مقالة منهجية

تحليل النمط النووي المقارن لمجموعات أعشاب Lycoris aurea باستخدام نطاقات الفلوروكروم و 45S و 5S rDNA-FISH

DOI:

10.3791/67363

⸱

نوفمبر 29, 2024

 ,  , 
1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبحث هذا البروتوكول في توزيع الكروماتين المتغاير في ثمانية مجموعات من عشب Lycoris aurea (L′Her) ، باستخدام تلطيخ كروموسوم PI و DAPI المشترك ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) مع مناطق جين 18S-5.8-26S rRNA (مناطق 45S rDNA) ، ومجسات الحمض النووي الريبوزومي 5S.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لفهم تباين النمط النووي في ثمانية مجموعات سكانية ، تم إنشاء أنماط نواة مفصلة بدقة باستخدام قياسات الكروموسومات ونطاقات التألق وإشارات rDNA FISH. يختلف عدد مواقع 45S rDNA من أزواج إلى خمسة أزواج لكل مجموعة سكانية ، مع الرقم الأكثر شيوعا لكل نمط النووي هو أربعة أزواج. يقع موضع 45S rDNA في الغالب في الأذرع القصيرة والمناطق الطرفية للكروموسومات ، بينما يوجد موضع 5S rDNA بشكل أساسي في الذراع القصيرة والمناطق الطرفية أو القريبة. أظهر السكان HBWF و HHNXN و HBBD و HNZX توزيعا مشابها لمواقع 45S rDNA ، كما فعلت GXTL و HBFC و SCLS ، مما يشير إلى وجود علاقة وثيقة بين السكان الذين لديهم توزيعات مواقع 45S rDNA مماثلة. الأنماط النووية لجميع المجموعات السكانية المدروسة متماثلة ، وتتألف من سنتروميرات مستقرة ومستقرة أو سنتروميرات مستقرة حصريا. تميز المخططات المبعثرة ل MCA و CVCL بشكل فعال هياكلها النمطية النووية. يتضمن التحليل ستة معلمات كمية (x ، 2n ، TCL ، MCA ، CVCL ، CVCI). بالإضافة إلى ذلك ، تشير النتائج إلى أن PCoA بناء على هذه المعلمات الستة هي طريقة قوية لتحديد علاقات النمط النووي البيولوجي بين المجموعات الثمانية. رقم الكروموسوم في مجموعات Lycoris هو x = 6-8. بناء على الدراسة والأدبيات الحالية ، تمت مناقشة التمايز الجيني لهذه المجموعات من حيث حجم الجينوم ، والكروماتين المتغاير ، ومواقع 45S و 5S rDNA ، وعدم تناسق النمط النووي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lycoris هي عائلة تضم العديد من النباتات البستانية المهمة1. Lycoris aurea (L'Hér.) عشب. هو نبات طبي صيني تقليدي له تاريخ طويل. أظهر التحليل الكيميائي النباتي أن Lycoris aurea (L′Her.) عشب يحتوي على galantamine وغيرها من قلوانيات, التي يمكن أن تعزز حساسية الأستيل ولديها القدرة على علاج مرض الزهايمر كمثبطات الكولينستراز2.

في النباتات العليا ، يعد تحليل النمط النووي أمرا بالغ الأهمية لدمج الخرائط الجينية والفيزيائية ، مع آثار عملية كبيرة على بيولوجيا النبات. يسمح هذا التحليل بتوصيف الجينوم على مستوى الكروموسومات ، وتوضيح العلاقات التصنيفية الخلوية بين السكان ، وتحديد الانحرافات الجينية ، وفهم اتجاهات تطور الكروموسومات3،4،5. عادة ما يتضمن وصف النمط النووي عدد الكروموسوم ، وأطوال الكروموسومات المطلقة والنسبية ، ومواقع الانقباض الأولية والثانوية ، وتوزيع الشظايا غير المتجانسة ، وأرقام مواقع الحمض النووي ومواقعه ، وخصائص تسلسل الحمض النووي الأخرى ، بالإضافة إلى عدم تناسق النمط النووي6،7،8. من بين معلمات النمط النووي ، يتم تحديد عدم التناسق من خلال الاختلافات في طول الكروموسوم (عدم التناسق بين الكروموسومات) وموضع السنترومير (عدم التناسق داخل الكروموسومات). عدم تناسق النمط النووي هو ميزة مهمة تعكس مورفولوجيا الكروموسوم ويستخدم على نطاق واسع في تصنيف الخلاياالنباتية 9،10،11،12.

في كثير من الأحيان ، يحد عدم وجود علامات كروموسوم من تحليل النمط النووي ويعيق تحديد الكروموسومات الفردية. في السنوات الأخيرة ، أصبح تلطيخ Giemsa ، والنطاقات المضان ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) شائعا في تحليل كروموسوم النبات. تكشف طرق تلطيخ الفلورسنت المزدوج ، مثل تلطيخ CMA (كرومومايسين A3) / DAPI (4 ، 6-diamino-2-phenylindole) وتلوين PI (بروبيل يوديد) / DAPI (المعروف باسم تلطيخ CPD) ، عن مناطق غير متجانسة غنية ب GC وغنية ب AT على الكروموسومات4،13. أثناء الطور الطوري أو الباشيتين من الانقسام النباتي ، يمكن أن تولد تسلسلات الحمض النووي المتكررة أو مقاطع الحمض النووي الطويلة إشارات محددة في مجموعات النباتات من خلال تهجين الأسماك14،15،16.

توفر نطاقات الفلورسنت وإشارات FISH علامات مفيدة لتحديد الكروموسومات. من خلال قياس طول الكروموسوم ، وتحليل خصائص النطاقات الفلورية ، ومقارنة اختلافات إشارة FISH ، يمكن بناء الأنماط اللونية الوراثية الخلوية الجزيئية التفصيلية لالأصول الوراثية النباتية المختلفة أو التجمعات. تعرض هذه الأنماط النووية بشكل فعال مورفولوجيا الكروموسوم في العديد من الأصول الوراثية أو المجموعات السكانية ، مما يتيح إجراء مقارنات بين توزيع الكروماتين غير المتجانس وتوطين تسلسل الحمض النووي ويشجع على إجراء مزيد من البحث4،8،17. يمكن أن تقدم مقارنات النمط النووي الخلوي الجزيئي رؤى قيمة حول العلاقات التطورية والتطور الكروموسومي للمجموعات السكانية ذات الصلة8،14،18،19.

