مقالة منهجية

إنشاء نماذج الطعم الغريب المشتق من تقويم العظام لأورام المخ باستخدام جهاز تجسيمي

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67349

⸱

مايو 2, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Cancer Institute Australia, Lowy Cancer Research Centre, UNSW Sydney, 2School of Clinical Medicine, Faculty of Medicine & Health, UNSW Sydney, 3Kid's Cancer Centre, Sydney Children's Hospital

في هذه المقالة

ملخص

يتطلب تطوير نماذج أورام الدماغ لدى الأطفال دقة دقيقة ، باستخدام جهاز تجسيمي لزرع الخلايا السرطانية بدقة. توضح المنهجية المعروضة هنا الخطوات المتبعة في تحضير خلايا ورم المخ ، وإجراء الحقن داخل الجمجمة ، وتنفيذ نظام مراقبة ما بعد الجراحة لتقييم نقش ورم الدماغ.

الملخص

كان تطوير نماذج ذات صلة سريريا وموثوقة لأورام الجهاز العصبي المركزي (CNS) محوريا في النهوض بمجال الأورام العصبية. واحدة من أكثر التقنيات استخداما هي الحقن داخل الجمجمة ، وهي طريقة تسمح بالتحقيق في نمو الورم وغزوه وانتشاره داخل بيئة خاضعة للرقابة. تتضمن هذه التقنية زرع الخلايا السرطانية من منطقة معينة للمريض في الموقع التشريحي المقابل في. من خلال القيام بذلك ، تقدم نماذج أورام الدماغ التقويمية هذه ميزة فريدة ، لأنها تكرر بشكل أكثر دقة السلوك البيولوجي للسرطان وتفاعلاته مع بيئة الدماغ التي تظهر في المرضى من البشر. هذا يجعلها ذات قيمة خاصة للاختبارات العلاجية قبل السريرية ، حيث يكون التشابه الوثيق مع السيناريو السريري ضروريا لتقييم العلاجات المحتملة. يشارك هذا البروتوكول الخبرات في تطوير نماذج الطعم الغريب المشتق من المريض (PDX) لأورام الدماغ لدى الأطفال ، بما في ذلك الورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG) ، والورم الأرومي الدبقي (GBM) ، والورم الأرومي النخاعي ، والورم البطاني العصبي. تحدد هذه الطريقة إجراء إجراء الحقن التجسيمية داخل الجمجمة في الفئران ، مما يضمن الاستهداف الصحيح لموقع الحقن داخل الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، نصف نظام المراقبة اللاحقة للإجراءات المستخدم للكشف عن علامات نقش الورم الناجح. بعد حقن الورم ، يتم تنفيذ نظام مراقبة صارم لمراقبة بحثا عن أي علامات للضعف العصبي و / أو التغيرات السلوكية و / أو فقدان الوزن ، وهي مؤشرات شائعة لتطور الورم. يسمح هذا النظام بالتدخل في الوقت المناسب ويوفر بيانات مهمة فيما يتعلق بديناميكيات نمو الورم. من خلال تحسين هذه النماذج والبروتوكولات ، نهدف إلى تعزيز الموثوقية والإمكانيات الانتقالية للدراسات قبل السريرية ، مما يساهم في تطوير علاجات أكثر فعالية لأورام الجهاز العصبي المركزي للأطفال.

المقدمة

أورام الجهاز العصبي المركزي لدى الأطفال (CNS) هي أكثر الأورام الصلبة شيوعا عند الأطفال ، وتشكل حوالي 20٪ -25٪ من أورام الأطفال الأولية ، مع خصائص مميزة عن أورام البالغين من حيث الحدوث والاستجابة للعلاج1،2. الأورام الدبقية عالية الدرجة (HGGs) ، مثل الورم الأرومي الدبقي (GBM) والورم الدبقي الجسري الجوهري المنتشر / الورم الدبقي المنتشر (DIPG / DMG) ، عدوانية بشكل خاص ، مع تكهنات كئيبة ، وعلى الرغم من التقدم في طرق العلاج ، تظل معدلات البقاء على قيد الحياة منخفضة3،4،5. حققت الأورام الأرومية النخاعية ، التي تمثل ما يقرب من 20٪ من أورام الجهاز العصبي المركزي لدى الأطفال ، معدل بقاء مرتفعا لمدة 5 سنوات مع العلاج القياسي ، ومع ذلك فإن بعض الأنواع الفرعية تشكل تحديات ، خاصة في سيناريوهات الانتكاس6،7. تظهر الأورام البطانية ، التي تشكل حوالي 10٪ من أورام الجهاز العصبي المركزي لدى الأطفال ، تكهنات متنوعة اعتمادا على الخصائص الجزيئية وموقع الورم ، مع تكرار الظهور الذي يشكل تحديات سريرية كبيرة8،9. إن فهم المشهد الجزيئي وتطوير نماذج أورام الدماغ التقويمية (BT) يبشر بتطوير علاجات فعالة لتحسين النتائج لمرضى الأطفال.

يعد تطوير نماذج BT ذات الصلة سريريا أمرا حيويا لتطوير أبحاث الأورام العصبية والاكتشاف العلاجي. تعتبر الحقن التقويمية باستخدام جهاز تجسيمي محورية في هذا النهج ، لأنها تسمح بوضع الخلايا السرطانية بدقة داخل الدماغ ، وتحاكي عن كثب البيئة الطبيعية لأورام المخ10. تعزز هذه الطريقة موثوقية وقابلية استنساخ نماذج الورم ، مما يسهل إجراء دراسات أكثر دقة لبيولوجيا الورم والخصائص الرئيسية مثل الغزو وتكوين الأوعية الدموية ، بالإضافة إلى تقييم التدخلات العلاجية11. تضمن قدرة الجهاز التجسيمي على التحكم في الموقع الدقيق وعمق حقن الخلايا أن يتم وضع الخلايا السرطانية باستمرار في مناطق الدماغ المقصودة ، وبالتالي تحسين صحة النتائج التجريبية10. توفر النماذج تحت الجلد خيارا أكثر سهولة وفعالية من حيث التكلفة للفحص الأولي للعوامل العلاجية. في هذه النماذج ، يتم زرع الخلايا السرطانية تحت الجلد ، مما يتيح المراقبة المباشرة لنمو الورم واستجابات العلاج12. على الرغم من أنها تفتقر إلى القدرة على تكرار البيئة المكروية المعقدة للدماغ ، إلا أن النماذج تحت الجلد تظل ذات قيمة عالية لفحص الأدوية عالية الإنتاجية وتقييمات الفعالية الأولية12،13.

أظهرت دراسات متعددة التطوير الناجح لنماذج الطعم الطبيعي المشتق من المريض (PDXs) من عينات أورام المخ ، بما في ذلك زرع الأنسجة مباشرة من عينات تشريح الجثة أو الخزعة ومزارع أورام المخ الأولية11،14،15. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان الاعتراف بأن الحقن داخل الجمجمة للأنسجة المنفصلة عن الورم أو الخلايا السرطانية لا يضمن دائما النقش ، مع عدم فهم أسباب الفشلتماما 15. ومن المثير للاهتمام أن عينات خزعة HGG تميل إلى إظهار معدل نجاح أعلى مقارنة بالأنواع الفرعية الأخرى من أورام الدماغ. على سبيل المثال ، He et al. أظهر معدل نجاح بنسبة 56٪ لنماذج تقويم العظام HGG ، في حين أن الدراسة التي أجراها Brabetz et al. أبلغت عن معدلات نقش أقل ، مثل 43٪ و 30٪ ، على التوالي ، لعينات أورام الدماغ الأخرى لدى الأطفال مثل الورم البطاني العصبي والورم الأرومي النخاعي11،14،16. والجدير بالذكر أن نماذج PDX لورم الدماغ تعرض مجموعة واسعة من فترات الكمون ، تتراوح من شهر واحد إلى 11 شهرا ، مع ظهور النقش اللاحق تناقص فائدة ما قبل السريرية. على الرغم من قدرتها على تلخيص المرض على المستوى الجزيئي ، فقد لوحظت بعض التفاوتات الجينومية بين الخزعات والنماذج الراسخة14،16.

