يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طريقة دراسة التمثيل الغذائي في الخلايا اللمفاوية باستخدام الكيمياء لقياس اندماج بوروميسين عن طريق قياس التدفق الخلوي

978 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67377

⸱

أغسطس 15, 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يوضح البروتوكول طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي باستخدام الكيمياء لدراسة استقلاب الطاقة في الخلايا.

الملخص

عند تحفيز المستضد ، تخضع الخلايا التائية الساذجة لتكاثر سريع وتوسع في الخلايا التائية المستجيبة. يلعب التمثيل الغذائي دورا مهما في توليد الكتلة الحيوية اللازمة لهذه الخلايا سريعة التكاثر ولتوليد الجزيئات اللازمة لتمايز الخلايا التائية المستجيبة ووظيفتها ، والتي تؤثر على نتيجة الاستجابة المناعية التكيفية في العدوى أو السرطانات. تعيد الخلايا التائية الساذجة برمجة عملية التمثيل الغذائي عند التحفيز المستضد لزيادة توليد ATP ، وهو أمر مطلوب لدعم نموها ، والتخليق الحيوي ، ووظائفها المستجيبة. يمكن إنشاء ATP في الخلية إما عن طريق مسار فسفرة الميتوكوندريا المؤكسدة (OXPHOS) أو عن طريق مسار تحلل السكر. نظرا لأن معظم ATP المتولدة في خلية متنامية مقسمة يتم استخدامها لتخليق البروتينات ، فقد تم استخدام تخليق البروتين كبديل لمستويات ATP. يمكن قياس تخليق البروتين عن طريق دمج بورومايسين ، الذي يحاكي الأدينوزين 3 ′ من الحمض النووي الريبي المشحون بالتيروزين المعدل ويؤدي إلى الإنهاء التلقائي لترجمة البروتين. يمكن استخدام مثبطات التمثيل الغذائي مثل 2-deoxyglucose (2DG) ، الذي يمنع مسار تحلل السكر ، و Oligomycin (O) ، الذي يمنع المركب 5 من سلسلة نقل الإلكترون (ETC) ، لدراسة تبعيات توليد ATP الخلوي على هذين المسارين جنبا إلى جنب مع تقييم تخليق البروتين بطريقة تسمى SCENITH. نصف هنا نوعا مختلفا من هذه الطريقة التي تكتشف دمج بورومايسين عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الكيمياء. هذه الطريقة لدراسة التمثيل الغذائي سهلة نسبيا ويمكن استخدامها لتقييم مجموعات الخلايا النادرة ، وكذلك عينات المرضى ، عن طريق قياس التدفق الخلوي.

المقدمة

في السنوات الأخيرة ، كان هناك تقدير متزايد للدور المهم لعملية التمثيل الغذائي في تنظيم الخلايا التائية. ينظم التمثيل الغذائي الخلوي العديد من الوظائف الهامة في الخلايا الليمفاوية ، بما في ذلك التمدد النسيلي للخلايا التائية الخاصة بممرض الأمراض وتمايزها إلى مجموعات فرعية من الخلايا المستجيبة ، والتي تصنع مجموعة متنوعة من جزيئات المستجيب ، بما في ذلك السيتوكينات الالتهابية والجرانزيم المحلل للخلايا اللازمة لقتل مسبباتالأمراض 1. لذلك فإن دراسة استقلاب الخلايا التائية مهمة لتقييم وظيفة الخلايا التائية الطبيعية ولتطوير العلاجات المحتملة.

