمل كخلايا جذعية لظهارة مجرى الهواء ، هي أسلاف متعددة القدرات ذات قدرات عالية على التكاثر والتجديد الذاتي ، مما يؤدي إلى ظهور خلايا ظهارية ناضجة في مجرىالهواء 1. خلايا النادي هي خلايا إفرازية غير مهدبة تساهم في الحفاظ على بطانة مجرى الهواء عن طريق إفراز البروتينات الواقية والمواد الخافضة للتوترالسطحي 2. تفرز خلايا الكأس ، الموجودة في التجويف وفي الغدد تحت المخاطية ، الميوسين لاحتجاز الحطام وحماية مجرى الهواء3. تعتبر الخلايا الهدبية جزءا لا يتجزأ من آلية السلم المتحرك الدائري الهدبية ، مما يمنع تراكم الكائنات الحية الدقيقةالضارة 4. يتكون الغشاء القاعدي من مصفوفة خارج الخلية ، والتي توفر الدعم الهيكلي5. القصبة الهوائية وبقية مجرى الهواء محاطة بشبكة غنية من الأوعية الدموية ، والتي تصطف على جانبيها الخلايا البطانية التي تلعب دورا حيويا في دعم وظيفة القصبة الهوائية من خلال توفير العناصر الغذائية والأكسجين ، وإزالة الفضلات ، وتنظيم الالتهاب ، والمساهمة في إصلاح الأنسجة وتكوين الأوعية6. أخيرا ، البلاعم في مجرى الهواء هي خلايا مناعية خاصة بالأنسجة ، وهي ضرورية لحماية الجهاز التنفسي من الالتهابات ، وإزالة الجسيمات المستنشقة ، والحفاظ على استجابة مناعيةمتوازنة 7.

تعتبر الإجراءات المنسقة للخلايا الظهارية واللحمة المتوسطة والبطانية وخلايا الضامة أمرا بالغ الأهمية لاستجابة مناعية فعالة لمسببات الأمراض في مجرى الهواء8. تشكل الخلايا الظهارية خط الدفاع الأول ضد الالتهابات الفيروسية من خلال العمل كحاجز مادي ، مع تقاطعات ضيقة تقيد مرور المواد الضارة. يساعد العمل المنسق للخلايا المهدبة وخلايا الكأس على احتجاز وإزالة الجسيمات المستنشقة ومسببات الأمراض والحطام4. بالإضافة إلى ذلك ، تنتج الخلايا الظهارية في مجرى الهواء السيتوكينات والكيموكينات لتجنيد الخلايا المناعية9. تحافظ الخلايا البطانية على سلامة الأوعية الدموية ، وتمنع انتشار الجزيئات الفيروسية عبر مجرى الدم ، وتنظم جزيئات الالتصاق (VCAM-1) لتسهيل التصاق الخلايا المناعية وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات لتجنيد الخلايا المناعية من مجرى الدم إلى موقعالإصابة 10. تبتلع البلاعم في مجرى الهواء وتهضم الجسيمات الفيروسية والخلايا المصابة والحطام ، وتقدم مستضدات فيروسية للخلايا التائية ، وتنتج السيتوكينات لتنشيط وتجنيد الخلايا المناعية الأخرى ، جنبا إلى جنب مع الإنترفيرون من النوع الأول لتثبيط تكاثر الفيروس11. تخلق الإجراءات المنسقة للخلايا الظهارية واللحمية المتوسطة والبطانية والضامة نظام دفاع قويا وديناميكيا يحمي مجرى الهواء من الالتهابات الفيروسية ويحافظ على صحة الجهاز التنفسي.

يعد فهم التفاعلات الديناميكية بين أنواع الخلايا المختلفة في الرئة البشرية أمرا بالغ الأهمية لفهم استجابة الرئة للالتهابات الفيروسية والأمراض الالتهابية وتوصيل الأدوية. تسمح الثقافات المشتركة في المختبر بدراسة إشارات الخلية الخلوية بين الظهارة والخلايا البطانية والخلايا المناعية الفطرية12. قمنا بتطوير أول نموذج رئة أصلي متعدد الخلايا مشتق من hiPSCsالخاصة بالمريض 13. يتضمن هذا كلا من مجموعات الخلايا الظهارية واللحمة المتوسطة ، التي تشكلت في اتجاه ثلاثي الأبعاد. بعد ذلك ، يمكن تمييز الخلايا السلفية للرئة إلى "عضوي مجرى الهواء"14 ، وزرعها على إدخالات ثقافة الخلايا المعقمة ، وتعريضها لواجهة الهواء والسائل (ALI) ، مما يكرر ظروف مجرى الهواء البشري15،16،17. يتم استزراع الخلايا البطانية المشتقة من iPSC على الجانب القاعدي الجانبي من الغشاء, محاكاة اتجاهها في مجرى الهواء البشري, تقع أسفل الطبقة الظهارية/اللحمة المتوسطة في الغشاء القاعدي. وأخيرا, تضاف الضامة المشتقة من iPSC إلى الجانب القمي من الغشاء, تتفاعل مع الخلايا الظهارية وتنتظر إشارات التنشيط (الشكل 1 أ). يعيد هذا النموذج إنتاج بيولوجيا ووظيفة مجرى الهواء بدقة. نفترض أن مزارع iAirway الأصلية متعددة الخلايا المشتقة من hiPSC والخاصة بالمريض هي الأنسب لتوضيح الاستجابة الجوهرية والحادة لحاجز مجرى الهواء ومسببات الأمراض ، بما في ذلك الالتهابات الفيروسية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا النموذج ل (1) دراسة دخول الفيروس وتكاثره ، (2) التحقيق في الاستجابة المناعية الأولية بواسطة الخلايا المناعية الظهارية والأنسجة الخاصة ، (3) فحص سلامة الحاجز ووظيفته ، (4) اختبار فعالية العوامل العلاجية ، و (5) دراسة الآليات الخلوية والجزيئية للتسبب في نموذج خاص بالمريض.

توضح هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لإعداد مزارع الرئة المشتركة متعددة الخلايا لدراسة الاستجابات الخلوية للعدوى الفيروسية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة هذا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لبرنامج حماية البحوث البشرية في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو (181180). يستخدم هذا البروتوكول جزيئات صغيرة وعوامل نمو لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى خلايا مجرى الهواء والخلايا البطانية والضامة. ثم يتم زراعة هذه الخلايا بشكل مشترك على إدخالات زراعة الخلايا واستقطابها في واجهة هواء سائل. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمواد الاستهلاكية والمعدات المستخدمة في جدول المواد. يتم توفير الوسائط والتراكيب العازلة في الملف التكميلي 1.

1. توليد عضيات مجرى الهواء المشتقة من iPSC (اليوم 1 - 30)

ملاحظة: يحدد هذا البروتوكول الخطوات المطلوبة لتوليد عضيات مجرى الهواء المشتقة من iPSC (الشكل 1 ب), باتباع المنهجية الموضحة في Leibel et al.13. تتضمن العملية تحريض الأديم الباطن النهائي (الأيام 1-3) ، وتوليد الأديم الباطن الأمامي للأمعاء الأمامية (الأيام 4-6) ، والتمايز إلى أسلاف الرئة (الأيام 7-16). يمكن العثور على منهجية مفصلة في المنشورالسابق 13. توضح الخطوات التالية بالتفصيل توليد عضيات مجرى الهواء من أسلاف الرئة.