تعمل نماذج PDX كأدوات لا غنى عنها في البحث عن استراتيجيات علاجية جديدة ضد BTs للأطفال. تعتبر المعيار الذهبي لإجراء دراسات فعالية الأدوية حيث تلخص النماذج بأمانة المرض البشري من حيث نمو الورم وأعراضه والحركية الدوائية للأدوية بسبب وجود الحاجز الدموي الدماغي (BBB). أثبتت الأبحاث في مجال الورم الدبقي في جذع الدماغ لدى الأطفال أن الحفاظ على سلامة BBB وعدم اختراق الدواء هي سمة تؤدي إلى تناقص الفعالية العلاجية لهذه الأورام17،18،19. ومع ذلك ، يمكن ملاحظة الفعالية في العلاجات المختارة التي تظهر تغلغل الدواء بشكل كاف ، مثل مثبطات التمثيل الغذائي والتمثيل الغذائي17،20.

تقدم هذه الدراسة طريقة لإجراء الحقن داخل الجمجمة لخلايا ورم المخ في التي تعاني من نقص المناعة ، تهدف إلى تقييم النقش إما لتطوير PDX و / أو تقييم فعالية الدواء العلاجي. كما يتم توفير أدوات شاملة لمراقبة تطور الورم حتى الوصول إلى نقطة النهاية التجريبية الأخلاقية.

البروتوكول

يتبع البروتوكول الموضح أدناه الإرشادات الأخلاقية لرعاية واستخدامها على النحو المبين من قبل جامعة نيو ساوث ويلز ، وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها. تم إعطاء الأولوية لرعاية ، وتم بذل كل الجهود لتقليل معاناة المستخدمة أثناء إجراء الحقن داخل الجمجمة.

1. زراعة توسيع ثقافات أورام الدماغ المكونة للغلاف العصبي

ملاحظة: قد تختلف المتطلبات المحددة بناء على مزارع الدماغ المستخدمة. تحدد الخطوات التالية بروتوكولا عاما للزراعة لخلايا أورام الدماغ الأولية كمجالات عصبية. يمكن الحصول على مزارع أورام الدماغ من البائعين التجاريين أو إنشاؤها كثقافات أولية من خزعات أو تشريح أورام الدماغ للمريض. تم توضيح إجراء إنشاء الثقافات الأولية من عينات خزعة المريض أو تشريح الجثة في الأدبيات المنشورة15 ، 21.

  1. ضع قارورة المرق المحفوظة بالتبريد في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تذوب المحتويات. امسح الأسطح الخارجية للقارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول لضمان العقم.
  2. تحضير وسائط الغلاف العصبي لخلايا ورم الدماغ الأولية كما هو موضح في Mayoh et al.21. في خزانة السلامة البيولوجية (BSC)، استخدم ماصة معقمة سعة 1 مل لنقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسائط الغلاف العصبي الدافئة مسبقا.
  3. الطرد المركزي الأنبوب المخروطي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق لتكوير الخلايا. تخلص بعناية من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل قدر الإمكان.
  4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل أو 25 مل من وسائط الغلاف العصبي. ضع تعليق الخلية في قارورة T25 أو T75 ، اعتمادا على رقم الخلية المتوقع من الحفظ بالتبريد. عادة ، يتم وضع خلايا البداية بكثافة 5 × 105 خلايا في قارورة T25.
  5. ضع القارورة في حاضنة على درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. تبادل الوسائط مع الوسائط الجديدة 1x أو 2x في الأسبوع. بدلا من ذلك ، قم بتعبئة عوامل النمو و B27 حسب الحاجة ، بناء على معدل نمو الخلايا.
  6. بمجرد تكوين المجالات العصبية في قارورة T25 ، يمكن توسيعها في قوارير T75. انقل محتويات قارورة T25 بماصة سعة 10 مل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. راقب المجالات العصبية تحت المجهر الضوئي ، وبمجرد أن تنمو بشكل كبير بما فيه الكفاية (حوالي 500 ميكرومتر) ، قد تكون مرئية أيضا بالعين المجردة.
  7. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 3-5 دقائق. استنشق الوسط فوق حبيبات الخلية, ترك ما يقرب من 1 مل في الأنبوب.
  8. قم بتحريك الخلايا برفق لأعلى ولأسفل 12x-15x باستخدام ماصة سعة 1 مل لفصل حبيبات الخلية. استخدم مصفاة خلوية (40 ميكرومتر) لفصل المجالات العصبية إلى خليط من خلية واحدة.
  9. ضع المصفاة في الجزء العلوي من أنبوب مخروطي سعة 50 مل وأضف كرويات منفصلة مع ماصة 10 مل على المصفاة. ستمرر معظم الخلايا المفردة الشبكة إلى الأنبوب ، وستبقى المواد المتكتلة على الشبكة.
  10. عد الخلايا التي تحتوي على غرفة عد الخلايا. قم بتقييم صلاحية الخلية عن طريق خلط كمية متساوية من تعليق الخلية (على سبيل المثال ، 5 ميكرولتر) مع Trypan Blue (5 ميكرولتر). ستظهر الخلايا الميتة باللون الأزرق تحت المجهر الضوئي ، بينما ستبقى الخلايا الحية غير ملوثة.
  11. احسب كثافة الخلية على النحو التالي:
    تركيز الخلية = متوسط عدد الخلايا لكل شبكة × عامل التخفيف / حجم شبكة واحدة (مل). حجم الشبكة من غرفة عد الخلايا القياسية هو 0.0001 مل.
  12. لتمرير الخلايا ، أعد تعليق 1 × 106 خلايا في 25 مل من الوسائط الطازجة الدافئة في قارورة T75. بمجرد وضع الخلايا في قارورة T75 ، قم باحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ CO2 حتى تنمو المجالات العصبية.
  13. للحفاظ على خلايا ورم الدماغ بالتبريد، أعد تعليق 1 × 106 خلايا في 1 مل من محلول الحفظ بالتبريد وضعها طوال الليل في حاوية تجميد ذات معدل متحكم فيه وتخزينها عند -80 درجة مئوية. ضع المخزونات المحفوظة بالتبريد في خزان نيتروجين سائل -180 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
    ملاحظة: يتكون وسط الحفظ بالتبريد من 90٪ مصل عجل الجنين و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).

2. تحضير خلايا ورم المخ للحقن داخل الجمجمة

ملاحظة: بينما يحدد البروتوكول التالي تحضير الخلايا المستنبتة من الثقافات الراسخة أو قصيرة المدى للحقن داخل الجمجمة ، يمكن أيضا تكييفه مع أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الأنسجة المنفصلة حديثا من أورام الدماغ البشرية22،23.