يشتهر جنس Lycoris ، وهي مجموعة متنوعة ومثيرة للاهتمام ضمن عائلة Amaryllis ، بمصابيحها المعمرة. يتألف من ما يقرب من 20 نوعا ، 15 منها مستوطنة في الصين ، ويعرض التنوع البيولوجي الغني. تم العثور على هذا الجنس حصريا في المناطق المعتدلة وشبه الاستوائية الدافئة في شرق آسيا ، بما في ذلك جنوب غرب الصين وجنوب كوريا واليابان ، مع عدد قليل من السكان الممتد إلى شمال الهند ونيبال20. تضمنت الدراسات الوراثية الخلوية المبكرة في المقام الأول عد الكروموسومات لتحديد عدد الكروموسوم الأساسي للجنس ووصف مورفولوجيا الكروموسوم في مجموعات سكانية محددة ، مع التركيز بشكل كبير على Lycoris radiata21. تتراوح الأعداد الإجمالية للكروموسومات التي لوحظت في هذا الجنس من 12 إلى 33 أو 44 ، تمثل مستويات ثنائي الصبغيات ، ثنائي الصبغيات غير طبيعي ، ثلاثي الصبغيات ، رباعي الصبغيات ، واختلال الصيغة الصبغية ، على التوالي. أرقام الكروموسومات الأساسية ، x ، هي 6 و 7 و 8 و 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) يتم توزيع الأعشاب ، وهي نوع بارز ضمن جنس Lycoris ، على نطاق واسع في جميع أنحاء الصين22. يزدهر في البيئات المريحة والرطبة ويتكاثر من خلال المصابيح الصغيرة. تم استخدام هذه المصابيح ، التي تحتوي على الليكورين والجالانتامين - وهما مركبان طبيان رئيسيان - في الطب الصيني التقليدي لعدة قرون. يأسر Lycoris aurea أيضا علماء البستنة بأزهاره الحمراء المدهشة في الخريف وأوراقها دائمة الخضرة في الشتاء. ومع ذلك ، فإن التشابه المورفولوجي عبر جميع موارد Lycoris aurea التي تمت دراستها (L'Hér.) تمثل مجموعات الأعشاب تحديا كبيرا لتحديد الكروموسومات باستخدام الطرق الخلوية التقليدية.

تم استخدام استنساخ FISH أو fosmid أو BAC (الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية) مع تسلسل الحمض النووي المتكرر ومجسات قليل النوكليوتيدات على الطور الطور أو الكروموسومات المخادمة لتحليل النمط النووي23،24،25 ، والتحليل الوراثي الخلويالمقارن 26،27 ، وبناء الخريطة الوراثيةالخلوية 28،29 ، والمقايسات الخاصةبالكروموسوم 30. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق تقنية FISH على تحليل الكروموسوم لمجموعات Lycoris 31. على الرغم من أن عدد الكروموسوم والنمط النووي يختلفان في مجموعات Lycoris ، إلا أن إجمالي عدد الكروموسوم يظل ثابتا ، مع ملاحظة ثلاثة أنواع أساسية: كروموسوم السنترومير المركزي المركزي (M-) ، وكروموسوم السنترومير البعيد (T-) ، وكروموسوم السنترومير القريب (A-). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت أشكال وأحجام كروموسومات متنوعة في التجمعات الطبيعية32.

يعد مضان الحمض النووي الريبي في التهجين الموضعي (FISH) مفيدا للكشف عن التغيرات الكروموسومية ، مثل اندماج السنترومير ، والانعكاس ، وتضخيم الجينات ، وحذف الشظايا. تتيح تقنية التهجين الموضعي الفلوري (RNA-FISH) تحليلا بصريا عالي الدقة للكروموسومات لاكتشاف وتحديد العديد من التغييرات المعقدة ، بما في ذلك اندماج المناطق المركزية للكروموسومات ، وتكوين هياكل كروموسومات جديدة ، وانعكاس مناطق الكروموسومات ، وتضخيم الجينات أو شظايا الجينات ، وفقدان تسلسل الجينات في مناطق كروموسومات معينة33. أظهرت خمسة من 500 نسخة إشارات FISH قوية على منطقة السنترومير لكروموسوم السنترومير المركزي (M-) ولكن ليس على كروموسوم السنترومير البعيد (T-) 34. مكن نمط توزيع إشارة FISH الفريد على كل كروموسوم من تحديد الكروموسومات الفردية ، والتي كانت تمثل تحديا سابقا في مجموعات Lycoris باستخدام طرق التلوينالتقليدية 31. حاليا ، هناك عدد قليل من الدراسات حول علم الوراثة الخلوية الجزيئي ل Lycoris aurea (L'Hér.) Herb ، مؤكدا الحاجة الملحة لمزيد من البحث في هذا المجال.

في هذه الدراسة ، ثمانية كروموسومات متطورة جيدة التمايز من Lycoris aurea (L'Hér.) تم تحضير مجموعات الأعشاب باستخدام طرق الغمر بالإنزيم والتجفيف باللهب (EMF). تم استخدام تلطيخ CPD ومجسات 45S و 5S rDNA لتحديد FISH. تم إنشاء الأنماط النووية الوراثية الخلوية الجزيئية التفصيلية لهذه المجموعات باستخدام بيانات مجمعة من قياسات الكروموسومات والنطاقات الفلورية وإشارات 45S و 5S rDNA FISH. تم حساب ستة مؤشرات مختلفة لعدم تناسق النمط النووي لكل مجموعة سكانية لتحديد العلاقات النمطية النووية فيما بينها. قدم تقييم بيانات النمط النووي الجزيئي الخلوي رؤى مهمة حول التمايز الجيني والعلاقات التطورية للمجموعات الثمانية ، مما قد يعيد تشكيل فهم كروموسومات Lycoris .

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تفصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد ، بينما يتم توفير المجسات المستخدمة في الملف التكميلي 1.

1. تحضير الكروموسومات القمية

  1. تتجذر عن طريق الزراعة المائية. بعد إزالة الجزء الموجود فوق سطح الأرض من المصباح ، ضعه في زجاجة مدببة مملوءة بالماء ، واستبدل الماء كل 3 أيام ، باتباع الطريقة التي وصفها Song et al.35.
  2. استئصال أطراف الجذور التي تنمو بنشاط عندما يصل طولها إلى حوالي 1.0-2.0 سم ومعالجتها في α-برومونافثالين المشبع عند 28 درجة مئوية لمدة 1.0 ساعة.
  3. اقطع أطراف الجذر إلى حوالي 1 سم وضعها في خليط طازج من الميثانول وحمض الخليك الجليدي بنسبة حجم 3: 1 في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-25 درجة مئوية) لمدة 2-3 ساعات. بعد ذلك ، قم بتخزينها في ثلاجة عند 4 درجات مئوية ، كما هو موضح من قبل She et al.36.
  4. اغسل أطراف الجذر الثابتة (2-3 مم) جيدا في ماء مقطر مزدوج.
  5. تحضير خليط من السليولاز والبكتين هيدرولاز في 0.01 ملي مولار من حامض الستريك وسيترات الصوديوم عند درجة الحموضة 4.5 ، مع السليولاز والبكتين هيدرولاز لكل منهما بنسبة 1٪. ضع أطراف الجذر المعالجة مسبقا في الخليط وهضمها عند 28 درجة مئوية لمدة 1.0-1.5 ساعة.
  6. اغسل أطراف الجذر المهضومة بالماء المقطر المزدوج ، وانقلها إلى شريحة زجاجية ، واهرسها جيدا باستخدام المثبت باستخدام ملقط مدبب ناعم.
  7. جفف الشرائح على لهب مصباح الكحول حتى يختفي رذاذ الماء. تحت مجهر تباين الطور ، حدد الشرائح التي تحتوي على أكثر من خمس مراحل منقسمة ولا توجد كروموسومات متداخلة. قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

