مقالة منهجية

التربية حسب التصميم للأرز الوظيفي باستخدام تقنيات تحرير الجينوم

DOI:

10.3791/67336

⸱

يناير 3, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Bellagen Biotechnology Co. Ltd, 2School of Life Sciences, Shandong Normal University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول تربية أصناف الأرز النشوي المقاوم حسب التصميم باستخدام تقنيات تحرير الجينوم بطريقة دقيقة وفعالة وبسيطة من الناحية الفنية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تواجه الأساليب التقليدية لتربية المحاصيل ، والتي تعتمد في الغالب على الأساليب التي تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة مثل التهجين التقليدي وتربية الطفرات ، تحديات في إدخال الصفات المستهدفة بكفاءة وتوليد مجموعات نباتية متنوعة. على العكس من ذلك ، أدى ظهور تقنيات تحرير الجينوم إلى نقلة نوعية ، مما مكن من التلاعب الدقيق والسريع بجينومات النبات لإدخال الخصائص المرغوبة عن قصد. واحدة من أكثر أدوات التحرير انتشارا هي نظام CRISPR / Cas ، والذي استخدمه الباحثون لدراسة المشكلات المهمة المتعلقة بعلم الأحياء. ومع ذلك ، فإن سير العمل الدقيق والفعال لتحرير الجينوم لم يتم تحديده جيدا في تربية المحاصيل. في هذه الدراسة ، أظهرنا العملية الكاملة لتربية أصناف الأرز المخصبة بمستويات عالية من النشا المقاوم (RS) ، وهي سمة وظيفية تلعب دورا مهما في الوقاية من أمراض مثل السكري والسمنة. شمل سير العمل عدة خطوات رئيسية ، مثل اختيار جين SBEIIb الوظيفي ، وتصميم الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNA) ، واختيار ناقل تحرير الجينوم المناسب ، وتحديد طريقة توصيل النواقل ، وإجراء زراعة الأنسجة النباتية ، وطفرة التنميط الجيني وتحليل النمط الظاهري. بالإضافة إلى ذلك ، تم توضيح الإطار الزمني اللازم لكل مرحلة من مراحل العملية بوضوح. لا يعمل هذا البروتوكول على تبسيط عملية التكاثر فحسب ، بل يعزز أيضا دقة وكفاءة إدخال السمات ، وبالتالي تسريع تطوير أصناف الأرز الوظيفية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد التربية التقليدية على إدخال السمات في المحاصيل أو إنتاج مجموعات نباتية ذات تباين كاف ، الأمر الذي يتطلب مراقبة ميدانية طويلة الأجل1،2. نظرا لقيود التربية التقليدية ، تم تطوير تقنية تحرير الجينات ، والتي يمكنها تعديل جينوم المحاصيل بدقة للحصول على السمات المرغوبة لمجموعات النباتات3. نظام تحرير الجينات الأكثر استخداما في النباتات هو CRISPR / Cas (Retroed Regular Interspaced Short Palindromic Repeats / Cas endonuclate المرتبط ب CRISPR) ، والذي يعتمد على نوكلياز داخلي موجه بالحمض النووي الريبي القابل للبرمجة لإنشاء فواصل مزدوجة الخيط المستهدفة (DSBs) في الحمض النووي4،5. ثم يتم إصلاح DSBs هذه بواسطة آليات إصلاح الحمض النووي الطبيعيةللخلية 6،7 ، مما يؤدي غالبا إلى إدخال التغييرات الجينية المرغوبة. على الرغم من أن هذه التقنية قد تم تنفيذها في محاصيل مختلفة ، بما في ذلك القمح8 والذرة9 وفول الصويا10 والأرز11 ، إلا أنها تستخدم في الغالب للكشف عن المشاكل البيولوجية. بالمقارنة مع تطبيقه المكثف في توضيح وظائف الجينات النباتية ، لا تزال الأبحاث حول تطبيق تقنيات تحرير الجينات على تربية المحاصيل نادرة نسبيا12.

عادة ما تتبع عملية تحرير الجينات في المحاصيل سير عمل محددا جيدا يشمل عدة خطوات رئيسية13. تتضمن الخطوة الأولى تحديد الجين أو المنطقة الجينية المحددة التي تحتاج إلى تعديل لتحقيق السمة المرغوبة. ثانيا ، تم تصميم استراتيجية تحرير الجينات ، والتي تتضمن اختيار نظام تحرير الجينات المناسب (على سبيل المثال ، CRISPR-Cas9 أو CRISPR-Cas12) وتصميم دليل محدد للحمض النووي الريبي لتوجيه نوكلياز داخلي إلى الموقع المستهدف. ثالثا ، يتم بعد ذلك دمج نظام تحرير الجينات في ناقل التوصيل ، والذي يستخدم لإدخال آلية التحرير في الخلايا النباتية. يمكن أن تكون هذه النواقل مجمعات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين النووي الريبي (RNP). بعد ذلك ، يتم تسليم نواقل تحرير الجينات إلى الخلايا النباتية باستخدام طرق مختلفة ، بما في ذلك التحول بوساطة Agrobacterium أو قصف الجسيمات أو التثقيب الكهربائي. على الفور ، يتم زراعة الخلايا النباتية المحولة في ظل ظروف مناسبة لتوليد الكالس المعدل وراثيا أو الأنسجة الجنينية. ثم يتم تجديد هذه الأنسجة إلى نباتات كاملة من خلال تقنيات زراعة الأنسجة. تخضع النباتات المتجددة للتوصيف الجزيئي الصارم لتأكيد وجود التغيرات الجينية المرغوبة.

تقدم مقالة سابقة بقلم Tsakirpaloglou et al.14 نظرة عامة واسعة على عملية تحرير الجينات ، من تصميم النواقل إلى توليد الشتلات المعدلة ، لكنها لا تتعمق في التحليل التفصيلي لسمات محددة مرتبطة بالجين المستهدف ولا التقييم اللاحق للأداء الزراعي أو التحقق الوظيفي من صحة المحاصيل المعدلة. لقد تجاوزنا مجرد إثبات جدوى تحرير الجين في الأرز. يقيم عملنا بشكل شامل تأثير هذا التعديل على السمات الكيميائية الحيوية والجزيئية والزراعية لخطوط الأرز المعدلة. يتضمن ذلك تقييم تكوين النشا ، وهو عامل حاسم يؤثر على جودة الحبوب والقيمة الغذائية ، والذي لم يتم استكشافه على نطاق واسع في دراسات تحرير الجينات السابقة.

يتكون نشا الأرز عادة من ~ 20٪ أميلوز و ~ 80٪ أميلوبكتين15. SBEIIb هو إنزيم ضروري لتخليق الأميلوبكتين ويتم التعبير عنه في السويداء16. أدى الضربة القاضية ل OsSBEIIb بواسطة الحمض النووي الريبي الشعري (RNAi) وتعبير الحمض النووي الريبي الصغير من محتوى النشا المقاوم17،18. النشا المقاوم هو نشا ركيزة لا يمكن هضمه وامتصاصه في الأمعاء الدقيقة ولكنه قادر على تقسيمه إلى أحماض دهنية قصيرة السلسلة وغازات بواسطة بعض البكتيريا الهضمية في الأمعاء. نظرا لأنه لا يمكن تكسيره بسرعة ، فإنه يحتوي على مؤشر نسبة السكر في الدم أقل مقارنة بالنشويات الأخرى ولا يسبب ارتفاعا سريعا في نسبة السكر في الدم خلال فترة زمنية قصيرة بعد تناول الطعام ، مما قد يخفف من مرض السكري إلى حد ما في النظام الغذائي19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النشا المقاوم له وظائف فسيولوجية أكثر ، مثل تقليل استجابة الأنسولين ، وتنظيم وظيفة الأمعاء ، ومنع تراكم الدهون ، وتسهيل التحكم في الوزن ، وتعزيز امتصاص الأيونات المعدنية. لذلك ، يتم متابعته على نطاق واسع كنوع جديد من الأليافالغذائية 20.

للتغلب على هذه التحديات والاستفادة بنجاح من تقنيات تحرير الجينات لتربية أصناف الأرز الوظيفية ، قمنا بتحسين وتحسين البروتوكولات التشغيلية داخل الأرز. كان تركيزنا على تحليل تصميم مواقع الجينات المستهدفة بدقة ، واختيار أنسب أدوات تحرير الجينات بعناية ، وإجراء تحليل صارم للنمط الظاهري طوال عملية التربية. كدليل على قوة وكفاءة هذه التقنيات ، نقدم دراسة حالة تعرض التطور السريع لصنف أرز وظيفي غني بالنشا عالي المقاومة. يؤكد هذا المثال على إمكانات تحرير الجينات في تسريع تربية الأرز الوظيفي ، ومعالجة الندرة الحالية للأبحاث في هذا المجال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت الدراسة في شركة Bellagen Biotechnology Co. Ltd في الصين وفقا لإرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري. قبل المشاركة ، تم شرح بروتوكول الدراسة بدقة للمشاركين ، الذين قدموا الموافقة المستنيرة.

1. تصميم sgRNA وناقلات البناء (توقيت 5-7 أيام)

ملاحظة: تم استخدام متجه ثنائي للتعبير عن نظام CRISPR / Cas-SF0121. لا يحتوي على أقل من 3 نيوكليوتيدات (nt) غير متطابقة مع الموقع المحتمل خارج الهدف ل sgRNA. يحتاج محول sgRNA إلى استكمال الطرف اللاصق ، والذي يتم إنشاؤه بواسطة هضم إنزيم Bsa I لناقل التحرير. استند اختيار البرنامج إلى الكفاءة العالية والخصوصية المبلغ عنها للبرنامج في الأرز14 ، فضلا عن سهولة استخدامه وإمكانية الوصول إليه لمجموعة البحث.

  1. انتقل إلى موقع NCBI على الويب (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) لاسترداد جين OsSBEIIb (LOC4329532) في Japonica. قم بتنزيل الجينوم المرجعي والوصول إليه داخل برنامج SnapGene.
  2. قم بتحليل عمليات الإدراج / الحذف (InDel) وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) في تسلسل exon ل OsSBEIIb من صنف X134 ، ومقارنته بالجينوم المرجعي. استخدم NCBI Primer Blast22 لتصميم بادئات تحيط بمناطق exon (الجدول التكميلي 1).
  3. للتحقق من صحة تسلسل exon لجين OsSBEIIb في X134 عن طريق تسلسل Sanger ، قم بإعداد التفاعل على النحو التالي: 10 ميكرولتر من مخزن خلط البوليميراز مع 1 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، 1 ميكرولتر من gDNA من أنسجة X134 و 7 ميكرولتر من الماء المقطر. تشغيل برنامج PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية ، 3 دقائق ؛ (95 درجة مئوية ، 20 ثانية - 56 درجة مئوية ، 30 ثانية - 72 درجة مئوية ، 60 ثانية) مع 35 دورة ، و 72 درجة مئوية ، 5 دقائق.
  4. صمم sgRNA على تسلسل إكسون OsSBEIIb ل X134 ، مع الالتزام ببروتوكول Tsakirpaloglou et al.14والتأكد من أن تسلسل PAM هو TTN.
  5. قم بتعديل تسلسل sgRNA عن طريق إضافة -ACAC- oligos في نهاية 5 'من التمهيدي الأمامي وإضافة -GGCC- oligos في نهاية 5 'من التمهيدي العكسي. قم بتجميع الاشعال الأمامية / العكسية تجاريا (ل sgRNA).
  6. قم بإذابة البادئات الأمامية والخلفية بتركيز 10 ميكرولتر / لتر ، وخذ 1 ميكرولتر من كل منها ، وأضفها إلى 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت الصلب (مخزن ثلاثي الأبعاد لليد + 50 ملي كلوريد الصوديوم) واخلطه عن طريق سحب العينات. ضعه في جهاز PCR وقم بتشغيل برنامج التلدين على النحو التالي على جهاز PCR: عملية التبريد البطيئة من 95 درجة مئوية إلى 16 درجة مئوية عند 0.1 درجة مئوية / ثانية.
  7. قم بتجميع sgRNA في ناقل تحرير الجينوم. قم بإعداد التفاعل على النحو التالي: 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للخلط مع 0.5 ميكرولتر من T4 DNA ligase ، 1 ميكرولتر من Bsa I ، 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتقييد 10x ، 2 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase buffere ، 2 ميكرولتر من بادئات التلدين ، 2.5 ميكرولتر من المتجه (يتم ضبط حجمه ليناسب النسبة) و 10 ميكرولتر من الماء المقطر. في جميع الحالات ، استخدم نسبة إدراج إلى متجه 2: 1 لتحقيق كفاءة التجميع. قم بتشغيل برنامج تجميع PCR ك (37 درجة مئوية ، 2 دقيقة ؛ 16 درجة مئوية ، 3 دقائق) مع 30 دورة ، و 55 درجة مئوية ، 30 دقيقة.
  8. تحويل المتجه الناتج إلى بكتريا قولونية الخلايا كما هو موضح23.
  9. تصميم بادئات تحيط بموقع إدخال الحمض النووي الريبي داخل البلازميد. باستخدام هذه البادئات ، قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل على المستعمرات الفردية للكشف عن عمليات الإدراج الناجحة. قم بإجراء تسلسل Sanger لمنتجات PCR لتأكيد الاستنساخ الناجح وعزل البلازميد24.

2. تحويل Agrobacterium (التوقيت 4 أيام)

  1. قم بإذابة الخلية المختصة EHA105 Agrobacterium على الجليد. أضف 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (الذي يحتوي على ~ 100-200 نانوغرام من الحمض النووي) إلى تعليق الخلية واخلطه برفق.
  2. قم بإجراء تحويل الصدمة الحرارية عن طريق وضع الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق ، والنيتروجين السائل لمدة 5 دقائق ، والصدمة الحرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم في الحمام الجليدي لمدة 5 دقائق.
  3. أضف 700 ميكرولتر من وسائط الببتون المستخلص من الخميرة (YEP) ، بدون مضادات حيوية ، إلى الأنبوب واخلطها برفق. استرجع الخلايا في حاضنة اهتزاز عند 28 درجة مئوية ، 200-250 دورة في الدقيقة ، لمدة 2-3 ساعات.
  4. جهاز الطرد المركزي للثقافة عند 2,800 × جم لمدة 1 دقيقة. تخلص من معظم المادة الطافية ، تاركا حوالي 100 ميكرولتر ، وأعد تعليق الخلايا. انشر الخلايا على ألواح أجار YEP التي تحتوي على 1٪ مضادات حيوية (كاناميسين وريفامبيسين) لاختيار البلازميد. احتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
  5. قم بربط صفيحة YEP (مع مقاومة المضادات الحيوية) بطرف ماصة يحتوي على مستعمرة واحدة من Agrobacterium التي تؤوي CRISPR / Cas وانقل الخلايا إلى 5 مل من وسائط YEP السائلة مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضان السائل عند 28 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  6. قم بتخزين سلالات Agrobacterium المحولة كمخزون من الجلسرين عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام.

3. تحول الأرز بواسطة Agrobacterium (توقيت 3 أشهر)

ملاحظة: تم الإبلاغ عن العديد من طرق تحويل النبات لتوصيل تسلسل الحمض النووي الغريب والتعبير عنه في الخلية النباتية25. بالنظر إلى تكامل النسخة الواحدة والتردد المنخفض ل DSBs في الجينوم ، فإن التحول بوساطة Agrobacterium هو الطريقة المفضلة لدمج جزء الحمض النووي للتعبير في كروموسومات الأرز.

  1. إجراء تحويل الأرز بوساطة Agrobacterium باتباع البروتوكول في25. يعتبر الكالي الذي ينمو بنشاط (أبيض مصفر ، جاف نسبيا ، وقطره 1-3 مم) نقطة أساسية للتحول الفعال. تخلص من البذور ذات نمو الشتلات أو الكالس البني قبل إصابة الكالس بالبكتيريا.

4. التنميط الجيني للنباتات المعدلة وراثيا وحصاد البذور (توقيت 8 أشهر)

ملاحظة: سيتم زراعة جيلين من الأرز لتحقيق طفرة متماثلة اللواقح وخطوط أجنبية خالية من الحمض النووي.

  1. أخذ عينات من أنسجة الشتلات: زرع النباتات المعدلة وراثيا في الأواني وزراعتها لمدة شهر واحد في دفيئة. لفحص نوع الطفرة ، اجمع 2-3 مجم من الأوراق الطازجة من كل حارث لشتلة واحدة ودمجها في عينة واحدة.
  2. استخراج الحمض النووي الجيني: اتبع بروتوكولا راسخا لاستخراج الحمض النووي لجينوم النبات26.
  3. تصميم بادئات الطفرات (الجدول التكميلي 1): تصميم بادئات PCR لتضخيم منطقة جين SBEIIb المحيطة بالموقع المستهدف sgRNA14. يبلغ طول الجزء المضخم 493 نقطة أساس.
  4. التنميط الجيني للطفرة: تسلسل شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة أو استنساخها في ناقل استنساخ T وتسلسله باستخدام طريقة سانجر لتحديد الطفرات14.
  5. حصاد البذور: اختر خطوط E0 التي تظهر طفرات تحول الإطار متماثلة اللواقح وزرعها في دفيئة للحصول على البذور.
  6. تصميم الاشعال لتحديد T-DNA: صمم ثلاثة بادئات محددة لشريط Hygromycin ، كاسيت UBI ، وكاسيت Cas للبناء لتحديد الخطوط الغريبة الخالية من الحمض النووي بين الطفرات (الجدول التكميلي 1).
  7. تأكيد الخطوط الأجنبية الخالية من T-DNA: حصاد الأوراق من شتلات عمرها أسبوعين واستخرج الحمض النووي لجينوم النبات كما هو موضح في الخطوة 4.2. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الجيني مع البرنامج التالي: 95 درجة مئوية ، 3 دقائق ؛ (95 درجة مئوية ، 20 ثانية - 56 درجة مئوية ، 30 ثانية - 72 درجة مئوية ، 60 ثانية) مع 35 دورة ، و 72 درجة مئوية ، 5 دقائق. هذا يسمح بالكشف عن كاسيت hygromycin و UBI و Cas في جينوم النبات.
  8. قم بتحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام وحدد الخطوط التي لا تظهر أي نطاقات ، مما يشير إلى أنها خطوط E1 خالية من الجينات المعدلة وراثيا. احصد البذور من هذه الخطوط المختارة.

5. قياس محتوى النشا المقاوم (توقيت 4 أيام)

  1. احصد بذور النباتات الطافرة و X134 واتركها تجف بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة ، مع الحفاظ على محتوى رطوبة حوالي 13٪ -15٪. حدد محتوى النشا المقاوم باستخدام إجراء البنكرياس α-أميلوز / أميلوجلوكوزيداز (AMG) الموضح أدناه.
  2. قم بتنشيط آلة التقشير وأدخل 10 جم من حبوب الأرز في وحدة التغذية لإزالة قشرة الجلوم بكفاءة ، مما ينتج عنه بذور الأرز المعالجة.
  3. انقل بذور الأرز المقشرة إلى مطحنة الأرز وقم بتشغيلها لمدة 60 ثانية للتخلص من طبقة الألورون ، مما ينتج عنه أرز مصقول.
  4. ضع الأرز المصقول في مطحنة المناديل ، واضبط تردد الطحن على 60 هرتز. قم بتشغيل المطحنة لمدة 15 ثانية ، وكرر الدورة 2x لإنتاج مسحوق الأرز.
  5. ضعي مسحوق الأرز المطحون في طبق بتري وضعيه في فرن مسخن مسبقا. اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية واتركها تجف لمدة 12 ساعة.
  6. تزن بدقة 100 مجم ± 5 ملغ من العينات وتصب مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل. اضغط برفق على الأنبوب للتأكد من استقرار العينة في الأسفل.
  7. أضف 180 ميكرولتر من الماء النقي إلى الأنبوب واغلي العينات لمدة 20 دقيقة في حمام مائي.
  8. اترك العينات لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم أدخل 4 مل من AMG (3 U / mL) التي تحتوي على α أميليز البنكرياس (10 مجم / مل) في كل أنبوب.
  9. قم بتغطية الأنابيب بإحكام ، واخلطها على مذبذب دوامة ، واحتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع التحريك المستمر.
  10. أضف 4 مل من الإيثانول واخلطه باستخدام دوامة. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق.
  11. صب المادة الطافية ، أضف 2 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ متبوعا ب 6 مل من 50٪ IMS ، واخلطها باستخدام دوامة وجهاز طرد مركزي.
  12. اسكب المادة الطافية بحذر واقلب الأنبوب لتصريف أي سائل زائد. ضع الأنابيب في حمام جليدي ، وأضف 2 مل من 2 M KOH إلى كل أنبوب ، وحرك العينات لمدة 20 دقيقة لإعادة تعليق الكتلة وإذابة النشا المقاوم.
  13. أضف 8 مل من محلول أسيتات الصوديوم 1.2 M (درجة الحموضة 3.8) إلى كل أنبوب اختبار واخلطه باستخدام محرك مغناطيسي.
  14. أدخل على الفور 0.1 مل من AMG (3300 وحدة / مل) ، واخلطها جيدا ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في حمام مائي عند 50 درجة مئوية مع الخلط المتقطع باستخدام دوامة. ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق.
  15. انقل 0.1 مل من المادة الطافية إلى أنبوب زجاجي ، وأضف 3 مل من كاشف الجلوكوز أوكسيديز / بيروكسيداز (GOPOD) واحتضانه عند 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بإعداد كاشف فارغ عن طريق خلط 0.1 مل من 100 ملي مولار من أسيتات الصوديوم و 3 مل من كاشف GOPOD. قم بإعداد المعايير عن طريق خلط 0.1 مل من D-glucose مع 3 مل من كاشف GOPOD.
  16. قم بتعبئة 200 ميكرولتر من كل محلول فارغ بعناية، والمحلول المراد اختباره، والمحلول القياسي في لوح سعة 96 بئرا.
  17. قم بقياس امتصاص كل عينة عند 510 نانومتر مقابل المحلول الفارغ واحسب محتوى النشا المقاوم باستخدام الصيغة المقدمة.
    النشا المقاوم (جم / 100 جم) = ΔA × F / W ×9.27
    حيث ΔA = الامتصاص يقرأ مقابل الكاشف الفارغ. F = التحويل من الامتصاص إلى ميكروغرام (يتم تحديد الامتصاص الذي تم الحصول عليه ل 100 ميكروغرام من D-glucose في تفاعل GOPOD) ؛ W = الوزن الجاف للعينة التي تم تحليلها.

6. استجابة جلوكوز الدم بعد الأكل (التوقيت 5 أيام)

  1. استخدم معايير الاشتمال التالية للمشاركين: البالغون الصينيون الآسيويون الأصحاء الذين تتراوح أعمارهم بين 18 و60 عاما، وغير المدخنين، ومؤشر كتلة الجسم (BMI) بين 18.5 و25 كغ/م2، وضغط الدم الطبيعي (< 140/90 ملم زئبق). استخدم معايير الاستبعاد التالية: أمراض التمثيل الغذائي (مثل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم وما إلى ذلك) أو اضطرابات الجهاز الهضمي أو تشوهات الغدد الصماء أو الأمراض العقلية. تم فحص ما مجموعه 10 مشاركين وتجنيدهم.
  2. إجراء جلسة الاختبار (تمتد ليومين متتاليين)
    1. اليوم 0 (يوم التحضير): اطلب من المشاركين الحفاظ على أنماط نوم منتظمة ونظام غذائي طبيعي لأول 3 أيام تسبق الاختبار. في الليلة التي تسبق الاختبار (بعد الساعة 20:00) ، اطلب من المشاركين الامتناع عن الوجبات الغنية بالألياف والسكر. لا ينصح بممارسة التمارين الرياضية القوية في صباح اليوم الأول.
    2. اليوم 1 (يوم الاختبار): تحضير الأرز الأبيض عن طريق طحن بذور الأرز ، ثم اشطف الأرز الأبيض 2x. املأ قدرا ب 1.5 جزء من الماء إلى جزء واحد من الأرز الأبيض. اسلقي الأرز حتى يمتص الماء بالكامل. أطفئي النار وغطي القدر واتركيه يرتاح لمدة 10 دقائق.
    3. قم بتعيين المشاركين العشرة عشوائيا إلى مجموعتين متساويتين: مجموعة اختبار واحدة ليتم إطعامها بالأرز الأبيض المقاوم للنشا ومجموعة ضابطة واحدة ليتم إطعامها بالأرز الأبيض X134. اطلب من المشاركين الراحة لمدة 10 دقائق قبل بدء الاختبار.
    4. تعقيم أطراف الأصابع بالكحول الطبي بنسبة 75٪. اضغط برفق على جهاز إبرة الوخز على طرف الإصبع وحرر الزنبرك لوخز الجلد. اضغط برفق على الإصبع لإنتاج قطرة دم صغيرة ولمس هذه القطرة إلى الطرف الممتص للدم من شريط الاختبار في جهاز القياس. يقوم جهاز القياس تلقائيا بسحب الدم ويبدأ عملية الاختبار. انتظر حتى تظهر قراءة جلوكوز الدم.
    5. استهلاك الأرز وأخذ عينات الدم: قدم للمشاركين 50 جراما من الأرز المحضر مع 200 مل من الماء واطلب منهم تناوله بوتيرة مريحة في غضون 5-10 دقائق. بعد الوجبة ، اجمع عينات الدم الوريدية في النقاط الزمنية التالية: 15 دقيقة و 30 دقيقة و 60 دقيقة و 90 دقيقة و 120 دقيقة من بداية الوجبة. قم بإجراء تحليل جلوكوز الدم كما في الخطوة 6.2.4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، تم عرض الإجراءات الكاملة لتربية الأرز الوظيفي عن طريق تحرير الجينوم للحصول على أصناف مستقرة من أرز النشا المقاومة. قمنا بدمج sgRNA الذي يستهدف SBEIIb في CRISPR / Cas-SF01 (الشكل التكميلي 1) ، وتسلل الأرز باستخدام تحويل Agrobacterium ، وحصلنا على نباتات توليد E0 بعد مراحل الغربلة والتجذير. تم فحص النباتات التي تفقد وظيفة الجينات ، وتم تحديد محتواها من النشا المقاوم بعد حصاد البذور (الشكل 1). تم العثور على طفرات متماثلة اللواقح (20.8٪) في نبا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في عملية إنشاء نواقل ضربة قاضية قائمة على CRISPR / Cas-SF01 ، يعد الاختيار الدقيق للحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA) أمرا محوريا. هذا يستلزم اعتماد التسلسلات التي تظهر كفاءة تحرير عالية مع الحد الأدنى من التأثيرات غير المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك ، يشتمل توليف البادئات المستهدفة على مواقع لصق المحول القصير المطابقة للمتجه ، مما يضمن التكامل السلس. والجدير بالذكر أنه على عكس المنهجيات السابقة التي تتطلب الهضم الأنزيمي المتسلسل وتنقية الهلام والربط ، فإن دراستنا تبسط العملية من خلال ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بتمويل من مشاريع التربية البيولوجية الكبرى (2023ZD04074).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2 × Taq Plus Master Mix IIVazyme Biotech Co.، LtdP213  ؛ الكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) للجينات
2،4-ثنائي كلورو فينوكسي أسيتيك (2،4-D) حمض SolutioPhyto TechnologyD309
AAM متوسطشاندونغ توبو بيول الهندسة المحدودةM9051C
BsaI-HFنيو إنجلاند biolabsR3535BSA I هضم إنزيم ناقل التحرير
المضادات الحيوية CarbenicillinApplygenAPC8250-5الاختيار  متوسطة ، وسط تجديد
حمض الكازامينوسومBBI-Life SciencesCorporationA603060-0500وسط تحريض الكالس ، وسط الزراعة المشتركة ، وسط الاختيار ، وسط التجديد
DH5 & alpha ؛ المختصة كيميائيا خليةWeidi التكنولوجيا الحيوية المحدودةDL1001E. القولونية < / em> الخلايا المختصة
D-SorbitolBBI-Life SciencesCorporationA610491-0500
EDTA ، ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي الهيدراتالماسA100105-0500CTAB عازلة
EHA105 خلية مختصة كيميائياWeidi Biotechnology Co.، Ltd.AC1010Agrobacterium < / em> الخلايا المختصة
FastPure Plasmid Mini KitVazyme Biotech Co.، LtdREC01-100البلازميد المعزولة
المضادات الحيوية HygromycinYeasen60224ESوسط الزراعة المشتركة ، وسط الاختيار ، وسط التجديد ووسط الجذر
المضادات الحيوية KanamycinYeasen60206ES10اختيار agrobacterium
KOHMacklinP766798CTAB buffer
L-GlutaminePhyto TechnologyG229وسط تحريض الكالس ، وسط الزراعة المشتركة ، وسط الاختيار ، وسط التجديد
L-ProlinePhyto TechnologyP698وسط تحريض الكالس ، وسط الزراعة المشتركة ، وسط الاختيار ، وسط التجديد
بذور الأرز الجاف Mautre (Xiushui134)-أصناف Japonica ل تربية RS الأرز
مطحنة الأرز الميكانيكيMARUMASUMHR1500Aلإنتاج الأرز الأبيض
Murashige SkoogPhyto TechnologyM519وسط الجذر ، وسط
التجديد Myo-inositolPhyto TechnologyI703التجديد المتوسط
NaClMacklinS805275For  YEP media
NB Basal MediumPhyto TechnologyN492وسط تحريض الكالس ، وسط الزراعة المشتركة ، وسط الاختيار ، وسط التجديد
Peptone   ؛SolarbioLA8800من أجل   YEP وسائل الإعلام
Phytogelشنغهاي yuanye Bio-Technology Co., LtdS24793
Pot   ؛شركة مجموعة ميدياMB-5E86لطهي ثلاجة الأرز
HaierBCD-170تخزين مجموعة
فحص النشا المقاومةالمتوسطة MegazymeK-RSTARقياس وتحليل النشا المقاوم
للمضادات الحيوية RifampicinSigmaR3501-250MGاختيار agrobacterium
محلول هيبوكلوريت الصوديومMacklinS817439لتعقيم البذور
السكروزشنغهاي yuanye Bio-Technology Co.، LtdB21647وسط تحريض الكالس ، وسط الزراعة المشتركة ، وسط الاختيار ، وسط التجديد
T4 DNA LigaseNew England biolabsM0202الانضمام إلى sgRNA إلى ناقل CEISPRY / Cas-SF01
جهاز مراقبة الجلوكوزالمعدات الطبية و توريد المحدودةXuetang 582الكشف عن نسبة الجلوكوز في الدم
Tris-HCLMacklinT766494CTAB buffer
الخميرة AgarSolarbioLA1370ل   YEP media
YEPmedia -زراعة Agrobacterium

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, X., Huang, S., Han, B., Li, J. The integrated genomics of crop domestication and breeding. Cell. 185 (15), 2828-2839 (2022).
  2. Labroo, M. R., Studer, A. J., Rutkoski, J. E. Heterosis and hybrid crop breeding: A multidisciplinary review. Front Genet. 12, 643761(2021).
  3. Khalil, A. M. The genome editing revolution: review. J Genet Eng Biotechnol. 18 (1), 68(2020).
  4. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  5. Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., Lundgren, M. The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. Biochimie. 117, 119-128 (2015).
  6. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Curr Opin Biotechnol. 32, 76-84 (2015).
  7. Koonin, E. V., Makarova, K. S. Mobile Genetic Elements and evolution of CRISPR-Cas systems: All the way there and back. Genome Biol Evol. 9 (10), 2812-2825 (2017).
  8. Zhang, Y., et al. Analysis of the functions of TaGW2 homoeologs in wheat grain weight and protein content traits. Plant J. 94 (5), 857-866 (2018).
  9. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Comm. 7, 13274(2016).
  10. Li, Z., et al. Cas9-guide RNA directed genome editing in Soybean. Plant Physio. 169 (2), 960-970 (2015).
  11. Li, M., et al. Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system. Front Plant Sci. 7, 377(2016).
  12. Karlson, C. K. S., Mohd-Noor, S. N., Nolte, N., Tan, B. C. CRISPR/dCas9-based systems: Mechanisms and applications in plant sciences. Plants. 10 (10), 2055(2021).
  13. Hua, K., et al. Perspectives on the application of genome-editing technologies in crop breeding. Mol Plant. 12 (8), 1047-1059 (2019).
  14. Tsakirpaloglou, N., Septiningsih, E. M., Thomson, M. J. Guidelines for performing CRISPR/Cas9 genome editing for gene validation and trait improvement in crops. Plants. 12 (20), 3564(2023).
  15. Jeon, J. S., Ryoo, N., Hahn, T. R., Walia, H., Nakamura, Y. Starch biosynthesis in cereal endosperm. Plant Physio Biochem. 48 (6), 383-392 (2010).
  16. Crofts, N., et al. Amylopectin biosynthetic enzymes from developing rice seed form enzymatically active protein complexes. J Exp Bot. 66 (15), 4469-4482 (2015).
  17. Butardo, V. M., et al. Impact of down-regulation of starch branching enzyme IIb in rice by artificial microRNA- and hairpin RNA-mediated RNA silencing. J Exp Bot. 62 (14), 4927-4941 (2011).
  18. Baysal, C., et al. Inactivation of rice starch branching enzyme IIb triggers broad and unexpected changes in metabolism by transcriptional reprogramming. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (42), 26503-26512 (2020).
  19. Keenan, M. J., et al. Role of resistant starch in improving gut health, adiposity, and insulin resistance. Adv Nutr. 6 (2), 198-205 (2015).
  20. Shen, L., Li, J., Li, Y. Resistant starch formation in rice: Genetic regulation and beyond. Plant Comm. 3 (3), 100329(2022).
  21. Duan, Z., et al. An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants. Innovation (Camb). 5 (2), 100564(2024).
  22. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinform. 13, 134(2012).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  24. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Meth Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  25. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nat Protoc. 1 (6), 2796-2802 (2006).
  26. Aboul-Maaty, N. A. F., Oraby, H. A. S. Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method. Bull Natl Res Cent. 43, 25(2019).
  27. Li, P., et al. Genes and their molecular functions determining seed structure, components, and quality of rice. Rice. 15 (1), 18(2022).
  28. Huang, X., et al. Structural basis for two metal-ion catalysis of DNA cleavage by Cas12i2. Nat Commun. 11 (1), 5241(2020).
  29. Lv, P., et al. Genome editing in rice using CRISPR/Cas12i3. Plant Biotechnol J. 22 (2), 379-385 (2024).
  30. Čermák, T., et al. A Multipurpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants. Plant Cell. 29 (6), 1196-1217 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SBE2b

مقالات ذات صلة