الخلايا التائية الساذجة هادئة من الناحية الأيضية وتعتمد على التمثيل الغذائي التقويضي والفسفرة المؤكسدة (OXPHOS) لتلبية احتياجاتها من الطاقة1،2. عند تنشيط مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ، تخضع الخلايا التائية لإعادة برمجة التمثيل الغذائي السريع مدفوعة جزئيا بتنظيم ناقلات المغذيات على سطح الخلايا ، مما يزيد من امتصاص الجلوكوز والأحماض الأمينية المتعددة ، بما في ذلك الجلوتامين ، من البيئة. ثم يتم استخدام اللبنات الأساسية للمغذيات هذه في المسارات الابتنائية لصنع جزيئات كبيرة تساهم في النمو الخلوي وتدعم زيادة متطلبات الطاقة المرتبطة بزيادة نمو الخلايا وانقسامها1،2،3. إعادة برمجة التمثيل الغذائي في الخلايا التائية المنشطة تجعل الخلايا أكثر اعتمادا على تحلل السكر الهوائي وتحلل الجلوتامينول لتلبية احتياجاتها من الطاقة1،2،3. عند تحفيز TCR ، يلعب امتصاص العناصر الغذائية أيضا دورا مهما في تنشيط المسارات الجزيئية النهائية3. على سبيل المثال ، يؤدي امتصاص الأحماض الأمينية وزيادة تركيز الأحماض الأمينية المحلية إلى تنشيط إشارات mTORC14. على العكس من ذلك ، فإن تقليل توافر الأحماض الأمينية داخل الخلايا يقلل من مسار إشارات mTORC12،3،5،6،7. وبالتالي ، يرتبط التمثيل الغذائي والوظيفة الخلوية ارتباطا وثيقا في الخلية التائية المستجيبة.

تتطلب الزيادة الكبيرة في الكتلة الحيوية المطلوبة للخلايا التائية سريعة الانقسام تنظيم تخليق / ترجمة البروتين8. يمكن قياس تخليق البروتين في الخلية من خلال دراسة دمج بورومايسين9 ، وهو تقليد تيروزيل - الحمض النووي الريبي الريبي يمنع الترجمة عن طريق دمج سلاسل عديد الببتيد الممدودة ووضع علامات عليها وإطلاقها من ترجمة الريبوسومات9. ترجمة البروتين هي عملية تعتمد على الطاقة العالية. في الواقع ، يتم استخدام معظم ATP المتولدة في الخلايا المنقسمة والنامية لتخليق البروتينات. وبالتالي ، تم استخدام تخليق البروتين كقياس بديل ل ATPالخلوي 10. لتوليد ATP ، تعتمد الخلايا عادة على تحلل السكر و / أو مسار OXPHOS للميتوكوندريا11. يولد تحلل السكر جزيئين ATP لكل جزيء جلوكوز. يولد مسار OXPHOS 36 ATPs لكل جلوكوز12،13 ، لكن تحلل السكر يمكن أن يولد ATP بشكل أسرع14. وبالتالي ، فإن الخلايا التائية المنشطة سريعة الانقسام ، مثل الخلايا السرطانية ، تعتمد بشكل كبير على مسار تحلل السكر لتوليد ATP.