  1. استخراج وفصل الأجسام الكروية السلفية للرئة من بوليمر ECM (اليوم 17)
    1. قم بإذابة بوليمر المصفوفة خارج الخلية (ECM) (8-9 مجم / مل) على الجليد.
    2. شفط الوسائط المستهلكة ، باستخدام شفاط الفراغ ، من عضيات الرئة المضمنة في ECM.
      ملاحظة: بالنسبة لخطوات الشفط اللاحقة ، استخدم شفاط فراغ ما لم يذكر خلاف ذلك.
    3. أضف 1 مل من 2 وحدة / مل متباعدة مع 10 ميكرومتر من مثبط ROCK1 (ROCKi) إلى الخلايا واستخدم ماصة P1000 لإعادة تعليق أسلاف الرئة يدويا في ECM. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مع تعليق الخليط كل 15 دقيقة لتعزيز فعالية التفكك المنفصل من خلال المعالجة الميكانيكية.
    4. قبل الاستخدام ب 15 دقيقة ، ضع 45 مل من PBS بدرجة حرارة الغرفة في فريزر -20 درجة مئوية ليبرد. تأكد من أن PBS أكثر برودة من 4 درجات مئوية لإزالة البلمرة المثلى ECM في الخطوات اللاحقة.
    5. بعد 30 دقيقة من الحضانة المتباينة ، انقل المحلول العضوي والمنفصل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    6. أضف PBS المبرد (2 مل لكل 1 مل من البروتياز) لغسل وجمع المواد العضوية المتبقية والمواد ECM من اللوحة. أعد تعليق العضيات باستخدام ماصة P1000 وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك في هذا البروتوكول.
    7. بعد الطرد المركزي ، يجب أن تكون حبيبات ECM غائمة مع عضيات مرئية. شفط المادة الطافية بعناية عبر الماصة، وتجنب حبيبات ECM.
    8. قم بإجراء غسيل ثان من PBS باستخدام PBS المبرد، وأعد التعليق باستخدام ماصة P1000، وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. قم بشفط المادة الطافية عبر الماصة، تاركا ~ 100 ميكرولتر من المحلول المتبقي.
    9. أضف 2 مل من البروتياز الشبيه بالتربسين إلى العضيات في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل. أعد التعليق باستخدام ماصة P1000. احتضن لمدة 10-12 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مع قلب الأنبوب أو نقره لإعادة تعليق الخليط في منتصف فترة الحضانة.
      ملاحظة: قم بإجراء 10-12 دقيقة من تفكك البروتياز الشبيه بالتربسين لتمرير العضيات كمجاميع.
    10. بعد 12 دقيقة، أوقف تفاعل البروتياز الشبيه بالتربسين عن طريق إضافة 2 مل من FBS 2٪ في الوسائط الأساسية (إيقاف الوسائط، انظر الملف التكميلي 1). أعد تعليق المحلول باستخدام ماصة P1000 وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
    11. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق العضيات في Stop Media المكملة ب 10 ميكرومتر من ROCKi. خذ عينة 10 ميكرولتر لحساب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم والتريبان الأزرق. احتفظ بالعضيات على الجليد أثناء العد.
    12. احسب الحجم المطلوب للحصول على 100,000 خلية لكل بئر. تتجمع خلية Aliquot في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم. قم بإزالة المادة الطافية الزائدة ، مع ترك 10 ميكرولتر من الوسائط المتبقية.
    13. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من بوليمر ECM البارد (تجنب الفقاعات واعمل بسرعة لمنع البلمرة المبكرة). أضف 200 ميكرولتر من ECM وخليط الخلية إلى قاع كل بئر في طبق مكون من 12 بئرا. اسمح ل ECM بالبلمرة جزئيا في درجة حرارة الغرفة في خزانة السلامة الحيوية لمدة 5 دقائق.
    14. انقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة لإكمال بلمرة ECM. ثم أضف 1.5 مل من وسط الحث العضوي لمجرى الهواء (الملف التكميلي 1).
    15. قم بتغيير الوسيط كل يومين لمدة 14 يوما حتى اليوم 30. إذا أصبح الوسط أصفر في غضون 24 ساعة ، فقم بزيادة الحجم إلى 2 مل.

2. توليد الخلايا البطانية المشتقة من iPSC (اليوم 1 - 14)

ملاحظة: الإجراء التالي تفاصيل توليد الخلايا البطانية من iPSCs (الشكل 1C), مقتبس من Patsch et al.18. وتشمل هذه الطريقة إعداد لوحات, تمايز iPSCs, تحريض الخلايا البطانية, فرز, والتوسع. يسرد الجدول 1 الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة.

  1. طلاء iPSCs للتمايز البطاني (اليوم 0)
    1. ابدأ تمايز الخلايا البطانية عندما تصل hiPSCs إلى 70٪ -80٪ التقاء. أضف 10 ميكرومتر من ROCKi Y-27632 إلى كل بئر قبل ساعة من التفكك.
    2. شفط الوسائط, غسل الآبار مع 1 مل من PBS ثم فصل iPSCs بإضافة 1 مل من محلول انفصال الخلية لكل بئر من لوحة 12 بئر. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. قم بتحييد محلول انفصال الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من Stop Media إلى الآبار. ماصة للحصول على تعليق أحادي الخلية. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
    4. شفط طاف, تعليق iPSCs في وسائط استزراع iPSC مع 10 ميكرومتر من ROCKi, وإجراء عدد الخلايا. لوحة 100,000 hiPSCs لكل بئر من لوحة 12 بئر مطلية ب ECM في 1 مل من وسائط استزراع iPSC مع 10 ميكرومتر من ROCKi. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: كثافة البذر للتمايز البطاني iPSC قد تحتاج إلى تحسين لكل خط خلية. تقييم كفاءة التمايز باستخدام قياس التدفق الخلوي ل CD31 في اليوم 6.
  2. تحريض الأديم المتوسط الجانبي (اليوم 1-3)
    1. شفط وسائط استزراع iPSC من iPSCs مطلية وإضافة 3 مل من الوسائط الأساسية N2B27 مكملة ب 6 ميكرومتر من CHIR و 25 نانوغرام / مل BMP4 لكل بئر (ملف تكميلي 1). قم بتسخين الوسائط قبل إضافتها إلى الخلايا. لا تقم بتغيير الوسائط لمدة 3 أيام.
  3. تحريض الخلايا البطانية (اليوم 4-5)
    1. في اليوم 4, استنشاق الوسائط N2B27 وإضافة 2 مل من وسائط التمايز البطاني (EDM) مع 200 نانوغرام/مل VEGF165 و 2 ميكرومتر من فورسكولين في البئر. قم بتغيير الوسائط في اليوم الخامس.
  4. فرز الخلايا البطانية وإعادة الطلاء (اليوم 6)
    1. في اليوم 5 أو 6 ، قم بإعداد قارورة T75 المغلفة بالألياف لإثراء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) عن طريق إعادة تكوين 1 مجم من الفيبرونيكتين في ماء معقم لصنع 100 ميكروغرام / مل من محلول الفيبرونيكتين. قم بتغطية قارورة T75 ب 6 مل من محلول الفبرونيكتين واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. استنشق محلول الفبرونيكتين واغسله بالماء المعقم. دع قارورة T75 تجف في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين القوارير الإضافية المصنوعة عند 4 درجات مئوية.
    2. تحضير وسائط الصيانة البطانية (EMM)18.
    3. في اليوم 6 ، قم بإثراء الخلايا البطانية المشتقة من iPSC عبر FACS باستخدام الجسم المضاد CD3118.
    4. أضف 10 ميكرومتر من ROCKi Y-27632 إلى كل بئر قبل ساعة من التفكك عند 37 درجة مئوية. استنشق الوسط واغسله باستخدام PBS. أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا الدافئ مسبقا لكل بئر من صفيحة 12 بئرا واحتضانها لمدة 8-10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    5. ماصة برفق لضمان انفصال خلية واحدة. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف حجما متساويا من وسائط الإيقاف. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
    6. شفط الخلايا الطافية وأعد تعليق الخلايا البطانية في 1 مل Stop Media مكملة ب 10 ميكرومتر من ROCKi.  قم بتمرير الخلايا عبر مرشح 70 ميكرومتر عن طريق إضافة 1 مل من وسائط التوقف أولا لترطيب المرشح ، ثم ماصة الخلايا عبر المرشح. خذ عينة 10 ميكرولتر لحساب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم والتريبان الأزرق. احتفظ بالخلايا على الجليد أثناء العد.
    7. إجراء تعداد الخلايا. قم بإعداد حصة من 200,000 خلية كعنصر تحكم سلبي غير ملوث. انقل الخلايا المتبقية إلى أنبوب Eppendorf سعة 1.5 مل وأضف 10 ميكرولتر من CD31-APC لكل 1 مليون خلية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. احتضن لمدة 30 دقيقة على دوار عند 4 درجات مئوية.
    8. بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بالطرد المركزي لأنبوب Eppendorf بالخلايا لمدة 5 دقائق عند 300 × جم ، واغسل الخلايا بإضافة 1 مل من PBS. كرر خطوة الغسيل والطرد المركزي مرتين. قم بإزالة المادة الطافية يدويا بين الغسل.
    9. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت FACS و 5 ميكروغرام / مل محلول DAPI لتلوين الجدوى ، قبل 5 دقائق من الفرز. الفرز حسب الإرشادات المؤسسية.
    10. اجمع الخلايا التي تم فرزها بواسطة FACS في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع 2 مل من EMM. جهاز طرد مركزي الأنبوب المخروطي سعة 15 مل مع الخلايا لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. شفط الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا البطانية في 10 مل من EMM مع 10 ميكرومتر من ROCKi Y-27632 والبنسلين ستربتومايسين (1٪).
    11. نقل الخلايا البطانية المشتقة من iPSC المعاد تعليقها إلى قارورة المغلفة بالألياف الضوئية الفيبرونكتينية. وزعي الخلايا بالتساوي وضعيها في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: استخدم ما لا يقل عن 500,000 خلية وبحد أقصى 2,000,000 خلية لكل قارورة T75.
  5. توسيع الخلايا البطانية المصنفة وحفظها بالتبريد (اليوم 7+)
    1. قم بتغيير وسائط EMM كل 2-3 أيام بعد إثراء FACS. بمجرد أن تصبح قارورة T75 ملتقية (حوالي 7 أيام بعد FACS ، اعتمادا على كثافة البذر) ، يمكن استخدام الخلايا البطانية المشتقة من iPSC للزراعة المشتركة أو المحفوظة بالتبريد للتطبيقات المستقبلية.
    2. قم بإعداد محلول تجميد البطاني 2x قبل تفكك الخلايا (80٪ Endo-CM2 ، 20٪ DMSO ، 20 ميكرومتر من ROCKi).
    3. قم بتسمية الأنابيب المبردة في قلم مقاوم للإيثانول بالمعلومات ذات الصلة. معرف السطر ، رقم المرور ، وسائط الثقافة ، "ذوبان الجليد في بئر 6" ، تاريخ التجميد.
    4. عندما تكون الخلايا البطانية المشتقة من iPSC فرزها ملتقية, بدء التفكك.
    5. اغسل قارورة T75 مع 5 مل من PBS -/-.
    6. فصل الخلايا البطانية المشتقة من iPSC مع 5 مل من البروتياز الشبيه بالتربسين لكل T75. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وتحقق من T75 بشكل دوري للتحقق من رفع الخلايا.
    7. قم بتحييد التفاعل بإضافة 5 مل من وسائط التوقف. نقل 10 مل من الخلايا في المحلول إلى أنبوب 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    8. استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا البطانية في وسائط E-CBM ، وخذ عينة 10 ميكرولتر للعد عبر مقياس الدم.
    9. بعد تعداد الخلايا ، قم بنقل 1 مليون خلية لكل 0.5 مل من وسائط EGM2.
      ملاحظة: الخطوة التالية حساسة للوقت. قم بإعداد الأوعية المبردة وأوعية التجميد لاستخدامها على الفور.
    10. Aliquot حجم متساو من محلول التجميد 2x للخلايا البطانية. التركيز النهائي هو 90٪ Endo-CM2 ، و 10٪ DMO ، و 10 ميكرومتر من ROCKi (1 مل / 1 مليون خلية).
    11. انقل القوارير المغطاة على الفور إلى غرفة التجميد وضعها في -80 درجة مئوية طوال الليل ، ثم إلى النيتروجين السائل (-180 درجة مئوية) في اليوم التالي للتخزين طويل الأجل.

3. توليد البلاعم المشتقة من iPSC (اليوم 1 - 26)

ملاحظة: يحدد هذا الإجراء خطوات توليد البلاعم من iPSCs (الشكل 1D), مقتبس من فان ويلغنبورغ وآخرون.19 و Pouyanfard et al.20. وهو يغطي التكيف أحادي الخلية من iPSCs, تمايز الجسم الجنيني, تشكيل سلف البلاعم, ونضج البلاعم.

  1. التكيف أحادي الخلية ل iPSCs
    1. عندما تصل iPSCs إلى ~ 70٪-90٪ التقاء مع عدم وجود علامات واضحة للتمايز, تبدأ مرور خلية واحدة مع البروتياز الشبيه بالتربسين.
    2. استنشق الوسائط المستهلكة واشطفها باستخدام PBS. قم بإزالة PBS وأضف البروتياز الشبيه بالتربسين (1 مل / بئر من صفيحة 6 آبار ، 500 ميكرولتر / بئر من لوح 12 بئر). احتضان في 37 درجة مئوية 2-5 دقيقة حتى تنفصل مستعمرات iPSC عن اللوحة.
    3. قم بتحييد البروتياز الشبيه بالتربسين بحجم متساو من Stop Media (1 مل / بئر من صفيحة 6 آبار ، 500 ميكرولتر / بئر من صفيحة 12 بئر). الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. استنشق الخلايا الطافية وأعد تعليق الخلايا برفق في وسائط زراعة iPSC مع 10 ميكرومتر من ROCKi. المرور على ألواح جديدة مطلية ب ECM. كرر ذلك لمدة 2-3 مقاطع قبل الحفظ بالتبريد أو استخدام iPSCs المكيفة أحادية الخلية.
      ملاحظة: اضبط نسبة المرور من 1: 2 إلى 1:10 بناء على صحة الخلية وتكيفها. بالإضافة, iPSCs التي خضعت لثلاثة ممرات أحادية الخلية على الأقل وتكون في مرور منخفض تنتج تمايزات البلاعم المثلى.
  2. تكوين الجسم الجنيني (اليوم 0-6)
    1. عندما تصل iPSCs المكيفة أحادية الخلية إلى ~ 75٪ التقاء, مرور iPSCs مع البروتياز الشبيه بالتربسين وفقا للخطوات 3.1-3.4.
    2. قم بتعليق الخلايا في Stop Media وقم بالمرور عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل لإزالة التكتلات. أعد تعليق الخلايا وأخذ عينة 10 ميكرولتر لعدد الخلايا عبر مقياس الدم.
    3. لتوليد الجسم الجنيني (EB) ، يتم طلاء 8,000-50,000 خلية لكل بئر من لوحة 96 بئرا منخفضة جدا (ULA). احسب العدد الإجمالي للخلايا اللازمة لزرع 60 بئرا من صفيحة ULA المكونة من 96 بئرا.
      ملاحظة: قد تتطلب كثافة البذر من iPSCs التحسين لكل خط خلية.
    4. أجهزة الطرد المركزي iPSCs في 15 مل مخروطي الشكل عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. شفط المادة الطافية.
    5. ل 480,000 iPSCs (8,000 خلايا/بئر في 60 آبار), إعادة تعليق في 6 مل (100 ul/بئر في 60 آبار) الوسائط التعريفية EB.
    6. أضف 150 ميكرولتر من PBS إلى 36 بئرا خارجية للوحة ULA مستديرة القاع مكونة من 96 بئرا.
    7. إعادة تعليق ونقل iPSCs في وسائط EB إلى حوض وسائط. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر/بئر من تعليق الخلية في مركز 60 بئرا من لوحة ULA سعة 96 بئرا. إعادة تعليق iPSCs في وسائط EB بشكل متقطع لضمان التوزيع المتساوي للخلايا.
    8. جهاز الطرد المركزي للوحة 96 بئرا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية (إن وجدت). نقل الألواح إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
    9. بعد 48-72 ساعة ، قم بتغيير 50 ميكرولتر من الوسائط (تغيير نصف الوسائط). تحقق من تكوين الكيس بعد 6 أيام.
      ملاحظة: تشكل بعض خطوط iPSC EBs في وقت أبكر أو بسهولة أكبر من غيرها. مراقبة تكوين EB والتأكد من نقل EBs في الوقت المناسب (يجب أن تتطور إلى الخراجات).
  3. طلاء الجيلاتين ونقل EB لتكوين سلف البلاعم (اليوم 6-19)
    1. قم بإعداد لوحين من 6 آبار مطلية بالجيلاتين بنسبة 0.1٪. أضف 1 مل من الجيلاتين 0.1٪ لكل بئر واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. قم بشفط محلول الجيلاتين واترك الألواح تجف في الغطاء لمدة 30-60 دقيقة.
    2. انقل EBs من الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى ألواح 6 آبار مطلية بالجيلاتين باستخدام ماصة مصلية سعة 2 مل. قم بتوزيع ما يقرب من 8-10 EBs لكل بئر من صفيحة مطلية بالجيلاتين مكونة من 6 آبار.
    3. قم بإزالة وسائط EB المتبقية المستخدمة بعناية من النقل. أضف 2 مل من وسائط زراعة البلاعم 1 (Mac-CM1) لكل بئر. احتضان EB دون إزعاج عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5-7 أيام.
      ملاحظة: من الناحية المثالية ، يمكن تقسيم صفيحة واحدة من 96 بئرا من الأجسام الجنينية إلى لوحين من 6 آبار. إذا كانت EBs ضعيفة التطوير, يمكن تعديل عدد EBs المنقولة لكل لوحة 6 آبار لتحسين خطوة تمايز الجسم iPSC إلى الجنين.
  4. جيل سلف البلاعم
    1. استبدل 2/3 من الوسائط مرتين في الأسبوع ، مع زيادة مستوى الصوت إلى 3 مل إذا تغير لون الوسائط.
    2. تحقق من الثقافات بين الأيام 8-19 لتحديد ما إذا كانت جاهزة لحصاد أسلف البلاعم. في حالة انفصال EBs ، انقل EBs إلى طبق مطلي حديثا باستخدام Mac-CM1 واحتضنه دون إزعاج لمدة 7 أيام.
      ملاحظة: تعد صيانة مركب تشكيل سلف البلاعم أمرا حيويا لتطوير أسلاف البلاعم والتوليد المستمر لها. ستولد المجمعات المحسنة لتشكيل أسلاف البلاعم باستمرار أسلاف نخاعية لمدة 2-6+ أشهر.
  5. حصاد أسلاف النخاع (اليوم 19-26+)
    1. عندما تكون هناك خلايا سلفية من البلاعم معلقة ، قم بحصاد الوسائط بالخلايا ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية بعناية.
    2. أعد تعليق أسلاف البلاعم في Mac-CM2 وانقلها إلى طبق / قارورة مزرعة معقمة غير معالجة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 3-4 أيام.
      ملاحظة: اعتمادا على عدد الخلايا التي تم حصادها ، انقله إلى طبق بتري مقاس 10 سم (3-4 آبار من صفيحة 6 آبار) ، أو قارورة T25 (1-2 آبار من صفيحة 6 آبار) ، أو قارورة T75 (صفيحة كاملة من 6 آبار) بالحجم المناسب من الوسائط. استخدم 5-6 مل من الوسائط لقارورة T25 ، و 10-12 مل من الوسائط في طبق بتري ، و 12-15 مل من الوسائط لقارورة T75. بالنسبة للحصاد اللاحق ، يمكن تجميع أسلاف النخاع النخاعي وخلايا البلاعم من المحاصيل السابقة إذا كانت من نفس المجمعات المكونة للخط / النخاعي. فقط تأكد من أن القارورة كافية للحفاظ على عدد الخلايا في القارورة (القارورة) وإطعامها. البلاعم لا تتكاثر. يتم إنشاؤها من أسلاف البلاعم. يمكن تجميع البلاعم وصيانتها لمدة 2-6 أسابيع دون فقدان علامات التعبير.
  6. حصاد البلاعم
    ملاحظة: بعد 14 يوما من تمايز البلاعم في وسائط Mac-CM2 ، تكون مزارع البلاعم جاهزة للزراعة المشتركة أو تحليل قياس التدفق الخلوي.
    1. اجمع الوسائط المستهلكة وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اشطف القارورة / اللوحة باستخدام PBS لإزالة الوسائط والخلايا المتبقية.
    2. أضف وسائط أساسية إلى القارورة (3 مل ل T25 و 5 مل ل T75) واستخدم مكشطة خلية معقمة لفصل الخلايا عن قاع القارورة / اللوحة. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل وكرر الكشط إذا لزم الأمر.
    3. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في الوسائط المناسبة أو المخزن المؤقت لمزيد من الاستخدام.

4. الزراعة المشتركة لخلايا مجرى الهواء والخلايا البطانية والضامة

ملاحظة: يصف هذا الإجراء خطوات الزراعة المشتركة لخلايا مجرى الهواء والخلايا البطانية والضامة (الشكل 1 أ) باستخدام إدخالات زراعة الخلايا ، مقتبسة من Costa et al.12.

  1. طلاء ECM لإدخالات زراعة الخلايا للزراعة المشتركة (اليوم 0 من الزراعة المشتركة)
    1. قم بتغطية 3.0 ميكرومتر من إدراج خلايا البوليستر المسام (PET) بمحلول 4 مجم / مل ECM. قم بتغطية الجانب القمي من إدراج إدراج ثقافة الخلية لفترة وجيزة داخل اللوحة باستخدام 4 مجم / مل من محلول ECM. Pipet قبالة حل ECM المتبقي. ضع اللوحة في الحاضنة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    2. احصل على طبق بتري كبير (100 مم × 20 مم أو 150 مم × 20 مم). باستخدام ملاقط نظيفة ، انقل إدخالات ثقافة الخلايا معقمة من اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى طبق بتري الكبير. اقلب الإدخالات بحيث يكون الجانب القاعدي الجانبي في وضع مستقيم.
    3. قم بتغطية الجانب القاعدي الوحشي بمحلول ECM 4 مجم / مل. Pipet قبالة حل ECM المتبقي. ضع طبق بتري مع إدخالات ثقافة الخلايا المطلية ب ECM في حاضنة 37 درجة مئوية حتى يجف طوال الليل.
  2. تفكك وتصفيح الخلايا البطانية المشتقة من iPSC (اليوم 1 من الزراعة المشتركة)
    1. اغسل قارورة T75 بمحلول PBS والشفاط. أضف 5 مل من البروتياز الشبيه بالتربسين إلى قارورة T75 واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. تقييم بصري أن الخلايا البطانية قد رفعت من القارورة.
      ملاحظة: زيادة وقت تفكك البروتياز الشبيه بالنوع إذا لم يتم رفع الخلايا البطانية المشتقة من iPSC من القارورة.
    2. اضغط على قارورة لضمان انفصال الخلايا البطانية ونقل الخلايا إلى شكل مخروطي سعة 15 مل. أضف 5 مل من وسائط الإيقاف لوقف التفكك. خلايا الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. قم بشفط الحبيبات المطفية وإعادة تعليق الحبيبات الخلوية في 1 مل من وسائط الثقافة البطانية مع 10 ميكرومتر من ROCKi. احصل على 10 ميكرولتر من المحلول المعلق لعدد الخلايا وضع الخلايا على الجليد أثناء العد.
    4. استخدام 150,000 iPSC-الخلايا البطانية لكل 12 مم إدراج ثقافة الخلية في 100 ميكرولتر من وسائط الثقافة البطانية. اضبط مستوى صوت الوسائط المعني للوصول إلى العدد المطلوب من الخلايا لكل إدخال.
    5. احصل على طبق بتري مع إدخالات ثقافة الخلايا 3.0 ميكرومتر المطلية ب ECM من الحاضنة (انظر الخطوات 4.1-4.3).
    6. أعد تعليق الخلايا البطانية iPSC والماصة 100 ميكرولتر مع 150,000 خلية على إدراج مزرعة الخلايا المقلوبة (الجانب القاعدي الجانبي متجها لأعلى). كرر سحب العينات لكل من إدخالات زراعة الخلايا المحضرة
    7. انقل الخلايا بعناية إلى الحاضنة واتركها دون إزعاج لمدة 3 ساعات.
    8. في طبق مكون من 12 بئرا ، أضف 1 مل من وسط الثقافة البطانية في كل بئر (للعدد الخاص من إدخالات زراعة الخلايا المعدة).
    9. أخرج طبق بتري مع الخلايا البطانية من الحاضنة. باستخدام ملاقط نظيفة ، انقل إدخالات مزرعة الخلايا بعناية إلى اللوحة باستخدام وسائط الثقافة البطانية (قلب الملحق بحيث يكون الجزء السفلي متجها الآن لأسفل في الوسائط).
    10. تحقق بصريا من التصاق الخلايا البطانية بالمجهر. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل.
  3. تفكك وطلاء عضيات مجرى الهواء المشتقة من iPSC (اليوم 2 من الثقافة المشتركة)
    ملاحظة: راجع الخطوات 1.1.1-1.15 لعزل عضيات مجرى الهواء عن بوليمر ECM. قم بتعديل مدة تفكك البروتياز الشبيه بالتربسين (الخطوة 1.1.10) إلى 15-20 دقيقة للحصول على تعليق أحادي الخلية.
    1. بعد 15-20 دقيقة ، أوقف تفاعل البروتياز الشبيه بالتربسين عن طريق إضافة 3 مل من Stop Media. أعد تعليق المحلول باستخدام ماصة P1000 وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. قم بشفط العضيات الطافية وإعادة تعليق مجرى الهواء في وسائط توسيع مجرى الهواء سعة 1 مل باستخدام 10 ميكرومتر من ROCKi. خذ عينة سعة 10 ميكرولتر لعدد خلايا مقياس الدم وضع الخلايا على الجليد أثناء العد.
    3. بذرة 300,000 iPSC-خلايا مجرى الهواء في 500 ميكرولتر من وسائط توسيع مجرى الهواء لكل 12 مم إدراج ثقافة الخلية. اضبط مستوى صوت الوسائط المعني للوصول إلى العدد المطلوب من الخلايا لكل إدراج معد.
    4. قم بإزالة اللوحة مع إدخالات ثقافة الخلايا مع الخلايا البطانية (المصنفة على الجانب القاعدي الجانبي) من الحاضنة 37 درجة مئوية.
    5. أعد تعليق خلايا مجرى الهواء iPSC والماصة 500 ميكرولتر مع 300,000 خلية في الغرفة القمية لكل إدراج مزرعة خلوية. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة مع الخلايا القمية في ظروف السائل والسائل.
  4. ثقافة الرفع الهوائي المشتركة (اليوم 4 من الثقافة المشتركة)
    1. قم بإزالة الوسائط من الجانب القمي لملحق مزرعة الخلية. قم بتغيير الوسائط القاعدية الجانبية إلى وسائط تمايز مجرى الهواء 1: 1 ووسائط الثقافة البطانية. أعد الطبق إلى الحاضنة.
  5. تفكك وتصفيح البلاعم المشتقة من iPSC (اليوم 5 من الثقافة المشتركة)
    1. فصل الضامة المشتقة من iPSC من القارورة باستخدام مكشطة الخلية (انظر الخطوات 3.22-3.24). جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وشفط المادة الطافية.
    2. قم بتعليق البلاعم iPSC في 1 مل من Mac-CM2. خذ عينة سعة 10 ميكرولتر لعد الخلايا وضع الخلايا على الجليد أثناء العد. سيعكس عدد البلاعم عدد خلايا مجرى الهواء المزروعة (نسبة 1: 1 من الضامة إلى خلايا مجرى الهواء).
    3. بعد تعداد الخلايا ، يتم إدخال 300,000 من البلاعم في وسائط 35 ميكرولتر لكل بئر من زراعة الخلايا المحضرة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. بعد الطرد المركزي ، قم بإخراج المادة الطافية. قم بتعليق البلاعم في نظام التشغيل Mac-CM2 المعني من العمليات الحسابية.
    5. قم بإزالة الحضانات مع المزارع المشتركة للخلايا البطانية والمجرى الهوائي من الحاضنة. قم بزرع 300,000 ضامة في 35 ميكرولتر من Mac-CM2 على الجانب القمي من إدراج ثقافة الخلية. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: لتأكيد التصاق الخلايا المناعية iPSC بإدراج ثقافة الخلايا, يمكن تمييز الخلايا بمسبار الفلورسنت. تأكد من الالتصاق عبر الفحص المجهري لإشارة الفلورسنت بعد 48 ساعة من طلاء البلاعم.
  6. الثقافة المشتركة الثلاثية (اليوم السابع من الثقافة المشتركة)
    1. تأكد من أن الزراعة المشتركة جاهزة للتطبيقات النهائية مثل دراسات العدوى وقياسات المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) ومقايسات سلامة الحاجز.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك مراحل متعددة يمكن فيها تقييم تمايز عضيات مجرى الهواء المشتقة من iPSC, الخلايا البطانية, الخلايا المناعية, والثقافات المشتركة على أنها اكتملت بنجاح. يمكن إجراء التمايزات في خطوط iPSC مختلفة, وقد تم اختبار هذا البروتوكول في خمسة خطوط مختلفة على الأقل. البروتوكول لا يحتاج إلى أن تتكيف مع كل خط iPSC جديد, على وجه التحديد عن طريق تعديل وتحسين كثافة البذر.

يمكن تقييم العائد الناجح لعضويات مجرى الهواء المشتقة من iPSC عبر المجال الساطع وسيكون لها أربع خصائص: الحدود / الحواف المحددة ، والتشكل الشفاف / الكيسي ، والقدرة على التكاثر / التوسع ، ونقص الخلايا النخرية. لا يزداد حجم عضيات مجرى الهواء التي تبدو غامضة خلال أسبوعين من الثقافة ، ولا ينبغي استخدام نخر في تجارب الزراعة المشتركة. العضيات ذات الطبقة اللمعية السميكة على المحيط مقابل. لا يزال من الممكن استخدام العضيات الشفافة / الكيسية في التجارب اللاحقة. ومع ذلك ، فإن عضيات مجرى الهواء الشفافة / الكيسية تتكون في الغالب من خلايا قاعدية ، في حين أن العضيات السميكة ذات الغشاء المزدوج تتكون في الغالب من خلايا النادي. نظرا لأن الخلايا القاعدية تتكاثر وتتوسع بسهولة ، فهي أكثر ملاءمة لثقافة الطور البيني للهواء والسائل والاستقطاب. طرق أخرى لتقييم العائد الناجح لعضيات الرئة المشتقة من iPSC هي تحليل قياس التدفق الخلوي في مرحلة سلف الرئة (اليوم 16 من التمايز) لعلامة السطح CPM (الجدول 1), عائد تمايز ناجح >50٪ CPM + الخلايا.

بالنسبة للتفكك العضوي لمجرى الهواء وثقافة الطور البيني للهواء والسائل ، تأكد من إزالة كل بوليمر ECM ، أو سيمنع الخلايا من التمدد على الغشاء. يجب أن تتلاقى الخلايا بحلول اليوم الثالث من الثقافة ، قبل رفع الهواء. يمكن تقييم تأكيد أنواع الخلايا في iAirways عن طريق تلطيخ العلامات الخاصة بنوع الخلية المعنية: الخلايا القاعدية (p63+) ، وخلايا النادي (SCGB1A1+) ، وخلايا الكأس (MUC5AC +) ، والخلايا المهدبة (AcTub +). تم التحقق من التوصيف والعلامات المميزة لنوع خلية الرئة على LungMAP21. يمكن الكشف عن اللحمة المتوسطة بالأجسام المضادة ضد الفيمنتين أو أكتين العضلات الملساء. لتوليد المزيد من الخلايا المهدبة ، قد تتطلب الثقافات رفع الهواء لفترة أطول من الوقت أو إضافة DAPT.

يمكن تقييم العائد الناجح للخلايا البطانية المشتقة من iPSC عبر حقل ساطع, إظهار مورفولوجيا شبيهة بالحصى (يوم 6 من التمايز البطاني المستمدة من iPSC). سوف تحتوي ثقافة البطانية الناجحة المشتقة من iPSC على >50٪ خلايا CD31 +, ويجب إنشاء خلايا كافية بحيث بعد الفرز, يجب أن يكون العائد أكثر من 500,000 خلايا. يمكن تمرير الخلايا أو حفظها بالتبريد ، ويجب اختبار علامة CD31 عن طريق التدفق مع كل ممر أو مزرعة جديدة. لا ينبغي أن تمر الخلايا إلى ما بعد P4. كمرجع, نرى الخلايا البطانية المشتقة من iPSC قبل / بعد فرز CD31 (الشكل 1C). ستكون الخلايا البطانية مسطحة مع جسم خلوي كبير مع مورفولوجيا ممدودة ومغزلية.

لتمايز البلاعم ، يجب أن تبقى الأجسام الجنينية في قاع بئر ULA ، ويجب أن يكون EB واحد فقط في كل بئر. يجب أن تظهر التغيرات الكيسية بحلول اليوم 5-7. إذا لم يشكلوا EB بعد الطرد المركزي, ثم بذرة iPSCs في لوحة ULA 96 جيدا دون الغزل. قد يكون من الضروري زيادة عدد iPSCs. يعتمد العائد الناجح للخلايا المناعية المشتقة من iPSC كليا على قدرة الأجسام الجنينية (EBs) على التطور إلى خراجات (اليوم 7 من التمايز). لن تشكل EBs المناعية المشتقة من iPSC والتي لا تتطور إلى الخراجات سدى عند طلاءها على الجيلاتين ولن تنتج أسلاف نخاعي. بعد النقل إلى اللوحة المطلية بالجيلاتين ، يجب أن تظل EBs متصلة بأسفل اللوحة. يجب أن تتم حركة اللوحة بعناية حتى لا تطردها. يجب تغيير الألواح مرتين في الأسبوع يدويا ، ويجب تمرير الخلايا العالقة إلى Mac-CM2 أو حفظها بالتبريد. بالإضافة إلى ذلك ، بعد حصاد الأسلاف النخاعية المعلقة ، يجب أن تلتصق بالقارورة البلاستيكية غير المطلية ، وتولد خلايا ساطعة تحت حقل ساطع مع فجوات ، مما يشير إلى الضامة. يجب أن تكون علامة الخلايا الوحيدة ، CD14 + ، >90٪ في الخلايا العالقة. يجب أن تزداد علامة البلاعم ، CD68 ، بمرور الوقت ، مع ~ 50٪ من البلاعم التي تعبر عن CD68 + بعد أسبوعين (الشكل 1 د). يجب تحديد كفاءة الالتصاق لكل خط خلية. نحقق كفاءة التصاق بنسبة 20٪ في المتوسط. بالنسبة للاستقطاب ، يتم استقطاب البلاعم M0 إما إلى البلاعم M1 (iPSC-M1) أو M2 (iPSC-M2) لمدة 48 ساعة في وسط التمايز II المكملة بمحفزات مختلفة: 100 نانوغرام / مل LPS و 20 نانوغرام / مل IFN-g للاستقطاب M1 أو 50 نانوغرام / مل IL-4 و 20 نانوغرام / مل IL-13 للاستقطاب M2. علامة الاستقطاب M1 هي CD80 + ، واستقطاب M2 هو CD206 +.

يمكن تقييم التوليد الناجح للزراعة المشتركة الثلاثية عن طريق التألق المناعي لعلامات الوصلة الظهارية الضيقة EPCAM أو ECAD أو ZO-1 أو علامة الوصلة البطانية الضيقة CD31 (الشكل 2C ، الجدول 1). يمكن أيضا تقييم وظيفة الزراعة المشتركة الثلاثية من خلال المقاومة الظهارية / البطانية عبر الكهرباء (TEER). سيكون للمزارع العضوية والبطانية المشتركة لمجرى الهواء المجمعة جيدا مقاومة كهربائية أكبر ، مما يشير إلى الاتصال والاتصال الأمثل للخلية. ستؤدي الإهانات البيئية ، مثل السجائر الإلكترونية أو التحدي الفيروسي ، إلى الإضرار بسلامة الحاجز الظهاري والبطاني ، مما يؤدي إلى تقليل المقاومة الكهربائية للثقافة المشتركة (الشكل 3 أ ، ب) والتقاطعات الضيقة غير المنظمة (الشكل 3 ج).

figure-results-1
الشكل 1: تمايز وتوصيف ظهارة مجرى الهواء المشتقة من iPSC, البطانة, والثقافات المناعية. (أ) تخطيطي للتمايزات الموجهة من iPSC لتجميع iAirway. (ب) عضيات ظهارة مجرى الهواء المشتقة من iPSC تتميز بتحليل الحقل الساطع (يسار) وتحليل قياس التدفق الخلوي (يمين) ل EPCAM و ECAD. (ج) بطانة مجرى الهواء المشتق من iPSC تتميز بالمجال الساطع (يسار) ، والتألق المناعي ، وتحليل قياس التدفق الخلوي (يمين) ل CD31. يظهر الحقل الساطع المعني بعد فرز CD31 على اليمين. (د) تتميز البلاعم المشتقة من iPSC بالمجال الساطع (يسار) وتحليل قياس التدفق الخلوي (يمين) لعموم علامة المكونة للدم CD45, صانع الخلايا الأحادية CD14, وعلامة البلاعم CD68. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: الزراعة المشتركة للظهارية المشتقة من iPSC, اللحمة المتوسطة, البطانة, وخلايا البلاعم. (أ) تخطيطي لتجميع iAirway. (ب) صور Brightfield للزراعة الأحادية الظهارية والبطانية ذات الصلة ، والثقافة الثنائية الظهارية والبطانية ، والثقافة المشتركة للظهارة والبطانية والبلاعم. البلاعم الموسومة ب cytotracker الأحمر. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر (ج) تلطيخ الفلورسنت المناعي لعلامة الوصلة الضيقة ZO-1 على الجانب القمي من إدراج ثقافة الخلية و CD31 على الجانب القاعدي الجانبي. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. (د) المقطع العرضي لإدراج ثقافة الخلية مع عضيات مجرى الهواء المنفصلة على الجانب القمي ، بعد أسبوع واحد من رفع الهواء. تظهر اللوحة اليسرى مع تلطيخ H & E بالسهم الأسود الخلايا المهدبة. تظهر اللوحة الوسطى ، مع التصوير المناعي الفلوري ، العلامة الظهارية E-cadherin (ECAD). تظهر اللوحة اليمنى ، مع التصوير المناعي الفلوري ، علامات اللحمة المتوسطة مثل الفيمنتين (VIM) وأكتين العضلات الملساء (SMA). أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: التغيرات في وظيفة حاجز مجرى الهواء في iAirways المعرضة للسجائر الإلكترونية والفيروسات. (أ) تخطيطي لأداة قياس المقاومة الظهارية / البطانية عبر الكهرباء (TEER). (ب) الرسم البياني الشريطي ل TEER بعد 7 أيام من إضافة سيجارة المنثول الإلكترونية إلى الوسائط. متوسط فاصل الثقة +/- 95٪. N = 5 مكررات بيولوجية و 3 مكررات تقنية ؛ قيمة القيمة الاحتمالية <0.001. (ج) تلطيخ الفلورسنت المناعي لبروتين الوصلة الضيقة ZO-1 قبل وبعد الإصابة ب SARS-CoV-2. لاحظ التصميم المضطرب ل ZO-1 بعد الإصابة. أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

جسمتطبيقالتخفيف
CD 31 PECAM-1 (APC)قياس التدفق الخلوي (FC)10 ميكرولتر في 100 UL buffer
EPCAM / CD 326 (APC)نادي1:500
E-CAD / CD 324 (APC)نادي5 ميكرولتر في 100 ul buffer
الكلفهنادي1:200
القرص المضغوط 45 (PE)نادي5 ميكرولتر في 100 ul buffer
القرص المضغوط 14 (FITC)نادي5 ميكرولتر في 100 ul buffer
القرص المضغوط 68 (PE)نادي5 ميكرولتر في 100 ul buffer
زو -1التألق المناعي (IF)1:300
فيمنتينلو1:200
SMAلو1:100

الجدول 1: الأجسام المضادة المستخدمة في FACS والتألق المناعي.

الملف التكميلي 1: تركيبات الوسائط والمخزن المؤقت. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب تطوير وتنفيذ نموذج للحاجز الدموي والهواء في الشعب الهوائية الكبيرة لدراسة الالتهابات الفيروسية والسموم الأخرى اهتماما دقيقا بالتفاصيل لضمان التمايز الناجح ووظيفة أنواع الخلايا المختلفة المعنية. ستتناول هذه المناقشة العوامل الرئيسية للتمايز الناجح والتحديات المحتملة والتطبيقات البديلة والآثار المترتبة على دراسة الأمراض البشرية.

لضمان التمايز الناجح ، من المهم الانتباه إلى نوع إدراج ثقافة الخلايا وحجم المسام. يجب استخدام المسام الكبيرة لضمان التواصل بين الخلية والخلية من خلال طبقات ECM. يعد ضمان كثافة البذر المثلى لخطوط الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) أمرا بالغ الأهمية. تسهل الكثافة المناسبة التمايز المنتظم وتمنع تكوين كتل الخلايا غير المرغوب فيها ، مما يؤدي إلى طبقة ظهارية أكثر تجانسا ووظيفية. للحفاظ على طبقة ظهارية صحية ووظيفية ، من المهم غسل السطح القمي قبل إضافة أي مركبات أو سموم أو فيروسات. يساعد ذلك في إزالة المخاط المتراكم والخلايا الميتة وغيرها من الحطام ، وبالتالي تعزيز بيئة ثقافة مستقرة وقابلة للحياة والسماح بالوصول إلى الخلايا الظهارية.

بالنسبة للمكون البطاني ، من الضروري التأكد من أن الخلايا مرتبة بشكل صحيح ومتجانسة. يمكن تحقيق ذلك من خلال تقنيات مثل FACS ، والتي تضمن استخدام الخلايا البطانية المرغوبة فقط ، وبالتالي الحفاظ على الاتساق والوظيفة.

بالنسبة لمكون البلاعم ، على الرغم من التصاق بالبلاستيك بسهولة ، لا تلتصق البلاعم جيدا بالخلايا الظهارية القمية. قد تكون زيادة عدد البلاعم مفيدة لضمان وجود عدد كبير من البلاعم في iAirways. تعتبر البلاعم الملتصقة في وضع أفضل للتفاعل مع مسببات الأمراض والخلايا المناعية الأخرى ، وبالتالي تعزيز أهمية النموذج. إذا كانت دراسة الإشارات المناعية البطانية مفضلة ، فيمكن زرع البلاعم في الجانب القاعدي الجانبي من إدراج ثقافة الخلية في الوسائط لتقليد مجموعة الخلايا الوحيدةالمنتشرة 22.

يحتوي نموذج iAirway على العديد من التطبيقات المهمة الأخرى ، بما في ذلك دراسة تطور الرئة في مجرى الهواء. يمكن استخدام النموذج لدراسة العمليات المعقدة التي ينطوي عليها نمو الرئة ، والتي تتضمن إشارات متعددة الخلايا بين مجموعات مختلفة من الخلايا ، مما يوفر نظرة ثاقبة للظروف الطبيعية والمرضية. لدراسة تطور السنخية ومرضها ، يمكن استبدال عضيات مجرى الهواء بعضيات الرئة البعيدة (DLOs)23،24 وهذا يسمح للباحثين بدراسة الرئة البعيدة ، بما في ذلك تطور السنخية ووظيفتها. هذا مفيد بشكل خاص لتوليد ودراسة الضامة السنخية ، والتي تلعب دورا رئيسيا في مناعة الرئة.

يأتي تطوير نموذج موثوق به وقابل للتكرار للحاجز الدموي الهوائي في الشعب الهوائية الكبيرة مع العديد من التحديات. يجب أن تعبر الخلايا السلفية للرئة عن أكثر من 50٪ NKX2-1 للتمايز الناجح. إذا لم يتم الوصول إلى المحصول ، فقد تحتوي مزارع ALI على المزيد من اللحمة المتوسطة أو تكون ملوثة بالخلايا الظهارية غير الرئوية. يعد الحفاظ على العقم أثناء طلاء الخلايا البطانية تحديا كبيرا حيث يتم زراعتها على الجانب القاعدي الجانبي من إدراج ثقافة الخلية. هذا يمنع غطاء اللوحة من إغلاق البيئة المعقمة ، لذلك يجب استخدام الألواح الأخرى أثناء بذر الخلايا البطانية. يمكن للملوثات أن تعطل الثقافة وتضر بسلامة النموذج. يتم تحضين معظم مزارع ALI لمدة لا تقل عن 3 أسابيع لتوليد معظم خلايا مجرى الهواء ، بما في ذلك الخلايا المهدبة. تقوم معظم البروتوكولات بزرع الخلايا القاعدية ، وبالتالي يجب أن تتيح الوقت لآليات الإشارات للتمييز بين خلايا مجرى الهواء الأخرى. يفصل البروتوكول الحالي عن عضيات مجرى الهواء ، التي تحتوي بالفعل على العديد من خلايا مجرى الهواء ، وإن كان ذلك بكميات أقل مقارنة ب ALI الناضج المشتق من HBEC. يظهر عدد قليل من الخلايا المهدبة جنبا إلى جنب مع أنواع الخلايا الظهارية واللحمة المتوسطة (الشكل 2 د). لتوليد المزيد من الخلايا المهدبة ، يمكن إضافة DAPT إلى الثقافات العضوية في مجرى الهواء و / أو وسائط ALI25. اختبرت هذه المنصة أيضا الجدوى قصيرة المدى للخلايا القمية والقاعدية الجانبية بعد رفع الهواء ، عندما يتم تغيير الوسط القاعدي الوحشي إلى 1: 1 الوسط الظهاري والبطاني. يجب إجراء المزيد من الأبحاث لاختبار الجدوى على مدى أسابيع ، مما قد يزيد من تعقيد الخلايا في ALI.

نموذج الحاجز الدموي والجوي له آثار عميقة على دراسة الأمراض التي تصيب الإنسان وتطوير التدخلات العلاجية. يمكن استخدام النموذج لفحص العوامل العلاجية وتحسينها ، بما في ذلك الأدوية المضادة للفيروسات ، من خلال توفير بيئة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية تحاكي الشعب الهوائية البشرية ، خاصة مع تعرض خلايا مجرى الهواء للهواء. يمكن استخدام تقنيات الضربة القاضية الجينية لدراسة آليات محددة لخلل الحاجز والتفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض. يوفر النموذج منصة لدراسة الجوانب المختلفة لأمراض الجهاز التنفسي البشري ، من الالتهابات الفيروسية إلى الحالات المزمنة مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن. يمكن أن يؤدي هذا الفهم إلى تطوير علاجات أكثر فعالية واستهدافا.

في الختام ، يمثل نموذج الحاجز الدموي الهوائي لمجرى الهواء الكبير (iAirway) أداة قوية لدراسة الخلل الوظيفي الحاجز بسبب الالتهابات الفيروسية وأمراض الجهاز التنفسي الأخرى. سيؤدي ضمان التمايز الناجح لأنواع الخلايا ، ومعالجة تحديات النمو ، واستكشاف التطبيقات البديلة إلى تعزيز فائدة ودقة هذا النموذج. يؤكد تطبيقه في دراسات الاستهداف العلاجي والخروج المغلوب للجينات على قدرته في تعزيز فهمنا وعلاجنا لأمراض الجهاز التنفسي البشرية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل CIRM (DISC2COVID19-12022).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12 لوحة بئر Corning3512
إدراج 12 بئر ، 0.4 & micro ؛ م ، شفاف   ؛VWR10769-208
2-mercaptoethanol سيجما ألدريتشM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
Activin AR & D Systems338-AC
حمض الريتينويك المتحول بالكامل (RA)   ؛سيجما ألدريتشR2625
حمض الأسكوربيكسيجماA4544
B27 بدون حمض الريتينويك   ؛ThermoFisher12587010
BMP4   ؛R & D Systems314-BP / CF
ألبومين مصل البقر (BSA) Fraction V ، محلول 7.5٪   ؛Gibco15260-037
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CD 14 (FITC)BioLegend982502
CD 31 PECAM-1 (APC)R & D SystemFAB3567A
CD 45 (PE) BDBiosciences560975
CD 68 (PE) BioLegend33808
CHIR99021 Abcamab120890
CPMFujifilm014-27501
ديكساميثازون Sigma-AldrichD4902
Dispase StemCellTech7913
DMEM/F12 Gibco10565042
DorsomorphinR & D Systems3093
E-CAD / CD 324 (APC)BioLegend324107
EGFR& D Systems236-EG
EGM2Medium LonzaCC-3162
EPCAM / CD 326 (APC)BioLegend324212
FBS & nbsp ؛جيبكو10082139
FGF10R & أنظمة D345-FG / CF
FGF7R & D أنظمة251-KG / CF
فيبرونيكتينفيشر356008
ForskolinAbcamab120058
Glutamax  لايف تكنولوجيز35050061
هام s F12 Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
IL-3Peprotech200-03
Iscove ' s Dulbecco المعدل ' s متوسط (IMDM) + Glutamax   ؛Invitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
M-CSFPeprotech 300-25
أحادي الغليسرين مجموعة SigmaM6145
mTeSR plus (10 / حالة)تقنية الخلايا الجذعية5825
N2 & nbsp ؛ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
PBSGibco10010023
Pen / StrepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + Glutamax   ؛12633012Life Technologies
SB431542 R & D Systems1614
SCFPeproTech300-07
SMAInvitrogen50-9760-80
STEMdiff APEL 2Medium STEMCELL Technologies5275
TrypLE ExpressGibco12605-028
VEGF165Preprotech100-20
إشاراتخلية Vimentin5741S
Y-27632 (مثبط الصخور) R & أنظمة D1254/1
ZO-1Invitrogen339100

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine. Respir Res. 23 (1), 122(2022).
  2. Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).
  3. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  4. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thorac Soc. 15 (Suppl 3), S143-S148 (2018).
  5. Khalilgharibi, N., Mao, Y. To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease. Open Biol. 11 (2), 200360(2021).
  6. Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation. Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).
  7. Parker, D., Prince, A. Innate immunity in the respiratory epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol. 45 (2), 189-201 (2011).
  8. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  9. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 210-229 (2011).
  10. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).
  11. Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection. Front Immunol. 13, 1012048(2022).
  12. Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier. Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).
  13. Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease. J Vis Exp. (170), e62456(2021).
  14. Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).
  15. Choi, K. -Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides. Front Cell Infect Microbiol. 10, 228(2020).
  16. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).
  17. Hao, S., et al. Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium. mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).
  18. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).
  19. Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), e71098(2013).
  20. Pouyanfard, S., et al. Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis. Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).
  21. Ardini-Poleske, M. E., et al. Lungmap: The molecular atlas of lung development program. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).
  22. Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), e0276013(2022).
  23. Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).
  24. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nat Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  25. Firth, A. L., et al. Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة