مقالة منهجية

العزل وتسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة للخلايا الدبقية الصغيرة الحصين من الفئران البالغة

DOI:

10.3791/67315

⸱

سبتمبر 27, 2024

 ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2School of Life Sciences, Guangzhou University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي كيفية عزل وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في الحصين من الفئران البالغة ، متبوعا بتعليمات لإجراء تسجيلات مشبك رقعة للخلية بأكملها على هذه الخلايا المعزولة بشكل حاد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا مناعية مقيمة في الدماغ تتفاعل مع الخلايا العصبية للحفاظ على توازن الجهاز العصبي المركزي (CNS). تشير الدراسات إلى أن سطح الخلايا الدبقية الصغيرة يعبر عن قنوات البوتاسيوم التي تنظم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ، في حين أن التشوهات في قنوات البوتاسيوم هذه يمكن أن تؤدي إلى أمراض عصبية. حاليا ، يتم إجراء تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة للخلايا الدبقية الصغيرة في الغالب على الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المستنبتة من الفئران الجنينية أو حديثي الولادة بسبب الصعوبات في إجراء تقييمات الفيزيولوجيا الكهربية على الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بشكل حاد. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا سهل المتابعة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين من الفئران البالغة وإجراء تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة على الخلايا المعزولة. لفترة وجيزة ، تمت إزالة الدماغ من الفأر بعد قطع الرأس ، وتم تشريح الحصين بشكل ثنائي ، وتم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام مجموعة تفكك دماغ الفأر البالغة. ثم تم تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام طريقة فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) وزرعها على أغطية. تم تأكيد عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الناجح من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعي بالأجسام المضادة ل CD11 والأجسام المضادة ل Iba1. تم وضع زلة غطاء في غرفة التسجيل ، وتم تسجيل تيارات البوتاسيوم كاملة الخلية للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بشكل حاد في ظل ظروف مشبك الجهد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الدبقية الصغيرة ، المشتقة من أسلاف النخاع في كيس الصفار البدائي ، موجودة في الجهاز العصبي المركزي وتشكل حوالي 10٪ إلى 15٪ من إجمالي الخلايا العصبية1،2. من الناحية الوظيفية ، بالإضافة إلى مراقبة البيئة المحلية ، وأداء وظائف الدفاع المناعي ، وتوفير التغذية والدعم للخلايا العصبية3،4 ، يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة أيضا الاتصال مباشرة بالخلايا العصبية لتنظيم المستقبلات السطحية العصبية وربط الترابط المقابل ، والتفاعل بشكل غير مباشر مع الخلايا العصبية عن طريق إفراز السيتوكينات5. أظهرت الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي أن الخلايا الدبقية الصغيرة تعبر عن أنواع مختلفة من قنوات البوتاسيوم ، والتي تساهم في الحفاظ على إمكانات الغشاء السلبية6 وتنظم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. بالنظر إلى أنه لوحظت قنوات البوتاسيوم الصغيرة غير الطبيعية في أمراض الدماغالمختلفة 7 ، فمن الأهمية بمكان للباحثين تحديد الأدوية المحتملة التي تستهدف قنوات البوتاسيوم هذه وتطوير استراتيجيات لتنظيم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة.

غالبا ما تستخدم طرق الهضم والتنقية التقليدية للخلايا الدبقية الصغيرة الدماغ بأكمله ، والذي يتجاهل عدم تجانس الخلايا الدبقية الصغيرة عبر مناطق الدماغ المختلفة8. يضع التفكك في المختبر والثقافة طويلة الأمد في الوسائط المحتوية على المصل الخلايا الدبقية الصغيرة في حالةنشطة 9 ، والتي قد لا تعكس بدقة خصائصها الفسيولوجية وحالتها الحقيقية.

بالإضافة إلى ذلك ، بينما تم تسجيل تيارات البوتاسيوم الخارجية في الخلايا الدبقية الصغيرة المزروعة لحديثي الولادة الأولية وخطوط الخلايا10 ، قد تختلف البيانات من الثقافات طويلة المدى لأنسجة دماغ الجنين أو الفئران حديثي الولادة عن تلك الموجودة في الخلايا الدبقية الصغيرة الناضجة. يهدف البروتوكول الحالي إلى عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل حاد وإجراء تسجيلات خلية كاملة على الفور لتيارات البوتاسيوم الدبقية الصغيرة باستخدام أنسجة دماغ الفئران البالغة.

تم فحص خصائص قناة البوتاسيوم والكيميائية الحيوية باستخدام طريقة مناسبة لعزل وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجةالصغيرة 11،12،13،14،15. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول إرشادات للباحثين لتوضيح الخصائص الكيميائية الحيوية والوظيفية للخلايا الدبقية الصغيرة في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم قنوات الحصين والبوتاسيوم كأمثلة ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا على دراسة مناطق الدماغ الأخرى وخصائص الفيزيولوجيا الكهربية للقناة / الخلية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام علوم الحياة في جامعة جنوب الصين العادية ، وتم الحفاظ على المعايير المناسبة لرعاية (الموافقة الأخلاقية: SCNU-SLS-2023-048). تم استخدام الفئران من الذكور أو الإناث C57BL / 6J البالغة من العمر 3-5 أشهر في هذه الدراسة. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. إعداد الحلول

  1. تحضير 50 مل من المحلول داخل الخلايا الذي يحتوي على 160 ملي مولار من KF ، و 10 ملي مولار من HEPES ، و 10 ملي من EGTA ، و 2 ملي من MgCl2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 مع 1 متر من محلول KOH ، واضبط الضغط الاسموزي على 300 مللي أسمول مع D-sukrose13,16. يحفظ في -20 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد 50 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) الذي يحتوي على 0.5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 2 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) في PBS.
  3. تحضير بولي إل ليسين (PLL) عند تخفيف 1: 1000 في الماء.
    ملاحظة: يجب طلاء أغطية الغطاء ب PLL في اليوم السابق للتجربة. احتضان الزلات المطلية عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. أعد تدوير PLL في اليوم الثاني وجفف الزلات المطلية عند 37 درجة مئوية.

2. تحضير معلق أحادي الخلية من أنسجة المخ

  1. تخدير الفئران بهيدرات الكلورال بنسبة 2.5٪ (0.15 مل / 10 جم ، IP) (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). يؤكد اختفاء منعكس القرنية وانعكاس الألم عن طريق الضغط على أصابع القدم أو قرص الجلد في الفئران التخدير العميق. ضع مستلقة على طاولة تشريح وقم بتثبيت أطرافها.
    1. كشف الصدر وزرع القلب17 مع PBS معقم مثلج لإزالة خلايا الدم المنتشرة داخل الأوعية الدموية. امسك الرأس واقطع الجلد على طول خط الوسط في الدماغ بالمقص لفضح الجمجمة.
    2. قطع الجزء الخلفي من الجمجمة ثنائيا وبين تجاويف العين بمقص صغير. قطع الجمجمة على طول خياطة السهمية وإزالة الجمجمة بالملاقط. استخرج أنسجة المخ بسرعة باستخدام الملقط17.
  2. ضع أنسجة المخ في أطباق ثقافة مقاس 10 سم تحتوي على PBS مثلج. قم بتشريح القشرة الدماغية بشكل ثنائي باستخدام ملاقط ، وعزل أنسجة الحصين ، وقطعها إلى قطع أصغر. انقل القطع إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
    ملاحظة: يكشف التشريح الثنائي للقشرة الدماغية عن هلال أنسجة الحصين في نصفي الكرة الأرضية.
  3. أعد تعليق القطع الصغيرة من أنسجة الحصين في 2 مل من محلول الملح المتوازن من هانك المثلج (HBSS) وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) ، ثم تخلص من HBSS.
  4. أضف 1950 ميكرولتر من خليط الإنزيم 1 إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل الذي يحتوي على قطع أنسجة الحصين. هز أنبوب الطرد المركزي باستمرار في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: خليط الإنزيم 1 عبارة عن مزيج من 50 ميكرولتر من إنزيم P و 1900 ميكرولتر عازلة Y ، مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية (موجودة كجزء من المجموعة المتوفرة تجاريا ، انظر جدول المواد).
  5. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي من الحمام المائي. أضف 30 ميكرولتر من خليط الإنزيم الطازج 2 إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل. قم بتفتيت شظايا الأنسجة لأعلى ولأسفل 20 مرة بطرف ماصة سعة 1 مل، وتحتضن في حمام مائي لمدة 5 دقائق مع الرج المستمر عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: خليط الإنزيم 2 عبارة عن مزيج من 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت Y و 10 ميكرولتر من الإنزيم A. تقوم خطوتا الهضم المذكورتان أعلاه بتحويل أنسجة المخ إلى تعليق خلوي. يجب ألا يتجاوز إجمالي وقت الهضم 15 دقيقة.
  6. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي وقم بإزالة المعلق لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة سعة 1 مل حتى تختفي قطع كبيرة من الأنسجة
  7. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مرشح فحص خلية 70 ميكرومتر واجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 مل.
    ملاحظة: تزيل هذه الخطوة أي قطع كبيرة من الأنسجة غير المهضومة.
  8. انقل المرشح إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية ، 300 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية بماصة سعة 1 مل.
  9. اغسل معلق الخلية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 20 مرة باستخدام 15 مل HBSS، وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و300 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية و
    أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت لنظام التشغيل Macs.
    ملاحظة: توفر هذه الخطوة التعليق أحادي الخلية المستخدم في التجارب اللاحقة.

3. الانفصال الحاد للخلايا الدبقية الصغيرة

  1. انقل 1 مل من نظام التعليق أحادي الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية ، 300 × جم لمدة 3 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  2. أعد تعليق الحبيبات أحادية الخلية في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS. أضف 10 ميكرولتر من الميكروبيدات CD11b / c واحتضن التعليق عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على شاكر أفقي.
  3. ضع عمود الفرز في المجال المغناطيسي لفاصل MACS مناسب وبلل العمود مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
  4. اغسل التعليق أحادي الخلية عن طريق إضافة 1 مل من المخزن المؤقت MACS مباشرة إلى الأنبوب وجهاز الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 300 × جم لمدة 3 دقائق. استنشق المادة الطافية تماما.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
  6. انقل معلق الخلية المعلق إلى عمود الفرز في المجال المغناطيسي باستخدام ماصة سعة 1 مل. تجاهل التدفق. اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS أثناء بقائه في المجال المغناطيسي.
    ملاحظة: يحتوي التدفق على خلايا غير مسماة. يجب غسل العمود دون إزالته من المجال المغناطيسي.
  7. قم بإزالة عمود الفرز من المجال المغناطيسي. أضف 1 مل من المخزن المؤقت MACS إلى العمود وادفعه ببطء باستخدام المكبس. اجمع التدفق.
    ملاحظة: يحتوي التدفق على الخلايا المسماة (أي الخلايا الدبقية الصغيرة). لتحسين نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة ، يمكن تكرار العملية باستخدام عمود فرز جديد (اختياري).
  8. قم بزرع الخلايا المحددة في صفيحة من 24 بئرا تحتوي على غطاء مطلي ب PLL. أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع واحتضنه لمدة 20 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 95٪ O2 و 5٪ CO2 و 60٪ -80٪ رطوبة. تسمح هذه الخطوة للخلايا الدبقية الصغيرة بالالتصاق بالغطاء لتجارب التصحيح اللاحقة للخلية الكاملة والمشبك المناعي.

4. التألق المناعي

  1. استنشق وسط الثقافة من آبار الألواح واشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام 0.1 M PBS على شاكر.
  2. تخلص من PBS وقم بتثبيت الخلايا الدبقية الصغيرة على الغطاء باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. قم بإزالة المثبت واشطف زلة الغطاء ثلاث مرات باستخدام 0.1 M PBS.
  4. تخلص من PBS وقم باختراق الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 0.2٪ Triton X-100 و 5٪ BSA في PBS لمدة ساعة واحدة في RT على شاكر.
  5. احتضان الخلايا الدبقية الصغيرة مع المخزن المؤقت المانع بالإضافة إلى الأجسام المضادة الأولية المضادة ل Iba1 ومضادات CD11b18 بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  6. في اليوم التالي ، قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية واشطف زلة الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS في RT على شاكر.
  7. احتضان الخلايا الدبقية الصغيرة مع المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على أجسام مضادة ثانوية مقترنة بالفلوروفور لمدة ساعتين في RT. أضف صبغة DAPI لآخر 15 دقيقة من الحضانة.
  8. قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية واشطف زلة الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS. قم بتركيب زلات الغطاء على شرائح المجهر للتصوير.

5. تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة لتيارات البوتاسيوم في الخلايا الدبقية الصغيرة

  1. قم بإذابة المحلول داخل الخلايا واحتفظ به على الجليد.
  2. اسحب الماصات المرقعة (الأقطاب الكهربائية) من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ذات الجدران الرقيقة باستخدام مجتذب رأسي17.
    ملاحظة: يجب أن تكون مقاومة القطب أقل من 10 MΩ.
  3. انقل غطاء إلى غرفة التسجيل وأضف المحلول خارج الخلية الذي يحتوي على 160 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، و 4.5 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، و 2 ملي من كلوريدالكالسيوم 2 ، و 1 ملي مولار من كلوريد الملكلوريد2 ، و 10 ملي مولار من HEPES. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 باستخدام محلول 1 M NaOH قبل الاستخدام 13,16 ، واضبط الضغط الاسموزي على 300 mOsm باستخدام D-sukrose.
  4. حدد موقع الخلايا الدبقية الكروية تحت مجهر مائي باستخدام هدف 40x.
  5. املأ القطب بمحلول داخل الخلايا ، وقم بتوصيله بمرحلة رأس مكبر الصوت لإعداد الفيزيولوجيا الكهربية ، وقم بالضغط الإيجابي. قم بالتبديل إلى الهدف 4x وحدد موقع القطب.
    1. قم بخفض القطب الكهربائي في محلول الحمام واضبط مكبر الصوت على وضع مشبك الجهد لإجراء اختبار الغشاء في وضع الحمام . ارجع إلى هدف 40x وحرك طرف القطب بالقرب من الخلايا الدبقية الصغيرة.
      ملاحظة: عندما يكون طرف القطب قريبا جدا من خلية الخلايا الدبقية الصغيرة ، يجب أن تزداد المقاومة قليلا.
    2. استخدم ضغطا سلبيا صغيرا لتثبيت الخلية. عندما تصل المقاومة إلى 100 MΩ ، قم بالتبديل من وضع الحمام إلى وضع التصحيح في اختبار الغشاء. عندما تصل المقاومة إلى 300 MΩ ، حرر الضغط السلبي.
    3. عندما تشير المقاومة إلى تكوين ختم جيجا أوم (أي >1 GΩ) بين القطب الكهربائي والغشاء الدبقي الصغير ، قم بالتبديل من وضع التصحيح إلى وضع الخلية في اختبار الغشاء.
  6. ضع كمية صغيرة من الشفط وابدأ صدمة كهربائية لتمزق الغشاء. يشير ظهور عابرات سعوية كبيرة إلى تمزق الغشاء الناجح.
  7. قم بالتبديل إلى وضع مشبك الجهد وافتح برنامج التسجيل. سجل تيارات البوتاسيوم لمدة 200 مللي ثانية. لاختبار الإمكانات ، قم بتطبيق خطوات الجهد بزيادات 20 مللي فولت من -120 مللي فولت إلى +40 مللي فولت عند 1 هرتز.
  8. تحليل البيانات التي تم الحصول عليها دون اتصال باستخدام البرامج المناسبة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باختصار ، تتضمن العملية عزل الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين من دماغ الفأر البالغ متبوعا بتسجيل مشبك رقعة خلية كاملة لهذه الخلايا (الشكل 1). يبدأ الإجراء بتشريح الحصين للفئران البالغة C57BL / 6J التي تتراوح أعمارها بين 3 و 5 أشهر. على وجه التحديد ، تتم إزالة الدماغ بالكامل بعد التروية ووضعه في طبق استزراع يحتوي على PBS مثلج (الشكل 2 أ). لضمان العزلة الحادة للخلايا من الحصين ، تتم إزالة القشرة الدماغية ، ويتم عزل أنسجة الحصين على شكل هلال سليمة (الشكل 2 ب).

للحصول على جودة مثالية للخلية وتسجيلات مشبك التصحيح عالية الجودة للخلية الكاملة ، من الضروري التحكم في وقت الهضم أثناء تحضير التعليق أحادي الخلية. قامت الدراسة باستمرار بتحريك أنسجة الحصين يدويا في خليط الإنزيم وحددت فترة الهضم بشكل صارم بما لا يزيد عن 15 دقيقة (الشكل 3). ثم تم عزل الخلايا باستخدام طريقة MACS ، وحققت نقاء 86.20٪ ± 0.68٪ 19،20. للتأكد من أن هذه الخلايا التي تم فرزها كانت دبقية صغيرة ، تم اختبار علامات سطح الخلايا الدبقية الدقيقة عن طريق التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل Iba1 ومضادات CD11b ، والتي تستخدم على نطاق واسع للكشف عن الخلايا الدبقيةالصغيرة 18. أشارت النتائج إلى أن الخلايا المعزولة كانت إيجابية CD11b و Iba1 ، مما يؤكد العزلة الناجحة للخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 4).

أخيرا ، لتقييم ما إذا كانت الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بشكل حاد ذات جودة عالية لتجارب المتابعة ، نصف كيفية إجراء تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة لتقييم تيارات البوتاسيوم الدبقية الصغيرة. كان متوسط سعة الغشاء في الخلايا الدبقية الصغيرة المسجلة 10.42 ± 2.05 (الشكل 5). أظهرت النتائج أنه يمكن تسجيل تيارات البوتاسيوم الدبقية الصغيرة ، مما يشير إلى أن الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بشكل حاد مناسبة للدراسات البيولوجية العصبية.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على الإجراء التجريبي. هناك أربع خطوات رئيسية: يتم استخراج أنسجة المخ بعناية ، ويتم تشريح الحصين بشكل ثنائي. يتم هضم أنسجة الحصين لتحضير معلق أحادي الخلية باستخدام خليط إنزيم كما هو مفصل في قسم البروتوكول. يتم عزل الخلايا المستهدفة بطريقة فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا ؛ ويتم فحص تيارات البوتاسيوم في الخلايا المعزولة بشكل حاد عن طريق تسجيل مشبك التصحيح للخلية بأكملها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تشريح الحصين. (أ) الدماغ الكامل لفأر عمره 3 إلى 5 أشهر. (ب) الحصين الثنائي المعزول. شريط المقياس: 0.5 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: رسم تخطيطي يوضح هضم أنسجة الحصين. رسم توضيحي للخطوات التجريبية الحاسمة ، مما يضمن هضم أنسجة الحصين في معلق أحادي الخلية عن طريق إضافة مخاليط الإنزيم عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر لمدة تصل إلى 15 دقيقة.

figure-results-4
الشكل 4: تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين المعزولة بشكل حاد. تظهر الصور التمثيلية متحدة البؤر الخلايا الإيجابية CD11b (الأخضر) و Iba1 (الحمراء) المنقاة من الحصين ، مما يؤكد أن الخلايا المعزولة هي خلايا دبقية صغيرة. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تسجيل تيارات البوتاسيوم الدبقية الصغيرة للخلية الكاملة. (أ) يتم وضع قطب تسجيل على سطح الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة في الحصين. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. (ب) تيارات البوتاسيوم التمثيلية للخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين المعزولة بشكل حاد في ظل ظروف مشبك الجهد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من الواضح أن الخلايا الدبقية الصغيرة المستنبتة من الفئران الجنينية أو حديثي الولادة غير مناسبة لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البالغة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لعدم تجانس الخلايا الدبقية الصغيرة عبر مناطق الدماغ المختلفة21 ، قد لا تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من الدماغ بأكمله بدقة خصائص الخلايا الدبقية الصغيرة في بنية دماغية معينة. يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين على وجه التحديد لتقييم الخصائص الكهربائية لهذه الخلايا. يتضمن طرقا لتسجيل التيارات التي تحكمها قنوات البوتاسيوم الدبقية الصغيرة.

من المعروف أن هضم الأنسجة يحتاج إلى التحكم الصارم عند تحضير معلقات أحادية الخلية لتجنب المساس بخصائص هذه الخلايا أثناء زراعة الخلايا الأولية والتجارب اللاحقة. عادة ، يتم الحصول على تعليق أحادي الخلية من الدماغ كله من خلال هضم إنزيم البنكرياس والتجانس الفيزيائي. ومع ذلك ، عند عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن منطقة معينة من الدماغ ، مثل الحصين ، فإن التجانس الفيزيائي وحده لا ينتج عنه كمية كافية من الخلايا لإجراء تجارب ذات مغزى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إنزيمات البنكرياس لها نشاط هضمي قوي ، مما قد يؤثر على بقاء الخلية.

لمعالجة هذه المشكلات ، اعتمدت الدراسة إجراء تفكك خفيف نسبيا وتحكمت يدويا في وقت الهضم بما لا يزيد عن 15 دقيقة باستخدام مجموعة تفكك دماغ الفأر البالغة. يحافظ هذا النهج على الخلايا الدبقية الصغيرة في حالة نشطة ، وهو أمر بالغ الأهمية لتسجيلات مشبك التصحيح اللاحقة للخلية بأكملها. يوفر إجراء التفكك الخفيف أيضا مزايا من حيث السرعة والفعالية من حيث التكلفة.

تشمل طرق تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية طريقة الاهتزاز الطبقي (SSM) 22 ، وطريقة الطرد المركزي المتدرج للكثافة (DGCM) 23 ، وطريقة فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) 11،24. من بين هؤلاء ، يستخدم SSM على نطاق واسع لتنقية الخلايا العصبية أو الخلايا الدبقية. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية ل SSM هو عدم قدرته على تحقيق مستويات عالية من النقاء25. وبالمثل ، ينتج عن DGCM أيضا مستويات نقاء منخفضة. تتطلب طريقة FACS تلطيخ الخلايا لمدة 15 دقيقة إلى 1 ساعة ، متبوعا بالفرز باستخدام فارز الخلايا عالي السرعة ، مما قد يضعف صلاحية الخلية. في المقابل ، يستخدم هذا البروتوكول طريقة MACS ، والتي توفر وقتا أقل للعزل وتتجنب الاستخدام المتكرر والمستهلك للوقت للأدوات وإجراءات التلوين. نتيجة لذلك ، يتم الحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة عالية النقاء ، وإن كانت بكميات أقل مقارنة ببعض الطرق البديلة.

هناك قيود على هذه التقنية. على سبيل المثال ، تنتج طريقة فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) عددا قليلا نسبيا من الخلايا الدبقية الصغيرة ، ولا يمكن زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بشكل حاد لفترات طويلة. ومع ذلك ، فإن هذا النهج ذو قيمة لأنه يسمح بالتحقيق في الخصائص الفيزيولوجية الكهربية للخلايا الدبقية الصغيرة التي تم تحضيرها حديثا من الحصين الفأر البالغ ، بدلا من الاعتماد على الخلايا التي تمت زراعتها لفترة طويلة.

تعد تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة أداة حاسمة ومستخدمة على نطاق واسع لدراسة الخصائص الخلوية ، وخاصة العصبية ، والفيزيولوجيا الكهربية في مجالات مثل علم الأعصاب وعلم الأدوية وعلم الأحياء الخلوية26. تم استخدام تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة في العديد من الدراسات للتحقيق في خصائص شرائح الدماغ التي تم تشريحها بشكل حاد والثقافات الأولية وخطوط الخلايا. ومع ذلك ، كانت التسجيلات المشبكية للخلية الكاملة للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بشكل حاد من دماغ الفأر البالغ غير موجودة حتى تحقيقاتنا.

لا توفر هذه الدراسة بروتوكولا لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين البالغة فحسب ، بل توضح أيضا التسجيل الناجح لتيارات البوتاسيوم في هذه الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة. والجدير بالذكر أنه من المرجح أن ينطبق هذا البروتوكول على دراسة الخلايا الدبقية الصغيرة في هياكل الدماغ بخلاف الحصين.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32170950 ، 32371065) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ ، رقم 2023A1515010899 و 2021A1515010804.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق بتري 100 ممكورنينج353003
15 مل أنابيب فالكون BD352096
24 بئر BD353047
35 مم طبق بتريكورنينج353001-50
مل أنابيب فالكونBD352070
70 & فحص الخلايا mMiltenyi130-095-823لإزالة كتل الخلايا قبل فرز الخلايا
مجموعة تفكك دماغ الفأر البالغMiltenyi130- 107-677
Anti-CD11bBio-RadMCA74Goat Anti-IgG المضادة للفأر متاح أيضا. لمنع الغلوبولين المناعي الداخلي.
الأجسام المضادة المضادة ل Iba 1SYSY234308الماعز المضادة لخنزير غينيا IgG) متوفرة أيضا. لمنع الغلوبولين المناعي الداخلي.
أكسون Digidata 1440Aالولايات المتحدة الأمريكية
محور متعدد المشبك 700B مكبر للصوتالولايات المتحدة الأمريكية
BSA الألبومين الكسر VBioFrox4240GR500مصل
C57BL / 6 فئران  مختبر
الطبي CD11 b / c MicroBeadsMiltenyi130-105-634
هيدرات الكلورAbsinabs47051394يستخدم على نطاق واسع كتخدير في الفئران
Clampfit 10.6الولايات المتحدة الأمريكية
مجهر متحد البؤرZeiss& nbsp ؛ LSM 800
ثقافة متوسطةفيشر ScientificC11995500BT-DAPI
صبغةBeyotimeC1002
مجتذب القطبالكهربائي NarishigePC-10
HBSSServicebioG4203
شاكر أفقيSCILOGEXSLK-O3000-S
برنامج تحليل الصورفيجي
أعمدة MACSMiltenyi130-042-201
فواصل MACSMiltenyi130-042-102
ParaformaldehydeFisher ScientificT353-500استخدم محلول طازج بنسبة 4٪ في 1X PBS ، درجة الحموضة 7.2-7.4.  ؛
بولي إل ليسينبيوتيم  C0313طلاء غطاء
Triton X-100SigmaX100
مركز قوانغدونغ

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), e1000527(2010).
  3. Voet, S., Prinz, M., Van Loo, G. Microglia in central nervous system inflammation and multiple sclerosis pathology. Trends Mol Med. 25 (2), 112-123 (2019).
  4. Salter, M. W., Beggs, S. Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS. Cell. 158 (1), 15-24 (2014).
  5. Wohleb, E. S. Neuron-microglia interactions in mental health disorders: For better, and for worse. Front Immunol. 7, 544(2016).
  6. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratskya, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  7. Sarkar, S. Microglial ion channels: Key players in non-cell autonomous neurodegeneration. Neurobiol Dis. 174, 105861(2022).
  8. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  9. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium. J Vis Exp. 133, e57122(2018).
  10. Lyons, S. A., et al. Distinct physiologic properties of microglia and blood-borne cells in rat brain slices after permanent middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (11), 1537-1549 (2000).
  11. Li, Q., Lan, X., Han, X., Wang, J. Expression of tmem119/SALL1 and CCR2/CD69 in FACS-sorted microglia- and monocyte/macrophage-enriched cell populations after intracerebral hemorrhage. Front Cell Neurosci. 12, 520(2018).
  12. Sarkar, S., et al. Kv1.3 modulates neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. J Clin Invest. 130 (8), 4195-4212 (2020).
  13. Maezawa, I., et al. Kv1.3 inhibition as a potential microglia-targeted therapy for Alzheimer's disease: Preclinical proof of concept. Brain. 141 (2), 596-612 (2018).
  14. Delbridge, A. R. D., et al. Organotypic brain slice culture microglia exhibit molecular similarity to acutely isolated adult microglia and provide a platform to study neuroinflammation. Front Cell Neurosci. 14, 592005(2020).
  15. Volden, T. A., Reyelts, C. D., Hoke, T. A., Arikkath, J., Bonasera, S. J. Validation of flow cytometry and magnetic bead-based methods to enrich cns single cell suspensions for quiescent microglia. J Neuroimmune Pharmacol. 10 (4), 65-665 (2015).
  16. Wulff, H., et al. The voltage-gated kv1.3 k(+) channel in effector memory t cells as new target for ms. J Clin Invest. 111 (11), 1703-1713 (2003).
  17. Tan, S., et al. Biocytin-labeling in whole-cell recording: Electrophysiological and morphological properties of pyramidal neurons in CYLD-deficient mice. Molecules. 28 (10), 4092(2023).
  18. Manitz, M. P., et al. Flow cytometric characterization of microglia in the offspring of polyi:C treated mice. Brain Res. 1636, 172-182 (2016).
  19. Xu, Y. N., et al. A modified protocol of mouse hippocampal primary microglia culture by using manual dissociation, magnetic activated cell sorting and tic medium. Sheng Li Xue Bao. 71 (6), 883-893 (2019).
  20. Zelenka, L., et al. Novel protocol for the isolation of highly purified neonatal murine microglia and astrocytes. J Neurosci Methods. 366, 109420(2022).
  21. Keren-Shaul, H., et al. A unique microglia type associated with restricting development of alzheimer's disease. Cell. 169 (7), 1276-1290.e17 (2017).
  22. Yang, B., et al. Various cell populations within the mononuclear fraction of bone marrow contribute to the beneficial effects of autologous bone marrow cell therapy in a rodent stroke model. Transl Stroke Res. 7 (4), 322-330 (2016).
  23. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  24. Ramesha, S., Rayaprolu, S., Rangaraju, S. Flow cytometry approach to characterize phagocytic properties of acutely-isolated adult microglia and brain macrophages in vitro. J Vis Exp. 160, e61467(2020).
  25. Mccarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  26. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD11b

مقالات ذات صلة