يمكن دراسة اعتماد الخلية على كل مسار استقلابي باستخدام مثبطات محددة. يعمل مثبط مسار تحلل السكر 2-Deoxyglucose (2-DG) ، وهو نظير للجلوكوز ، كمثبط تنافسي لإنزيم تحلل السكر hexokinase15. يتم فسفرة 2-DG إلى 2DG-phosphate (2DG-P) بواسطة hexokinase. لا يمكن استقلاب 2DG-P عن طريق إيزوميراز الفوسفوهكسوز ، والذي يحول عادة الجلوكوز -6-فوسفات (G-6-P) إلى الفركتوز -6-فوسفات16. وبالتالي ، فإن 2DG-P محاصر ويتراكم في الخلايا ، مما يؤدي إلى تثبيط تحلل السكر واستنفاد ATP الخلوي ، وبالتالي منع تخليق البروتين17. بطريقة مماثلة ، يمكن دراسة اعتماد الخلايا على مسار OXPHOS للميتوكوندريا باستخدام Oligomycin ، الذي يرتبط بقناة البروتون لسينسيز ATP لسلسلة نقل الإلكترون (ETC) 18 ، وبالتالي منع تخليق ATP للميتوكوندريا (الشكل 1). يمكن أن يوفر استخدام هذه المثبطات جنبا إلى جنب مع تقييم تخليق البروتين صورة عن حالة التمثيل الغذائي للخلايا وقد تم استخدامه في طريقة قوية أحادية الخلية تعرف باسم SCENITH والتي تقيم دمج البيورومايسين باستخدام قياس التدفقالخلوي 10. ومع ذلك ، يمكن أن يكون توافر كواشف SCENITH محدودا. تشمل التقنيات الأخرى شائعة الاستخدام لتقييم تحلل السكر و OXPHOS تحليلات التدفق خارج الخلية لفرس البحر ، والتي تتطلب أعدادا أكبر للخلايا ، والتي قد لا تكون ممكنة تجريبيا. في هذه المقالة ، نصف طريقة بديلة لتقييم دمج البيرومايسين باستخدام كاشف كيمياء Click-it المتاح تجاريا. تسمح سهولة هذه الطريقة بالتقييم السريع للحالة الأيضية للخلايا الليمفاوية ، بما في ذلك مجموعات الخلايا النادرة وعينات المرضى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء تربية والتجارب وفقا للبروتوكول المعتمد G98-3 من قبل لجنة استخدام ورعايتها التابعة للمعهد الوطني لأبحاث الجينوم البشري ، المعاهد الوطنية للصحة ، والبروتوكول المعتمد LISB 22E من قبل لجنة رعاية واستخدام في المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية ، المعاهد الوطنية للصحة. تم استخدام ذكور الفئران C57Bl / 6J التي تتراوح أعمارها بين 6-12 أسبوعا ، والتي تم تربيتها وإيوائها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، في هذه الدراسة. تم الحصول على نتائج مماثلة مع إناث الفئران. تم الحصول على الدم البشري الكامل من بنك الدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب البروتوكول 99-CC-0168 المعتمد من المركز السريري للمعاهد الوطنية للصحة IRB لجمع وتوزيع مكونات الدم من المتبرعين الأصحاء للاستخدام في البحث في المختبر. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع الأشخاص وفقا لإعلان هلسنكي.

1. الفأر الساذج CD4 + عزل الخلايا التائية وثقافة

  1. قم بتنقية خلايا CD4 + T الساذجة عن طريق الانتقاء السلبي من المعلقات أحادية الخلية المجمعة لطحال الفأر أو الغدد الليمفاوية من الفئران الذكور التي تتراوح أعمارها بين 6 و 12 أسبوعا باستخدام نظام فصل الخلايا المغناطيسية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. خلايا المزرعة (كما هو موضح أدناه) في وسائط IMDM التي تحتوي على L-alanyl-L-glutamine ثنائي الببتيد ومكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ، و 2 ملي مولار L-glutamine ، و 100 U / مل بنسلين ، و 100 U / مل ستربتومايسين ، و 0.05 ملي مولار 2-β-ميركابتوإيثانول.
  3. الزراعة المشتركة لخلايا CD4 T الساذجة بنسبة 1: 8 مع خلايا الطحال المستنفدة على شكل حرف T المعالجة بالميتومايسين C (الموضحة أدناه) كخلايا ناقلة جنود مدرعة في ألواح مكونة من 48 بئرا تحت غير مستقطبة (1 ميكروغرام / مل من مضاد CD3 [استنساخ 2C11] و 3 ميكروغرام / مل من مضاد CD28 [استنساخ 37.51]) ، وظروف Th0 (1 ميكروغرام / مل من مضاد CD3 ، 3 ميكروغرام / مل من مضاد CD28 ، 10 ميكروغرام / مل لكل من مضاد ل IFNg [استنساخ XMG1.2] ، مضاد ل IL-12 [استنساخ C17.8] ، ومضاد ل IL-4 [استنساخ 11B11]) لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية. قم بإعداد الثقافات باستخدام 1 × 106 ناقلات الجنود المدرعة و 0.13 × 106 خلايا CD4 T الساذجة لكل بئر من صفيحة 48 بئرا (جدول المواد)
  4. توليد خلايا الطحال المستنفدة على شكل مائل للميتومايسين C كناقلات ناقلة جندرية: باختصار ، قم بتلطيخ معلق خلية واحدة من طحال الفأر بالأجسام المضادة CD4 و CD8 المترافقة مع FITC. بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا مغناطيسيا باستخدام الميكروبيدات المضادة ل FITC (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، باستخدام نظام فصل الخلايا المغناطيسية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، حدد سلبا APCs من الخلايا التائية. بعد ذلك ، عالج نادرات الجنود المدرعة ب 50 ميكروغرام / مل Mitomycin C لمدة 40 دقيقة عند حاضنة 37 درجة مئوية ، متبوعة بغسل 3x مع 1x PBS.