2. تلطيخ CPD

  1. قم بإعداد محلول CPD عن طريق إضافة PI و DAPI إلى مخفف مضاد للمضان بنسبة 30٪ (v / v) ، حيث يكون تركيز PI 0.6 ميكروغرام · مل لتر -1 وتركيز DAPI هو 3 ميكروغرام · مل لتر -1.
  2. جفف شريحة الكروموسوم عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. أضف 100 ميكرولتر من مخفف RNase A (محلول تخزين RNase A مخفف 100 مرة باستخدام 2x SSC (سترات الصوديوم المالحة) ، مما ينتج عنه تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل) لكل شريحة كروموسوم. قم بتغطية الشريحة وتسخينها في حجرة رطبة 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
  4. اغسل شريحة الكروموسوم ب 2x SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث فترات مدة كل منها 5 دقائق.
  5. اغسل شريحة الكروموسوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة.
  6. أضف 200 ميكرولتر من مخفف البيبسين (محلول تخزين البيبسين المخفف 100 مرة مع 0.01 نيوتن حمض الهيدروكلوريك لتحقيق تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل) لكل شريحة كروموسوم. قم بتغطية الشريحة واحتضانها في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-20 دقيقة.
  7. اغسل أقسام الكروموسوم بالماء فائق النقاء في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ، متبوعا بالغسيل ب 2 xSSC في درجة حرارة الغرفة لفترتين مدة كل منهما 5 دقائق.
  8. إصلاح الشرائح بالميثانول: محلول حمض الخليك الجليدي (3: 1) لمدة 10 دقائق.
  9. يغسل ب 2x SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث فترات مدة كل منها 5 دقائق.
  10. عالجها بنسبة 70٪ و 95٪ و 100٪ إيثانول عند -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لكل منهما ، ثم جففها في درجة حرارة الغرفة.
  11. خذ شرائح الكروموسوم المعالجة والمجففة ، وأضف 30 ميكرولتر من محلول تلطيخ CPD إلى كل شريحة ، وقم بتغطيتها بغطاء 24 مم × 50 مم ، وقم بالبقعة في الظلام لأكثر من 30 دقيقة. يجب تلطيخ مادة الكروموسوم الواسعة بين عشية وضحاها.
  12. راقب شرائح الكروموسوم تحت المجهر الفلوري ، باستخدام مرشح الإثارة الأخضر (WG) لتلوين PI ومرشح الأشعة فوق البنفسجية (UV) لتلوين DAPI. التقط الصور باستخدام البرنامج المتوافق.
    1. اضبط وقت التعرض من خلال المرشحين لتحقيق شدة مضان متشابهة باللونين الأحمر والأزرق أثناء التقاط الصورة. يتم الحصول على صورة CPD من الصور ذات التدرج الرمادي الملطخة ب PI و DAPI. تم إجراء قياسات الكروموسوم ومعالجة الصور باستخدام برنامج Adobe Photoshop.

3. التهجين الفلوري في الموقع

  1. تحضير المحلول الهجين: FAD (10 ميكرولتر) ، ssDNA (2 ميكرولتر) ، 20× SSC (2 ميكرولتر) ، 5S rDNA (1 ميكرولتر) ، 45S rDNA (1 ميكرولتر) ، و 50٪ كبريتات جلوكان (4 ميكرولتر). بعد التحضير ، قم بالطرد المركزي للمحلول الهجين (2500 × جم ، 5-10 دقائق ، في درجة حرارة الغرفة) وضعه على الجليد.
  2. ضع الشرائح الممسوحة ضوئيا في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
  3. قم بإزالة الشرائح المخبوزة ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول تمسخ FAD بنسبة 70٪ ، وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي ، وقم بتشويه في فرن تهجين جزيئي 85 درجة مئوية لمدة 2.5 دقيقة.
  4. قم بإزالة زجاج الغطاء واغمر الشرائح على الفور في 70٪ و 90٪ و 100٪ من الإيثانول البارد ، مع تجفيف التجفيف على التوالي لمدة 5 دقائق لكل منها.
  5. قم بإزالة الشرائح واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 30 دقيقة.
  6. أضف 20 ميكرولتر من المحلول الهجين إلى الشريحة ، ضع زجاج الغطاء برفق في الأعلى حتى ينتشر السائل تماما ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لترطيب المنطقة المغطاة من الشريحة.
  7. ضع الشرائح في طبق هجين مبلل ب 2× SSC (يجب أن يكون الطبق الهجين عبارة عن طبق بتري كبير بغطاء ملفوف بورق قصدير لتسهيل التشغيل بعيدا عن الضوء) واحتضانه عند 37 درجة مئوية طوال الليل (لمدة 6 ساعات على الأقل).
  8. قم بمكافحة تلطيخ الكروموسومات عن طريق تركيبها باستخدام 3 ميكروغرام مللي -1 DAPI في محلول 30٪ (حجم حجم / حجم) من Vectashield H-100. التقط الصورة باستخدام برنامج متوافق ، مع التألق الأزرق ل DAPI متحمس للضوء الأرجواني للمرشح والتألق الأحمر ل PI المتحمس للضوء الأخضر ، على التوالي.
    ملاحظة: تم إجراء تهجين FISH باستخدام مجسات 45S و 5S rDNA على شرائح ملطخة سابقا ب CPD ، باتباع الطريقة التي وصفتها She et al.36.