  1. في خزانة السلامة الحيوية ، انقل الخلايا ووسط الثقافة بعناية من قارورة زراعة الأنسجة باستخدام ماصة مصلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  2. جهاز الطرد المركزي للأنبوب المخروطي عند 300 × جم لمدة تصل إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بالشفط باستخدام ماصة 25 مل في الوسط فوق الحبيبات ، تاركا ما يقرب من 0.5 مل في الأنبوب.
  3. قم بتحريك الخلايا برفق لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة سعة 1 مل لفصل حبيبات الخلية. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق ومقياس كثافة الكريات.
  4. بمجرد أن يتم نقل عدد الخلايا المطلوب في أنبوب جديد ، اغسل 2x باستخدام PBS عن طريق تعليق الخلايا وتكويرها عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن تحديد عدد الخلايا كما هو موضح. على سبيل المثال ، إذا احتاجت 10 إلى الحقن بكثافة خلية تبلغ 200,000 خلية ، فإن الحد الأدنى لعدد الخلايا المطلوبة هو 2 × 106.
  5. أثناء الغسيل النهائي ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS. ضع بحبيبات الخلية برفق و 50 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية (ECM) هيدروجيل على الجليد.
    ملاحظة: يمكن تقسيم هيدروجيل ECM مسبقا إلى أجزاء سعة 50 ميكرولتر على الجليد باستخدام ماصات مبردة بدرجة حرارة 4 درجات مئوية وتخزينها عند -80 درجة مئوية لحين الحاجة. يمكن الاحتفاظ بالهيدروجيل ECM مؤقتا على الجليد لإذابة الجليد ببطء للاستخدام التجريبي اللاحق.
  6. امزج حبيبات الخلية مع هيدروجيل ECM للحقن ، بهدف إكمال هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن قبل بدء الحقن داخل الجمجمة. كإجراء قياسي ، استخدم 2 ميكرولتر من المعلق الذي يحتوي على 200,000 خلية معلقة في هيدروجيل ECM.
    ملاحظة: إذا استغرقت الحقن داخل الجمجمة أكثر من 2-3 ساعات ، فيجب تحضير مخزون جديد من الخلايا ، لأن الحضانة المطولة على الجليد قد تقلل من صلاحية الخلايا. من الممكن حقن ما يصل إلى 1،000،000 خلية داخل الجمجمة وبأحجام تصل إلى 10 ميكرولتر ؛ ومع ذلك ، سيتطلب ذلك إعادة تعليق الخلايا في PBS بدلا من هيدروجيل ECM وإضافتها بمعدل حقن بطيء للغاية.

3. إعداد معدات التخدير والتخدير

ملاحظة: قد يختلف الإجراء المذكور أدناه قليلا اعتمادا على الشركة المصنعة للمعدات التجسيمية ونوع التخدير المفضل.

  1. ابدأ تشغيل BSC عن طريق تعقيم سطحه أولا بمنظف بولي سوربات 20 وتركه لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، امسح السطح بنسبة 80٪ من الإيثانول. قبل وضعها داخل غطاء محرك BSC ، امسح كل قطعة من المعدات بنسبة 80٪ من الإيثانول (تجنب ترطيب أي مدخلات كهربائية).
  2. ضع لوحة القاعدة داخل غطاء محرك BSC وفقا للشكل 1 ، مع وضع مخروط الأنف على الجانب الأيمن (للمستخدمين الذين يستخدمون اليد اليمنى). تأكد من أن معالجات XYZ مثبتة بالفعل على لوحة القاعدة ومؤمنة.
  3. قم بتوصيل وحدة التحكم في العرض الرقمي بالمدخل الموجود في الجزء الخلفي من لوحة القاعدة وقم بتوصيل كابل الطاقة الخاص به بمصدر الطاقة المتوفر داخل غطاء محرك BSC (انظر الشكل 1). تسجل وحدة التحكم هذه إحداثيات حركات مناور XYZ.
  4. قم بتأمين علبة فلتر الكربون (لإخراج التخدير) ومدخلات التخدير إلى الصمامين الموجودين على قطعة الأنف القابلة للفصل. حرك قطعة الأنف المخروطية على قسم التثبيت وشد المسمار على الجهاز التجسيمي.
  5. قم بتوصيل قضبان الأذن بحاملاتها على كل جانب من جوانب قسم التثبيت ، وقم بتثبيتها في مكانها عن طريق شد البراغي المثبتة على الحوامل. يمكن تغطية قضبان الأذن بوسادات شاش أو شريط كهربائي.
  6. أدخل السرير الجراحي في الجهاز ، واضبط ارتفاعه ليتماشى مع قضبان الأذن ، والتي تثبت في موضعه. لف السرير الجراحي بوسادة قياس للحفاظ على دفء.
  7. قم بتوصيل وسادة التدفئة بمصدر الطاقة وضعها أسفل للحفاظ على الدفء أثناء إجراء التخدير.
  8. داخل غطاء محرك BSC، قم بترتيب أطراف قطنية معقمة، وأطراف ماصة سعة 20 ميكرولتر، ومرهم للعين، ومناديل الأيزوبروبانول المعبأة بشكل فردي، وغراء جراحي، وماصة سعة 20 ميكرولتر. بلل وسادة شاش بنسبة 80٪ من الإيثانول ووضع ملقط معقم ومشرط فوقها.
  9. قم بتنظيف المحقنة الدقيقة الزجاجية عن طريق غسلها 5 مرات في الإيثانول البارد بنسبة 80٪ وبالتالي في محلول ملحي بارد بنسبة 0.9٪.
  10. لأغراض الحفر ، قم بتوصيل محرك الحفر بمصدر الطاقة وقم بتركيب المثقاب على مناور XYZ ، مما يضمن ملاءمة آمنة عن طريق تثبيته بإحكام.
  11. استبدل مكون الحفر بحامل الحقنة الدقيقة الزجاجية لأغراض حقن الخلايا. قم بإزالة المثقاب عن طريق فك المسمار الموجود على مناور XYZ واستبداله بحامل المحقنة. تأكد من شد المسمار قبل محاذاة المحقنة الزجاجية مع الفتحة المحفورة مسبقا.
  12. بعد استخدام الجهاز التجسيمي ، قم بتفكيك جميع المكونات وتعقيمها بنسبة 80٪ من الإيثانول قبل تخزينها في صندوق تخزين نظيف أو خزانة خالية من الغبار. تخلص من جميع الأدوات الحادة بأمان وبشكل مناسب في حاوية أدوات حادة مخصصة.

4. الحقن داخل الجمجمة

ملاحظة: يمكن إجراء الحقن داخل الجمجمة في كل من الفئران من الذكور والإناث ، على الرغم من تفضيل إناث الفئران بشكل عام ، لأنها أقل عرضة لمضاعفات الجروح الناجمة عن العدوان بين الذكور. يتم تنفيذ الإجراء عادة في الفئران التي تتراوح أعمارها بين 7-10 أسابيع ، مما يتيح وقتا كافيا لتطور الورم. عادة ، يتم تقسيم بشكل عشوائي في مجموعات من 4-6 لكل قفص. تستخدم السلالات التي تعاني من نقص المناعة مثل BALB / c Nude و NOD-SCID و NSG بشكل شائع لتطوير الطعم الغريب المشتق من المريض (PDX) ، حيث تدعم حالة نقص المناعة نقش الورمونموه 24. بينما يحدد هذا البروتوكول استخدام الأيزوفلوران لتحريض التخدير ، يمكن أيضا استخدام التخدير البديل مثل الكيتامين والزيلازين25. إذا لم يتم استخدام الأيزوفلوران ، فيمكن حذف الخطوات التي تنطوي على غرفة التخدير والمعدات ذات الصلة من الإجراء.

  1. قم بوزن ومراقبة الرفاهية العامة للحيوانات قبل الإجراء داخل الجمجمة. يتم إعطاء مسكن للحيوانات قفصا واحدا في كل مرة (على سبيل المثال ، بوبرينورفين 0.05 مجم / كجم ، داخل الصفاق) لمدة تصل إلى ساعة واحدة قبل البدء في الحقن داخل الجمجمة.
  2. قم بإعداد معدات التخدير وفقا للإرشادات المقدمة مع الأداة. قبل البدء في الإجراء ، تأكد من أن المرذاذ ممتلئ في منتصف الطريق على الأقل. تأكد من أن إمداد الأكسجين مفتوح.
  3. إذا كان لدى فراء ، فيمكن إزالته في اليوم السابق للإجراء داخل الجمجمة أو في وقت واحد. قم بإزالة الفراء من موقع الجراحة في جمجمة الظهر أو الفأر باستخدام مقص كهربائي أو ماكينة حلاقة.
  4. انقل إلى غرفة تحريض التخدير. تأكد من ضبط مقياس التدفق في جهاز التخدير على معدل تدفق 1 لتر / دقيقة ، وأن منظم الأكسجين بين 40-50 رطل لكل بوصة مربعة. تأكد من الحفاظ على التخدير المتوسط عن طريق التحقق من استرخاء العضلات وغياب ردود الفعل.
  5. راقب استجابة للمنبهات وراقب حركة جدار الصدر لضمان التنفس الثابت. إذا تجاوزت الحقن داخل الجمجمة 10 دقائق، راقب درجة الحرارة باستخدام مسبار المستقيم ونظام مراقبة درجة الحرارة وتتبع النبض باستخدام مقياس التأكسج النبضي
  6. قم بتركيب على الجهاز التجسيمي ، مما يضمن تثبيت الأسنان الأمامية في شريط الشق وأن مخروط الأنف قد ثبت في مكانه.
  7. قم بتطهير رأس الفأر برأس قطني مبلل باليود ثم منديل من الأيزوبروبانول. ضع مرهم عين القرنية على كلتا العينين لمنع الجفاف أثناء الجراحة.
  8. ابدأ الشق في قاعدة المخيخ وقم بتمديده عبر الجمجمة إلى نقطة المنتصف ، مما يجعل قطعا صغيرا يبلغ طوله حوالي 1 سم على طول الجانب العلوي من الجمجمة.
  9. شد الجلد بين الأذنين لكشف الجمجمة وتأمين الرأس عن طريق شد قضبان الأذن. نظف سطح الجمجمة وجففه بقطعة قطن.
  10. قم بتثبيت المثقاب على الإطار التجسيمي وحدد موقع البريجما (أو الهيكل اللامدويد) باستخدام المثقاب.
    ملاحظة: يتم تحديد إحداثيات تجسيمية محددة بناء على المنطقة التشريحية المطلوبة لدراسة النقش. يمكن الحصول على هذه الإحداثيات الدقيقة من الأدبيات المنشورة أو تحديدها باستخدام موارد مثل Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates26 atlas ، مما يضمن استهداف دقيق للزرع الناجح.
  11. بمجرد تحديد الإحداثيات ، استخدم مثقابا لإنشاء ثقب صغير في العظم بعناية في الموقع المخصص للورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG): X = +0.5 ، Y = -5.5 ، Z = -3.1 من bregma. ورم الدماغ فوق الوتر (GBM أو ورم البطانة العصبية): X = +1.5 ، Y = +1 ، Z = -3 من الورم البطاني ؛ ورم الدماغ تحت الوتر (الورم الأرومي النخاعي ، الورم البطاني العصبي): X = +2 ، Y = - 2 ، Z = -2 من بنية lambdoid.
  12. أعد تعليق الخلايا عدة مرات باستخدام ماصة مع تجنب فقاعات الهواء. ارسم 2 ميكرولتر من خليط الخلية في حقنة زجاجية باردة مغسولة مسبقا. قم بتوصيل المحقنة بالإطار التجسيمي واضبط الإبرة على طرف الجمجمة.
  13. حقن الخلايا في غضون 30 ثانية في المنطقة المحفورة ، وتجفيف أي تعليق خلوي متردد أثناء الحقن.
    ملاحظة: نظرا لأن الخلايا معلقة في هيدروجيل ECM ، يجب أن يحدث الحقن بالسرعة الكافية حتى لا يتجمد تعليق الخلية في المحقنة. يمكن استخدام كثافات الخلايا المتفاوتة لتقييم معدلات النقش المختلفة ، حيث تؤدي كثافة الخلايا الأعلى بشكل عام إلى نقش الورم بشكل أسرع.
  14. اترك المحقنة في مكانها لمدة 1 دقيقة لتجنب التدفق العكسي والسماح للهيدروجيل ECM بالاستقرار. قم بإزالة المحقنة وامسح الجرح بمنديل الأيزوبروبانول. استخدم غراء الجلد أو مشابك الجرح لإغلاق الشق إذا لزم الأمر.
  15. ضع في وضع الاستلقاء في قفص استرداد نظيف مع مصباح حراري أو على وسادة تدفئة للتدفئة حتى الشفاء. راقب باستمرار حتى يبدأ في التحرك من تلقاء نفسه وبشكل متكرر بعد ذلك حتى يظهر سلوكا طبيعيا.
  16. إذا وجد أن قد أعيد فتح جرح مغلق مسبقا أثناء الشفاء ، فقم بتخدير مرة أخرى ، ونظف الجرح بمنديل من الأيزوبروبانول لإزالة أي غراء متبقي ، ثم أعد تثبيته بالدبابيس.

5. مراقبة ما بعد الجراحة للنقش

  1. بعد الحقن داخل الجمجمة ، ابدأ في مراقبة الفئران 5 أيام في الأسبوع (أو أكثر إذا لزم الأمر). توفير الرعاية اللاحقة، مثل البذور أو الطعام الطري، خلال الأسبوعين الأولين بعد الحقن داخل الجمجمة. راقب بعناية بحثا عن أي فتحة محتملة للجرح.
    ملاحظة: إذا تم قص جروحها في إناث ، فإنها تظل في صندوق القمامة ، لأنها نادرا ما تظهر عدوانية. بالنسبة للحيوانات الذكور ، نقدم اثنين من الأكواخ الثلجية في القفص جنبا إلى جنب مع إثراء إضافي للمساعدة في تقليل العدوان. في الحالات النادرة التي يحدث فيها العدوان ويؤدي إلى إعادة فتح الجروح ، يتم إعادة تثبيت الجروح بدبابيس ، ويتم إزالة المعتدي من المجموعة وإيوائه بشكل منفصل.
  2. سجل معلمات الرفاهية العامة مثل فقدان الوزن ومستوى النشاط والموقف وعلامات الجفاف وحالة الفراء في ورقة المراقبة.
  3. سجل على ورقة المراقبة الأعراض العصبية المتقطعة أو الخفيفة أو الشديدة مثل إمالة الرأس و / أو الرنح و / أو السلوك الدائري.
  4. تحديد الأعراض العصبية على النحو التالي:
    1. لاحظ وصنف ما يلي على أنه أعراض متقطعة: إمالة الرأس: لوحظ 1-2 مرات خلال فحص مدته 5 دقائق ، والرفاهية العامة مرضية. الرنح: لوحظ 1-2 مرات خلال فحص لمدة 5 دقائق ؛ الرفاهية العامة مرضية. الدوران: لوحظ 1-2 مرات خلال فحص لمدة 5 دقائق ؛ الرفاهية العامة مرضية. السلوك: تظهر الفئران سلوكا طبيعيا وقادرة على الوصول إلى الطعام / الماء والتسلق.
    2. لاحظ وصنف ما يلي على أنه أعراض خفيفة: إمالة الرأس: يتم عرضه بانتظام أثناء فحص مدته 5 دقائق ، والرفاهية العامة مرضية. الرنح: يتم عرضه بانتظام أثناء فحص مدته 5 دقائق ، والرفاهية العامة مرضية. الدائرة: يتم عرضها بانتظام أثناء فحص مدته 5 دقائق ، والرفاهية العامة مرضية. السلوك: قد يكون للفئران معطف مكشكش أو جلد جاف ولكن لا يزال بإمكانه إظهار سلوك طبيعي ، والتغذية ، والتسلق.
    3. لاحظ وصنف ما يلي على أنه أعراض شديدة: إمالة الرأس: يتم عرضه باستمرار أثناء الفحص ، إمالة 90 درجة تقريبا ، معطف مكشكش ، أقل نشاطا. الرنح: يتم عرضه باستمرار أثناء الفحص ، وحركات في حالة سكر ، ومعطف مكشكش ، وأقل نشاطا. الدائرة: يتم عرضها باستمرار أثناء التفتيش ، معطف مكشكش ، أقل نشاطا. السلوك: قد يكون للفئران معطف مكشكش للغاية أو جلد جاف. قد تظهر فقدان الوزن بأكثر من 15٪. زود بالبذور أو الطعام الطري في هذه المرحلة.
  5. حدد نقطة النهاية الإنسانية للفئران عندما تظهر أيا من العلامات السريرية التالية التي تشير إلى نمو الورم الذي يؤثر على صحتها: فقدان الوزن بنسبة 20٪ أو أكثر من وزنها الأولي ، أو إمالة الرأس الشديدة ، أو الرنح الشديد ، أو الدوران الشديد ، أو الخمول ، أو صعوبة التنفس. في هذه المرحلة ، قم بالقتل الرحيم للفئران بشكل إنساني باستخدام اختناق ثاني أكسيد الكربون2 .

6. حصاد الأدمغة

  1. تأكد من القتل الرحيم للحيوان بشكل إنساني إما عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون2 أو خلع عنق الرحم.
  2. قم بعمل شق خط الوسط بطول 2 سم على طول فروة الرأس باستخدام مقص أو مشرط. افصل الجلد بعناية وقشره لكشف الجمجمة.
  3. باستخدام مقص ناعم أو مشرط ، قم بعمل شق دقيق بطول 2 سم على طول خط الوسط للجمجمة. افتح الجمجمة برفق باستخدام ملقط ، واعمل من مؤخرة الرأس باتجاه الأنف.
  4. استمر في القطع على جانبي الجمجمة ، مع ضمان عدم تلف أنسجة المخ تحتها. بمجرد فتح الجمجمة بالكامل ، افصل الدماغ بعناية عن الأعصاب القحفية والأوعية الدموية باستخدام الملقط والمقص.
  5. ارفع الدماغ برفق من تجويف الجمجمة ، بدءا من الخلف والتقدم للأمام. قم بتخزين الدماغ في ظل ظروف مناسبة بناء على متطلبات الإجراءات التجريبية اللاحقة ، مثل التجميد المفاجئ أو التثبيت. قد يختلف التحليل الكيميائي المناعي للأدمغة بين المختبرات المختلفة. تم وصف سير العمل النموذجي لعلامة الخلية التكاثرية KI67 في الأدبياتالمنشورة 20.

النتائج

أصبحت الحقن تقويم العظام باستخدام جهاز تجسيمي ضرورية لتطوير نماذج أورام الدماغ. تسمح هذه التقنية بوضع الخلايا السرطانية بدقة وقابلة للتكرار ، وهو أمر بالغ الأهمية لتوليد بيانات متسقة وموثوقة في أبحاث الأورام العصبية. يعتمد التنفيذ الناجح لحقن تقويم العظام بشكل كبير على الإعداد الدقيق للمعدات التجسيمية ، والتي تتضمن عادة إطارا مجسما ، ومعالجا دقيقا رقميا للحركات الدقيقة ، وحقنة حقن ، ونظام تخدير لشل حركة (الشكل 1 أ ، ب). يتيح استخدام المحقنة الدقيقة الزجاجية الحقن داخل الجمجمة لكميات صغيرة ، عادة ما بين 2-5 ميكرولتر. الصيانة المناسبة والغسيل المتكرر ضروريان لمنع تراكم المواد البيولوجية ، والتي يمكن أن تمنع الحقن (الشكل 1 ج).

يتضمن إجراء الحقن داخل الجمجمة لخلايا ورم الدماغ باستخدام معدات التجسيم في الفئران عدة خطوات رئيسية. أولا ، يتم تخدير الفأر ليظل ثابتا ومريحا طوال العملية. تشمل الإشارات النموذجية التي تشير إلى أن مخدر غياب الحركة وردود الفعل عند قرص أصابع القدم ، بالإضافة إلى وجود نمط تنفس منتظم. بعد ذلك ، يتم وضع الماوس في إطار تجسيمي ، وتأمين رأسه في وضع ثابت (الشكل 2 أ). باستخدام المعالم الموجودة على الجمجمة ، مثل بريغما ولاجدا ، يتم تحديد إحداثيات دقيقة للحقن. يتم إجراء شق صغير في فروة الرأس ، ويتم حفر ثقب لدغ من خلال الجمجمة عند الإحداثيات المختارة (الشكل 2 ب). يتم إدخال إبرة حقن مجهرية متصلة بالذراع التجسيمية من خلال فتحة الأزيز لتوصيل الخلايا السرطانية إلى منطقة الدماغ المرغوبة (القشرة أو المخيخ أو جذع الدماغ. الشكل 2 ج). تضمن المراقبة الدقيقة وتعديل موضع الإبرة الاستهداف الدقيق. بعد الحقن ، يتم سحب الإبرة ببطء ، ويتم إغلاق الشق (الشكل 2 د). من المتوقع أن يلتئم الجرح المغلق في غضون أسبوعين بعد الحقن داخل الجمجمة.

بعد الحقن داخل الجمجمة ، تتطلب مراقبة دقيقة للرفاهية العامة وتطور الأعراض العصبية ، والتي غالبا ما تشير إلى تطور الورم (الجدول التكميلي 1). عادة, قد تواجه فقدان طفيف في الوزن خلال الأسبوع الأول بعد الحقن (ما يصل إلى 10٪ من أعلى وزن), الذي عادة ما يستقر بمجرد إغلاق مواقع الحقن بالكامل بنهايةالأسبوع الثاني . بشكل عام ، تظهر زيادة مطردة في الوزن وتحافظ على صحة عامة جيدة حتى يحدث تطور الورم. يختلف مظهر الأعراض العصبية اعتمادا على عوامل مثل نوع ورم المخ وموقع الحقن وإجهاد. على سبيل المثال ، قد تظهر الأورام الدبقية القشرية أو الأورام البطانية العصبية مع فقدان الوزن التدريجي وتضخم محتمل في الدماغ الأمامي ، بينما قد تظهر على الأورام الدبقية في جذع الدماغ والأورام الأرومية النخاعية أعراض مثل الرنح وإمالة الرأس ، خاصة في التي تعاني من نقص المناعة (الشكل 3 أ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ملاحظة السلوك الدائري في المصابة بأورام جذع الدماغ ، خاصة في سلالات NSG أو NOD / SCID. غالبا ما يتزامن تطور الأعراض العصبية مع فقدان الوزن التدريجي. تعتبر تدابير ما بعد الرعاية المناسبة ، مثل تزويد زجاجات المياه بفوهات طويلة أو تقديم طعام طري (كريات طعام طرية) أو بذور ، ضرورية لدعم رفاهية. عند الوصول إلى نقطة النهاية التجريبية والقتل الرحيم الإنساني اللاحق للحيوانات ، قد تظهر التغيرات المحتملة في الدماغ ، بما في ذلك التضخم في موقع الحقن و / أو وجود مناطق نزفية (الشكل 3 ب).

تستخدم الرسوم البيانية كابلان ماير بشكل شائع لتصوير نتائج البقاء على قيد الحياة لنماذج أورام الدماغ. أنها توفر تصويرا مرئيا لاحتمال البقاء على قيد الحياة بمرور الوقت بعد الحقن داخل الجمجمة أو العلاجات المضادة للسرطان. تعمل هذه الرسوم البيانية كأدوات مهمة لتحليل وتقديم بيانات البقاء على قيد الحياة في إعدادات البحث قبل السريري15،27. أجرينا حقنا داخل الجمجمة لثقافة خلايا الورم الأرومي النخاعي D425 بكثافات خلاوية متفاوتة في المخيخ. جميع حقن داخل الجمجمة الأورام المتطورة. أشارت نتائجنا إلى أن كثافة الخلايا الأعلى ، وتحديدا 50,000 و 100,000 خلية لكل فأر ، تم تطعيمها بسرعة أكبر من 10,000 خلية لكل فأر (الشكل 4). علاوة على ذلك ، قمنا بحقن خلايا الورم الدبقي عالي الدرجة (HGG) المشتقة من المريض داخل الجمجمة في القشرة وجذع الدماغ لمقارنة البقاء على قيد الحياة بشكل عام ونمط نمو الورم ، بالإضافة إلى السمات الكيميائية المناعية ، في هذه المواقع المختلفة. بغض النظر عن الموقع ، تم حقن جميع بأورام متقدمة داخل الجمجمة. تم استزراع خلايا HGG باتباع البروتوكول المفصل في الخطوات من 1.1 إلى 1.10. تم إجراء تحضير الخلايا للحقن داخل الجمجمة كما هو موضح في الخطوات من 2.1 إلى 2.6 ، بينما التزم إجراء الحقن داخل الجمجمة بالطريقة الموضحة في الخطوات 4.1 إلى 4.1627. عند حقنها في القشرة ، أظهرت خلايا HGG متوسط بقاء على قيد الحياة لمدة 25 يوما تقريبا بعد الحقن داخل الجمجمة (الشكل 5 أ). تمت مراقبة كما هو موضح في الخطوات من 5.1 إلى 5.4. لم تظهر على هذه أي أعراض عصبية ولكنها أظهرت فقدانا تدريجيا في الوزن. تم القتل الرحيم للحيوانات بشكل إنساني عند الوصول إلى نقطة النهاية الإنسانية الموضحة في الخطوة 5.5. تم حصاد الأدمغة باتباع البروتوكول المفصل في الخطوات 6.1 إلى 6.5 وإرسالها لمزيد من التحليل27. كشف التحليل الكيميائي المناعي عن كتلة ورم كبيرة عالية النواة مع دليل على زيادة الأوعية الدموية (الشكل 5 ب) والعديد من خلايا Ki67 التكاثرية (الشكل 5 ج). عند حقنها في جذع الدماغ ، أظهرت خلايا HGG متوسط بقاء على قيد الحياة يبلغ حوالي 26 يوما بعد الحقن داخل الجمجمة (الشكل 5 د). أشار التحليل الكيميائي المناعي إلى وجود كتلة ورمية كبيرة في منطقة البطين الرابع / الجسر العلوي ، بالإضافة إلى تسلل السحائية البريمية إلى البطين الجانبي (الشكل 5 ه). أشار المزيد من التحليل الكيميائي المناعي إلى العديد من الخلايا التكاثرية في جذع الدماغ والمناطق الأخرى المتسللة (الشكل 5F). تسلط هذه التجربة الضوء على أن حقن نفس الخلايا السرطانية في مواقع تشريحية مختلفة لا يؤثر على معدل نمو الورم ، على الرغم من ملاحظة بعض الاختلافات في نمط النمو.

figure-results-1
الشكل 1: صور تمثيلية للإعداد التجسيمي للحقن داخل الجمجمة لخلايا ورم الدماغ. (أ) عادة ما يتم وضع جهاز التخدير بجوار غطاء محرك BSC ، مما يستلزم إعطاء التخدير المزدوج لكل من غرفة الحث والجهاز التجسيمي. (ب) محطة غسيل الحقن المجهرية الزجاجية وحامل الفراغ؛ تتطلب المحقنة التنظيف بالمحلول الملحي والإيثانول وبالتالي الماء بعد كل حقن داخل الجمجمة. (ج) الإعداد التجسيمي داخل غطاء محرك BSC ، يوضح غرفة التخدير ، وآلة الحفر ، والجهاز التجسيمي ، ووحدة التحكم الإحداثيات التجسيمية ، وأطراف القطن ، والمشرط ، والملاقط ، والماصة ، والأطراف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صور تمثيلية للحقن داخل الجمجمة يتم إجراؤها على فأر يعاني من نقص المناعة. (أ) مخدر يوضع في مخروط مخدر. (ب) شق الجلد متبوعا بتثبيت الجلد على كل جانب بقضبان الأذن. (ج) حقنة زجاجية دقيقة موضوعة فوق الفتحة المحفورة للحقن. (د) يشكل الجلد نمط الموهوك بمجرد لصقه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الأعراض العصبية المحتملة التي لوحظت بعد نقش خلايا ورم الدماغ. (أ) يظهر إمالة الرأس بعد الحقن داخل الجمجمة لخلايا DMG في جذع الدماغ. (ب) تضخم نصف الكرة القشري الأيمن مع جانب الحقن الذي يكشف عن تكوين الورم. تم حقن بخلايا ورم البطانة العصبية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: نقش ثقافة الورم الأرومي النخاعي D425 بكثافات خلايا مختلفة. تم حقن خلايا الورم الأرومي النخاعي داخل الجمجمة باستخدام معدات تجسيمية بكثافة 10,000 خلية في 2 ميكرولتر من هيدروجيل ECM و 50,000 خلية و 100,000 خلية. تمت مراقبة لفقدان الوزن التدريجي وتم القتل الرحيم بشكل إنساني بمجرد وصولها إلى 20٪ أقل من أعلى وزن مسجل. كان متوسط البقاء على قيد الحياة للحيوانات التي تم حقنها ب 10,000 خلية 29 يوما ، في حين كان متوسط البقاء على قيد الحياة لأولئك الذين حقنون بكثافة خلايا أعلى من 50,000 و 100,000 خلية 17.5 يوما و 15 يوما على التوالي. نجحت جميع التي تم حقنها في هذه الدراسة في تطوير الأورام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: منحنيات البقاء التمثيلية والتحليل النسيجي لحيوانات NSG المحقونة داخل الجمجمة بخلايا HGG في القشرة وجذع الدماغ. تم حقن ما يقرب من 100,000 خلية HGG (الممر 3) في 2 ميكرولتر من هيدروجيل ECM باستخدام معدات تجسيمية. تمت مراقبة لفقدان الوزن التدريجي والقتل الرحيم بشكل إنساني بمجرد وصولها إلى 20٪ أقل من أعلى وزن مسجل. لم يتم ملاحظة أي أعراض عصبية لهذا النوع الفرعي من ورم الدماغ. (أ) يبلغ متوسط بقاء التي تحتوي على خلايا HGG المحقونة في القشرة حوالي 25 يوما بعد الحقن (N = 2). (ب) يظهر تلطيخ H & E للقشرة منطقة عالية النواة مع زيادة الأوعية الدموية ، ويشار إليها بوجود خلايا الدم الحمراء. (ج) تعرض المنطقة المطعمة بالورم في القشرة مستوى عال من الخلايا التكاثرية ، كما هو موضح في تلطيخ KI67. (د) متوسط بقاء التي تحتوي على خلايا HGG المحقونة في جذع الدماغ هو حوالي 26 يوما بعد الحقن (N = 2). نجحت جميع التي تم حقنها في هذه الدراسة في تطوير الأورام. (ه) يظهر تلطيخ H & E لجذع الدماغ منطقة شديدة النواة مع تسلل الورم لوحظ في البريميات السحائية في البطين الجانبي. (F) تعرض المنطقة المطعمة بالورم في جذع الدماغ مستوى عال من الخلايا التكاثرية ، كما هو موضح في تلطيخ KI67. يشير شريط المقياس الأسود في الصور الرئيسية إلى 2 مم ، بينما تشير الصور المكبرة المدرجة إلى 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي 1: نموذج المراقبة المستخدم لفحص الحقن بعد الجمجمة للحيوانات والعلاج المحتمل بالعوامل المضادة للسرطان. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

المناقشة

في حين أن تقنية الحقن داخل الجمجمة المفصلة في هذه الدراسة توفر طريقة قوية لإنشاء نماذج الطعم الطبيعي المشتق من المريض (PDX) لأورام الدماغ لدى الأطفال ، فإن العديد من المجالات تحتاج إلى تحسين. تتضمن إحدى طرق تحسين هذه التقنية تحسين عملية تحضير الخلايا السرطانية. وهذا يشمل تكرير المواد المستخدمة في زرع الخلايا السرطانية. بينما يعتبر هيدروجيل ECM هو المعيار الذهبي ، فإن استخدام الهلاميات المائية المكونة من مكونات تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في الدماغ أو الورم يمكن أن يعزز بقاء خلايا BT ونقشها. يفيد هذا النهج بشكل خاص أنواع الأورام ذات فترات النقش الأطول ، مثل الأورام الأرومية النخاعية والأورام البطانية العصبية. على سبيل المثال ، ثبت أن الكولاجين يلعب دورا مهما في نمو الورم الأرومي النخاعي من المجموعة 3 ، بينما يدعم اللامينين نوع SHH من الورم الأرومي النخاعي28. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤثر تصلب ECM أيضا على نمو الورم. تظهر الأورام الأرومية الدبقية عالية الدرجة ، على سبيل المثال ، تصلبا أعلى في قلبها مقارنة بأنسجة المخ الطبيعية ، مما قد يدعم نمو الورم والبقاء على قيد الحياة29. من خلال تصميم تركيبة ECM وصلابتها لتتناسب مع المتطلبات المحددة لأنواع الأورام المختلفة ، يمكن تحسين نقش ونمو نماذج PDX بشكل كبير.

قدمت بعض الدراسات الحديثة رؤى قيمة حول التعامل مع عينة الورم للمريض وتطوير نماذج PDX. تسليط الضوء على أن الزرع المباشر لأنسجة DMG يؤدي عادة إلى معدلات نقش أعلى من الثقافات الأولية15. أنشأ سميث وآخرون 37 نموذجا PDX من خلال الحقن داخل الجمجمة لخزعات أورام المخ أو عينات تشريح الجثة ، حيث أبلغوا عن معدل نجاح إجمالي قدره 43٪ ، حيث أظهرت HGGs أعلى معدل نقش (100٪) ، تليها الأورام الأرومية النخاعية (45٪) والأورام البطانية العصبية (25٪). تباين زمن انتقال الورم على نطاق واسع ، من 1 إلى 11 شهرا ، مع تطعيم الأورام الأكثر عدوانية بسرعةأكبر 11. في المقابل ، أبلغ Brabetz et al. عن معدل نجاح إجمالي أقل بنسبة 30٪ ، حيث أظهرت HGGs معدل نقش 31٪ ومعدلات أقل للأورام الأرومية النخاعية (37٪) والأورام البطانية العصبية (17٪) 16. على الرغم من هذه الاختلافات ، أكدت الدراستان الأخيرتان اللتان أجراهما Smith et al. و Brabetz et al. أن نماذج PDX تلخص بشكل عام أورام المريض على المستويات الكيميائية المناعية والجزيئية ، على الرغم من ملاحظة تناقضات جينومية طفيفة بين عينات الورم الأصلية والنماذج المعمول بها. تؤكد هذه النتائج على التحديات في تطوير نماذج PDX التمثيلية وتسلط الضوء على التباين في نجاح النقش عبر أنواع الأورام11،16.

أحد القيود المهمة لنهج تقويم العظام هو عدم القدرة على قياس حجم الورم بدقة ما لم يتم استخدام نظام تصوير ، مثل تصوير Xenogen ، إذا تم تمييز الخلايا السرطانية باستخدام لوسيفيراز أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). يمكن أن يوفر وضع علامات على الخلايا السرطانية باستخدام لوسيفيراز حلا من خلال السماح بالتصوير الحيوي لتأكيد النقش ومراقبة تطور الورم بشكل غير جراحي. ستعزز هذه الطريقة القدرة على تتبع الاستجابة للعلاج ديناميكيا ، وبالتالي تقديم تقييم أكثر دقة للفعالية العلاجية17،30. تتضمن الطريقة البديلة استخدام تقنية التصوير بالرنين المغناطيسي. ومع ذلك ، فإن قابلية اكتشاف الأورام تتوقف على حجمها. يتم تحديد الأورام الأكبر بسهولة أكبر ، والتي غالبا ما تكون في نقطة النهاية التجريبية ، وقد يختلف الكشف أيضا اعتمادا على النوع الفرعي للورم ، حيث يتم اكتشاف GBM بسهولة أكبر من الأورام الدبقيةالمنتشرة 27،31. خاصة بالنسبة للأورام الدبقية المنتشرة ، يؤدي وجود حاجز دموي دماغي سليم (BBB) إلى نقص تحسين التباين. ومع ذلك ، في GBM ، يمكن أن يؤدي تسرب الأوعية الدموية ووجود الوذمة إلى تضخيم التباين بين أنسجة الورم وأنسجة المخ السليمة المحيطة ، مما قد يساعد في عملية الكشف. بشكل عام ، هناك حاجة إلى عوامل متناقضة لتحسين الكشف30،31،32. تستخدم تقنيات التصوير البديلة مثل التصوير المرجح بالانتشار (DWI) والتعافي من الانعكاس الموهن بالسوائل (FLAIR) أحيانا لتحسين اكتشاف مناطق الورم غير المعززة. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها أيضا حدودها وقد لا توفر دائما تحديدا دقيقا لحدودالورم 33. تصوير أميد بروتون الموزون (APTw) هو تقنية تصوير بالرنين المغناطيسي غير الغازية تكتشف الأورام الدبقية المنتشرة عن طريق تتبع تبادل البروتون بين البروتين والماء ، مما يساعد في تصنيف الورم. على الرغم من أنها واعدة ، إلا أنها تواجه تحديات مثل القابلية للتأثر بالقطع الأثرية ولم يتم تكييفها بعد لتصوير الصغيرة ، مما يحد من تطبيقها الأوسع34.

جانب آخر حاسم يجب مراعاته عند استخدام نماذج BT PDX لتقويم العظام لدراسات فعالية الأدوية هو سلامة BBB في نماذج PDX المستخدمة. تؤثر نفاذية BBB بشكل كبير على توصيل الدواء وفعاليته في علاج أورام الدماغ. على سبيل المثال ، غالبا ما يؤدي الحفاظ على سلامة BBB في الأورام الدبقية في جذع الدماغ إلى ضعف اختراق الدواء ، مما يحد من فعالية العلاجات الجهازية17. من ناحية أخرى ، في الورم الأرومي النخاعي من المجموعة 3 ، لوحظ أن سلامة BBB غير متجانسة في تصوير التصوير بالرنين المغناطيسي ، وبالمثل وجد أنه متسرب في نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX)35. لذلك ، فإن توصيف حالة BBB - سواء كانت سليمة أو متسربة - في كل نموذج PDX أمر ضروري لتصميم استراتيجيات علاجية مناسبة وتفسير نتائج دراسات فعالية الدواء بدقة.

بشكل عام ، يوفر إجراء الحقن داخل الجمجمة الموضح نهجا قويا لإنشاء نماذج BT PDX وإجراء دراسات الفعالية للعوامل العلاجية. ستؤدي التحسينات المستمرة ، إلى جانب الفهم الشامل لهذه النماذج ، إلى زيادة فائدتها وتسهيل تطوير التدخلات العلاجية لمرضى BT الأطفال.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون المرضى والأطباء والباحثين في شبكة مستشفيات سيدني للأطفال ، وشبكة بنك أورام الأطفال في سيدني ، وبرنامج القضاء على سرطان الطفولة على توفير العينات الأساسية بسخاء لإنشاء هذه المنهجية. معهد سرطان الأطفال في أستراليا تابع لجامعة نيو ساوث ويلز سيدني وشبكة مستشفيات سيدني للأطفال. ينبع هذا البروتوكول من الجهود البحثية المدعومة بمنح من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (منحة التآزر # 2019056 ، منحة القيادة APP2017898 إلى DZ) ومنحة برنامج معهد السرطان في نيو ساوث ويلز (TPG2037 إلى DZ و MT) ، بالإضافة إلى الدعم من مشروع Levi's ، ومشروع سرطان الأطفال ، والعلاج يبدأ الآن ، و DIPG التعاوني ، مؤسسة كيور لسرطان الدماغ ومؤسسة روبرت كونور دوز ومؤسسة بيني ويلز.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
عامل مخدر (مثل الأيزوفلوران)ميرك792632
100٪ إيثانولميرك459844
70٪ إيثانولNANAاصنع 70٪ إيثانول من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وتخفيفه بالماء المعقم
80٪ إيثانولNANAاصنع 80٪ إيثانول من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وتخفيفه بالماء المعقم
شرائح مجهر لاصقةميركZ681156
مسكن (بوبرينورفين 0.3 مجم / مل)جوروكسNA
علبة فلتر الكربونتجهيز الطبيب البيطري931401
أنابيب مخروطية 15 مل (صقر)فيشر العلمية14-959-53 أ
أنابيب مخروطية 50 مل (صقر)فيشر العلمية14-432-22
DMSOميرك472301
قضبان الأذنكوبف1921
هيدروجيل ECM (ماتريجيل ، كورنينج)ميركإ1270
مرهم العين (بولي فيسك)ChemistDirect 719986
مصل العجل الجنينيميركإف 0926
حقنة زجاجية صغيرةهاملتون7002
مناديل الأيزوبروبانولميديساSUL_LWMS-1
الجسم المضاد KI67أبكامأب209897
أنابيب الطرد المركزي الدقيقإيبندورف211-2130
مثقاب دقيق   ؛ 0.028 بوصةكوبف8170
وحدة الحقن المجهريكوبف5004
برنامج تلفزيونيميركص 4474
ماصة 10 ملكورنينجCLS4488
ماصة 1 مل   ؛إيبندورف3123000063
ماصة 200 ميكرولترإيبندورف3123000055
ماصة 20 ميكرولترإيبندورف3123000098
ماصة 25 ملكورنينجCLS4489
طرف ماصة 1 ملكورنينجCLS4868
طرف ماصة 200 ميكرولتركورنينجCLS4860
منظف بولي سوربات 20 (F10SC)الصحة والنظافةجي 3070
مقياس التأكسج النبضي (MouseSTAT)كينت العلميةSPO2-MSE
الريودين (بوفيدون اليود)ميركY0000466
مشرط (يمكن التخلص منه)ميديساSUL_SCALPEL
غراء الجلد Vetbondميديسا3M_1469SB
أداة تجسيمية للحيوانات الصغيرة مع وحدة عرض رقمية   ؛كوبف940
الحفر التجسيمي  كوبف1474
نظام مراقبة درجة الحرارة   ؛جهاز هارفارد55-7020
تريبان بلوميرك93595

المراجع

  1. Mueller, S., Chang, S. Pediatric brain tumors: current treatment strategies and future therapeutic approaches. Neurotherapeutics. 6 (3), 570-586 (2009).
  2. Packer, R. J. Brain tumors in children. Arch Neurol. 56 (4), 421-425 (1999).
  3. Paugh, B. S., et al. Integrated molecular genetic profiling of pediatric high-grade gliomas reveals key differences with the adult disease. J Clin Oncol. 28 (18), 3061-3068 (2010).
  4. MacDonald, T. J., Aguilera, D., Kramm, C. M. Treatment of high-grade glioma in children and adolescents. Neuro Oncol. 13 (10), 1049-1058 (2011).
  5. Rutka, J. T. Malignant brain tumours in children : Present and future perspectives. J Korean Neurosurg Soc. 61 (3), 402-406 (2018).
  6. Cho, Y. J., et al. Integrative genomic analysis of medulloblastoma identifies a molecular subgroup that drives poor clinical outcome. J Clin Oncol. 29 (11), 1424-1430 (2011).
  7. Thomas, A., Noel, G. Medulloblastoma: optimizing care with a multidisciplinary approach. J Multidiscip Healthc. 12, 335-347 (2019).
  8. Pajtler, K. W., et al. Molecular classification of ependymal tumors across all CNS compartments, histopathological grades, and age groups. Cancer Cell. 27 (5), 728-743 (2015).
  9. Thorp, N., Gandola, L. Management of ependymoma in children, adolescents and young adults. Clin Oncol. 31 (3), 162-170 (2019).
  10. Upton, D. H., Ziegler, D. S., Tsoli, M. Development of orthotopic patient-derived xenograft models of pediatric intracranial tumors. Methods Mol Biol. 2806, 75-90 (2024).
  11. Smith, K. S., et al. Patient-derived orthotopic xenografts of pediatric brain tumors: a St. Jude resource. Acta Neuropathol. 140 (2), 209-225 (2020).
  12. Akter, F., et al. Pre-clinical tumor models of primary brain tumors: Challenges and opportunities. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1875 (1), 188458(2021).
  13. Stribbling, S. M., Ryan, A. J. The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research. Nat Protoc. 17 (9), 2108-2128 (2022).
  14. He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nat Commun. 12 (1), 4089(2021).
  15. Tsoli, M., et al. International experience in the development of patient-derived xenograft models of diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. 141 (2), 253-263 (2019).
  16. Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nat Med. 24 (11), 1752-1761 (2018).
  17. Khan, A., et al. Dual targeting of polyamine synthesis and uptake in diffuse intrinsic pontine gliomas. Nat Commun. 12 (1), 971(2021).
  18. Chen, Y., et al. Preclinical evaluation of protein synthesis inhibitor omacetaxine in pediatric brainstem gliomas. Neurooncol Adv. 6 (1), vdae029(2024).
  19. Ung, C., et al. Doxorubicin-loaded gold nanoarchitectures as a therapeutic strategy against diffuse intrinsic pontine glioma. Cancers (Basel). 13 (6), 1278(2021).
  20. Ehteda, A., et al. Dual targeting of the epigenome via FACT complex and histone deacetylase is a potent treatment strategy for DIPG. Cell Rep. 35 (2), 108994(2021).
  21. Mayoh, C., et al. High-throughput drug screening of primary tumor cells identifies therapeutic strategies for treating children with high-risk cancer. Cancer Res. 83 (16), 2716-2732 (2023).
  22. Lin, G. L., Monje, M. A Protocol for rapid post-mortem cell culture of diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). J Vis Exp. (121), e55360(2017).
  23. Whitehouse, J. P., et al. In vivo loss of tumorigenicity in a patient-derived orthotopic xenograft mouse model of ependymoma. Front Oncol. 13, 1123492(2023).
  24. Hermans, E., Hulleman, E. Patient-derived orthotopic xenograft models of pediatric brain tumors: In a mature phase or still in its infancy. Front Oncol. 9, 1418(2019).
  25. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4 (11), 1670-1680 (2009).
  26. Paxinos, G., Franklin, K. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 5th edn, Academic Press. (2019).
  27. Tsoli, M., et al. Integration of genomics, high throughput drug screening, and personalized xenograft models as a novel precision medicine paradigm for high risk pediatric cancer. Cancer Biol Ther. 19 (12), 1078-1087 (2018).
  28. Yang, H., et al. Roles and interactions of tumor microenvironment components in medulloblastoma with implications for novel therapeutics. Genes Chromosomes Cancer. 63 (4), e23233(2024).
  29. Kondapaneni, R. V., et al. Glioblastoma mechanobiology at multiple length scales. Biomater Adv. 160, 213860(2024).
  30. Mahmoudian, E., Jahani-Asl, A. Establishing brain tumor stem cell culture from patient brain tumors and imaging analysis of patient-derived xenografts. Methods Mol Biol. 2736, 177-192 (2024).
  31. Oudin, A., Moreno-Sanchez, P. M., Baus, V., Niclou, S. P., Golebiewska, A. Magnetic resonance imaging-guided intracranial resection of glioblastoma tumors in patient-derived orthotopic xenografts leads to clinically relevant tumor recurrence. BMC Cancer. 24 (1), 3(2024).
  32. Bauer, S., Wiest, R., Nolte, L. P., Reyes, M. A survey of MRI-based medical image analysis for brain tumor studies. Phys Med Biol. 58 (13), R97-R129 (2013).
  33. Lasocki, A., Gaillard, F. Non-contrast-enhancing tumor: A new frontier in glioblastoma research. AJNR Am J Neuroradiol. 40 (5), 758-765 (2019).
  34. Nichelli, L., Zaiss, M., Casagranda, S. APT weighted imaging in diffuse gliomas. BJR Open. 5 (1), 20230025(2023).
  35. Genovesi, L. A., et al. Patient-derived orthotopic xenograft models of medulloblastoma lack a functional blood-brain barrier. Neuro Oncol. 23 (5), 732-742 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ورم دماغي في الموقع الأصليحقن داخل القحفورم دماغي لدى الأطفالدبقية خطية منتشرةالحاجز الدموي الدماغيتطعيم الورمزراعة الكرات العصبيةتحليل كيميائي نسيجي مناعي
إنشاء نماذج الطعم الغريب المشتق من تقويم العظام لأورام المخ باستخدام جهاز تجسيمي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.