2. عزل وثقافة PBMCs البشرية

  1. عزل PBMCs من الدم الكامل باستخدام وسائط فصل الخلايا الليمفاوية ووفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  2. كثافة PBMCs في وسائط RPMI مكملة ب 2 ملي مولار ل-جلوتامين ، 0.01 M HEPES ، 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية ، 100 وحدة / مل بنسلين وستربتومايسين ، 0.05 ملي مولار 2-β-ميركابتو إيثانول ، و 5٪ مصل بشري.
  3. استزراع 1 × 106 PBMCs لكل بئر من صفيحة 96 بئر ذات قاع U مع 5 ميكروغرام / مل من Phytohemagglutinin-L (PHA-L) لمدة 18-24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

3. فحص التمثيل الغذائي

ملاحظة: من المهم الحفاظ على جميع الخلايا والمثبطات [Oligomycin (O) و 2-Deoxyglucose (2-DG) و DMSO (Co)] ، و O-propargyl-puromycin (OPP) كاشف قريب من 37 درجة مئوية قدر الإمكان. قم بإخراج الخلايا والمثبطات وكاشف OPP على 96 لوحة ذات قاع U واترك الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية قدر الإمكان. مثبطات Aliquot 2-DG و O في أحجام أصغر لتجنب الذوبان المتعدد بالتجميد.

  1. اصنع محلول مخزون 2 متر (20x) من 2-DG و 40 ميكرومتر (40x) محلول مخزون O. بالنسبة ل OPP ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من OPP في 49 ميكرولتر من الوسط بحيث يكون التركيز 400 ميكرومتر - سيكون هذا هو محلول المخزون 20x.
  2. تأكد من أن جميع المكونات الأخرى لمجموعة تخليق البروتين OPP (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة (RT) ، قبل بدء التجربة.
  3. قم بإعداد 1x OPP ACTION BUFFER عن طريق تخفيف كمية من زجاجة المكون C 1:10 بالماء منزوع الأيونات. بعد الاستخدام ، قم بتخزين أي محلول 1x متبقي عند 2-8 درجة مئوية.
  4. بذرة 0.1-2 × 106 خلايا لكل بئر من صفيحة 96 بئر مستديرة القاع لكل حالة (Co / DG / O / DGO) في 100 ميكرولتر من IMDM الكامل (لخلايا CD4 T للماوس) أو RPMI كامل (ل PBMCs البشرية) أو أي وسائط كاملة من اختيارها. احتفظ بالطبق في الحاضنة قدر الإمكان.
  5. أضف مثبطات 1x من محاليل المخزون (5 ميكرولتر من 20x DG ، Co) ، (2.5 ميكرولتر من 40x O) واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. التركيزات النهائية على الخلايا هي 100 ملي مولار DG و 1 ميكرومتر O. امزج المثبطات مع الخلايا بعناية باستخدام ماصة. لسهولة السهولة ، قم بإخراج المثبطات في صفيحة مكونة من 96 بئرا وأضف الخلايا إلى المثبطات واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات.
  6. في عينة DGO، أضف 1x من DG (5 ميكرولتر)، واخلطها بعناية باستخدام ماصة، واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، 5٪ من ثاني أكسيدالكربون 2. ثم أضف 1x O (2.5 ميكرولتر) ، وقم بالماصة عدة مرات ، واحتضانها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  7. دون غسل المثبطات ، أضف 5 ميكرولتر من OPP من محلول مخزون 20x (400 μM) إلى كل عينة بحيث يكون التركيز 20 ميكرومتر في الخلايا ، والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ، واحتضان 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. لسهولة ، قم بإخراج OPP على طبق مكون من 96 بئرا ، وأضف خلايا بها مثبطات إلى كاشف OPP ، واخلطه جيدا.
    ملاحظة: بالنسبة للخلايا والخلايا الأقل نشاطا من الناحية الأيضية المعزولة مباشرة خارج الجسم الحي ، قم بزيادة وقت الحضانة بعد إضافة OPP. يجب توحيد وقت الحضانة مع OPP لكل نوع من أنواع الخلايا.
  8. بعد الحضانة باستخدام OPP ، أضف 100-150 ميكرولتر من FACS Buffer المثلج البارد (2٪ FBS و 1 ملي مولار EDTA في 1x PBS). جهاز طرد مركزي عند 750 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وكرر خطوة الغسيل.
  9. خلايا البقع ذات علامات السطح المناسبة ، أو الجسم المضاد CD4 المضاد للفأر (يستخدم عند تخفيف 1/200) أو الجسم المضاد CD4 المضاد للإنسان (يستخدم عند تخفيف 1/50) ، كاشف حي / ميت (يستخدم عند تخفيف 1/600) ، في وجود Fc Block (يستخدم عند تخفيف 1/200). احتضن لمدة 25-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  10. اغسل اللوحة ب 150-200 ميكرولتر من عازلة FACS وجهاز طرد مركزي عند 750 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بتحريك اللوحة برفق للتخلص من المادة الطافية ، ثم كرر خطوة الغسيل. في هذه المرحلة ، يتم تلطيخ الخلايا على السطح.
  11. أعد تعليق الخلايا في 1٪ PFA في PBS ، واخلطها جيدا ، واحتضانها لمدة 10-15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. حماية من الضوء.
  12. يغسل باستخدام FACS Buffer وجهاز طرد مركزي على حرارة 750 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ، وكرر الغسيل.
  13. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الصابونين البارد 1x (0.1٪ (بالوزن / الحجم) Saponin + 3٪ FBS في 1x PBS). احتضن في RT ، محمي من الضوء لمدة 5-15 دقيقة. الخلايا ثابتة ونفاذة في هذا الوقت.
  14. قم بإعداد 1x OPP المضاف العازل للتفاعل (المكون E) عن طريق تخفيف محلول 10x 1:10 في الماء منزوع الأيونات. تحضير هذا المحلول طازجا واستخدامه في نفس اليوم.
  15. تحضير كوكتيل تفاعل OPP وفقا للجدول 1. استخدم كوكتيل التفاعل في غضون 15 دقيقة من التحضير.
  16. الطرد المركزي للعينات من الخطوة 3.13 عند 750 × جم لمدة دقيقتين. تخلص من المادة الطافية. اغسل الخلايا 2x ب 200 ميكرولتر من 1x عازلة نفاذية الصابونين. قم بتدوير وتخلص من المادة الطافية.
  17. أضف 50-100 ميكرولتر من كوكتيل تفاعل OPP (المحضر في الخطوة 3.12) إلى كل بئر واخلطه جيدا. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT ، محمي من الضوء. ثم قم بتدوير الألواح عند 750 × جم أو دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
  18. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من 1x عازلة نفاذية الصابونين وعينات الطرد المركزي عند 750 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
  19. قم بإعادة التعليق في 50 ميكرولتر من محلول شطف التفاعل (المكون F) لكل بئر وجهاز طرد مركزي عند 750 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا الملطخة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  20. قم بتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (انظر الشكل التكميلي 1) في نفس اليوم ، أو قم بتخزين الخلايا في الظلام عند 4 درجات مئوية وتحليلها في اليوم التالي.

4. تحليل الفحص الأيضي

  1. قياس دمج بورومايسين (OPP) كبديل لتخليق البروتين في ظل الظروف التالية: 1) حالة التحكم (Co) ؛ 2) في الخلايا التي يتم فيها حظر مسار حال السكر بواسطة 2-DG ؛ 3) في الخلايا التي يتم فيها حظر مسار OXPHOS للميتوكوندريا بواسطة O ؛ و 4) في الخلايا التي يتم فيها حظر كل من مسارات تحلل السكر والميتوكوندريا بواسطة مثبطات (DGO) ، من خلال تقييم متوسط شدة التألق (MFI) ل OPP (الشكل 2).
  2. قم بتحليل تبعية الخلايا تجاه مسار معين من خلال النظر إلى MFI ل OPP في كل حالة. قم بتقييم MFI بشكل مباشر كمقياس لتخليق البروتين. احسب اعتماد الجلوكوز ، والقدرة على تحلل السكر ، وأكسدة الأحماض الدهنية (FAO) وقدرة أكسدة الأحماض الأمينية (AAO) ، والاعتماد على الميتوكوندريا وفقال 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم عزل الخلايا التائية الساذجة CD4 + من الطحال والغدد الليمفاوية للفئران وتمايزها إلى سلالات Th0 أو غير المستقطبة (NP) لمدة 72 ساعة. تم حصاد الخلايا بعد 0 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة من الثقافة ، وتم قياس دمج OPP من خلال النظر إلى MFI ل OPP. كانت خلايا CD4 + T الساذجة أقل اصطناعية من الخلايا التائية المنشطة ، كما يتضح من MFI ل OPP (الشكل 3). كانت الخلايا الساذجة تعتمد جزئيا على تحلل السكر ولكن أكثر من ذلك على مسار OXPHOS كما تم تقييمه بواسطة MFI وتغيير الطية لدمج OPP. إذا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توفر هذه الورقة طريقة لدراسة التمثيل الغذائي في الخلايا اللمفاوية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، بناء على تقنية SCENITH ، ولكن باستخدام الملصقات الكيميائية للبورومايسين المدمج. على الرغم من أننا ركزنا على الخلايا الليمفاوية ، إلا أنه يمكن تعديل هذا البروتوكول لدراسة التمثيل الغذائي في أي نوع من الخلايا. هذه الطريقة مفيدة أيضا لدراسة التمثيل الغذائي في مجموعات نادرة من الخلايا وعينات المرضى ، حيث تتطلب التقنيات الأخرى ، مثل فرس البحر ، أعدادا أكبر من الخلايا.

تتم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور تشين شو والدكتور أفيك دوتا على تقديم عينات PBMC واقتراحات تجريبية قيمة. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل قسم البحوث الداخلية في NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-MercaptoethanolThermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 الأجسام المضادة للبوروميسينBiolegend381506التخفيف المستخدم: 1/100
Alexa Fluor 647 المضاد للإنسان CD4 الأجسام المضادةBiolegend357422التخفيف المستخدمة:   1/50
دينار بحريني هورايزون BUV737 الفئران المضادة للفأر CD4BD Biosciences612761التخفيف المستخدمة:   1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 مجموعة فحص تخليق البروتينThermo FisherC10456
HEPES (1 م)Thermo Fisher15630080
مصل بشريMillipore SigmaH4522
IMDM ، مكمل GlutaMAX ، 500 ملThermo Fisher31980030
InVivoMAb مضاد للفأر CD28 ، استنساخ:   ؛ 37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb مضاد للفأر CD3 &epsilon ؛ ، استنساخ:  145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb مضاد للفأر IFNγ, استنساخ:  XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb مضاد للفأر IL-12 p40 ، استنساخ:  C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb مضاد للفأر IL-4 ، استنساخ:  11B11BioXcellBE0045
L-Glutamine (200 ملم) ThermoFisher25030081
LIVE / DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ، لإثارة 405 نانومترThermo FisherL34966التخفيف المستخدم:   ؛ 1/600
LSM فصل الخلايا الليمفاوية متوسطMP Biomedicals50494X
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X)Thermo Fisher11140050
Mitomycin C من Streptomyces caespitosusSigmaM0503-10X2MG
Naive CD4 Isolation Kit ، فأرMiltenyi Biotec130-104-453
Paraformaldehyde 16٪ محلول مائي علوم المجهر الإلكترونيEM 15710
PBS (1X) ، درجة الحموضة 7.4 ، 500 ملجودة بيولوجيات114-058-101
البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل). 100 ملثيرموفيشر 15140122
فيتوهيماجلوتينين-إل (PHA-L) ميليبورسيجما11249738001
مصل بقري الجنين عالي الجودة (FBS) أفانتور97068-085
RPMI 1640 متوسط ، بدون جلوتامينثيرمو فيشر21870076
سابونينثيرمو فيشرA18820.22
بيروفات الصوديوم (100 ملم)ثيرموفيشر 11360070
من الدرجة

المراجع

  1. Saravia, J., Raynor, J. L., Chapman, N. M., Lim, S. A., Chi, H. Signaling networks in immunometabolism. Cell Res. 30, 328-342 (2020).
  2. Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 20, 55-70 (2020).
  3. Raynor, J. L., Chi, H. Nutrients: Signal 4 in T cell immunity. J Exp Med. (221), e20221839(2024).
  4. Shimobayashi, M., Hall, M. N. Multiple amino acid sensing inputs to mTORC1. Cell Res. 26, 7-20 (2016).
  5. Huang, H., et al. In vivo CRISPR screening reveals nutrient signaling processes underpinning CD8(+) T cell fate decisions. Cell. 184, 1245-1261.e21 (2021).
  6. Pollizzi, K. N., et al. Asymmetric inheritance of mTORC1 kinase activity during division dictates CD8(+) T cell differentiation. Nat Immunol. 17, 704-711 (2016).
  7. Verbist, K. C., et al. Metabolic maintenance of cell asymmetry following division in activated T lymphocytes. Nature. 532, 389-393 (2016).
  8. Marchingo, J. M., Cantrell, D. A. Protein synthesis, degradation, and energy metabolism in T cell immunity. Cell Mol Immunol. 19, 303-315 (2022).
  9. Enam, S. U., et al. Puromycin reactivity does not accurately localize translation at the subcellular level. Elife. 9, e60303(2020).
  10. Argüello, R. J., et al. SCENITH: A Flow Cytometry-Based Method to Functionally Profile Energy Metabolism with Single-Cell Resolution. Cell Metab. 32, 1063-1075.e7 (2020).
  11. Dunn, J., Grider, M. H. Physiology, Adenosine Triphosphate. , StatPearls Publishing LLC. (2024).
  12. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9, 18699(2019).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  14. Pfeiffer, T., Schuster, S., Bonhoeffer, S. Cooperation and competition in the evolution of ATP-producing pathways. Science. 292, 504-507 (2001).
  15. Brown, J. Effects of 2-deoxyglucose on carbohydrate metabolism: review of the literature and studies in the rat. Metabolism. 11, 1098-1112 (1962).
  16. Weindruch, R., et al. Caloric restriction mimetics: metabolic interventions. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 56 Spec No1, 20-33 (2001).
  17. Gronostajski, R. M., Pardee, A. B., Goldberg, A. L. The ATP dependence of the degradation of short- and long-lived proteins in growing fibroblasts. J Biol Chem. 260, 3344-3349 (1985).
  18. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicol In Vitro. 67, 104907(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SCENITH
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.