4. تحليل النمط النووي

  1. حدد خمس خلايا انقسامية الطور لكل مجموعة تضم تكون فيها الكروموسومات مشتتة جيدا (بدون تداخل) ومكثفة بشكل معتدل (لا ينبغي تجميع الكروموسومات إلى أقصى حد ، ولكن لا ينبغي أن تتكتل الأطراف معا) ، باتباع المنهجية التي وصفتها She et al.4.
  2. حدد الطول المطلق لكل كروموسوم عن طريق اختيار خمسة كروموسومات ذات أعلى تركيز أثناء انقسام الخلية.
  3. قم بقياس طول الذراع الطويلة (L) والذراع القصيرة (S) لكل كروموسوم بدقة ودقة ، بالإضافة إلى حجم كل شريط صبغي فلوري على الكروموسوم.
  4. احسب المعلمات التالية: (1) طول الكروموسوم النسبي (RL ، النسبة المئوية أحادية الصيغة الصبغية) ؛ (2) نسبة الذراع (AR = L / S ، الذراع الطويلة / الذراع القصير) ؛ (3) إجمالي طول الكروموسوم أحادي الصيغة الصبغية (TCL ؛ طول النمط النووي) ؛ (4) متوسط طول الكروموسوم (C) ؛ (5) حجم الشريط الفلوري (النسبة المئوية لشريط التألق بالنسبة لطول الكروموسوم) ؛ (6) المسافة من السنترومير إلى موقع الحمض النووي الريبي. (7) متوسط مؤشر السنترومير (CI ، محسوبا على أنه طول الذراع القصير لكل كروموسوم مقسوما على الطول الإجمالي لهذا الكروموسوم ، ثم حساب متوسط هذه القيم) ؛ (8) أربعة مؤشرات مختلفة لعدم تناسق النمط النووي ، بما في ذلك مؤشر السنترومير (CVCI) ، ومعامل التباين (CV) ، ومعامل طول طول الكروموسوم (CVCL) ، ومتوسط معامل عدم تناسق السنترومير (MCA) ، وفئة عدم تناسق ستيبينز.
    ملاحظة: راجع طرق Paszko10 و Peruzzi et al.11 لحساب مؤشر عدم التناسق. تصنيف الكروموسومات بنسب ذراع مختلفة وفقا لطرق تصنيف ليفان الخمس. رتب كروموسومات Lycoris aurea (L'Hér.) عشب بترتيب تنازلي من الطول كما هو موضح في هان وآخرون بروتوكول37.
  5. تأكد من دقة ودقة المنهجية من خلال رسم أنماط النمط النووي للكروموسوم بناء على بيانات قياس الكروموسوم جنبا إلى جنب مع معلومات النطاق الفلوري وموضع وحجم rDNA-FISH.
  6. يعد تصور العلاقات غير المتكافئة للنمط النووي للمجموعات السكانية الثمانية خطوة أساسية توفر رؤى واضحة. يتم تحقيق ذلك من خلال مخططات مبعثرة ثنائية الأبعاد ، والتي تستخدم للحصول على MCA و CVCL.
  7. قم بإجراء تحليل الإحداثيات الرئيسي (PCoA) باستخدام معامل تشابه Gower ، وهو مكون حاسم ، باتباع طرق She et al.38.
  8. احسب ستة معلمات كمية (x ، 2n ، TCL ، MCA ، CVCL ، CVCI) لتحديد الأنماط النووية الوراثية الخلوية للمجموعات الثمانية.
  9. إجراء تحليلات إحصائية باستخدام برنامج تحليل البيانات والتصور لإنشاء مخطط الشجيرات المستند إلى UPGMA ومخطط مبعثر PCoA.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من خلال استخدام طريقة الغمر الدقيق بالإنزيم وتجفيف اللهب (EMF) ، فإن كروموسومات الطور المتناثرة والمتمايزة جيدا من Lycoris aurea (L'Hér.) تم الحصول على العشب ، وتم بناء النمط النووي للكروموسوم الوراثي الخلوي ل Lycoris aurea (الشكل 1). كروموسومات الطور الحاد ذات أعلى درجة من التكثيف غير مناسبة لتحليل النمط النووي بسبب انخفاض الاختلافات المورفولوجية. ومع ذلك ، نظرا لأن الطول الإجمالي للكروموسومات أحادية الصيغة الصبغية (TCL) يمكن مقارنته بين السكان ، فإن التمييز بين الأنماط النووية لمجموعات Lycoris aurea المختلفة أمر ممكن من خلال مقارنة الاختلافات في قيم TCL. يتم عرض خصائص النمط النووي ومحتوى الحمض النووي النووي لثمانية مجموعات من Lycoris aurea في الجدول 1. يتم عرض توزيع نطاقات التألق ومواقع 45S و 5S rDNA في الجدول 2. يعرض الشكل 2 قياسات الكروموسومات جنبا إلى جنب مع خصائص النطاقات الفلورية وموقع وحجم إشارات 45S و 5S rDNA FISH.

أرقام الكروموسومات ثنائية الصبغيات هي كما يلي: 2n = 16 = 8m + 8t ل GXTL ، 2n = 14 = 8m + 6t ل HBFC ، 2n = 14 = 8m + 6t ل GZDS ، 2n = 16 = 6m + 10t ل HNZX ، 2n = 14 = 8m + 6t ل HBBD ، 2n = 14 = 8m + 6t ل HNXN ، 2n = 16 = 6m + 10t ل HBWF ، و 2n + 1 = 15 = 7m + 8t ل SCLS (الجدول 1). كما هو موضح في البروتوكول بواسطة She et al.4 ، فإن كروموسومات الطور الطوري للثماني L. أوريا مجموعات صغيرة ، مع متوسط أطوال كروموسومات يتراوح من 1.01 ميكرومتر (HNZX) إلى 2.08 ميكرومتر (GZDS) و TCL يتراوح من 16.14 ميكرومتر (HNZX) إلى 29.13 ميكرومتر (GZDS). ترتبط TCLs للمجموعات الثمانية بمحتويات الحمض النووي النووي المبلغ عنها (الجدول 1). لوحظ أصغر نطاق طول نسبي (RRL) في HNXN (1.52-3.81) ، بينما شوهد أكبره في GZDS (2.73-5.86). أظهر السكان HNXN و GZDS أصغر وأكبر تباين في طول الكروموسوم ، على التوالي. تراوح متوسط مؤشر السنترومير (CI) للجينوم بين 61.02 ± 5.63 (السكان HBFC) و 70.70 ± 4.63 (السكان HBWF). أظهر سداسي HBFC السكاني أقل تغير في مؤشر السنترومير ، بينما أظهر HBWF السكاني أكبر التغيرات الشاملة.

تتكون الأنماط النووية من كروموسومات ميتامركزية (م) وكلوسومات مركزية (t) (الجدول 1 ؛ الشكل 2) ، الذي يمثل أشكال الكروموسومات الأكثر شيوعا بين المجموعات السكانية الثمانية التي تمت دراستها. يتم توفير مؤشرات عدم تناسق النمط النووي الثمانية المختلفة في الجدول 1. من بين هذه المؤشرات ، يميز معامل تباين مؤشر السنترومير (CVCI) ومتوسط عدم تناسق السنترومير (MCA) عدم التناسق داخل الكروموسومات ، بينما يقيس معامل تباين طول الكروموسوم (CVCL) عدم التناسق بين الكروموسومات. نطاقات CVCI و MCA هي كما يلي: CVCI = 10.97 (HBBD) إلى 18.25 (HBWF) ، و MCA = 28.85 (HNZX) إلى 39.30 (HBWF). تشير هذه القيم باستمرار إلى أن سداسي البروم ثنائي الفينيل له أدنى مستوى وأن HBWF لديه أعلى عدم تناسق داخل الكروموسومات. نطاق CVCL هو 14.98 (GZDS) إلى 23.32 (HBWF) ، مما يشير إلى أن GZDS يظهر أقل نمط نووي غير متماثل ، بينما يعرض HBWF النمط النووي الأكثر تناسقا بين المجموعات الثمانية. وفقا لمبادئ التصنيف الخاصة ب Stebbins9 ، تنتمي هذه الأنماط النووية إلى الفئة 1B ، مما يشير إلى أن جميع المجموعات السكانية المدروسة لها أنماط نواوية متماثلة نسبيا.

