استخدام R و Seurat و CellChat لتحليل مجموعة بيانات النسخ أحادية الخلية لالتئام جروح جلد الفأر

Shalyn Keiser; Nichole Botello; Ethan Cruz; Mateusz S. Wietecha

doi:10.3791/67266

Method Article

استخدام R و Seurat و CellChat لتحليل مجموعة بيانات النسخ أحادية الخلية لالتئام جروح جلد الفأر

DOI:

10.3791/67266

⸱

August 1st, 2025

Shalyn Keiser¹ , Nichole Botello¹ , Ethan Cruz¹ , Mateusz S. Wietecha¹

¹Department of Oral Biology, College of Dentistry, University of Illinois Chicago

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم سير عمل مرئيا خطوة بخطوة لتحليل مجموعة بيانات النسخ ذات المسار الزمني أحادي الخلية لالتئام جروح جلد الفأر باستخدام R. يتضمن البروتوكول خط أنابيب قياسيا لتنزيل مجموعة البيانات ومراقبة الجودة والتصورات والتعليقات التوضيحية لنوع الخلية باستخدام Seurat وتحليل تفاعل الخلية الخلوية باستخدام CellChat.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنظيم عملية التئام الجروح من خلال التفاعلات المعقدة بين أنواع الخلايا المختلفة عبر المكان والزمان. من خلال تحديد ملامح الخلايا الفردية داخل بيئتها المعقدة ، تتيح طرق النسخ أحادية الخلية التحقيق في عدم التجانس الخلوي ، وشبكات الاتصالات الخلوية ، وتفاعلات الخلايا الخلوية المشاركة في عملية التئام الجروح. ومع ذلك ، يتم تشغيل العديد من أدوات تحليل الخلية المفردة في بيئة ترميز الكمبيوتر ، ويتم إحباط استخدامها على نطاق واسع من قبل علماء التئام الجروح بسبب النقص الواضح في الخبرة في المعلوماتية الحيوية. لذلك ، يتم تقديم سير عمل خطوة بخطوة يوضح كيفية استخدام بيئة ترميز رسومية تسمى RStudio لإجراء تحليل أساسي أحادي الخلية لمجموعة بيانات التئام الجروح الجلدية المفاجئة. سيمكن هذا البروتوكول المرئي والموجه العلماء الذين ليس لديهم خلفية في المعلوماتية الحيوية من تنزيل مجموعة بيانات التئام الجروح المنشورة مسبقا ، وتنفيذ خطوات مراقبة الجودة الهامة ، وتشغيل سير عمل قياسي لتحليل الخلية المفردة بما في ذلك تصورات مجموعة البيانات والتعليقات التوضيحية لنوع الخلية باستخدام Seurat ، وتشغيل تحليلات النوع الفرعي للخلية ، وتشغيل تحليلات تسجيل الوحدة النمطية ، وتشغيل تحليلات تفاعل الخلية الخلوية باستخدام CellChat ، وإجراء تحليلات تكاملية لمجموعات بيانات متعددة باستخدام Seurat. يتم توفير تفسيرات سردية لكل خطوة في البروتوكول ويتم تقديم النتائج الرسومية من كل سطر من التعليمات البرمجية لتوجيه المستخدم بأمان خلال سير العمل. الهدف من هذه المقدمة المرئية لخط أنابيب تحليل الخلية الواحدة هو تمكين المزيد من علماء التئام الجروح من استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مباشرة في مختبراتهم الخاصة من أجل تسهيل التحليلات الأعمق لمجموعات البيانات أحادية الخلية الخاصة بهم بالإضافة إلى إعادة التحليلات الأكثر انتشارا لمجموعات البيانات أحادية الخلية المنشورة سابقا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التئام الجروح من أكثر العمليات تعقيدا في بيولوجيا الثدييات ، ويتضمن مجموعة من ثلاث مراحل من الشفاء: الالتهابات ، والتكاثرية ، والدقة¹^،². تصنف مراحل الشفاء هذه على نطاق واسع الإجراءات المنسقة لعشرات أنواع الخلايا ومئات منتجاتها الجزيئية عبر مكان وزمان إصلاح الجروح³. أوضحت عدة عقود من الدراسات النسيجية والجزيئية القائمة على أخذ عينات من أنسجة الجرح عبر المسار الزمني للشفاء الأنماط الخلوية الشاملة لإصلاح الأنسجة³ ، لا سيما في نماذج الفئران القابلة للتكرار لالتئام جروح الجلد الاستئصالي⁴^،⁵^،⁶. فقط في العقدين الماضيين أصبح من الممكن تقدير تعقيد التئام الجروح بشكل كامل ، بدءا من ظهور التحليلات النسخية عالية الإنتاجية للجروح على مقاييس الأنسجة السائبة⁷^،⁸^،⁹ والخلايا¹⁰^،¹¹^،¹²^،¹³^،¹⁴. في الآونة الأخيرة ، قامت العديد من الدراسات بتحديد الجروح الجلدية بشكل نسخي على مستوى الخلية المفردة ، وتحديد أنواع فرعية جديدة من خلايا الجرح وإظهار كيف يمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض أثناء الشفاء¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸^،¹⁹^،²⁰. استخدم Hu et al. نهجا مبتكرا لتسلسل الحمض النووي الريبي المكاني أحادي الخلية لتشكيل الجروح الجلدية طوال فترة الشفاء على عدة مسافات شعاعية من مركز الجرح ، مما كشف عن "حركات" جديدة بين الخلايا والجزيئية عبر المكان^{والزمان 20}. تكشف مثل هذه الدراسات عن تعقيد التئام الجروح بتفاصيل غير مسبوقة ، وبدأت في رسم صورة لعدم التجانس الخلوي والجزيئي الهائل.

تتيح التطورات الحديثة الرئيسية في طرق تحليل المعلوماتية الحيوية من الممكن فهم بيولوجي لمجموعات البيانات المعقدة متعددة الأوميك التي يتم إنشاؤها في مجال أبحاث التئام الجروح. توفر حزم التحليل أحادية الخلية مثل Seurat أدوات للتحليل القوي وتكامل مجموعات البيانات ، بما في ذلك تصنيف أنواع الخلايا في الأنسجة المعقدة مثل الجروح²¹. للتفسير النهائي للبيانات أحادية الخلية ، يتم استخدام أدوات مثل CellChat لتحديد برامج التفاعل المفترضة بين الخلية والخلية التي قد تشرح كيفية تنسيق الخلايا لإصلاح الجروح²². في حين أن هذه الأدوات موثقة جيدا ومقتبسة جيدا ، إلا أنه يجب تشغيلها في بيئة ترميز حاسوبية مثل R ، وهي لغة برمجة إحصائية ورسومية تستخدم بشكل شائع في مجالات المعلوماتية الحيوية لعلم الجينوم والنسخ. في حين أن علماء الأحياء والأطباء في مجال التئام الجروح يستخدمون بشكل متزايد مناهج الخلية المفردة لدراسة إصلاح الأنسجة ، فإن القليل منهم لديهم التدريب المطلوب للمعلوماتية الحيوية لاستخدام أدوات مثل Seurat و CellChat مباشرة في مختبراتهم الخاصة. مثل هذا الحاجز في استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية هذه لا يمنع العلماء من تحليل مجموعات البيانات الخاصة بهم بشكل أعمق دون مساعدة علماء المعلوماتية الحيوية فحسب ، بل يمنع العلماء أيضا من إعادة تحليل ثروة بيانات الخلية المفردة التي نشرتها بالفعل مجموعات أخرى بشكل موثوق.

لذلك ، يتم تقديم سير عمل خطوة بخطوة هنا لتمكين العلماء الذين ليس لديهم خلفية في المعلوماتية الحيوية من تحليل مجموعة بيانات التئام الجروح أحادية الخلية المنشورة مسبقا والمتاحة للجمهور²⁰. يستخدم البروتوكول بيئة ترميز R الرسومية السائدة والمجانية المسماة RStudio ، ويوضح كيفية التنقل في هذه البيئة لتشغيل أسطر محددة من التعليمات البرمجية التي تتيح تحليلا أساسيا لمجموعة بيانات معقدة أحادية الخلية باستخدام Seurat و CellChat. ضمن هذا البروتوكول ، يتم تقديم الطرق السبع الرئيسية ذات الصلة بأبحاث التئام الجروح ، بما في ذلك: 1) تثبيت بيئة الترميز ، 2) تنزيل مجموعة البيانات وخطوات مراقبة الجودة الهامة ، 3) سير عمل تحليل الخلية المفردة بما في ذلك التصورات والتعليقات التوضيحية لنوع الخلية ، 4) تحليلات النوع الفرعي للخلية ، 5) تحليلات تسجيل الوحدات النمطية ، 6) تحليلات تفاعل الخلية الخلية ، و 7) التحليلات التكاملية لمجموعات البيانات المتعددة. ضمن كل طريقة ، يتم توفير التعليمات البرمجية الفعلية للمستخدم لتشغيلها جنبا إلى جنب مع البروتوكول ، ويتم عرض النتائج الرسومية الفعلية من كل سطر من التعليمات البرمجية لتوجيه المستخدم خلال سير العمل. الهدف الأساسي من هذه المقدمة الموجهة والمرئية ل RStudio وسير عمل تحليل الخلية المفردة الأساسي هو تمكين المزيد من علماء التئام الجروح من استخدام هذه الأدوات القوية مباشرة من أجل تمكين تقدم أسرع في مجال البحث.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظه: في مهام سير العمل التالية التي توضح بالتفصيل سبع طرق للمعلوماتية الحيوية ، تكون جميع خطوات البروتوكولات مصحوبة بكتل التعليمات البرمجية الخاصة بها والتي يجب تشغيلها مباشرة على واجهة RStudio الخاصة بالمستخدم بالترتيب الذي تم إدراجها فيه. لجعل هذا البروتوكول سهل الاستخدام قدر الإمكان ، يتم تضمين ملف نصي R (الملف التكميلي 1: JoVE_Rscript.R) ، والذي يمكن تحميله مباشرة في جلسة RStudio الخاصة بالمستخدم ، بحيث يمكن تشغيل كل سطر من التعليمات البرمجية ببساطة. هذا يتجنب اضطرار المستخدم إلى كتابة أو نسخ ولصق الكود من مستند البروتوكول ، مما قد يؤدي إلى حدوث أخطاء. يتم أيضا تضمين جميع تعليمات البروتوكول في ملف البرنامج النصي R في شكل تعليقات ، يشار إليها برمز الهاشتاج "#" في بداية كل سطر تعليق.

1. تثبيت R و RStudio وحزم R المطلوبة لسير عمل التحليل أحادي الخلية

قم بتنزيل R وتثبيته (الإصدار 4.4.1) على الكمبيوتر. استخدم الارتباط الذي يتوافق مع نظام تشغيل الكمبيوتر.
1. إذا كنت تستخدم جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل Microsoft Windows ، فاستخدم هذا الرابط: https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/
2. إذا كنت تستخدم جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل MacOS، فاستخدم هذا الرابط: https://cran.rstudio.com/bin/macosx/
قم بتثبيت أحدث إصدار من RStudio على الكمبيوتر. اضغط على الرابط التالي واتبع التعليمات:
https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/#download
قم بتثبيت Rtools (الإصدار 4.4) ، مما سيسمح ل R بتجميع حزم معينة. اضغط على الرابط التالي واتبع التعليمات:
1. إذا كنت تستخدم Windows ، فاستخدم هذا الرابط: https://cran.rstudio.com/bin/windows/Rtools/
2. إذا كنت تستخدم نظام التشغيل MacOS، فاستخدم هذا الرابط:
  https://mac.r-project.org/tools/
قم بتعيين دليل العمل المحلي ؛ هذا هو المجلد الموجود على الكمبيوتر حيث سيتم تحميل جميع الملفات منه وحفظها فيه. قم بتعيين دليل العمل عن طريق تحديد جلسة العمل في شريط قوائم RStudio والنقر فوق تعيين دليل العمل > اختيار الدليل وتحديد المجلد المطلوب.
1. إذا كنت تستخدم جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل Windows، فاستخدم الأمر التالي لتعيين دليل العمل. قم بتغيير [الدليل] في السطر التالي من التعليمات البرمجية إلى بنية الدليل الفعلية. ضع في اعتبارك أن محدد الدليل في R هو الحرف "/"
  setwd("C:/[Directory]")
2. إذا كنت تستخدم جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل MacOS، فسيقوم الأمر التالي أيضا بتعيين دليل العمل. قم بتغيير [الدليل] في السطر التالي من التعليمات البرمجية إلى بنية الدليل الفعلية. ضع في اعتبارك أن محدد الدليل في R هو الحرف "/"
  setwd("~/[Directory]")
3. في أي وقت أثناء جلسة R ، تحقق من دليل العمل باستخدام سطر التعليمات البرمجية التالي:
  getwd()
4. في RStudio، استكشف بصريا بنية دليل العمل، بما في ذلك جميع الملفات والمجلدات المضمنة فيه، داخل النافذة اليمنى في علامة التبويب الملفات . للانتقال إلى مستكشف ملفات RStudio إلى دليل العمل ، انقر فوق رمز الترس -> انتقل إلى دليل العمل.
قم بتثبيت الحزم التالية من مستودع حزمة R CRAN، وهي تبعيات ضرورية للبروتوكول. لتثبيت هذه الحزم، قم بتشغيل الأوامر التالية.
install.packages("devtools") install.packages("readxl") install.packages("openxlsx") install.packages("tidyverse") install.packages("scCustomize")
ملاحظه: أثناء تثبيت حزم R ، من الطبيعي أن تظهر النوافذ المختلفة وتختفي. إذا ظهرت نافذة تطلب تجميع حزمة، فانقر فوق نعم. إذا ظهرت نافذة تطلب إعادة تشغيل R قبل تثبيت الحزمة، فانقر فوق NO.
قم بتثبيت الحزم التالية من مستودع حزمة R المنسق Bioconductor
(https://bioconductor.org/)، وهي تبعيات ضرورية للبروتوكول. لتثبيت هذه الحزم، قم بتشغيل الأوامر التالية.
if (! requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE) ) install.packages("BiocManager") BiocManager::install("NMF", update=F) BiocManager::install("ComplexHeatmap", update=F) BiocManager::install("BiocNeighbors", update=F) BiocManager::install("SingleCellExperiment", update=F) BiocManager::install("circlize", update=F) BiocManager::install("edgeR", update=F) BiocManager::install("scDblFinder", update=F)
قم بتثبيت الحزم التالية المطلوبة لسير العمل الموضح في هذه المخطوطة.
install.packages("Seurat") devtools::install_github("jinworks/CellChat")
قم بالتحميل في كل حزمة للتأكد من نجاح عمليات التثبيت. في حالة ظهور خطأ "لم يتم العثور على الحزمة" ، أعد تثبيتها باستخدام التعليمات البرمجية المناسبة أعلاه.
library(readxl) library(openxlsx) library(tidyverse) library(scCustomize) library(edgeR) library(scDblFinder) library(Seurat) library(CellChat)

2. التحميل في مجموعة بيانات التئام الجروح أحادية الخلية وتنفيذ خطوات مراقبة الجودة

ملاحظه: بالنسبة لسير عمل المعلوماتية الحيوية هذا ، يتم إجراء إعادة تحليل لتجربة التئام الجروح الجلدية أحادية الخلية المكانية والزمانية المنشورة^{سابقا 20}. يتم تخزين ملفات مجموعة البيانات في مستودع NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) المنسق (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

انتقل إلى ملفات مجموعة البيانات من GEO باستخدام رقم الانضمام GSE204777. استخدم الرابط التالي وراجع التصميم التجريبي للدراسة: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE204777
داخل صفحة مستودع GEO ، هناك خمس دفعات فردية من البيانات التي تم الحصول عليها من خمسة ممرات للتسلسل. انقر فوق مجموعة البيانات الأولى ، بعنوان GSM6190913. فيما يلي رابط مباشر للعينة: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM6190913
قم بالتمرير لأسفل إلى أسفل الصفحة وقم بتنزيل الملفات الثلاثة التالية ، باستخدام روابط ftp أو html . داخل مستكشف ملفات الكمبيوتر ، انقل هذه الملفات الثلاثة إلى دليل يسمى b1. تأكد من أن المجلد b1 موجود داخل دليل العمل المعين في الخطوة 1.4.
اسم الملف: GSM6190913_b1_barcodes.tsv.gz / حجم الملف: 18.5 ميغابايت
اسم الملف: GSM6190913_b1_features.tsv.gz / حجم الملف: 254.1 كيلو بايت
اسم الملف: GSM6190913_b1_matrix.mtx.gz / حجم الملف: 151.2 ميغابايت
احصل على معلومات الدليل لملفات التسلسل أحادية الخلية التي تم تنزيلها في الخطوة 2.3.
b1_data_dir <- file.path(getwd(), "b1")
قم بالتحميل في ملفات التسلسل أحادية الخلية. تحدد المعلمة gene.column تسمية الجين/الميزة المستخدمة. في هذه الحالة ، استخدم gene.column = 2 لرموز الجينات (gene.column = 1 لأسماء الجينات Ensembl).
b1 <- Read10X_GEO(data_dir = b1_data_dir, gene.column = 2)
ملاحظه: لا تحتوي معظم مجموعات البيانات أحادية الخلية على بيانات إضافية متعددة الإرسال ، لذلك لن تحتوي ملفات 10x التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الخطوة على طبقات متعددة. بالنسبة لمجموعة البيانات المتعددة الحالية ، تابع الخطوة 2.6. بالنسبة لمجموعات البيانات التي لا تحتوي على بيانات مضاعفة ، انتقل إلى الخطوة 2.7.
قم بإلغاء تعدد إرسال مجموعة البيانات أحادية الخلية باستخدام الرموز الشريطية المكانية والزمانية.
1. بالنسبة لمجموعة بيانات العمل ، افصل بين التعبير الجيني وبيانات HTO (تعدد الإرسال).
  dataset_rna_counts <- b1$GSM6190913_b1_$`Gene Expression` dataset_barcodes <- b1$GSM6190913_b1_$`Antibody Capture`
2. قم بإنشاء كائن Seurat باستخدام بيانات التعبير الجيني ، مع تصفية الجينات المعبر عنها في أقل من 5 خلايا وخلايا بها أقل من 200 جين تم اكتشافها.
  dataset <- CreateSeuratObject(counts = dataset_rna_counts, min.cells = 5, min.features = 200)
3. قم بإنشاء مجموعة بيانات تعبير جيني كطبقة وقم بإنشاء قائمة بالخلايا والرموز الشريطية المشتركة لكلا المقايسين.
  dataset_rna_counts2 <- LayerData(dataset, data = "RNA") dataset_joint.barcodes <- intersect(colnames(dataset_rna_counts2), colnames(dataset_barcodes))
4. مجموعة فرعية من التعبير الجيني وعدد HTO بواسطة الرموز الشريطية للخلايا المشتركة.
  dataset_rna_counts2 <- dataset_rna_counts2[, dataset_joint.barcodes] dataset_barcodes2 <- as.matrix(dataset_barcodes[, dataset_joint.barcodes])
5. تأكد من أن HTO يحتوي على أسماء الباركود المتوقعة.
  rownames(dataset_barcodes2)
6. قم بإنشاء اختبار جديد لتخزين معلومات الباركود وإضافة هذا الاختبار إلى كائن Seurat الذي تم إنشاؤه مسبقا.
  dataset_barcode_assay <- CreateAssayObject(counts = dataset_barcodes2) dataset[["barcodes"]] <- dataset_barcode_assay
7. تحقق من أن الكائن يحتوي الآن على فحوصات متعددة.
  DefaultAssay(dataset)
8. تطبيع بيانات الباركود وإجراء إلغاء تعدد الإرسال عبر وظيفة HTODemux. تم وصف هذه الطريقة بالتفصيل في المقالة القصيرة التالية من Seurat: https://satijalab.org/seurat/articles/hashing_vignette
  dataset <- HTODemux(dataset, assay = "barcodes", positive.quantile = 0.99)
9. تجميع الخلايا استنادا إلى نتائج التصنيف العام وإزالة الخلايا بدون تصنيف الباركود.
  Idents(dataset) <- "barcodes_classification.global" dataset <- subset(dataset, idents = "Negative", invert = TRUE)
10. تجميع الخلايا بناء على الحد الأقصى لإشارة HTO.
  Idents(dataset) <- "barcodes_maxID"
11. تصور توزيع الجينات المكتشفة في الخلايا وفقا لرموزها الشريطية المتعددة (الشكل التكميلي 1).
  VlnPlot(dataset, features = "nFeature_RNA", pt.size = 0.1, log = TRUE)
12. أعد تسمية الرموز الشريطية إلى وقت الجرح الفعلي (أيام ما بعد الجرح) وتخصيص المساحة (2-8 مم) (مأخوذة من المخطوطة الأصلية) وقم بتعيينها إلى متغير بيانات وصفية جديد يسمى time_space.
  Idents(dataset) <- "barcodes_maxID" levels(dataset) dataset <- RenameIdents(dataset, "Barcode-1" ="D01_2mm", "Barcode-2" ="D01_4mm", "Barcode-3" ="D01_6mm", "Barcode-4" ="D01_8mm", "Barcode-5" ="D03_2mm", "Barcode-6" ="D03_4mm", "Barcode-7" ="D03_6mm", "Barcode-8" ="D03_8mm", "Barcode-9" ="D07_2mm", "Barcode-10" ="D07_4mm", "Barcode-11" ="D07_6mm", "Barcode-12" ="D07_8mm", "Barcode-13" ="D14_2mm", "Barcode-14" ="D14_4mm", "Barcode-15" ="D14_6mm", "Barcode-16" ="D14_8mm", "Barcode-17" ="UW") levels(dataset) dataset[["time_space"]] <- Idents(dataset)
لمجموعات البيانات التي لا تحتوي على بيانات مضاعفة: قم بإنشاء كائن Seurat ، مع تصفية الجينات المعبر عنها في أقل من 5 خلايا وخلايا بها أقل من 200 جين تم اكتشافها.
dataset <- CreateSeuratObject(counts = b1, min.cells = 5, min.features = 200)
قم بالتبديل إلى تحليل مقايسة التعبير الجيني لمجموعة البيانات.
DefaultAssay(dataset) <- "RNA" Idents(dataset) <- "data"
كخطوة مهمة لمراقبة الجودة ، احسب النسبة المئوية لجينات الميتوكوندريا في كل خلية وقم بتعيينها كمتغير بيانات وصفية. تم وصف هذه الطريقة بالتفصيل في المقالة القصيرة التالية من Seurat: https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial#qc-and-selecting-cells-for-further-analysis
dataset[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(dataset, pattern = "^mt-")
تصور توزيع الجينات المكتشفة وأعداد الحمض النووي الريبي ونسبة الميتوكوندريا في جميع الخلايا (الشكل التكميلي 2).
plot1 <- FeatureScatter(dataset, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt") plot2 <- FeatureScatter(dataset, feature1 = "nFeature_RNA", feature2 = " percent.mt ") plot1 + plot2
هناك عدد من الخلايا ذات المحتوى الكبير من الميتوكوندريا ، والتي ترتبط بانخفاض عدد الحمض النووي الريبي. هذه خلايا ميتة أو محتضرة. قم بإزالة هذه الخلايا منخفضة الجودة من مجموعة البيانات باستخدام قطع عادل. في هذه الحالة ، استخدم قيم مجموعة البيانات الأصلية الموضحة في الدراسة^{المنشورة سابقا 20} ، حيث تتم إزالة الخلايا التي تحتوي على أكثر من 25٪ من جينات الميتوكوندريا.
dataset <- subset(dataset, subset = nFeature_RNA > 200 & percent.mt < 25)
تصور توزيع الجينات المكتشفة وأعداد الحمض النووي الريبي ونسبة الميتوكوندريا في جميع الخلايا بعد إزالة الخلايا منخفضة الجودة (الشكل التكميلي 3).
plot1 <- FeatureScatter(dataset, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt") plot2 <- FeatureScatter(dataset, feature1 = "nFeature_RNA", feature2 = " percent.mt ") plot1 + plot2
كخطوة إضافية مهمة لمراقبة الجودة ، اكتشف المزدوجات المحتملة في مجموعة البيانات. هذه هي الخلايا التي تم ربطها أثناء تسلسل القطيرات وبالتالي ستؤدي إلى تعبيرات جينية ليست على مستوى الخلية الواحدة. لمواجهة هذه المشكلة ، تم تطوير العديد من الأدوات. من المهم ملاحظة أن كل أداة تضع افتراضات معينة حول البيانات أحادية الخلية ، لذلك من المهم للمستخدم قراءة جميع الوثائق ذات الصلة قبل استخدام أي أداة واحدة. في سير العمل هذا، قم بتنفيذ أسلوب يسمى scDblFinder²³. يرجى ملاحظة أن هذه الطريقة تستخدم خوارزمية تفرض معدلا مزدوجا متوقعا ثابتا. استخدم الأوامر التالية لتشغيل البنية الأساسية لبرنامج ربط العمليات التجارية scDblFinder.
DefaultAssay(dataset) <- "RNA" sce <- scDblFinder(GetAssayData(dataset, assay="RNA", slot="counts"), samples=Idents(dataset))
ملاحظه: يمكن أيضا فحص مجموعات البيانات أحادية الخلية المتعددة مثل هذه المجموعات بحثا عن المزدوجات عن طريق إزالة الخلايا التي تعبر عن رموز شريطية متعددة. لم يوضح سير العمل هذا هذا الأسلوب لأن معظم مجموعات البيانات أحادية الخلية لا تحتوي على هذه الميزة الفريدة. بدلا من ذلك ، يتم عرض مسار أكثر قابلية للتعميم لفحص الزوجي باستخدام طريقة scDblFinder.
قم بتعيين الدرجة المزدوجة لمتغير بيانات تعريف جديد.
dataset$scDblFinder.score <- sce$scDblFinder.score
تصور توزيع النتيجة المزدوجة في جميع الخلايا (الشكل التكميلي 4).
VlnPlot(dataset, features = "scDblFinder.score", raster=FALSE, pt.size=0.5)
قم بإزالة الخلايا فوق عتبة الدرجات المزدوجة 0.25. تم اختيار هذه العتبة بناء على مخطط الكمان الذي تم إنشاؤه أعلاه ، والذي أظهر أنه يمكن تعيين معظم الخلايا في مجموعة البيانات إما إلى درجات مزدوجة عالية جدا أو منخفضة جدا ، و 0.25 هو قطع معقول لمجموعة البيانات هذه التي من شأنها إزالة الغالبية العظمى من الزوجي المحتمل دون إزالة العديد من الزوجات غير المحتملة.
dataset <- subset(dataset, scDblFinder.score < 0.25)
احفظ كائن Seurat لمجموعة البيانات كملف RDS في دليل العمل.
saveRDS(dataset, "dataset_post_Method2.rds")

3. تحليل مجموعة بيانات التئام الجروح أحادية الخلية باستخدام Seurat

ملاحظة: (خطوة اختيارية) في حالة بدء سير العمل هنا، قم بتحميل ملف RDS المحفوظ ككائن Seurat.

dataset <- readRDS("dataset_post_Method2.rds")

قم بتنفيذ سير عمل Seurat القياسي لتطبيع مجموعة البيانات أحادية الخلية والتحجيم وتحليل المكونات الرئيسية (PCA). يتم وصف سير العمل القياسي هذا في المقالات القصيرة التالية من Seurat:
Seurat - البرنامج التعليمي للتجميع الموجه: https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial
قائمة أوامر سورات: https://satijalab.org/seurat/articles/essential_commands
DefaultAssay(dataset) <- "RNA"
dataset <- NormalizeData(object = dataset) dataset <- FindVariableFeatures(object = dataset) dataset <- ScaleData(object = dataset) dataset <- RunPCA(object = dataset)
تصور مقدار تباين مجموعة البيانات فيما يتعلق بأبعاد PCA ال 50 الأولى (الشكل التكميلي 5).
ElbowPlot(dataset, reduction = "pca", ndims = 50)
يحدث الكثير من الاختلاف الرئيسي ضمن الأبعاد ال 13 الأولى.
قم بإجراء تجميع الخلايا لمجموعة البيانات باستخدام نطاق أبعاد PCA محدد من 1-13 ودقة محددة تبلغ 0.1.
dataset <- FindNeighbors(dataset, verbose = TRUE, dims = 1:13) dataset <- FindClusters(dataset, verbose = TRUE, resolution = 0.1)
ملاحظه: يركز سير العمل هذا على الاختلافات واسعة النطاق في أنواع الخلايا. لذلك ، فإنه يستخدم معلمة متحفظة إلى حد ما لنطاق أبعاد PCA ، حيث تظهر الأبعاد ال 13 الأولى لتمثل الغالبية العظمى من التباين داخل مجموعة البيانات. لتمييز الخلايا إلى أنواع فرعية أصغر وأكثر ندرة ، يمكن للمستخدم استخدام عدد أكبر من الأبعاد لتحليل المصب نظرا لأن هذه الأنواع الفرعية للخلايا النادرة من المحتمل أن تمثل مستويات أقل من تباين مجموعة البيانات. تتراوح معلمة الدقة من 0 إلى 1 ، وتحدد حجم الفصل الفئوي المفروض على مجموعة البيانات. يعتمد إعداد هذه المعلمة على سؤال بحث المستخدم. لتجميع الخلايا في العديد من الأنواع الفرعية الصغيرة والنادرة ، استخدم دقة أعلى لتحليل المصب. نظرا لأن سير العمل هذا يهدف إلى استكشاف اختلافات أكثر اتساعا بين أنواع الخلايا الرئيسية ، فإنه يستخدم قيمة دقة صغيرة إلى حد ما تبلغ 0.1 ، والتي من المتوقع أن تتجمع الخلايا إلى مجموعات أقل وأكبر. سيؤدي استخدام الإعدادات المذكورة في الخطوة 3.3 إلى تمييز 8 مجموعات خلايا فريدة. يتم تعيين هذه المجموعات تلقائيا إلى متغير بيانات تعريف يسمى "seurat_clusters".
قم بإجراء تقليل أبعاد UMAP وإيجاد تحليل الجيران باستخدام أول 13 بعدا من أبعاد PCA. أضف الرقم الأولي 123 لضمان قابلية تكرار إسقاط البيانات الناتجة.
dataset <- RunUMAP(dataset, verbose = TRUE, dims = 1:13, seed.use = 123)
ملاحظه: خوارزمية UMAP عشوائية وتقدم العشوائية في تقليل الأبعاد (انظر "الاستقرار والاستنساخ" في https://cran.r-project.org/web/packages/umap/vignettes/umap.html). بينما يوفر استخدام بذرة متسقة "الحد الأدنى من القابلية للتكرار" للخوارزمية ، فقد تظل المخطط الناتج مختلفة قليلا عما هو موضح في الأشكال التمثيلية والنتائج النهائية وجد الاختبار أن النتائج ستختلف بشكل خاص بين أجهزة الكمبيوتر التي تعمل بنظام Windows وتلك التي تعمل بنظام التشغيل MacOS ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى التطبيقات المختلفة للعشوائية في أنظمة التشغيل هذه.
تصور تجميع الخلايا على مخطط UMAP (الشكل 1).
DimPlot(dataset, group.by = "seurat_clusters", raster = FALSE, label = TRUE)
ملاحظه: قد تؤدي عشوائية خوارزمية UMAP إلى إنشاء مخططات مختلفة قليلا ، كما هو موضح في الشكل الذي يوضح مخططات UMAP بديلة تم إنشاؤها باستخدام نفس الكود كما هو مذكور أعلاه على أجهزة الكمبيوتر التي تعمل بنظام التشغيل Windows و MacOS ؛ لاحظ الاختلافات الطفيفة في أشكال المجموعات. لذلك ، من الضروري أن يحفظ المستخدم جميع البيانات والمخططات ويختمدها بختم زمني عند إنشائها ، وأن يتم إجراء جميع التحليلات النهائية على المجموعات بعناية ومع مراعاة الفهم البيولوجي ، كما هو موضح أدناه للتعليق التوضيحي لنوع الخلية.
نظرا لأنه يتم تضمين ملصقات التجربة الأصلية التي تشير إلى مكان ووقت جاءت الخلايا أثناء التئام الجروح ، تصور التعليق التوضيحي لوقت / مكان الجرح للخلايا على مخطط UMAP (الشكل 2).
DimPlot(dataset, group.by = "time_space", raster = FALSE, label = FALSE)
قم بإنشاء جدول لاقتران مجموعة الخلايا مع التعليق التوضيحي لوقت الجرح / المكان.
table(dataset$time_space, dataset$seurat_clusters)
تحديد هويات أنواع الخلايا الرئيسية في مجموعة البيانات. للقيام بذلك ، احسب الجينات المعبر عنها تفاضليا (DEG) بين جميع المجموعات. احصل على قوائم DEG للمجموعات، وقم بتعيينها إلى متغير، واحفظ الإخراج كملف نصي محدد داخل دليل العمل.
ملاحظه: هذه الخطوة كثيفة الاستخدام لوحدة المعالجة المركزية ويمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، اعتمادا على أجهزة المستخدم.
Idents(dataset) <- "seurat_clusters" Cell_markers <- FindAllMarkers(dataset, max.cells.per.ident = 500, only.pos = TRUE, min.pct = 0.10, logfc.threshold = 0.25) write.csv(Cell_markers, file = file.path(getwd(), "dataset_cluster_markers.txt"))
قم بتنزيل ملف dataset_cluster_markers.txt المضمن وافتحه في جدول بيانات (على سبيل المثال، Excel) عن طريق نسخ محتويات الملف النصي واستخدام معالج استيراد النص لتحديد محدد الفاصلة وهوية أعمدة اسم الجينات كنص. من المهم الإشارة إلى أن أسماء الجينات هي "نص" ، وإلا سيقوم Excel تلقائيا بتحويل أسماء جينات معينة إلى تواريخ ، على سبيل المثال تغيير 7 سبتمبر إلى 7 سبتمبر.
في جدول بيانات، قم بتصفية النتائج وفقا للمعلمات التالية الموصى بها:
1. رتب عمود avg_log2FC من الأكبر إلى الأصغر لترتيب جميع الصفوف وفقا لتغييرات أضعاف السجل_{المتناقص 2} (log2FC).
2. رتب عمود نظام المجموعة من الأصغر إلى الأكبر لترتيب جميع الصفوف وفقا لزيادة أرقام نظام مجموعة Seurat.
3. قم بتصفية عمود avg_log2FC بحثا عن أرقام أكبر من أو تساوي 2.5 لإظهار الجينات الأكثر تعبيرا تفاضليا فقط (DEGs) في المجموعة المشار إليها مقابل المجموعات الأخرى.
4. قم بتصفية عمود pct.1 للأرقام الأكبر من أو تساوي 0.4. يشير هذا العمود إلى النسبة المئوية للخلايا في المجموعة المشار إليها التي تعبر عن الجين المشار إليه (Cluster٪) وتعيين العتبة عند 0.4 يعني أنه يتم عرض الجينات المعبر عنها فقط في 40٪ على الأقل من الخلايا في المجموعة المشار إليها.
5. قم بتصفية عمود pct.2 للأرقام الأقل من أو تساوي 0.2. يشير هذا العمود إلى النسبة المئوية للخلايا غير الموجودة في المجموعة المشار إليها التي تعبر عن الجين المشار إليه (غير عنقودية) ، ويعني تعيين العتبة عند 0.2 أنه يتم عرض الجينات المعبر عنها فقط في 20٪ على الأكثر من الخلايا غير الموجودة في المجموعة المشار إليها.
6. قم بتصفية عمود p_val_adj للأرقام الأقل من أو تساوي 0.01. يشير هذا العمود إلى قيمة P المعدلة أو معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) ، مما يشير إلى القوة الإحصائية ل DEG المشار إليه ، وتعيين العتبة عند 0.01 يعني أنه يتم عرض الجينات التي تحتوي على FDR < 0.01 فقط.
  ملاحظة: يحتوي الجدول التكميلي 1 (JoVE_DEGs_cellMarkers.xlsx) على المخرجات الكاملة للجينات المعبر عنها تفاضليا المصنفة المستخدمة في الخطوة 3.10 من البروتوكول. يوضح الجدول التكميلي 2 أفضل 5 جينات لكل مجموعة في هذا التحليل ، مع الجينات الجريئة المستخدمة في التصورات اللاحقة.
للحصول على تعليق توضيحي غير متحيز من نوع الخلية للمجموعات، استخدم أداة تحليل التخصيب المستندة إلى الويب EnrichR.
استخدم الرابط: https://maayanlab.cloud/Enrichr/
انسخ قوائم DEGs لكل مجموعة إلى نافذة EnrichR منفصلة، ثم انقر فوق تحليل. تقوم أداة EnrichR بتشغيل قائمة الجينات من خلال مئات قواعد البيانات المنسقة وتصنف كل مصطلح تم إثراؤه في كل فئة.
لأغراض التعليق التوضيحي لنوع الخلية ، انقر فوق علامة التبويب أنواع الخلايا أعلاه وركز على أعلى 5 عمليات إثراء في قواعد البيانات المنسقة لعلامات الخلايا الثلاثة على الجانب الأيسر (الشكل 3):
سيل ماركر 2024 (http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/)
تابولا العاقل (https://tabula-sapiens-portal.ds.czbiohub.org/)
PanglaoDB المعزز (https://panglaodb.se/)
بناء على إثراء DEGs في قواعد البيانات هذه ، تأكد من الهوية المحتملة للمجموعات الثمانية. لاحظ أن هناك مجموعتين (2 ، 6) تثريان مثل الخلايا الليفية. لذلك ، ادمج هذه المجموعات في تعليقات توضيحية من نوع الخلية الواحدة. قم بتعيين هويات نوع الخلية كتسميات لمتغير بيانات تعريف جديد يسمى cell_types.
Idents(dataset) <- "seurat_clusters" dataset[["cell_types"]] <- Idents(dataset) Idents(dataset) <- "cell_types" dataset <- RenameIdents(dataset, "0" = "Macrophage", "1" = "Neutrophil", "2" = "Fibroblast", "3" = "Epithelial cell", "4" = "Endothelial cell", "5" = "T cell", "6" = "Fibroblast", "7" = "Smooth muscle cell" ) levels(dataset) dataset[["cell_types"]] <- Idents(dataset)
تصور مجموعات الخلايا المعاد تسميتها كتعليقات توضيحية على مخطط UMAP (الشكل 4).
DimPlot(dataset, group.by = "cell_types", raster = FALSE, label = FALSE)
تصور توطين جينات علامات الكتلة العلوية (الغامقة) من الجدول 1 على سلسلة من مخططات UMAP (الشكل 5).
DefaultAssay(dataset) <- "RNA" FeaturePlot(dataset, features = c("Arg1", "Retnlg", "Fgf7", "Dsp", "Tie1", "Cd3g", "Cdh4", "Rgs5"), raster=FALSE, ncol = 4)
تصور DEGs لعلامات نظام المجموعة العلوي على مخطط نقطي ، مجمعة حسب أرقام الكتلة الأصلية (الشكل التكميلي 6).
DotPlot(dataset, group.by = "seurat_clusters", features = c("Arg1","Retnlg","Fgf7","Dsp","Tie1", "Cd3g","Cdh4","Rgs5")) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(low = "blue", mid = "grey", high = "red")
تصور DEGs لعلامات نظام المجموعة العلوي على مخطط نقطي ، مجمعة حسب أنواع الخلايا المشروحة (الشكل 6).
DotPlot(dataset, group.by = "cell_types", features = c("Arg1","Retnlg","Fgf7","Dsp","Tie1", "Cd3g","Cdh4","Rgs5")) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(low = "blue", mid = "grey", high = "red")
لإجراء تحليلات السلاسل الزمنية، قم أولا بتبسيط مجموعة البيانات لإزالة المكون المكاني. بالنسبة لتحليلات المسار الزمني ، قم بتجميع التعليقات التوضيحية لوقت / مكان الجرح في الأيام الإجمالية بعد الجرح (DPW) باستخدام متغير بيانات وصفية جديد يسمى "DPW".
Idents(dataset) <- "time_space" dataset[["DPW"]] <- Idents(dataset) Idents(dataset) <- "DPW" new.cluster.ids <- c("D1", "D1", "D1", "D1", "D3", "D3", "D3", "D3", "D7", "D7", "D7", "D7", "D14", "D14", "D14", "D14", "UW") names(new.cluster.ids) <- levels(dataset) dataset <- RenameIdents(dataset, new.cluster.ids) dataset[["DPW"]] <- Idents(dataset) Idents(dataset) <- "DPW"
تصور مجموعات المسار الزمني الجديدة للجرح على مخطط UMAP (الشكل التكميلي 7).
DimPlot(dataset, group.by = "DPW", raster = FALSE, label = FALSE)
قم بإنشاء جداول توضح عدد الخلايا من كل نوع تحدث في كل DPW.
table(dataset$DPW, dataset$cell_types)
1. الخطوة الاختيارية: للحصول أيضا على قوائم DEG لمجموعات الدورة التدريبية الزمنية للجرح، قم بتعيينها إلى متغير، واحفظ الإخراج كملف نصي محدد.
  Idents(dataset) <- "DPW" Cell_DPW_markers <- FindAllMarkers(dataset, max.cells.per.ident = 500, only.pos = TRUE, min.pct = 0.10, logfc.threshold = 0.25) write.csv(Cell_DPW_markers, file = file.path(getwd(), "dataset_DPW_markers.txt"))
قم بتحويل أرقام الخلايا إلى نسب لكل فئة لفهم التغييرات النسبية في تكوين نوع الخلية بشكل أفضل طوال فترة الشفاء. تصور نسبة DPW في كل نوع من أنواع الخلايا (الشكل التكميلي 8):
pt1 <- table(dataset$DPW, dataset$cell_types) pt1 <- as.data.frame(pt1) pt1$Var1 <- as.character(pt1$Var1) ggplot(pt1, aes(x = Var2, y = Freq, fill = Var1)) + theme_bw(base_size = 15) + geom_col(position = "fill", width = 0.5) + xlab("Sample") + RotatedAxis() + ylab("Proportion") + theme(legend.title = element_blank())
تصور نسبة أنواع الخلايا في كل DPW ( الشكل 7).
pt2 <- table(dataset$cell_types, dataset$DPW) pt2 <- as.data.frame(pt2) pt2$Var1 <- as.character(pt2$Var1) ggplot(pt2, aes(x = Var2, y = Freq, fill = Var1)) + theme_bw(base_size = 15) + geom_col(position = "fill", width = 0.5) + xlab("Sample") + ylab("Proportion") + theme(legend.title = element_blank())
احفظ كائن Seurat لمجموعة البيانات كملف RDS في دليل العمل.
saveRDS(dataset, "dataset_post_Method3.rds")

4. تحليل الأنواع الفرعية للخلايا باستخدام Seurat

ملاحظه: تتيح قوة تحليل الخلية المفردة اكتشاف وتحليل الأنواع الفرعية النادرة داخل أنواع الخلايا الرئيسية التي تم تحليلها أعلاه. يركز هذا المثال على الخلايا الليفية ، التي تجمعت في البداية في مجموعتين من Seurat قبل دمجها في فئة واحدة. يركز هذا الجزء من البروتوكول على الخلايا الليفية على وجه التحديد ، باستثناء جميع أنواع الخلايا الأخرى ، ويستكشف هوياتها وخصائصها الزمنية أثناء التئام الجروح. كخطوة اختيارية ، إذا لزم الأمر ، قم بتحميل ملف RDS المحفوظ ككائن Seurat.

dataset <- readRDS("dataset_post_Method3.rds")

مجموعة البيانات الأصلية وفقا لهوية الخلية الليفية.
المعرفات (مجموعة البيانات) <- "cell_types"
dataset_fibroblast <- subset(dataset, idents = "Fibroblast")
قم بإجراء PCA على مجموعة البيانات الأصغر هذه وتصور مقدار تباين مجموعة البيانات فيما يتعلق بأبعاد PCA (الشكل التكميلي 9).
dataset_fibroblast <- RunPCA(dataset_fibroblast, verbose = TRUE) ElbowPlot(dataset_fibroblast, reduction = "pca", ndims = 50)
ملاحظه: يحدث الكثير من التباين الرئيسي داخل أول 9 أبعاد.
قم بإجراء تجميع الخلايا لمجموعة البيانات باستخدام مجموعة أبعاد PCA من 1-9 ودقة محددة تبلغ 0.1.
dataset_fibroblast <- FindNeighbors(dataset_fibroblast, verbose = TRUE, dims = 1:9) dataset_fibroblast <- FindClusters(dataset_fibroblast, verbose = TRUE, resolution = 0.1)
ملاحظه: باستخدام هذه الإعدادات ، تميز الخوارزمية 3 مجموعات فريدة من الخلايا الليفية. يتم تعيين هذه المجموعات تلقائيا إلى متغير بيانات تعريف يسمى seurat_clusters.
قم بإجراء تقليل أبعاد UMAP وإيجاد تحليل الجيران باستخدام أول 9 أبعاد PCA. أضف الرقم الأولي 123 لضمان قابلية تكرار إسقاط البيانات الناتجة.
dataset_fibroblast <- RunUMAP(dataset_fibroblast, verbose = TRUE, dims = 1:9, seed.use = 123)
تصور تجميع الخلايا على مخطط UMAP (الشكل 8).
DimPlot(dataset_fibroblast, group.by = "seurat_clusters", raster = FALSE, label = TRUE)
تصور التعليق التوضيحي للمسار الزمني للجرح للخلايا على مخطط UMAP (الشكل التكميلي 10).
DimPlot(dataset_fibroblast, group.by = "DPW", raster = FALSE, label = FALSE)
احصل على قوائم DEG للأنواع الفرعية الثلاثة للأرومات الليفية واحفظها في ملف نصي في دليل العمل.
Idents(dataset_fibroblast) <- "seurat_clusters" fibroblast_markers <- FindAllMarkers(dataset_fibroblast, max.cells.per.ident = 500, only.pos = TRUE, min.pct = 0.10, logfc.threshold = 0.25) write.csv(fibroblast_markers, file = file.path(getwd(), "fibroblast_cluster_markers.txt"))
اتبع خطوات مماثلة على النحو الوارد أعلاه (الخطوات 3.9-3.10) في جدول بيانات لتصفية DEGs في علامات النوع الفرعي العلوي للأرومات الليفية.
حدد قائمة جينات مخصصة كمتغير عن طريق نسخ أفضل 5 علامات من النوع الفرعي للأرومات الليفية لكل مجموعة من المجموعات الثلاث من ملف نص DIG.
FB_type_marker <- c("Plac8", "Cthrc1", "Adam12", "Ifi211", "Plat", "Cdh4", "Aldh3a1", "Ppp1r14a", "Oxtr", "Serpina3c", "Sostdc1", "Scube3", "Ptprz1", "Corin", "Alx4")
تصور الجينات الموجودة في القائمة في مجموعة بيانات الخلايا الليفية فقط عن طريق استدعاء المتغير في معلمة الميزات للمخطط النقطي (الشكل 9).
DotPlot(dataset_fibroblast, group.by="seurat_clusters", features = FB_type_marker) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(midpoint = 0, low = "blue", mid = "grey", high = "red") DotPlot(dataset_fibroblast, group.by="DPW", features = FB_type_marker) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(midpoint = 0, low = "blue", mid = "grey", high = "red")
تصور الجينات الموجودة في القائمة في مجموعة البيانات الأصلية أحادية الخلية عن طريق استدعاء المتغير في معلمة الميزات الخاصة بالمخطط النقطي (الشكل التكميلي 11).
DotPlot(dataset, group.by="cell_types", features = FB_type_marker) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(midpoint = 0, low = "blue", mid = "grey", high = "red")
تصور نسبة الأنواع الفرعية للأرومات الليفية في كل فئة من فئات DPW (الشكل التكميلي 12).
pt3 <- table(dataset_fibroblast$seurat_clusters, dataset_fibroblast$DPW) pt3 <- as.data.frame(pt3) pt3$Var1 <- as.character(pt3$Var1) ggplot(pt3, aes(x = Var2, y = Freq, fill = Var1)) + theme_bw(base_size = 15) + geom_col(position = "fill", width = 0.5) + xlab("Sample") + ylab("Proportion") + theme(legend.title = element_blank())
تصور نسبة خلايا الخلايا الليفية DPW في كل فئة فرعية من الخلايا الليفية (الشكل التكميلي 13).
pt4 <- table(dataset_fibroblast$DPW, dataset_fibroblast$seurat_clusters) pt4 <- as.data.frame(pt4) pt4$Var1 <- as.character(pt4$Var1) ggplot(pt4, aes(x = Var2, y = Freq, fill = Var1)) + theme_bw(base_size = 15) + geom_col(position = "fill", width = 0.5) + xlab("Sample") + ylab("Proportion") + theme(legend.title = element_blank())
احفظ كائن Seurat لمجموعة البيانات كملف RDS في دليل العمل.
saveRDS(dataset_fibroblast, "dataset_fibroblast_post_Method4.rds")

5. مثال على تحليل المتابعة عبر تسجيل الوحدة

ملاحظه: تسمى إحدى الطرق المفيدة لتحليل مجموعات البيانات أحادية الخلية تسجيل الوحدة النمطية. في سير العمل هذا ، يمكن للمرء تحديد قائمة الجينات وفقا للمعرفة السابقة ثم حساب درجات الوحدة ، والتي يمكن أن تحدد التخصيب المحتمل لقائمة الجينات داخل كل خلية. يمكن حساب متوسط هذه الدرجات عبر التعليقات التوضيحية للخلايا للكشف عن أنماط التخصيب المحتملة.

هنا ، استخدم قوائم الجينات من دراسة نشرت^{سابقا 2} ، حيث تم تحديد الجينات الخاصة بمرحلة التئام الجروح باستخدام عينات متسلسلة من الحمض النووي الريبي السائبة من جميع أنحاء سلسلة الشفاء. تم حفظ قوائم الجينات في ملف نصي محدد بعلامات جدولة (الملف التكميلي 2: JoVE_PhaseSpecificGenes.txt) يمكن الآن تنزيله في دليل العمل واستخدامه لإنشاء قوائم الجينات التي تحدد مراحل الشفاء الرئيسية الثلاث.

قم بتحميل قوائم الجينات في متغير عن طريق قراءة ملف TEXT.
PhaseSpecificGenes <- read_delim("JoVE_PhaseSpecificGenes.txt", delim="\t", col_names = T)
افصل الأعمدة إلى متغيرات قائمة جينات فردية وقم بتغيير الجينات إلى أسماء الماوس التي تحتوي على حرفها الأول بأحرف كبيرة.
PS_Inflammatory <- PhaseSpecificGenes[1] PS_Inflammatory_ms <- lapply(PS_Inflammatory, str_to_sentence) PS_Proliferative <- PhaseSpecificGenes[2] PS_Proliferative_ms <- lapply(PS_Proliferative, str_to_sentence) PS_Resolution <- PhaseSpecificGenes[3] PS_Resolution_ms <- lapply(PS_Resolution, str_to_sentence)
ملاحظة: (اختياري) إذا لزم الأمر، قم بتحميل ملف RDS المحفوظ ككائن Seurat.
dataset <- readRDS("dataset_post_Method3.rds")
استخدم قوائم الجينات كوحدات لتسجيل كل خلية في مجموعة البيانات وفقا لمراحل الشفاء.
dataset <- AddModuleScore( object = dataset, features = PS_Inflammatory_ms, ctrl = 100, name = 'Inflammatory' ) dataset <- AddModuleScore( object = dataset, features = PS_Proliferative_ms, ctrl = 100, name = 'Proliferative' dataset <- AddModuleScore( object = dataset, features = PS_Resolution_ms, ctrl = 100, name = 'Resolution' )
تصور درجات الوحدة النمطية المجمعة لكل فئة خلية، بما في ذلك DPW وأنواع الخلايا الرئيسية (الشكل 10).
DotPlot(dataset, group.by="DPW", features = c("Inflammatory1","Proliferative1", "Resolution1")) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(midpoint = 0, low = "blue", mid = "grey", high = "red") DotPlot(dataset, group.by="cell_types", features = c("Inflammatory1","Proliferative1", "Resolution1")) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(midpoint = 0, low = "blue", mid = "grey", high = "red")

6. مثال على تحليل المتابعة عبر CellChat

ملاحظه: طريقة أخرى مفيدة ومقتبسة جيدا لتحليل مجموعات البيانات أحادية الخلية هي استنتاج تفاعلات الخلية الخلية. في سير العمل هذا، استخدم الحزمة CellChat، التي تستنتج الاتصالات بين الخلية والخلية من خلال تحليل التفاعلات التفاضلية بين مجموعات الخلايا²². في الآونة الأخيرة ، نشر مطورو CellChat بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لاستخدامه المعمم²⁴ ، وهذا مورد ممتاز للمستخدمين أثناء عملهم من خلال سير العمل التالي وتطبيقه على مجموعات البيانات الخاصة بهم. على سبيل المثال ، يقارن سير العمل التالي تفاعلات جميع الخلايا الرئيسية في الجروح في 1 مقابل 14 يوما بعد الجرح (DPW). لم يتم وصف كل خطوة بتفصيل كبير ، حيث تم وصف جميع الخطوات بالفعل في منشور CellChat الرسمي²⁴ بالإضافة إلى البرامج التعليمية المرتبطة هنا:

استدلال وتحليل الاتصال بين الخلية والخلية باستخدام
CellChat: https://github.com/jinworks/CellChat/blob/master/tutorial/CellChat-vignette.html

تحليل مقارنة مجموعات البيانات المتعددة باستخدام CellChat:
https://github.com/jinworks/CellChat/blob/master/tutorial/Comparison_analysis_of_multiple_datasets.html

الخطوة الاختيارية: إذا لزم الأمر، قم بالتحميل في ملف RDS المحفوظ ككائن Seurat:

dataset <- readRDS("dataset_post_Method3.rds")

قم بتعيين مجموعة البيانات الأصلية إلى مجموعتي بيانات وفقا للتعليق التوضيحي DPW.
Idents(dataset) <- "DPW" dataset_D1 <- subset(dataset, ident = "D1") dataset_D14 <- subset(dataset, ident = "D14")
حدد التعليق التوضيحي الذي سيتم من خلاله تنفيذ CellChat --- في هذه الحالة ، استخدم أنواع الخلايا الرئيسية.
Idents(dataset_D1) <- "cell_types" Idents(dataset_D14) <- "cell_types"
قم بإنشاء كائنات CellChat واتبع سير عمل CellChat النموذجي. راجع البرامج التعليمية المرتبطة أعلاه كمراجع مفصلة لكل خطوة.
cellchat_D1 <- createCellChat(dataset_D1, group.by = "ident", assay = "RNA") cellchat_D14 <- createCellChat(dataset_D14, group.by = "ident", assay = "RNA") CellChatDB <- CellChatDB.mouse CellChatDB.use <- CellChatDB cellchat_D1@DB <- CellChatDB.use cellchat_D14@DB <- CellChatDB.use cellchat_D1 <- subsetData(cellchat_D1) cellchat_D14 <- subsetData(cellchat_D14) future::plan("multisession", workers = 4) cellchat_D1 <- identifyOverExpressedGenes(cellchat_D1, do.fast = F) cellchat_D14 <- identifyOverExpressedGenes(cellchat_D14, do.fast = F) cellchat_D1 <- identifyOverExpressedInteractions(cellchat_D1) cellchat_D14 <- identifyOverExpressedInteractions(cellchat_D14) cellchat_D1 <- computeCommunProb(cellchat_D1, type = "triMean", population.size = TRUE) cellchat_D14 <- computeCommunProb(cellchat_D14, type = "triMean", population.size = TRUE) cellchat_D1 <- filterCommunication(cellchat_D1, min.cells = 10) cellchat_D14 <- filterCommunication(cellchat_D14, min.cells = 10) cellchat_D1 <- computeCommunProbPathway(cellchat_D1) cellchat_D14 <- computeCommunProbPathway(cellchat_D14) cellchat_D1 <- aggregateNet(cellchat_D1) cellchat_D14 <- aggregateNet(cellchat_D14) cellchat_D1 <- netAnalysis_computeCentrality(cellchat_D1, slot.name = "netP") cellchat_D14 <- netAnalysis_computeCentrality(cellchat_D14, slot.name = "netP")
تصور نقاط القوة الواردة مقابل التفاعل الصادرة في جميع أنواع الخلايا الرئيسية في كل نقطة زمنية لالتئام الجروح (الشكل التكميلي 14).
netAnalysis_signalingRole_scatter(cellchat_D1) netAnalysis_signalingRole_scatter(cellchat_D14)
تزيد الخلايا الليفية بشكل كبير من تفاعلاتها بين D1 و D14 DPW.
إظهار قوائم جميع مسارات الاتصال بين الخلية والخلية المستنبطة المهمة.
cellchat_D1@netP$pathways cellchat_D14@netP$pathways
يعد مسار الكولاجين أحد المسارات المهمة في كل من D1 و D14 DPW.
ركز على مسار إشارات الكولاجين وتفاعله مع الخلايا الليفية.
pathways.show <- c("COLLAGEN")
تصور تفاعلات مسار إشارات الكولاجين بين أنواع الخلايا باستخدام المخططات الدائرية (الشكل التكميلي 15).
par(mfrow=c(1,2)) netVisual_aggregate(cellchat_D1, signaling = pathways.show, layout = "circle") netVisual_aggregate(cellchat_D14, signaling = pathways.show, layout = "circle") par(mfrow=c(1,1))
تصور تفاعلات مسار إشارات الكولاجين بين أنواع الخلايا باستخدام مخططات الوتر (الشكل التكميلي 16).
par(mfrow=c(1,2)) strwidth <- function(x) {0.5} netVisual_aggregate(cellchat_D1, signaling = pathways.show, layout = "chord", vertex.label.cex = 0.6) netVisual_aggregate(cellchat_D14, signaling = pathways.show, layout = "chord", vertex.label.cex = 0.6) par(mfrow=c(1,1))
تصور تفاعلات مسار إشارات الكولاجين مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر (الشكل التكميلي 17).
ملاحظه: يتم سرد أنواع الخلايا في كائنات cellchat كمعرفات بالترتيب الذي تم تعيينه في كائن Seurat الأصلي: 1 = البلاعم ، 2 = العدلات ، 3 = الخلايا الليفية ، 4 = الخلية الظهارية ، 5 = الخلية البطانية ، 6 = الخلية التائية ، 7 = خلية العضلات الملساء.
par(mfrow=c(1,2)) strwidth <- function(x) {0.5} netVisual_aggregate(cellchat_D1, signaling = pathways.show, layout = "chord", vertex.label.cex = 0.6, sources.use = 3) netVisual_aggregate(cellchat_D14, signaling = pathways.show, layout = "chord", vertex.label.cex = 0.6, sources.use = 3) par(mfrow=c(1,1))
تصور مساهمات كل زوج من مستقبلات الترابط في مسار إشارات الكولاجين مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر.
1. باستخدام مخططات الفقاعات (الشكل التكميلي 18):
  gg1 <- netVisual_bubble(cellchat_D1, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, remove.isolate = FALSE) gg2 <- netVisual_bubble(cellchat_D14, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, remove.isolate = FALSE) gg1 + gg2
2. باستخدام مخططات الوتر (الشكل التكميلي 19):
  par(mfrow=c(1,2)) strwidth <- function(x) {0.4} netVisual_chord_gene(cellchat_D1, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, lab.cex = 0.6, show.legend= F) netVisual_chord_gene(cellchat_D14, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, lab.cex = 0.6, legend.pos.x = 60) par(mfrow=c(1,1))
ركز على تفاعل مستقبلات الترابط Col1a1-Cd44 داخل مسار إشارات الكولاجين.
LR.show <- "COL1A1_CD44"
تصور تفاعلات مستقبلات الترابط Col1a1-Cd44 بين أنواع الخلايا باستخدام مخططات الوتر (الشكل التكميلي 20).
strwidth <- function(x) {0.5} netVisual_individual(cellchat_D1, signaling = pathways.show, pairLR.use = LR.show, layout = "chord") netVisual_individual(cellchat_D14, signaling = pathways.show, pairLR.use = LR.show, layout = "chord")
قم بإجراء تحليل CellChat التفاضلي عن طريق إنشاء كائن CellChat مدمج.
object.list_D14_v_D1 <- list(D1 = cellchat_D1, D14 = cellchat_D14) cellchat_D14_v_D1 <- mergeCellChat(object.list_D14_v_D1, add.names = names(object.list_D14_v_D1))
تصور الأعداد الإجمالية والقوة النسبية لتفاعلات الخلية الخلوية في النقاط الزمنية لالتئام الجروح (الشكل التكميلي 21).
gg1 <- compareInteractions(cellchat_D14_v_D1, show.legend = F) gg2 <- compareInteractions(cellchat_D14_v_D1, show.legend = F, measure = "weight") gg1 + gg2
تخيل باستخدام دائرة رسم نقاط قوة التفاعل بين الخلية والخلية التفاضلية بين كل نوع من أنواع الخلايا حيث ينتقل الجرح من اليوم 1 إلى اليوم 14 (الشكل التكميلي 22).
netVisual_diffInteraction(cellchat_D14_v_D1, weight.scale = T, measure = "weight")
تخيل باستخدام خريطة حرارية قوة التفاعل بين الخلية والخلية التفاضلية بين كل نوع من أنواع الخلايا مع انتقال الجرح من اليوم 1 إلى اليوم 14 (الشكل التكميلي 23).
netVisual_heatmap(cellchat_D14_v_D1, measure = "weight")
تصور باستخدام مخطط الرتبة المساهمات النسبية للمسارات الفردية لتفاعلات الخلية الخلوية مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر في اليوم 14 مقابل اليوم 1 (الشكل التكميلي 24).
rankNet(cellchat_D14_v_D1, mode = "comparison", measure = "weight", sources.use = 3, targets.use = NULL, stacked = T, do.stat = TRUE)
تصور باستخدام مخططات الفقاعات للمساهمات النسبية لأزواج مستقبلات الترابط الفردية في مسار إشارات الكولاجين مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر في اليوم 14 مقارنة باليوم 1 (الشكل التكميلي 25).
gg1 <- netVisual_bubble(cellchat_D14_v_D1, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, comparison = c(1, 2), max.dataset = 2, title.name = "Increased signaling in D14", angle.x = 45, remove.isolate = F) gg2 <- netVisual_bubble(cellchat_D14_v_D1, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, comparison = c(1, 2), max.dataset = 1, title.name = "Decreased signaling in D14", angle.x = 45, remove.isolate = F) gg1 + gg2
تماما مثل كائنات Seurat ، يمكن حفظ كائنات CellChat وفتحها كملفات RDS.
saveRDS(cellchat_D1, "cellchat_D1.rds") saveRDS(cellchat_D14, "cellchat_D14.rds") saveRDS(cellchat_D14_v_D1, "cellchat_D14_v_D1.rds")
خطوة اختيارية: يمكن أيضا فتح كائنات CellChat من ملفات RDS.
cellchat_D1 <- readRDS("cellchat_D1.rds") cellchat_D14 <- readRDS("cellchat_D14.rds") cellchat_D14_v_D1 <- readRDS("cellchat_D14_v_D1.rds")

7. مثال على التحليل التكاملي من خلال الجمع بين مجموعات بيانات متعددة أحادية الخلية

ملاحظه: غالبا ما يتم فصل مجموعات البيانات أحادية الخلية إلى ملفات متعددة لأنه تم تسلسلها على دفعات أو مجموعات. يوضح سير العمل هذا كيفية دمج دفعتين من الدفعات الخمس لمجموعة بيانات التئام الجروح ²⁰. يتم وصف الطرق الحالية لتكامل مجموعة البيانات من خلال المقالات القصيرة التالية من Seurat:

مقدمة لتكامل scRNA-seq:
https://satijalab.org/seurat/articles/integration_introduction

التحليل التكاملي في Seurat v5:

https://satijalab.org/seurat/articles/seurat5_integration

ملاحظه: هناك العديد من طرق تكامل مجموعة البيانات أحادية الخلية ، ولكل منها نقاط قوتها وضعفها. للحصول على التفاصيل، راجع المعيار الشامل لطرق التكامل²⁵. من المهم للمستخدم قراءة جميع الوثائق ذات الصلة قبل الاعتماد على أي طريقة تكامل واحدة.

كرر جميع الخطوات في الطريقة 2 لدفعة أخرى من Hu et al. مجموعة البيانات²⁰. في البروتوكول التالي، يتم إستخدام الدفعة #3. يتم تضمين ملف البرنامج النصي R التكميلي ويمكن استخدامه لمعالجة الدفعة #3 (الملف التكميلي 3: JoVE_Rscript_b3. R). تذكر إنشاء واستخدام متغير جديد لمجموعة البيانات --- في الكود أدناه ، استخدم "dataset_b3" لمجموعة البيانات الدفعة # 3.
1. الخطوة الاختيارية: إذا لزم الأمر ، افتح مجموعتي البيانات ككائنات Seurat من ملفات RDS المحفوظة في دليل العمل:
  dataset <- readRDS("dataset_post_Method2.rds") dataset_b3 <- readRDS("dataset_b3_post_Method2.rds")
قم بتعيين متغير جديد لكل مجموعة بيانات تسمى "دفعة" لتسمية مجموعة بيانات المنشأ في التحليلات اللاحقة.
dataset@meta.data$batch <- "b1" dataset_b3@meta.data$batch <- "b3"
قم بإجراء دمج Seurat لمجموعتي البيانات، وإضافة التعليقات التوضيحية لمعرف الخلية المستندة إلى الدفعات، ثم قم بتنفيذ سير عمل Seurat القياسي لمجموعة البيانات المدمجة، كما هو موضح في الطريقة 3.
dataset_merged <- merge(x = dataset, y = c(dataset_b3), add.cell.ids = c("b1", "b3"), merge.data = TRUE) DefaultAssay(dataset_merged) <- "RNA" dataset_merged <- NormalizeData(dataset_merged) dataset_merged <- FindVariableFeatures(dataset_merged) dataset_merged <- ScaleData(dataset_merged) dataset_merged <- RunPCA(dataset_merged) ElbowPlot(dataset_merged, reduction = "pca", ndims = 50)
قم بإجراء التجميع وتحليل UMAP على مجموعة البيانات المجمعة قبل تكامل البيانات.
dataset_merged <- FindNeighbors(dataset_merged, dims = 1:10, reduction = "pca") dataset_merged <- FindClusters(dataset_merged, resolution = .1, cluster.name = "unintegrated_clusters") dataset_merged <- RunUMAP(dataset_merged, dims = 1:10, seed.use = 123, reduction = "pca", reduction.name = "umap.unintegrated")
تصور مخطط UMAP وفقا لأرقام المجموعات والدفعات (الشكل التكميلي 26).
DimPlot(dataset_merged, reduction = "umap.unintegrated", group.by = c("seurat_clusters", "batch"))
إظهار توزيع أرقام الخلايا في كل مجموعة وفقا لرقم الدفعة.
table(dataset_merged$batch, dataset_merged$seurat_clusters)
ملاحظه: من مخطط UMAP والجدول، لا يبدو أن هناك أي تأثيرات دفعية كبيرة لمجموعتي البيانات هاتين الاثنين. يمكن أن يتجلى الدليل على تأثيرات الدفعات على شكل تناقضات غير متوقعة في توزيع المجموعات بين مجموعتي البيانات ، مما قد يعني أن هناك اختلافات تقنية محتملة بين مجموعات البيانات التي تتجاوز أوجه التشابه البيولوجية الفعلية.
قم بإجراء تكامل بيانات Seurat باستخدام طريقة RPCA. لمزيد من المعلومات حول هذا وطرق تكامل البيانات الأخرى ، يرجى قراءة المقالة القصيرة ل Seurat المرتبطة أعلاه.
dataset_merged <- IntegrateLayers( object = dataset_merged, method = RPCAIntegration, orig.reduction = "pca", new.reduction = "integrated.rpca", verbose = TRUE )
قم بإجراء التجميع وتحليل UMAP على مجموعة البيانات المجمعة بعد تكامل البيانات.
FindNeighbors(dataset_merged, dims = 1:10, reduction = "integrated.rpca") dataset_merged <- FindClusters(dataset_merged, resolution = .1, cluster.name = "rpca_clusters") dataset_merged <- RunUMAP(dataset_merged, dims = 1:10, seed.use = 123, reduction = "integrated.rpca", reduction.name = "umap.rpca")
تصور مخطط UMAP وفقا لأرقام المجموعات والدفعات بعد التكامل (الشكل التكميلي 27).
DimPlot(dataset_merged, reduction = "umap.rpca", group.by = c("seurat_clusters","batch"))
إظهار توزيع أرقام الخلايا في كل مجموعة وفقا لرقم الدفعة بعد التكامل.
table(dataset_merged$batch, dataset_merged$seurat_clusters)
من مخطط UMAP وجدول البيانات المتكاملة ، يوجد الآن تداخل ممتاز بين الدفعتين عبر مجموعات مختلفة. ومن المثير للاهتمام أن تكامل البيانات أدى إلى تحديد مجموعة إضافية باستخدام نفس معلمات التجميع.
بعد تكامل مجموعة البيانات وقبل تحليلات المصب ، يجب ضم طبقات مجموعة البيانات المدمجة.
dataset_merged <- JoinLayers(dataset_merged)
احفظ كائن Seurat لمجموعة البيانات كملف RDS في دليل العمل.
saveRDS(dataset_merged, "merged_dataset_post_Method7.rds")

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بدءا من الطريقة #2، يمر البروتوكول بخطوات التحميل وتنفيذ خطوات مراقبة الجودة على مجموعة بيانات التئام الجروح أحادية الخلية. بعد إنشاء كائن Seurat (الخطوة 2.6.2) ، تدمج سلسلة من الخطوات المقياسين داخل مجموعة البيانات (RNA والبروتين ؛ الخطوات 2.6.3-2.6.7) وتقوم بإزالة تعقيد مقايسة البروتين وفقا للرموز الشريطية المكانية والزمانية (الخطوات 2.6.8-2.6.9). تقوم وظيفة إزالة المعقد بتعيين العديد من تسميات البيانات الوصفية لكل خلية في مجموعة البيانات ، بما في ذلك "barcodes_maxID" ، والتي تحدد الرمز الشريطي المكاني والزماني الأكثر احتمالا لكل خلية (الخطوة 2.6.10). في الخطوة 2.6.11 ، يتم تنفيذ وظيفة مؤامرة الكمان لتصور توزيع الجينات المكتشفة في الخلايا بناء على الرموز الشريطية متعددة الإرسال. تظهر النتيجة التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل التكميلي 1) أن هناك توزيعا متساويا إلى حد ما للجينات المكتشفة لكل رمز شريطي ، وهو أمر مهم لسلامة مجموعة البيانات والتحليل النهائي للنقاط الزمنية لالتئام الجروح. بعد تعيين الملصق المناسب للرموز الشريطية للبروتين (الخطوة 2.6.12) ، يوضح البروتوكول بعد ذلك كيفية تنفيذ خطوات مراقبة الجودة على مقايسة الحمض النووي الريبي لمجموعة البيانات ، بدءا من حساب النسبة المئوية لجينات الميتوكوندريا في كل خلية (الخطوة 2.9). في الخطوة 2.10 ، يتم تنفيذ وظيفة مخطط مبعثر الميزة لتصور توزيع الجينات المكتشفة وعدد الحمض النووي الريبي والنسبة المئوية للميتوكوندريا في جميع الخلايا. تظهر النتائج التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل التكميلي 2) أن هناك عددا من الخلايا ذات المحتوى الكبير من الميتوكوندريا ، والتي ترتبط بعدد منخفض من الحمض النووي الريبي ويحدد الخلايا الميتة أو المحتضرة. بعد إزالة الخلايا ذات عدد الحمض النووي الريبي المنخفض ومحتويات الميتوكوندريا الكبيرة (الخطوة 2.11) ، في الخطوة 2.12 ، يتم تنفيذ وظيفة مخطط مبعثر ميزة أخرى على مجموعة بيانات المجموعة الفرعية ، وتظهر النتيجة التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل التكميلي 3) أن توزيع الجينات المكتشفة والنسبة المئوية للحمض النووي الريبي للميتوكوندريا لكل خلية أصبح الآن أكثر طبيعية ، مما يمهد الطريق لتحليلات مجرى النهر القوية. بعد ذلك ، يصف البروتوكول استخدام وظيفة scDblFinder لتحديد الزوجي المحتمل في مجموعة البيانات ويعين بيانات وصفية جديدة تسمى "scDblFinder.score" لكل خلية (الخطوات 2.13-2.14). في الخطوة 2.15 ، يتم تنفيذ وظيفة مخطط الكمان لتصور توزيع الدرجات المزدوجة في مجموعة البيانات ، وتظهر النتيجة التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل التكميلي 4) أن هناك عددا من الخلايا ذات الدرجات المزدوجة العالية نسبيا ، وأن 0.25 يبدو أنه قطع طبيعي يوجد فوقه مجموعة من الزوجيات المحتملة. لذلك، تستخدم الخطوات التالية هذه المعلمة لتعيين مجموعة البيانات إلى خلايا أسفل القطع (الخطوة 2.16)، وبالتالي إكمال خطوات مراقبة الجودة لمجموعة البيانات أحادية الخلية هذه.

بدءا من الطريقة #3، يمر البروتوكول بخطوات تحليل مجموعة بيانات التئام الجروح أحادية الخلية التي يتم التحكم فيها بالجودة باستخدام حزمة Seurat وسير العمل. بعد تطبيع بيانات الحمض النووي الريبي وقياسها ، يتم إجراء تحليل PCA (الخطوة 3.1). في الخطوة 3.2 ، يتم استخدام وظيفة مخطط الكوع لتصور مقدار تباين مجموعة البيانات فيما يتعلق بأول 50 بعدا من أبعاد PCA ، والنتيجة التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل التكميلي 5) يبين أن الكثير من التباين الرئيسي يحدث ضمن الأبعاد ال 13 الأولى كما هو محدد في الانحناء في الرسم البياني يوضح البروتوكول بعد ذلك كيفية العثور على الجيران وإجراء تجميع الخلايا (الخطوة 3.3) وتقليل أبعاد UMAP (الخطوة 3.4) لمجموعة البيانات باستخدام أول 13 بعدا PCA ومعلمة دقة تجميع منخفضة نسبيا تبلغ 0.1 ، وكلاهما تم اختيارهما من أجل تحديد أنواع الخلايا الرئيسية الأكثر قابلية للتعميم في الجروح. في الخطوة 3.5 ، يتم تنفيذ وظيفة مخطط الأبعاد لتصور تجميع الخلايا على مخطط UMAP ، والنتيجة التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل 1) يوضح أن جميع الخلايا في مجموعة البيانات مجمعة حول 8 مجموعات عنافية Seurat رئيسية مشفرة بالألوان، مع مخططات UMAP مختلفة قليلا تم الحصول عليها من جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل Windows (يسار) وMacOS (يمين). في الخطوة 3.6 ، يتم تنفيذ وظيفة مخطط الأبعاد أخرى لتصور التعليق التوضيحي لوقت الجرح / المكان للخلايا ، والنتيجة التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل 2) أن جميع الخلايا في مجموعة البيانات منتشرة وفقا لأصل الزمان / المكان ، مع عدم وجود تجميع واضح وفقا للتعليق التوضيحي للزمان / المكان. يصف البروتوكول بعد ذلك كيفية الحصول على قوائم بالجينات المعبر عنها تفاضليا وحفظها في ملف نصي (الخطوة 3.8) ، وفتح جدول البيانات في جدول بيانات ، وتنفيذ خطوات تصفية مختلفة من أجل الحصول على علامات نظام المجموعة الأعلى تصنيفا لكل مجموعة خلايا (الخطوات 3.9-3.10.6). النتيجة التمثيلية لهذه الخطوات (الجدول التكميلي 1) هو ملف جدول البيانات النهائي الذي يحتوي على المخرجات الكاملة للجينات المعبر عنها تفاضليا المرتبة ، بينما نتيجة تمثيلية أخرى (الجدول التكميلي 2) هو جدول مبسط يوضح أفضل 5 جينات منظمة ومعبر عنها لكل مجموعة Seurat. يصف البروتوكول بعد ذلك كيفية استخدام أداة تحليل التخصيب الوظيفي المستندة إلى الويب تسمى EnrichR لتحديد أنواع الخلايا المفترضة وفقا لجينات علامات العنقود العلوية (الخطوات 3.11-3.12) ، والنتائج التمثيلية لهذه الخطوات (الشكل 3) هي لقطات شاشة اقتصاص لمخرجات EnrichR التي تعرض أعلى أنواع الخلايا المخصبة لكل مجموعة من مجموعات الخلايا الثمانية. يقوم البروتوكول بعد ذلك بتعيين تسمية بيانات وصفية جديدة تسمى "cell_types" لجميع الخلايا في مجموعات Seurat المعنية وفقا للتعليقات التوضيحية لنوع الخلايا الأكثر إثراء (الخطوة 3.14). في الخطوة 3.15 ، يتم تنفيذ وظيفة مخطط الأبعاد لتصور مجموعات الخلايا المعاد تسميتها كتعليقات توضيحية لنوع الخلية على مخطط UMAP ، والنتائج التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل 4) أن جميع الخلايا في مجموعة البيانات تتجمع حول أنواع الخلايا الرئيسية المشفرة بالألوان. في الخطوة 3.16 ، تم استخدام وظيفة مخطط الميزة لتصور توطين جينات علامات العنقود العنقودية العلوية (من الجدول التكميلي 2) على سلسلة من مخططات UMAP ، والنتائج التمثيلية (الشكل 5) عبارة عن شبكة من مخططات UMAP تظهر التعبير العالي لجينات علامات الخلية العلوية داخل مواقع مجموعة نوع الخلايا الرئيسية الخاصة بها. في الخطوتين 3.17 و 3.18 ، تم تنفيذ وظيفة المخطط النقطي لتصور مستويات التعبير النسبية لجينات علامات العنقود العنقودية العلوية في الخلايا ، والتي تم تجميعها أولا حسب أرقام مجموعة Seurat الأصلية (الخطوة 3.17) وثانيا مجمعة حسب تسميات نوع الخلية المشروحة (الخطوة 3.18). أكدت النتائج التمثيلية لهذه الخطوات المستوى العالي للتعبير عن جينات علامات الخلية العليا فقط في مجموعات Seurat الخاصة بها (الشكل التكميلي 6) وفقط في أنواع الخلايا الرئيسية الخاصة بها (الشكل 6). تعمل الخطوة التالية في البروتوكول على تبسيط الملصقات الأصلية القائمة على البروتين المكاني والزماني إلى تعليقات توضيحية زمنية صارمة ، والتي تحدد الخلايا بناء على أيام ما بعد الجرح (DPW) التي نشأت منها. في الخطوة 3.20 ، يتم تنفيذ وظيفة مخطط الأبعاد لتصور الخلايا كتعليقات توضيحية DPW على مخطط UMAP ، والنتائج التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل التكميلي 7) توطين التعليقات التوضيحية للمسار الزمني للجرح عبر مجموعة بيانات التئام الجروح أحادية الخلية. كما هو متوقع ، سيطرت التعليقات التوضيحية في اليوم 1 (D1) على مجموعات العدلات والبلاعم ، في حين أن النقاط الزمنية اللاحقة لالتئام الجروح كانت أكثر تمثيلا في أنواع الخلايا الأخرى. استخدمت الخطوات التالية في البروتوكول مخططات شريطية مكدسة لتصور نسب DPW أولا عبر أنواع الخلايا المختلفة (الخطوة 3.22) ثم لتصور نسب أنواع الخلايا عبر نقاط زمنية مختلفة (3.23). النتائج التمثيلية لهذه الخطوات هي مخططات النسب التي توضح الأعداد النسبية لخلايا DPW في كل فئة من فئات أنواع الخلايا الرئيسية (الشكل التكميلي 8) والأعداد النسبية لأنواع الخلايا الرئيسية في كل فئة من فئات DPW (الشكل 7). أكدت هذه النتائج الشلال الخلوي المعروف لالتئام الجروح الجلدية ، حيث تهيمن الخلايا المناعية (العدلات والضامة) على النقاط الزمنية المبكرة خلال المرحلة الالتهابية ، وتبدأ أنواع الخلايا الأخرى (الخلايا الظهارية والخلايا البطانية) في الظهور خلال المرحلة التكاثرية ، مع سيطرة الخلايا الليفية بشكل خاص في النقاط الزمنية اللاحقة أثناء حل الجرح.

بدءا من الطريقة # 4 ، يحدد البروتوكول خطوات استخدام Seurat للتركيز على نوع خلية رئيسية فردية في مجموعة البيانات أحادية الخلية من أجل تحديد الأنواع الفرعية الخلوية المحتملة أثناء التئام الجروح. يركز البروتوكول على الخلايا الليفية ، التي تجمعت في البداية في مجموعتين من Seurat قبل دمجها في فئة واحدة ، ويصف كيفية إنشاء كائن Seurat جديد يحتوي فقط على الخلايا الليفية من مجموعة البيانات الأصلية (الخطوة 4.1). يتم تنفيذ سير عمل Seurat على مجموعة البيانات الخاصة بالخلايا الليفية هذه (الخطوات 4.2-4.4) ، مع الخطوة 4.2 التي تؤدي إلى مخطط الكوع (الشكل التكميلي 9) يوضح أن الكثير من التباين الرئيسي في مجموعة بيانات الخلايا الليفية يحدث ضمن أول 9 أبعاد PCA. في الخطوة 4.5 ، يتم تنفيذ وظيفة مخطط الأبعاد لتصور تجميع الخلايا على مخطط UMAP ، وأظهرت النتائج التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل 8) الخلايا الليفية في مجموعة البيانات المتجمعة حول 3 أنواع فرعية للخلايا المشفرة بالألوان. أدى تصور مجموعة بيانات الخلايا الليفية وفقا للتعليق التوضيحي DPW (الخطوة 4.6) ، إلى مخطط UMAP (الشكل التكميلي 10) يوضح الخلايا الليفية في مجموعة البيانات الموزعة في جميع أنحاء وفقا للتعليق التوضيحي DPW الخاص بهم. يصف البروتوكول بعد ذلك كيفية الحصول على قوائم بالجينات المعبر عنها تفاضليا وحفظها في ملف نصي (الخطوة 4.7) ، وفتح جدول البيانات في Excel وتنفيذ خطوات تصفية مختلفة من أجل الحصول على علامات الكتلة الأعلى تصنيفا لكل مجموعة خلايا (الخطوة 4.8) ، وتعيين متغير جديد يسرد أعلى جينات علامات الخلايا الليفية المسماة "FB_type_marker" (الخطوة 4.9). في الخطوة 4.10 ، يتم استخدام وظيفة المخطط النقطي لتصور الجينات الموجودة في القائمة في مجموعة بيانات الخلايا الليفية فقط عن طريق استدعاء المتغير "FB_type_marker" في معلمة الميزات ، والنتائج التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل 9) هي مخططات نقطية تؤكد التعبير العالي عن علامات النوع الفرعي للأرومات الليفية فقط في فئات المجموعات الخاصة بها (أعلى) ولكنها موزعة بشكل عادل عبر فئات DPW (أسفل). في الخطوة 4.11 ، يتم استدعاء نفس متغير الميزات لتصور جينات علامات الخلايا الليفية في مجموعة بيانات التئام الجروح الإجمالية ، والنتيجة التمثيلية (الشكل التكميلي 11) هي مخطط نقطي أكد التعبير العالي عن علامات النوع الفرعي للأرومات الليفية في الغالب في الخلايا الليفية الأصلية. أخيرا ، استخدمت الخطوات التالية في البروتوكول مخططات شريطية مكدسة لتصور نسب DPW أولا عبر الأنواع الفرعية الثلاثة للأرومات الليفية (الخطوة 4.12) ثم لتصور نسب الأنواع الفرعية للأرومات الليفية عبر نقاط زمنية مختلفة (الخطوة 4.13). النتائج التمثيلية لهذه الخطوات هي مخططات نسبية توضح الأعداد النسبية لخلايا DPW في كل فئة من فئات الأنواع الفرعية للأرومات الليفية (الشكل التكميلي 12) والأعداد النسبية للأنواع الفرعية للأرومات الليفية في كل فئة DPW (الشكل التكميلي 13). تشير هذه النتائج إلى تغيير كبير في نسب النوع الفرعي للأرومات الليفية عبر المسار الزمني للشفاء ، حيث يهيمن النوع الفرعي الأول من الخلايا الليفية (المجموعة 0) بشكل كبير في الجروح في المراحل المبكرة (D1 و D3) ، والنوع الفرعي الثاني (المجموعة 1) السائد أثناء حل الجرح (D14) ، والنوع الفرعي الثالث (المجموعة 2) هو الأعلى خلال المرحلة التكاثرية من التئام الجروح (D7).

بدءا من الطريقة #5 ، يسير البروتوكول عبر خطوات تحليل مجموعة بيانات التئام الجروح أحادية الخلية باستخدام وظيفة تسجيل الوحدة النمطية في Seurat. يصف البروتوكول أولا خطوات استخدام ملف نصي محدد بعلامات جدولة لتحميل مجموعات الجينات إلى متغيرات في R (الخطوات 5.1-5.2) ، متبوعا بتطبيق وظيفة تسجيل الوحدة النمطية على ثلاث مجموعات جينية تتعلق بالمراحل الرئيسية الثلاث لالتئام الجروح (الخطوة 5.3). في الخطوة 5.4 ، يتم استخدام وظيفة المخطط النقطي لتصور درجات الوحدة النمطية المجمعة عبر فئتين مختلفتين من البيانات الوصفية ، والنتائج التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل 10) هي مخططات نقطية توضح متوسط التعبير عن وحدات مرحلة الشفاء الرئيسية عبر الخلايا في فئة الأيام التي تلي الجرح (DPW ، يمين) وعبر فئة أنواع الخلايا الرئيسية (يسار). تظهر هذه النتائج أن تطبيق ملفات تعريف التعبير الجيني المستندة إلى التسلسل المجمع على مجموعات بيانات التعبير أحادي الخلية بطريقة زائفة بالجملة هو طريقة قوية لأساليب المعلوماتية الحيوية المقارنة من خلال استخدام مجموعات البيانات المنشورة مسبقا في مجال التئام الجروح.

بدءا من الطريقة #6 ، يمر البروتوكول بخطوات تحليل مجموعة بيانات التئام الجروح أحادية الخلية المشتقة من Seurat باستخدام حزمة CellChat وسير العمل وفقا لسؤال علمي محدد لمقارنة الخلايا المشتقة من الجروح المبكرة مقارنة بالجروح في المرحلة المتأخرة. يقوم البروتوكول أولا بتجميع مجموعة بيانات Seurat الإجمالية إلى نقطتين زمنيتين بعد الإصابة ، واحدة خلال المرحلة الالتهابية (اليوم 1 (D1)) والأخرى أثناء حل الجرح (اليوم 14 (D14)) (الخطوة 6.1). يتم إنشاء كائنين من CellChat ، ويمر البروتوكول بجميع الوظائف النموذجية لبروتوكول CellChat لحساب جميع التفاعلات المفترضة بين أنواع الخلايا المحددة في الطريقة # 3 من البروتوكول (الخطوات 6.2-6.3). في الخطوة 6.4 ، يتم تنفيذ وظيفة مخطط مبعثر الإشارة لتصور قوة التفاعل الواردة والصادرة في جميع أنواع الخلايا الرئيسية في كل نقطة زمنية لالتئام الجروح. النتائج التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل التكميلي 14) هي مخططات مبعثرة توضح نقاط قوة التفاعلات الواردة (المحور y) والصادرة (المحور السيني) لأنواع الخلايا الرئيسية عند النقطتين الزمنيتين D1 (يسار) و D14 (يمين). أظهرت هذه النتائج أن الخلايا المناعية مثل العدلات والضامة لديها أعلى قوة تفاعل الخلية الخلوية خلال المرحلة الالتهابية ، لكن الخلايا الليفية سيطرت على تفاعلات الخلية الخلية أثناء حل الجروح ، مما يؤكد عقودا من أبحاث التئام الجروح. تركز الخطوات التالية على التحليل على أحد المسارات المخصبة بشكل كبير ، وهو مسار الكولاجين (الخطوات 6.5-6.6). في الخطوة 6.7 ، يتم تنفيذ وظيفة مخطط الدائرة لتصور تفاعلات مسار إشارات الكولاجين بين أنواع الخلايا في النقطتين الزمنيتين. النتائج التمثيلية لهذه الخطوة (الشكل التكميلي 15) عبارة عن مخططات دائرية تظهر تفاعلات إشارات مسار الكولاجين المستنبط بين جميع أنواع الخلايا في D1 (يسار) و D14 (يمين). في الخطوة 6.8 ، يتم تصور نفس التفاعلات باستخدام وظيفة مخطط الوتر ، مع النتائج التمثيلية (الشكل التكميلي 16) كعبارة عن مخططات وترية توضح تفاعلات إشارات مسار الكولاجين المستنبط بين جميع أنواع الخلايا في كل نقطة زمنية. كما هو متوقع ، أظهرت هذه النتائج أن الخلايا الليفية كانت خلايا المصدر الأساسية لمسار إشارات الكولاجين ، على الرغم من أن تدفق المعلومات كان أكثر تقييدا بالخلايا المناعية في D1 مقارنة ب D14. للتركيز على الخلايا الليفية كخلية مصدر في تفاعلات الخلية الخلية ، تكرر الخطوة 6.9 وظيفة مخطط الوتر بإضافة معلمة خلية المصدر ، والنتائج التمثيلية (الشكل التكميلي 17) هي مخططات الوتر التي توضح تفاعلات إشارات مسار الكولاجين المستنبط مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر في كل نقطة زمنية. في الخطوة 6.10 ، يتم تنفيذ وظيفتين لتصور مساهمات كل زوج من مستقبلات الترابط في مسار إشارات الكولاجين مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر ، واحدة تستخدم مخططات الفقاعات (الخطوة 6.10.1) والأخرى باستخدام مخططات الوتر (الخطوة 6.10.2). تظهر النتائج التمثيلية المساهمات المستنبطة لكل زوج من مستقبلات الترابط في إشارات مسار الكولاجين مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر في النقطتين الزمنيتين D1 (يسار) و D14 (يمين) باستخدام كلتا المخططات الفقاعية (الشكل التكميلي 18) ومخططات الوتر (الشكل التكميلي 19). أظهرت هذه النتائج أنه في D1 ، كان مسار الكولاجين القادم من الخلايا الليفية مقصورا على العدلات والضامة مع هيمنة مستقبلات Cd44 و Sdc4 ، ولكن في D14 تعمل الخلايا الأخرى كمستقبلات عبر مجموعة متنوعة من المستقبلات بما في ذلك الإنتجرين. للتركيز على تفاعل Col1a1-Cd44 بين مستقبلات الترابط ، والذي أظهر قوة قوية في تفاعلات الخلايا الليفية ، يتم تعيين معلمة (الخطوة 6.11) ثم استخدامها في الخطوة 6.12 في وظيفة مخطط الوتر لتصور هذا التفاعل المعين بين مستقبلات الترابط بين جميع أنواع الخلايا ، مع النتائج التمثيلية (الشكل التكميلي 20) كعبارة عن مخططات وترية توضح التفاعلات المستنبطة بين مستقبلات الترابط Col1a1-Cd44 المستنبطة بين جميع أنواع الخلايا عند النقطتين الزمنيتين D1 (يسار) و D14 (يمين). أظهرت هذه النتائج أنه بينما يقتصر هذا التفاعل في D1 على الخلايا الليفية كخلايا مصدر ، في D14 ، تعمل البلاعم وخلايا العضلات الملساء أيضا كخلايا مصدر. بعد ذلك ، يصف البروتوكول كيفية إجراء تحليل CellChat التفاضلي عن طريق دمج كائنات D1 و D14 CellChat أولا (الخطوة 6.13). في الخطوة 6.14 ، يتم تنفيذ وظيفة مقارنة التفاعلات لتصور الأرقام الإجمالية والقوة النسبية لتفاعلات الخلية الخلية بين النقطتين الزمنيتين لالتئام الجروح ، والنتائج التمثيلية (الشكل التكميلي 21) هي المخططات الشريطية الناتجة التي توضح الأعداد الإجمالية (على اليسار) ونقاط القوة (على اليمين) للتفاعلات المستنبطة في الخلايا التي تتكون من جروح D1 و D14 ، مع أعداد أكبر من التفاعلات في D14 بدلا من القوة النسبية الأعلى للتفاعلات في D1. في الخطوتين 6.15 و 6.16 ، يتم استخدام وظيفتين لتصور قوة التفاعل بين الخلية والخلية التفاضلية بين كل نوع من أنواع الخلايا حيث ينتقل الجرح من اليوم 1 إلى اليوم 14 مع النتائج التمثيلية لكل منهما ، الأولى هي مخطط دائري (الخطوة 6.15 ، الشكل التكميلي 22) والثانية هي خريطة التمثيل اللوني (الخطوة 6.16 ، الشكل التكميلي 23)، حيث تظهر التفاعلات المتزايدة في D14 مقارنة ب D1 باللون الأحمر وتلك التي تم انخفاضها باللون الأزرق. كما هو متوقع ، تزداد التفاعلات بوساطة العدلات والبلاعم في D1 ، وتزداد التفاعلات بوساطة الخلايا الليفية في D14. في الخطوة 6.17 ، يتم استخدام وظيفة الترتيب لإنشاء مخطط يصنف المساهمات النسبية للمسارات الفردية لتفاعلات الخلية الخلوية مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر في D14 مقارنة ب D1 ، والنتائج التمثيلية (الشكل التكميلي 24) تبين مخطط الرتبة الناتج مع تمثيل D1 في الأعلى باللون الأحمر و D14 في الأسفل باللون الأزرق، مع تمثيل العديد من المسارات حصريا إما في D1 أو D14 والعديد من المسارات الأخرى التي تظهر تدرجا للتنشيط. أخيرا ، في الخطوة 6.18 ، يتم استخدام وظيفتين لمؤامرة الفقاعة لإظهار المساهمات النسبية لأزواج مستقبلات الترابط الفردية في مسار إشارات الكولاجين مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر في D14 مقارنة ب D1 ، مع النتائج التمثيلية المقابلة (الشكل التكميلي 25) تظهر أزواج إشارات متزايدة (يسار) ومنخفضة (يمين) في D14 مقارنة ب D1 عبر العديد من تفاعلات الخلية الخلوية على المحور السيني. كما هو متوقع ، كان للخلايا الليفية تفاعلات زوج مستقبلات الترابط الصادرة عبر العديد من خلايا الاستقبال في جروح D14 مقارنة بجروح D1 ، حيث كان الاتصال أكثر محدودية تجاه العدلات والضامة خلال المرحلة الالتهابية.

بدءا من الطريقة # 7 ، يسير البروتوكول عبر خطوات دمج مجموعتي بيانات التئام الجروح أحادية الخلية باستخدام Seurat. يصف البروتوكول أولا خطوات دمج دفعتين من مجموعات البيانات أحادية الخلية المنشورة وتطبيق سير عمل Seurat القياسي على مجموعة البيانات المدمجة (الخطوات 7.1-7.4). في الخطوة 7.5 ، يتم استخدام وظيفة مخطط الأبعاد لتصور مخطط UMAP وفقا لأرقام الكتلة والدفعات لمجموعة بيانات التئام الجروح المدمجة ولكن غير المدمجة بعد. النتائج التمثيلية من هذه الخطوة (الشكل التكميلي 26) هي مخططات UMAP التي تصور توزيع مجموعات Seurat (يسار) وأرقام الدفعات (يمين) ، مما يدل على أنه لا يبدو أن هناك أي تأثيرات دفعية كبيرة لهاتين المجموعتين من البيانات قبل تكامل البيانات. يقوم البروتوكول بعد ذلك بتكامل البيانات باستخدام طريقة RPCA وسير عمل Seurat للمتابعة لمجموعة البيانات المتكاملة (الخطوات 7.7-7.8). في الخطوة 7.9 ، يتم استخدام وظيفة مخطط الأبعاد لتصور مخطط UMAP وفقا لأرقام الكتلة والدفعات لمجموعة بيانات التئام الجروح المتكاملة. النتائج التمثيلية من هذه الخطوة (الشكل التكميلي 27) هي مخططات UMAP التي تصور توزيع مجموعات Seurat (يسار) وأرقام الدفعات (يمين) ، مما يدل على أن هناك الآن تداخلا أكبر بين الدفعتين عبر مجموعات مختلفة. تظهر النتائج أيضا ظهور مجموعة إضافية بعد تكامل البيانات ، مما قد يشير إلى زيادة القدرة على تحديد الأنواع الفرعية المحتملة للخلايا بعد التحكم في التأثيرات الفنية لدفعات البيانات.

figure-results-1
الشكل 1: مخطط UMAP يعرض جميع الخلايا في مجموعة البيانات المجمعة حول 8 مجموعات عنقودية رئيسية مرمزة بالألوان. النتائج التي تم الحصول عليها من جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل Windows (يسار) وMacOS (يمين). هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 3.5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مخطط UMAP يوضح جميع الخلايا في مجموعة البيانات المنتشرة وفقا لأصل الزمان / المكان ، مع عدم وجود تجميع واضح وفقا للتعليق التوضيحي للوقت / المكان. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 3.6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: لقطات شاشة مقصوصة لمخرجات EnrichR ، توضح أعلى أنواع الخلايا المخصبة لكل مجموعة خلايا. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 3.13. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مخطط UMAP يوضح جميع الخلايا في مجموعة البيانات المتجمعة حول أنواع الخلايا الرئيسية المرمزة بالألوان. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 3.15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: شبكة من مخططات UMAP توضح التعبير العالي لجينات علامة الخلية العلوية داخل مجموعات أنواع الخلايا الرئيسية. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 3.16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: مخططات نقطية تؤكد المستوى العالي للتعبير عن جينات علامة الخلية العلوية فقط في أنواع الخلايا الرئيسية الخاصة بها. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 3.18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: مخطط النسبة الذي يوضح الأعداد النسبية لأنواع الخلايا الرئيسية في كل فئة DPW. هذا الشكل يقابل الخطوة 3.23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: مخطط UMAP يوضح الخلايا الليفية في مجموعة البيانات المتجمعة حول 3 أنواع فرعية من الخلايا المشفرة بالألوان. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 4.5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9
الشكل 9: مخططات نقطية تؤكد التعبير العالي عن علامات النوع الفرعي للأرومات الليفية فقط في فئات المجموعات الخاصة بها ولكنها موزعة بشكل عادل عبر فئات DPW. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 4.10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10
الشكل 10: مخططات نقطية توضح متوسط التعبير عن وحدات مرحلة الشفاء الرئيسية عبر الخلايا لكل DPW ولكل أنواع الخلايا الرئيسية. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 5.4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: النتائج التي تظهر أن هناك توزيعا متساويا إلى حد ما للجينات المكتشفة لكل رمز شريطي ، وهو أمر مهم لسلامة مجموعة البيانات والتحليل النهائي للنقاط الزمنية لالتئام الجروح. ويقابل هذا الشكل الخطوة 11.6.2. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: مخططات مبعثرة توضح أن هناك عددا من الخلايا ذات المحتوى الكبير من الميتوكوندريا ، والتي ترتبط بعدد منخفض من الحمض النووي الريبي --- هذه خلايا ميتة أو محتضرة. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 2.10. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: مخططات مبعثرة توضح أن توزيع الجينات المكتشفة والنسبة المئوية للحمض النووي الريبي للميتوكوندريا لكل خلية أصبح الآن أكثر طبيعية ، مما يمهد الطريق لتحليلات نهائية قوية. هذا الشكل يقابل الخطوة 2.12. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 4: مؤامرة الكمان التي تظهر أن هناك عددا من الخلايا ذات الدرجة المزدوجة العالية نسبيا ، وأن 0.25 يبدو أنه قطع طبيعي ، يوجد فوقه عدد من الزوجيات المحتملة. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 2.15. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 5: مخطط الكوع الذي يوضح أن الكثير من التباين الرئيسي يحدث ضمن الأبعاد ال 13 الأولى. وهذا الرقم يقابل الخطوة 2.3. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 6: مؤامرة نقطية تؤكد المستوى العالي للتعبير عن جينات علامة الخلية العلوية فقط في مجموعات Seurat الخاصة بها. هذا الشكل يقابل الخطوة 3.17. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 7: مخطط UMAP يوضح توطين التعليقات التوضيحية للمسار الزمني للجرح عبر مجموعة بيانات التئام الجروح. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 3.20. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 8: مخطط النسبة الذي يوضح الأعداد النسبية لخلايا DPW في كل فئة من فئات أنواع الخلايا الرئيسية. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 3.22. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 9: مخطط الكوع الذي يوضح أن الكثير من التباين الرئيسي في مجموعة بيانات الخلايا الليفية يحدث ضمن أول 9 أبعاد. وهذا الرقم يقابل الخطوة 2.4. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 10: مخطط UMAP يوضح الخلايا الليفية في مجموعة البيانات الموزعة في جميع أنحاء وفقا للتعليق التوضيحي DPW الخاص بهم. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 4.6. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 11: مخطط نقطي يؤكد التعبير العالي عن علامات النوع الفرعي للأرومات الليفية في الغالب في مجموعة الخلايا الليفية الأصلية. هذا الشكل يقابل الخطوة 4.11. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 12: مخطط النسبة الذي يوضح الأعداد النسبية للأنواع الفرعية للأرومات الليفية في كل فئة من فئات DPW. يتوافق هذا الشكل مع الخطوة 4.12. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 13: مخطط النسبة الذي يوضح الأعداد النسبية للأرومات الليفية عبر DPW في كل فئة من فئات الأنواع الفرعية للأرومات الليفية. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 4.13. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 14: مخططات مبعثرة توضح نقاط قوة التفاعلات الواردة (المحور y) والصادرة (المحور السيني) لأنواع الخلايا الرئيسية في اليوم 1 (D1 ، يسار) واليوم 14 (D14 ، يمين). يتوافق هذا الشكل مع الخطوة 6.4. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 15: مخططات دائرية توضح تفاعلات إشارات مسار الكولاجين المستنبط بين جميع أنواع الخلايا في كل فئة DPW. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 6.7. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 16: مخططات الوتر التي توضح تفاعلات إشارات مسار الكولاجين المستنبطة بين جميع أنواع الخلايا في كل فئة DPW. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 6.8. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 17: مخططات الوتر التي توضح تفاعلات إشارات مسار الكولاجين المستنبط مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر في كل فئة من فئات DPW. يتوافق هذا الشكل مع الخطوة 6.9. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 18: مخططات الفقاعات التي توضح المساهمات المستنبطة لكل زوج من مستقبلات الترابط في إشارات مسار الكولاجين مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر في كل فئة من فئات DPW. يقابل هذا الشكل الخطوة 6.10.1. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 19: مخططات الوتر توضح المساهمات المستنبطة لكل زوج من مستقبلات الترابط في إشارات مسار الكولاجين مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر في كل فئة من فئات DPW. يتوافق هذا الشكل مع الخطوة 6.10.2. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 20: مخططات الوتر التي توضح تفاعلات مستقبلات الترابط Col1a1-Cd44 المستنبطة بين جميع أنواع الخلايا في كل فئة DPW. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 6.12. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 21: مخططات شريطية توضح عدد (يسار) وقوة (يمين) التفاعلات المستنبطة في جروح اليوم 1 واليوم 14. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 6.14. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 22: مخطط دائري يوضح قوة التفاعل بين الخلية والخلية التفاضلية بين كل نوع من أنواع الخلايا حيث ينتقل الجرح من اليوم 1 (الأزرق) إلى اليوم 14 (الأحمر) DPW. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 6.15. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 23: خريطة حرارية توضح قوة التفاعل بين الخلية والخلية التفاضلية بين كل نوع من أنواع الخلايا حيث ينتقل الجرح من اليوم 1 (أزرق) إلى اليوم 14 (أحمر) DPW. هذا الشكل يقابل الخطوة 6.16. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 24: مخطط الترتيب الذي يوضح المساهمات النسبية للمسارات الفردية لتفاعلات الخلية الخلوية بين الخلايا الليفية وأنواع الخلايا الأخرى في اليوم 1 مقابل اليوم 14 DPW. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 6.17. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 25: مخططات الفقاعات التي توضح المساهمات النسبية لأزواج مستقبلات الترابط الفردية في مسار إشارات الكولاجين مع الخلايا الليفية كخلايا مصدر في اليوم 1 مقابل اليوم 14 DPW. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 6.18. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 26: مخططات UMAP توضح توزيع مجموعات Seurat (يسار) وأرقام الدفعات (على اليمين) قبل تكامل البيانات. هذا الشكل يتوافق مع الخطوة 7.5. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 27: مخططات UMAP توضح توزيع مجموعات Seurat (يسار) وأرقام الدفعات (على اليمين) بعد تكامل البيانات. هذا الرقم يتوافق مع الخطوة 7.9. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: JoVE_Rscript.R: ملف البرنامج النصي لكود R الرئيسي ، والذي يتضمن جميع الخطوات والتفسيرات الموضحة لجميع أجزاء البروتوكول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: JoVE_PhaseSpecificGenes.txt. ملف نصي محدد بعلامات جدولة، والذي يحتوي على قوائم الجينات التي تم تحميلها في الخطوة 5.1 من البروتوكول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: JoVE_Rscript_b3.R. ملف البرنامج النصي التكميلي لكود R ، والذي يتضمن جميع الخطوات والتفسيرات المطلوبة لتحليل الدفعة # 3 من مجموعة البيانات لاستخدامها في الخطوة 7.1 من البروتوكول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: JoVE_DEGs_cellMarkers.xlsx. Excel ، والذي يحتوي على الإخراج الكامل للجينات المعبر عنها تفاضليا المصنفة المستخدمة في الخطوة 3.10 من البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 2: أعلى 5 جينات منظمة ومعبر عنها لكل مجموعة سيورات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، يتم استخدام RStudio لتشغيل أسطر محددة من التعليمات البرمجية التي تتيح تحليلا أساسيا لمجموعة بيانات معقدة أحادية الخلية باستخدام Seurat. يتم تقديم العديد من الطرق ذات الصلة بأبحاث التئام الجروح ، بما في ذلك تثبيت بيئة الترميز R ، وتنزيل مجموعة بيانات التئام الجروح أحادية الخلية المنشورة مسبقا ، وتنفيذ خطوات مراقبة الجودة الهامة وسير عمل تحليل الخلية المفردة القياسية بما في ذلك التصورات ، والتعليقات التوضيحية لنوع الخلية الرئيسية ، وتحليلات النوع الفرعي للخلية ، والتحليلات التكاملية باستخدام Seurat ، وإجراء تحليلات تفاعل الخلية الخلية باستخدام CellChat.

الطرق المقدمة هنا هي مقالات قصيرة مبسطة لسير العمل النموذجي لتحليل الخلية الواحدة باستخدام R وحزمها العلمية مفتوحة المصدر الشهيرة ، Seurat²¹ و CellChat²². في الواقع ، يعد سير العمل مثالا واحدا فقط على نوع التحليل الذي يمكن للمرء أن ينجزه باستخدام مجموعة بيانات معقدة أحادية الخلية لالتئام الجروح. التعديلات المحتملة على هذه الطريقة تكاد تكون غير محدودة ، مع القيد الوحيد هو الاستفسار العلمي الخاص للمستخدم. على سبيل المثال ، قد يغير المستخدم بعض المعلمات الرئيسية ، مثل أنواع الخلايا والنقاط الزمنية ، وفقا لأسئلة البحث التي قد يرغب في طرحها على مجموعة البيانات هذه. يأمل المؤلفون أيضا أن يشعر المستخدم بالراحة الكافية لتكييف سير العمل هذا مع مجموعة البيانات أحادية الخلية التي تهمهم. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند استخدام سير العمل هذا لتحليل مجموعات البيانات الأخرى ، نظرا لأن كل تجربة قد تنشر مشكلات فنية وإعداد العينات على البيانات نفسها. لذلك ، من الضروري أن يقرأ المستخدم ويفهم جميع التفاصيل التجريبية قبل تفسير نتائج أي مجموعات بيانات أحادية الخلية تم نشرها وإعادة تحليلها مسبقا. من المهم أن نتذكر أن أدوات المعلوماتية الحيوية هي طريقة قوية لاستكشاف العملية البيولوجية وتوليد الفرضيات ، وأن أي تفسيرات بيولوجية حاسمة للنتائج يجب التحقق من صحتها في تجارب المتابعة.

في جميع أنحاء البروتوكول ، لاحظ أنه قد يتم إجراء تعديلات رئيسية على مجالات معينة من سير العمل لإنجاز مهام أخرى. ومع ذلك ، فإن تفاصيل جميع المجموعات الممكنة من التعديلات على سير العمل خارج نطاق هذه المخطوطة. على سبيل المثال ، الدقة المستخدمة لتجميع الخلايا والأبعاد المستخدمة لتحليل UMAP هي بالضرورة ذاتية ، وتسمح الأدوات المقدمة هنا بكل من التحليلات واسعة النطاق (كما هو موضح هنا لأنواع الخلايا الرئيسية المحددة على نطاق واسع) والتحليلات المحددة للغاية التي يمكن أن تستلزم التجميع الفرعي للخلايا في مجموعات سكانية فرعية أكثر ندرة داخل مجموعة البيانات الأكبر. لمزيد من المعلومات حول هذا الجانب من طريقة تحليل الخلية الواحدة ، وللحصول على تفاصيل حول جميع المعلمات الأخرى التي يمكن تغييرها في خط أنابيب تحليل الخلية المفردة ، يحيل المؤلفون المستخدم إلى منشورات Seurat²¹^،²⁶ والموقع الإلكتروني (https://satijalab.org/seurat/) ، حيث يقدم مؤلفو هذه الأداة المتطورة تفسيرات متعمقة ومقالات قصيرة ودروس تعليمية.

قدمت هذه المخطوطة بعضا من أكثر الأدوات التي تم الاستشهاد بها واستخدامها في أدبيات النسخ أحادية الخلية ، وهي Seurat²¹ و CellChat²² ، لتحليلات تفاعل الخلية المفردة والخلية الخلية ، على التوالي. ومع ذلك ، توجد أدوات أخرى تؤدي وظائف مماثلة بطرق مختلفة قليلا. لتحليل مجموعة البيانات أحادية الخلية ، هناك Scran²⁷ و Scater ²⁸ و ScanPy²⁹ المستند إلى Python ، والتي تستخدم طرقا مختلفة لتكامل مجموعة البيانات²⁵. في هذا البروتوكول ، تم عرض التعليق التوضيحي اليدوي لأنواع الخلايا ، والذي يعتمد على حكم المستخدم لتفسير إثراء علامات الخلايا العنقودية ، ولكن توجد الآن أدوات مختلفة تتيح التصنيف الآلي لأنواع الخلايا ، مثل SingleR³⁰ و scGate³¹ ، من بين أمور أخرى. بالنسبة لتحليلات الاتصال الخلوي الخلوي ، تم عرض CellChat في هذا البروتوكول ، ولكن توجد أدوات أخرى لتقدير اتصالات الخلية الخلوية ، بما في ذلك CellPhoneDB³² و Cytotalk³³ وقواعد بيانات مستقبلات الترابط الأخرى التي يتم تنفيذها ضمن إطار إجماع LIANA (إطار عمل تحليل مستقبلات LIgand)³⁴. جميع أدوات المعلوماتية الحيوية فريدة من نوعها وتأتي مع خصائصها الخاصة ومعلماتها القابلة للتعديل. لذلك ، من المهم للمستخدم قراءة الوثائق المرتبطة بكل أداة بعناية من أجل فهم الفروق الدقيقة قبل تفسير أي مخرجات ناتجة عن استخدامها. أخيرا ، مهما كانت أدوات المعلوماتية الحيوية التي يستخدمها المرء ، من الأهمية بمكان أن نتذكر أن هذه الأدوات تتطور باستمرار وأن الإصدارات المختلفة من الحزم قد تسفر عن مخرجات مختلفة.

في R ، يعد بناء الجملة أمرا بالغ الأهمية ، وسيؤدي ظهور علامات الترقيم في غير محلها أو علامة الاقتباس أو القوس أو حتى الحرف المكتوب بأحرف كبيرة بشكل خاطئ إلى حدوث خطأ. لذلك ، من الضروري أن ينتبه المستخدم إلى التفاصيل عند كتابة التعليمات البرمجية وأن يكون حذرا بشكل خاص عند نسخ أسطر التعليمات البرمجية من أجل تكييفها مع الأسئلة العلمية ومجموعات البيانات الجديدة. لاستكشاف أخطاء معينة قد يواجهها المرء وإصلاحها ، يوصي المؤلفون ببساطة بنسخ رسالة الخطأ ولصقها في محرك بحث الويب المفضل للمستخدم وتصفح النتائج من منتديات المعلوماتية الحيوية مثل GitHub و Stack Overflow ، حيث من المحتمل أن تكون الأخطاء الأكثر شيوعا قد تمت الإجابة عليها بالفعل من قبل مستخدم قوي على دراية. في بعض المنتديات ، يتم "التصويت على الإجابات الأكثر نجاحا" من قبل مستخدمين آخرين وجدوا أن الحل هو الأفضل للمشكلة. يجب أن يكون المستخدم حريصا على عدم مجرد نسخ ولصق أسطر التعليمات البرمجية التي وجدها على الإنترنت في جهاز الكمبيوتر الخاص به (خاصة إذا كان الحل يستدعي تغيير إعدادات النظام خارج لغة البرمجة R) ، نظرا لوجود احتمال أن تكون هذه البرامج ضارة. تتمثل إحدى الطرق الناشئة المثيرة لاستكشاف أخطاء الترميز وإصلاحها في استخدام نماذج الذكاء الاصطناعي للغة الكبيرة التوليدية القوية مثل ChatGPT من OpenAI أو Microsoft Copilot أو Gemini من Google. أثبتت هذه النماذج أنها مفيدة بشكل خاص لهندسة البرمجيات بشكل عام واستكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل خاص. لهذا ، يمكن للمستخدم نسخ ولصق أسطر كاملة من التعليمات البرمجية الخاصة به بعد تقديم مطالبة بسيطة لروبوت الدردشة حول نية المستخدم للرمز. يوجد التحذير المعتاد بأن هذه النماذج ليست مضمونة ، وقد يضطر المستخدم إلى تجربة مطالبات متعددة من أجل إنشاء إجابة مناسبة لحل المشكلة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقى مختبر MS Wietecha تمويلا من منحة المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS R35-GM154921 ، ومنحة أبحاث جمعية التئام الجروح ، وقسم بيولوجيا الفم في كلية طب الأسنان UIC.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
كمبيوتر محمول أو كمبيوتر مكتبي	غير متاح	غير متاح	تشغيل Windows أو MacOS
R	غير متاح	الإصدار 4.4.1	مجاني للتنزيل من https://cran.rstudio.com/
Rstudio	برنامج Posit ، PBC	الإصدار 2024.09.0	مجاني للتنزيل من https://posit.co/download/rstudio-desktop/
مكتب إكسل	مايكروسوفت	أي إصدار	لتحليل بيانات الجدول
متصفح الإنترنت	غير متاح	غير متاح	للتنقل إلى مواقع الويب
حزم <قوية>R< / قوية>	<قوي>مستودع	<قوي>إصدار
أدوات التطوير	كران	2.4.5
ريدكس إل	كران	1.4.3
أوبن إكس إل إس إكس	كران	4.2.7.1
Tidyverse	كران	2.0.0
scتخصيص	كران	2.1.2
BiocManager	الموصل الحيوي	1.30.25
إن إم إف	الموصل الحيوي	0.28
خريطة الحرارة المعقدة	الموصل الحيوي	2.20.0
BiocNeighbours	الموصل الحيوي	1.22.0
تجربة خلية واحدة	الموصل الحيوي	1.26.0
تدوير	الموصل الحيوي	0.4.16
إيدج آر	الموصل الحيوي	4.2.1
scDblFinder	الموصل الحيوي	1.18.0
سورات	كران	5.1.0
CellChat	جيثب	2.1.2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).
Wietecha, M. S., et al. Phase-specific signatures of wound fibroblasts and matrix patterns define cancer-associated fibroblast subtypes. Matrix Biol. 119, 19-56 (2023).
Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: a cellular perspective. Physiol Rev. 99 (1), 665-706 (2019).
Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
Rhea, L., Dunnwald, M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. J Vis Exp. (162), e61616(2020).
Fischer, K. S., et al. Protocol for the splinted, human-like excisional wound model in mice. Bio-Protocol. 13 (3), e4606(2023).
Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Sci Transl Med. 10 (451), aap8798(2018).
Chen, L., Arbieva, Z. H., Guo, S., Marucha, P. T., Mustoe, T. A., DiPietro, L. A. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471(2010).
Leonardo, T. R., et al. Transcriptional changes in human palate and skin healing. Wound Repair. 31 (2), 156-170 (2023).
Rognoni, E., et al. Fibroblast state switching orchestrates dermal maturation and wound healing. Mol Syst Biol. 14 (8), e8174(2018).
Bergmeier, V., et al. Identification of a myofibroblast-specific expression signature in skin wounds. Matrix Biol. 65, 59-74 (2018).
Plikus, M. V., et al. Regeneration of fat cells from myofibroblasts during wound healing. Science. 355 (6326), 748-752 (2017).
Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), aar2971(2018).
Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), aaa2151(2015).
Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nat Commun. 10 (1), 650(2019).
Gay, D., et al. Phagocytosis of Wnt inhibitor SFRP4 by late wound macrophages drives chronic Wnt activity for fibrotic skin healing. Sci Adv. 6 (12), eaay3704(2020).
Haensel, D., et al. Defining epidermal basal cell states during skin homeostasis and wound healing using single-cell transcriptomics. Cell Rep. 30 (11), 3932-3947.e6 (2020).
Phan, Q. M., Sinha, S., Biernaskie, J., Driskell, R. R. Single-cell transcriptomic analysis of small and large wounds reveals the distinct spatial organization of regenerative fibroblasts. Exp Dermatol. 30 (1), 92-101 (2021).
Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).
Hu, K. H., et al. Transcriptional space-time mapping identifies concerted immune and stromal cell patterns and gene programs in wound healing and cancer. Cell Stem Cell. 30 (6), 885-903.e10 (2023).
Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nat Commun. 12 (1), 1088(2021).
Germain, P. -L., Lun, A., Garcia Meixide, C., Macnair, W., Robinson, M. D. Doublet identification in single-cell sequencing data using scDblFinder. F1000Research. 10, 979(2021).
Jin, S., Plikus, M. V., Nie, Q. CellChat for systematic analysis of cell-cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 20 (1), 180-219 (2024).
Luecken, M. D., et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 19 (1), 41-50 (2022).
Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
Lun, A. T. L., McCarthy, D. J., Marioni, J. C. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with Bioconductor. F1000Research. 5, 2122(2016).
McCarthy, D. J., Campbell, K. R., Lun, A. T. L., Wills, Q. F. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics (Oxford, England). 33 (8), 1179-1186 (2017).
Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19 (1), 15(2018).
Aran, D., et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).
Andreatta, M., Berenstein, A. J., Carmona, S. J. scGate: marker-based purification of cell types from heterogeneous single-cell RNA-seq datasets. Bioinformatics. 38 (9), 2642-2644 (2022).
Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nat Protoc. 15 (4), 1484-1506 (2020).
Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell transcriptomic data. Sci Adv. 7 (16), eabf1356(2021).
Dimitrov, D., et al. Comparison of methods and resources for cell-cell communication inference from single-cell RNA-Seq data. Nat Commun. 13 (1), 3224(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

استخدام R و Seurat و CellChat لتحليل مجموعة بيانات النسخ أحادية الخلية لالتئام جروح جلد الفأر

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles

Related Articles

https://satijalab.org/seurat/articles/hashing_vignette

https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial#qc-and-selecting-cells-for-further-analysis

https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial

https://satijalab.org/seurat/articles/essential_commands

https://satijalab.org/seurat/articles/integration_introduction

https://satijalab.org/seurat/articles/seurat5_integration