علاقات عدم تناسق النمط النووي بين الثمانية Lycoris aurea (L'Hérit.) يتم توضيح مجموعات الأعشاب باستخدام مخططات مبعثرة ثنائية الأبعاد من CVCI مقابل CVCL و MCA مقابل CVCL (الشكل 3). هيكل النمط النووي لهذه المجموعات ، كما هو موضح من خلال الأزواج الثلاثة من المعلمات - CVCI و CVCL و MCA - له آثار كبيرة. توضح هذه المعلمات عدم تناسق النمط النووي المماثل. تسلط النتائج المستخلصة من مخططات المبعثر الضوء على التأثير المحتمل للبحث ، مما يدل على أن السكان HNXN لديهم النمط النووي الأكثر تناسقا ، بينما تظهر مجموعات HBFC و HBWF معظم حالات عدم التناسق داخل الكروموسومات وبين الكروموسومات ، على التوالي (الشكل 3).

صنفت هذه الدراسة بدقة مجموعات Lycoris aurea الثمانية إلى ثلاث مجموعات رئيسية بناء على مخطط شجرة UPGMA مع خمس معلمات النمط النووي (الشكل 4). تشكل المجموعة الأولى ، ممثلة بالسكان SCLS ، كليدا مستقلا. تتكون المجموعة الثانية من HNXN و HBWF. تنقسم المجموعة الثالثة إلى مجموعتين فرعيتين: إحداهما تحتوي فقط على مركبات سداسي بدونية فلورية ، بينما تشمل الأخرى مجموعات سكون HBWF و GZDS و GXTL ، مع تجمع السكان HBBD و GZDS في فرع أصغر. يتم توضيح العلاقات الكريولوجية بين السكان المدروسين ، كما هو موضح من خلال تحليل الإحداثيات الرئيسية (PCoA) ، في الشكل 5. يشير مخطط مبعثر PCoA إلى أنه يمكن تقسيم المجموعات السكانية الثمانية إلى مجموعتين بمستوى ثقة 68.36٪. تشمل المجموعة الأولى HBWF و HBBD و GXTL ، مع تجمع المجموعات السكانية الثلاثة السابقة معا بشكل وثيق. تتكون المجموعة الثانية من HBFC و HHNXN و HNZX و SCLS ، حيث يحتل HBFC الموضع الأوسط بين المجموعتين ، ويتم وضع SCLS بشكل أكثر عزلة (الشكل 5).

CPD (مزيج من يوديد البروبيديوم و DAPI) و DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) التلوين العكسي هي تقنيات قياسية تستخدم لمراقبة التركيب النووي وتوزيع الكروماتين. كشفت نتائج هذه الدراسة عن ظواهر غير متجانسة بين ثمانية مجموعات من Lycoris aurea (L'Hérit). عشب (الشكل 1 والشكل 2 ؛ الجدول 2). أشارت نتائج تهجين FISH لكل مجموعة سكانية إلى أن جميع مناطق الكروموسومات تتوافق مع مواقع 45S و 5S rDNA. يتم توضيح خصائص نطاقات CPD في الشكل 1A و C ، E ، G ، I ، K ، M ، O.

في مجموعات سداسي بلور البروم الكلي وثنائي البنزين ، لوحظت نطاقات CPD في المناطق المركزية والمناطق المحيطة بالمركز (الشكل 1G ، K ؛ الشكل 2D ، F). ومع ذلك ، لم تعرض بعض الكروموسومات نطاقات CPD: الكروموسومات الثالثة والثامنة في SCLS ، والكروموسوم الأول في HNXN ، والكروموسوم الأول في HNZX ، والكروموسوم الأول في HBWF ، والكروموسوم الثاني في GZDS ، والكروموسوم الثاني في GXTL (الشكل 1A ، C ، E ، I ، J ، M ، O ؛ الشكل 2A-C ، E ، G ، H). والجدير بالذكر أنه تم العثور على نطاقات CPD أيضا على أطراف الأذرع القصيرة لأزواج الكروموسومات 5 و 6 و 7 في SCLS و HNXN ، على الأزواج 4 و 5 و 6 و 7 و 8 في HNZX ، وعلى الأزواج 5 و 6 و 7 في HBFC. بالإضافة إلى ذلك ، كانت نطاقات CPD موجودة على نهايات الذراع القصيرة للكروموسومات 4 و 5 و 6 و 7 و 8 في HBWF ، وعلى نهايات الذراع القصيرة للكروموسومات 5 و 6 و 7 في HBBD ، وعلى نهايات الذراع القصيرة للكروموسومات 5 و 6 و 7 و 8 في GXTL (الشكل 1 أ والشكل 2 أ).

بعد تهجين FISH ، شكل التلوين العكسي DAPI نطاقات فلورية ساطعة حول الجسيمات المركزية للكروموسومات 5 و 6 و 7 في GZDS. تشير هذه النطاقات ، التي تسمى نطاقات ما بعد FISH DAPI + ، إلى أن مناطق الكروماتين غير المتجانسة هذه تحتوي على عدد كبير من أزواج قواعد AT (الشكل 2G). كان نطاق نطاقات CPD (المحيطة) المركزية التي لوحظت عبر المجموعات السكانية الثمانية 25.00٪ إلى 57.14٪ (الجدول 2) ، بينما تراوح المبلغ الإجمالي لنطاقات CPD الطرفية من 40.00٪ إلى 71.43٪ (الجدول 2). في GZDS السكانية ، ترتبط نطاقات ما بعد FISH DAPI + بطول النمط النووي ، وهو ما يمثل 42.86٪ من الإجمالي. اختلفت أحجام نطاقات rDNA CPD ، ونطاقات CPD غير rDNA ، ونطاقات DAPI + بعد FISH بشكل كبير بين أزواج الكروموسومات المختلفة من Lycoris aurea (L'Hérit). عشب (الشكل 2 ؛ الجدول 2).

تم استخدام تقنية FISH لإدخال مجسات 45S و 5S rDNA في الكروموسومات الملطخة ب CPD ، كما هو موضح في الشكل 1. ملخص عدد وموقع مواقع 45S و 5S rDNA في المجموعات الثمانية من Lycoris aurea (L'Hérit.) يتم تقديم العشب في الجدول 2 ويصور في الشكل 2. والجدير بالذكر أن الاختلافات الكبيرة في عدد وحجم وموقع مواقع الحمض النووي الريبي بين المجموعات السكانية الثمانية تسلط الضوء على أهمية هذه النتائج. في المجموع ، كان هناك 30 موقعا 45S rDNA عبر المجموعات الثمانية. من بين هؤلاء ، كانت 4 مواقع (13.33٪) موجودة في منطقة السنترومير الوسطى ، و 9 (30.00٪) في منطقة السنترومير القريبة من وسط ، و 17 (56.67٪) في المناطق النهائية لأذرع الكروموسومات الخاصة بها (الشكل 2 ؛ الجدول 2).

في مجموعة GXTL ، تم العثور على إشارة موضع 45S rDNA في منطقة السنترومير للذراع القصير للكروموسوم 4 ، بينما كانت هناك أربع إشارات إضافية في منطقة السنترومير للأذرع الطويلة للكروموسومات 5 و 6 و 7 و 8 (الشكل 1 ص ؛ الشكل 2 ز). في مجموعة مركبات ثنائي الفينيل ، تم وضع موضع 45S rDNA في منطقة السنترومير على الذراع القصير للكروموسوم 4 ، مع وجود ثلاثة مواقع في مناطق الكروماتين غير المتجانسة حول الوسط على الأذرع القصيرة للكروموسومات 5 و 6 و 8 (الشكل 1H ؛ الشكل 2 د). في مجموعة GZDS ، كان موضع 45S موجودا في منطقة السنترومير من الذراع القصير للكروموسوم 4 (الشكل 1N; الشكل 2 ز). في HNZX ، لوحظت خمسة مواقع 45S rDNA في المناطق الطرفية للأذرع القصيرة لأزواج الكروموسومات 4 و 5 و 6 و 7 و 8 (الشكل 1H ؛ الشكل 2 د). توزيع مواقع 45S في HBBD (الشكل 1J; الشكل 2 هاء) و HNXN (الشكل 1L ؛ الشكل 2F) كان مشابها ، مع موضع واحد في منطقة السنترومير للذراع القصيرة للكروموسوم 4 وثلاثة مواقع في منطقة السنترومير للأذرع القصيرة للكروموسومات 5 و 6 و 7.

في HBWF ، ظهرت خمس إشارات مواقع 45S rDNA في مناطق السنترومير قصيرة الذراع لأزواج الكروموسومات 4 و 5 و 6 و 7 و 8 (الشكل 1N ؛ الشكل 2 ز). في SCLS ، تم العثور على إشارة موضع 45S rDNA في مناطق السنترومير قصيرة الذراع لأزواج الكروموسومات 1 و 2 ، وكذلك في المناطق المحيطة بالوسط للأذرع القصيرة لأزواج الكروموسومات 5 و 6 (الشكل 1 ص ؛ الشكل 2H). بالنسبة لمواقع 5S rDNA ، تم تحديد ما مجموعه تسعة عبر الأصناف الثمانية ، مع وجود 3 (33.33٪) في المناطق القريبة ، و 3 (33.33٪) في المناطق المحيطة بالمركز ، و 3 (33.33٪) في المناطق النهائية لأذرع الكروموسوم المعنية (الشكل 2 ؛ الجدول 2). في GXTL ، ظهرت إشارة موضع 5S rDNA بالقرب من الطرف النهائي للذراع الطويلة لزوج الكروموسوم 6 (الشكل 1P ؛ الشكل 2 ز). كان توزيع مواقع 5S مشابها في HBFC (الشكل 1H; الشكل 2 د) و GZDS (الشكل 1N ؛ الشكل 2G) ، وكلاهما يحتوي على موضع 5S rDNA في المنطقة القريبة من الذراع القصيرة للكروموسوم 7. في HNZX ، تم العثور على موضع 5S rDNA بالقرب من الطرف النهائي للذراع الطويلة للكروموسوم 8 (الشكل 1H ؛ الشكل 2 د) ، بينما في HBBD ، تم تحديد موضع 5S rDNA في الكروموسوم 7 (الشكل 1J ؛ الشكل 2 ه). في HBWF ، ظهر موقعان 5S rDNA بالقرب من الطرف النهائي للأذرع الطويلة للكروموسومات 4 و 8 ، واثنان آخران في الذراع الطويلة للكروموسوم 7 ، وأحدهما في منطقة السنترومير ، والآخر بالقرب من النهاية (الشكل 1N ؛ الشكل 2 ز).

إن الجمع بين إشارات 45S و 5S rDNA FISH ، جنبا إلى جنب مع خصائص مقطع CPD الطرفية ، ميز بشكل فعال جميع الكروموسومات الانقسامية من مجموعات مختلفة من Lycoris aurea (L'Hérit.) عشب. في مجموعات SCLS و HBFC و HBBD و GZDS و GXTL ، أظهر الكروموسوم 1 إشارات CPD قوية في المنطقة الوسطى. أظهر الكروموسوم 2 إشارات CPD قوية في المنطقة المركزية ، باستثناء GZDS و GXTL. أظهر الكروموسوم 3 إشارة CPD قوية في المنطقة المركزية ، باستثناء SCLS. أظهر الكروموسوم 4 باستمرار إشارات CPD قوية في المنطقة الوسطى. بالنسبة للكروموسومات 5 و 6 و 7 ، لوحظت إشارات CPD قوية في نهايات الأذرع القصيرة. أظهر الكروموسوم 4 أيضا إشارات 45S rDNA قوية في نهاية الذراع القصيرة ، بينما كان للكروموسومات 5 و 6 إشارات 45S قوية في مناطقها الطرفية ، باستثناء GZDS. والجدير بالذكر أن إشارة DAPI القوية كانت موجودة في سكان GZDS. بالإضافة إلى ذلك ، ظهرت إشارة 5S rDNA ضعيفة في المنطقة القريبة من الكروموسوم 7 في مجموعات HBFC و HBWF و HBBD و GZDS.

figure-results-1
الشكل 1: الكروموسومات الانقسامية لثمانية ليكوريس أوريا (L' Hér.) مجموعات الأعشاب. فحص كروموسومات الطور الانقسامي من ثمانية مختلفة من Lycoris aurea (L' Herit.) يتم عرض مجموعات الأعشاب ، بما في ذلك السكان SCLS (A ، B) ، والسكان HNXN (C ، D) ، والسكان HNZX (E ، F) ، والسكان HBFC (G ، H) ، والسكان HBWF (I ، J) ، والسكان HBBD (K ، L). تم إجراء تهجين GZDS (M ، N) و GXTL (O ، P) باستخدام FISH مع 45S المسمى بالبيوتين ومجسات 5S rDNA المسماة بالديجوكسين بعد تلطيخ CPD. تعرض الصور الناتجة للكروموسومات بعد تلطيخ CPD إشارات rDNA 45S (أخضر) و 5S (حمراء). تم صبغ الحمض النووي الكلي بصبغة DAPI ، مما أدى إلى اللون الأزرق. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: مخططات النمط النووي للكروموسوم لثمانية Lycoris aurea (L' Hér.) مجموعات الأعشاب. مخطط نمط الكروموسوم لثمانية مجموعات من Lycoris aurea (L' Herit.) يكشف Herb عن خصائص نطاق التألق ، جنبا إلى جنب مع موقع وحجم إشارات 45S و 5S rDNA FISH. يتم تمثيل مجموعات SCLS و HHNXN و HNZX و HBFC و HBWF و HBBD و GZDS و GXTL بواسطة (A-H) ، على التوالي. يشير مقياس الإحداثي إلى الطول النسبي للكروموسوم (النسبة المئوية لهذا الكروموسوم في الجينوم أحادي الصيغة الصبغية) ، ويشير الرقم الموجود في الأعلى إلى الرقم التسلسلي للكروموسوم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: مخططات مبعثرة لثمانية Lycoris aurea (L' Hér.) مجموعات الأعشاب على أساس ثلاثة معلمات من النمط النووي. (أ) يتم رسم مؤشر CVCI مقابل مؤشر CVCL. (ب) يتم رسم مؤشر MCA مقابل مؤشر CVCL. يشار إلى مجموعات SCLS و HHNXN و HNZX و HBFC و HBWF و HBBD و GZDS و GXTL. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مخطط شجيرات UPGMA لثمانية Lycoris aurea (L' Hér.) مجموعات الأعشاب. يعتمد مخطط شجيرات UPGMA على المعلمات x و 2n و TCL و MCA و CVCL و CVCI لثمانية Lycoris aurea (L 'Hér.) مجموعات الأعشاب: SCLS و HHNXN و HNZX و HBFC و HBWF و HBBD و GZDS و GXTL. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: PCoA من Lycoris aurea الثمانية (L' Hér.) أصناف الأعشاب على أساس ستة معلمات النمط النووي. يعتمد PCoA على المعلمات x و 2n و TCL و MCA و CVCL و CVCI ، والتي تمثل SCLS و HHNXN و HNZX و HBFC و HBWF و HBBD و GZDS و GXTL. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: أسماء ثمانية Lycoris aurea (L' Hér.) مجموعات الأعشاب. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: توزيع نطاقات الفلوروكروم ومواقع الحمض النووي الريفي في الثمانية Lycoris aurea (L' Hér.) مجموعات الأعشاب. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: المجسات المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحضير Lycoris aurea (L'Hér.) تتضمن كروموسومات جذر الأعشاب عدة خطوات حاسمة: (1) زراعة الجذور عن طريق الزراعة المائية ، (2) معالجة أطراف الجذر ب α-bromonaphthalene المشبع ، (3) تثبيت الجذور باستخدام محلول حمض الكحول الخليك ، (4) إجراء التحلل المائي الأنزيمي على أطراف الجذر بمحلول إنزيمي ، و (5) سحق الجذور المهضومة جيدا وتجفيف الشرائح فوق لهب مصباح الكحول.

يعد القياس الدقيق للكروموسوم ضروريا لتحليل النمط النووي في الدراسات الوراثية الخلوية. يجب أن تظهر الكروموسومات تكاثفا ملحوظا وحدودا محددة بوضوح. خلاف ذلك ، يصبح حساب معلمات الكروموسوم بدقة أمرا صعبا5. أظهرت الأبحاث الوراثية الخلوية السابقة أن التمايز المورفولوجي للكروموسومات الانقسامية يعتمد على درجة التكثيف4،36. عندما يكون التكثيف غير كاف ، قد تظل نهايات أذرع الكروموسوم غير متقلة ، مما يؤدي إلى حدود كروموسومية غير واضحة. ومع ذلك ، عندما تصل الكروموسومات إلى أقصى قدر من التكثيف ، تنخفض الاختلافات المورفولوجية بين الكروموسومات. لذلك ، يعد اختيار الكروموسومات ذات التكثيف المعتدل أمرا بالغ الأهمية لتحديد الكروموسومات وقياسها ، خاصة في المجموعات السكانية التي تحتوي على عدد أقل من الكروموسومات.

يعد وضع العلامات على المسبار أمرا بالغ الأهمية لنجاح تهجين FISH في الموقع ، خاصة بالنسبة لمحلول مسبار 5S rDNA. نظرا للتسلسل القصير ل 5S rDNA ، فإن تركيز التسلسلات المستهدفة المسماة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل عادة ما يكون منخفضا ، مما يؤدي إلى إشارات تهجين ضعيفة. ومع ذلك ، فإن توليف المجسات المسماة بالفلورسين مباشرة ينتج إشارات تهجين أقوى ويبسط العملية. بالنسبة لمحلول مسبار 45S rDNA ، تم تصنيف التسلسلات الجزئية من مناطق ترميز 5.8S و 18S و 25S rRNA ل Arabidopsis thaliana في نهايات 5 و 3 ب 6-كربوكسيل رباعي ميثيل الرودامين (TAMRA) ثم خلطها. تم الحصول على محلول مسبار الفلوريسين 5S rDNA باستخدام 1-59 و 60-118 تسلسل نيوكليوتيدات من منطقة ترميز جين Arabidopsis 5S rRNA ، مع تسمية كل تسلسل في نهاية 5 بفلوريسين 6-كربوكسيل (6-FAM) ، ثم مختلط.

في هذه الدراسة ، استفدنا من الاختلافات بين أصباغ DAPI و PI في ربط الحمض النووي ودمجناها للحصول على نطاقات فلورية واضحة. يمكن أن تخترق أصباغ PI (يوديد البروبيديوم) أغشية الخلايا وترتبط بجزيئات الحمض النووي داخل الخلايا. في المقابل ، يرتبط DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) بشكل تفضيلي بمناطق الحمض النووي الغنية ب AT ، مما يوفر تلطيخا واضحا وعالي التباين. نظرا لهذه الخصائص التكميلية ، غالبا ما يتم استخدام DAPI و PI معا ، والمعروف باسم تلطيخ CPD ، لجمع المعلومات عن كل من النواة والسيتوبلازم في وقت واحد. كشفت الاختلافات في وجود وموقع وحجم نطاقات CPD و DAPI + عن تمايز كبير في الكروماتين المتغاير عبر المجموعات الثمانية من Lycoris aurea. أظهر تلطيخ CPD مناطق غير متجانسة الكروماتين غنية بمحتوى GC في كل من المناطق المركزية والمناطق المحيطة بالمركز وداخل الكروموسومات الكلوية.

تعد دراسة عدم تناسق النمط النووي نهجا تصنيفيا خلويا شائعا وبأسعار معقولة ومستخدما على نطاق واسع يتضمن مجموعة من المعلمات والمؤشرات ، بما في ذلك كل من المقاييس النوعية والكمية ، ومعلمات تصنيف Stebbins ، والمؤشرات الكمية المختلفة (على سبيل المثال ، Paszko 10 ؛ Paszko10 ؛ Peruzzi et al.11). من بين هذه ، يتم استخدام نسبة R و CVCL لقياس عدم تناسق الكروموسومات ، بينما يمثل CVCI و MCA مؤشرات رئيسية لعدم تناسق الكروموسومات. والجدير بالذكر أن CVCL يعتبر معلمة إحصائية قوية لتقدير عدم التناسق بين الكروموسومات10 ، ويتم التعرف على مقياس عدم تناسق الكروموسومات (MCA) كمقياس فعال لتقييم عدم التناسق داخل الكروموسومات11. لتمثيل عدم تناسق النمط النووي بين السكان بشكل أفضل ، يوصى باستخدام مخطط مبعثر ثنائي الأبعاد ، مع وضع اثنين من مقدري عدم التناسق على المحورين x و y ، على التوالي ، حيث يتم تمثيل كل عينة كنقطة11،12. أظهرت النتائج أن مخططات التشتت ثنائية الأبعاد ل CVCL مقابل. CVCI ، وكذلك MCA مقابل. CVCL ، يوضح بشكل فعال علاقات عدم تناسق النمط النووي بين المجموعات الثمانية المتميزة من Lycoris aurea (L′Herit.) عشبة ، تدعم موثوقية هذه المؤشرات في تقييم عدم تناسق الكروموسومات.

لمقارنة الأنماط النووية وإعادة بناء العلاقات اللونية بين المجموعات السكانية الثمانية ، طبقت هذه الدراسة المنهجية التي اقترحها Peruzzi et al.11 ، باستخدام المعلمات x و 2n و TCL و MCA و CVCL و CVCI. كشفت النتائج أن مجموعات HBWF و GZDS و HBBD و GXTL كانت مرتبطة ارتباطا وثيقا ، مع وضع HBFC بين هذه المجموعات. وبالتالي ، أثبتت PCoA بناء على هذه المعلمات الستة أنها طريقة فعالة للغاية للتمييز بين العلاقات بين المجموعات السكانية الثمانية. ومع ذلك ، ظهرت بعض الأنماط المعقدة أيضا من شجرة التطور الجزيئي المبنية. على سبيل المثال ، بينما بدت HNZX مرتبطة ارتباطا وثيقا ب HBWF في شجرة النشوء والتطور الجزيئية ، إلا أنها كانت أكثر ارتباطا في مخطط مبعثر PCoA. يسلط هذا التعقيد الضوء على أهمية استخدام مناهج كمية متعددة للتنبؤ بالاتجاهات في تطور النمط النووي داخل Lycoris ، مكملة لخصائص التصنيف الجزيئي.

تم أخذ عينات من النباتات الخاصة بهذه الدراسة من وسط وغرب الصين ، بما في ذلك مقاطعة تيانلين ، مقاطعة قوانغشي (GXTL) ، مقاطعة فانغ ، مقاطعة هوبي (HBFC) ، مقاطعة دوشان ، مقاطعة قويتشو (GZDS) ، مقاطعة زيشينغ ، مقاطعة هونان (HNZX) ، مقاطعة بادونغ ، مقاطعة هوبي (HBBD) ، مقاطعة شينينغ ، مقاطعة هونان (HNXN) ، مقاطعة ووفنغ ، مقاطعة هوبي (HBWF) ، ومقاطعة لوشان ، مقاطعة سيتشوان (SCLS). تم الاحتفاظ بعينة قسيمة في المعشبة بجامعة هوايهوا. وجدت هذه الدراسة أن الجمع بين إشارات 45S و 5S rDNA FISH وخصائص مقطع CPD الطرفية ميز بشكل فعال جميع الكروموسومات الانقسامية من مجموعات مختلفة من Lycoris aurea (L′Herit.) عشب. يهدف البروتوكول المقدم هنا إلى التحقيق في توزيع الكروماتين المتغاير بين مجموعات مختلفة من Lycoris aurea (L′Herit.) عشب. CPD (مزيج من PI و DAPI) و DAPI (4′،6-diamidino-2-phenylindole) هي تقنيات راسخة لمراقبة التركيب النووي وتوزيع الكروماتين. يعد وضع العلامات الفلورية المباشرة لمناطق جين 18S-5.8-26S rRNA (مناطق 45S rDNA) والحمض النووي الريبوزومي 5S لتهجين الكروموسوم FISH أمرا بسيطا ويوفر إشارات تهجين قوية. سيكون هذا التمييز النوعي ذا قيمة متزايدة في تحليل المجموعات السكانية المختلفة.

هذه الطريقة هي الأنسب للأنواع النباتية القادرة على الزراعة السريعة لأطراف الجذر ، حيث أن زراعة طرف الجذر مطلوبة أثناء الانقسام النشط. نظرا لتسلسل 5S القصير ، استخدمت الدراسة تسلسل النيوكليوتيدات 1-118bp لمنطقة ترميز جين 5S rRNA في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا باعتباره مسبار 5S rDNA. نظرا لتسلسلها القصير وإشارتها الضعيفة ، فإن هذه الطريقة فعالة فقط لتحديد الأنواع ذات القواعد المحفوظة نسبيا في منطقة 1-118 نقطة أساس من جين 5S rRNA. يعد اختيار كروموسومات الطور مع التكثيف المعتدل أمرا بالغ الأهمية لنجاح الطريقة. يرتبط تكثيف الكروموسوم ارتباطا وثيقا بتوقيت حصاد الجذور ومدة المعالجة المسبقة والخبز باللهب. لذلك ، تتطلب التقنية تحكما دقيقا في كل خطوة لضمان النجاح التجريبي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية (32070367).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكحولسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA500737-0005(70٪ ،   90٪,  100٪)
1 & مرات ؛ TNTSangon Biotech (شنغهاي) المحدودةB5481081 مرات ؛ 10 مرات ؛
2 وأقات. SSCSangon Biotech (شنغهاي) المحدودةB5481092 مرات ؛ 20 مرة ؛
45S  rDNASangon Biotech (شنغهاي) المحدودةتمت إضافة TAMRA إلى كلا الطرفين (5 'و 3' نهايات)
4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.E60730320 مل
5S & nbsp ؛ rDNASangon Biotech (شنغهاي) المحدودة5 'end plus 6-FAM (FITC)
برنامج Adobe PhotoshopAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naphthaleneSangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.A602718التشبع
المضادة للإرهاق وكيلسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةVectashield H-100010 مل
حاضنة الكيمياء الحيويةشنغهاي Yiheng Scientific Instrument Co.، LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.A42606810 جرام
حامض الستريكسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودة.A50170210 جرام
فورماميد منزوع الأيونات (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.A600211-05000.7
كبريتات ديكسترانسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA42822910 مل
مضان في الموقع أداة التهجينالولايات المتحدة الأمريكية / Abbott ThermoBriteS500-24
مجهر مضانأوليمبوس & nbsp ؛ الصين  Co.ltdBX60
حمض الخليك الجليديسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA501931500 مل
هيدروكلوريك كاشفعلاء الدين المحدودة (شنغهاي)H399657500 مل
آلة صنع الثلجدان دينغ شنغهاي للتجارة الدولية المحدودةST-70
مجهر لايكا البيولوجيألمانيا Leica Instrument Co.، LTDDM6000B
كحول الميثيلسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA601617500 مل
برنامج MetMorphالأجهزة الجزيئيةالإصدار 7.35
فرنحراري علمي تجاري ؛ Heratherm™THM # 51028152
PectinaseSangon Biotech (شنغهاي) المحدودةA00429710 جرام
بيبسينسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودة1.07185100 جرام
يوديد البروبيديوم (PI)سانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA4252591 جرام
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.R464210 مجم
الحمض النووي للحيوانات المنوية من السلمون (ssDNA) كاشفعلاء الدين (nbsp ؛ Co.  ؛ Ltd. (شنغهاي)D1198711 جم
سترات الصوديومكاشف علاء الدين المحدودة (شنغهاي)S18918310 جم
إحصائيات لنظام التشغيل Windows 10.0   ؛للتحليل الإحصائي
من

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729(2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508(2021).
  6. Levin, D. A. The role of chromosomal change in plant evolution. , Oxford Univ Press. 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. , Addison-Wesley. London. (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85(2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795(2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18(2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028(2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

rDNA 45S rDNA 5S
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة