Method Article

التحليل المجهري البؤري لفرز البروتين إلى البلازموديزما في نيكوتيانا بينثاميانا

DOI:

10.3791/67378

⸱

November 1st, 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول اختيار واسمات البلازموديزم المثلى للتحليلات القائمة على الفحص المجهري متحد البؤر لاستهداف البروتين إلى البلازموديزما أثناء تفاعلات الفيروس والبلازموديزما أو نقل البلازموديزم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلازموديزما هي مسام نانوية غشائية تربط سيتوبلازم الخلايا النباتية المجاورة وتمكن من الاتجار من خلية إلى أخرى بالمغذيات والجزيئات الكبيرة وكذلك الفيروسات الغازية. تلعب البلازموديزما أدوارا أساسية في تنظيم الاتصال بين الخلايا ، مما يساهم في تطوير النبات ، والاستجابات البيئية ، والتفاعلات مع مسببات الأمراض الفيروسية. يمكن أن يوفر اكتشاف توطين البلازموديزمي للبروتينات النباتية أو الفيروسية معلومات وظيفية مفيدة حول البروتين وهو مهم لفهم آليات تفاعلات الفيروسات النباتية. لتسهيل هذه الدراسات ، وصفنا بروتوكولا للتحليل القائم على الفحص المجهري متحد البؤر لمختلف البروتينات المستهدفة للبلازموديزمال لاختيار أفضل علامة بلازمودية لدراسة تفاعلات الفيروس والبلازموديزما أو نقل البلازموديزم. على وجه التحديد ، يتم توضيح تحليلات هذه الأحداث باستخدام بروتين الحركة من خلية إلى خلية (MP) لفيروس إزالة الوريد اللفت (TVCV) ، والبروتين الموضعي البلازموديزمي أرابيدوبسيس 5 (PDLP5) وبروتين ربط البلازموديزما كالوز 1 (PDCB1). يتم تحليل بيانات توطين البروتين البلازموديزمي بالتوازي مع التصور العالمي للبلازموديزما باستخدام تلطيخ الأنيلين الأزرق للأنسجة التي تم أخذ عينات منها. يمكن تكييف هذه الأساليب بسهولة لتحليل توطين البلازموديزمي لأي بروتينات خلوية أو ممرضة في لسان النبات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب البلازموديزما (PD) دورا أساسيا في التحكم في نمو النبات والاستجابات البيئية والتفاعلات مع مسببات الأمراض الفيروسية من خلال تنظيم الاتصال بين الخلايا 1,2. يتشكل PD في البداية أثناء التحريك الخلوي ، مع إدخال المئات من PD في الخلية الجديدة بين الخليتين الابنتين ، وبالتالي توفير قنوات الاتصال من خلية إلى خلية 3,4. PD هو هيكل غني بالغشاء ، يحتوي على غشاء مشتق من الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وهو أنبوب عبر PD ، في الجزء المركزي من المسام التي يصطف عليها غشاء البلازما 3,4. حددت النهج البروتينية المقارنة العديد من البروتينات الوظيفية PD ، بما في ذلك β-1،3-glucanases (BGs) ، سينسيز كالوز (CALSs) ، البروتينات الموجودة في البلازموديزما (PDLPs) ، البروتينات المرتبطة بالكالوز (PDCBs) ، بروتينات المنطقة عبر الغشاء المتعددة C2 (MCTPs) 3 ، والكينازات الشبيهة بالمستقبلات المتكررة الغنية بالليوسين (RLK) 5. في الآونة الأخيرة ، طور كيرك وآخرون أداة تسمى البلازموديزما في بروتين السيليكو 1 (PIP1) ، مما جعل من الممكن التنبؤ ببروتينات PD الجديدة في 22 نوعا نباتيا6. يختلف PD في النفاذية والهيكل أثناء تطوير النبات والاستجابة للضغوط المختلفة. يعد ترسب كالوز (β-1،3-جلوكان) والتحلل المائي في منطقة الرقبة المحيطة ب PD إحدى الآليات المعروفة على نطاق واسع للائحةPD 7.

يمكن للعديد من الميكروبات المسببة للأمراض ، بما في ذلك الفطريات والبكتيريا والفيروسات ، التلاعب بتمدد أو بنية PD أثناء العدوى2،8،9. Magnaporthe oryzae ، العامل المسبب لانفجار الأرز ، ينشر خيوط غازية داخل الخلايا للانتقال من خلية إلى أخرى من خلال PD8. أحد مسببات الأمراض البكتيرية Pseudomonas syringae pv. تتطلب الطماطم بروتين مستجيب HopO1-1 للحركة بين الخلايا وينتشر في النبات المضيف من خلال التفاعل مع PDLP7 وزعزعة استقراره ، وبالتالي زيادة التدفق الجزيئي في الخلايا المجاورة في Arabidopsis9. ومع ذلك ، فإن فيروسات النبات أكثر تنوعا في تنظيم مرض باركنسون أثناء انتقالها بين الخلايا ، حيث يعزز بروتين الحركة الفيروسية (MP) الحركة من خلية إلىخلية 2. نظرا لوظيفتها الهامة في تنظيم نمو النبات ونموه ، فضلا عن تفاعلها مع الميكروبات المسببة للأمراض النباتية ، اكتسبت PD اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة. في Arabidopsis thaliana ، هناك نوعان رئيسيان من البروتينات الوظيفية PD ، PDLPs (1-8) و PDCBs (1-5) ، والعديد منها ، على سبيل المثال ، PDLP51،10،11 ، PDLP112 ، PDLP613 ، PDLP714 ، و PDCB115 ، لعبت دورا في التلاعب بنفاذية PD من خلال تنظيم ترسب الكالوس. ومع ذلك ، وجد أن بعض PDLPs لديها تكرار وظيفي ، على سبيل المثال ، لم تؤثر طفرات الضربة القاضية ل pdlp1 و pdlp1,2 على الاتجار الجزيئي ، على الرغم من أن طفرات الضربة القاضية المزدوجة من pdlp1,3 و pdlp2,3 أظهرت زيادة نفاذية البلازموديزمال16. ومن المثير للاهتمام ، أن انخفاض التنظيم / خروج المغلوب أو الإفراط في التعبير عن PDLP5 وحده يؤدي إلى زيادة أو نقصان في نفاذية البلازموديزمال ، على التوالي 1,17. في الآونة الأخيرة ، وجد Li et al. أن PDLP5 و PDLP6 يعملان في واجهات خلوية مختلفة13. تشير هذه النتائج إلى أن PDLP5 قد يكون له وظائف غير زائدة عن الحاجة مع PDLPs الأخرى.

نظرا للوظيفة الحاسمة ل PD في التواصل بين الخلايا ، قمنا بتطوير بروتوكول لنشر بروتينات PD النباتية PDLP5 و PDCB1 وبروتين الحركة الفيروسية من خلية إلى خلية (MP) لفيروس إزالة الوريد اللفت (TVCV) كعلامات PD بسيطة ومريحة وموثوقة لتجربة بيولوجيا الخلية. لمزيد من التحقق ، استمر تصور PD باستخدام تلطيخ الأنيلين الأزرق للأنسجة التي تم أخذ عينات منها بالتوازي. يمكن تكييف البروتوكولات الموصوفة لتوطين PDLP5 و PDCB1 و TVCV MP بسهولة لتحليل توطين PD المحتمل لأي بروتينات خلوية أو مشتقة من مسببات الأمراض في النباتات الحية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. نمو النبات

  1. قم بزراعة بذور Nicotiana benthamiana في التربة الرطبة في غرفة بيئة خاضعة للرقابة عند 23 درجة مئوية تحت 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات من الظلام.
  2. بعد حوالي 2 أسابيع ، قم بنقل الشتلات بعناية مع كريات الخث حول جذورها إلى أواني أكبر واستمر في النمو في ظل نفس الظروف لمدة 4-5 أسابيع لتجارب التسلل الزراعي.
    ملاحظة: لا تستخدم النباتات عندما تبدأ في الإزهار ، حيث سيقل تراكم GFP في مرحلة الإزهار18.

2. بناء ناقلات

  1. استخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تسلسلات الترميز ذات الأهمية باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5 واستنساخها في ناقل الدخول pDONR207 بواسطة تفاعل BP19 باستخدام مجموعة BP Clonase المتاحة تجاريا.
  2. نقل الجينات المستهدفة في بلازميدات الدخول الناتجة إلى ناقل الوجهة pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 بواسطة تفاعل LR19 باستخدام مجموعة LR Clonase المتاحة تجاريا لإنتاج البلازميدات مع علامة EGFP المنصهرة في النهاية C للبروتينات المستهدفة.
  3. تحقق من جميع الإنشاءات بواسطة PCR والتسلسل19.

3. التسلل الزراعي

  1. Streak Agrobacterium tumefaciens EHA105 خلايا تحتوي على ناقلات مختلفة على ألواح أجار LB وتحضن لمدة يومين تحت 28 درجة مئوية.
  2. انقل مستعمرة واحدة إلى 2 مل من مرق LB واحتضانها طوال الليل عند 28 درجة مئوية مع التقليب (250 دورة في الدقيقة).
  3. قم بإزالة 1 مل من المزرعة الليلية ، متبوعا بإضافة 4 مل من مرق LB الطازج ، وإعادة الزراعة لمدة ساعة واحدة في ظل نفس الظروف.
  4. اضبط التعليق البكتيري على OD600 = 0.1 (OD600 = 0.2 للتعبير المشترك لبروتينين) مع مخزن مؤقت للتسلل (MgCl2 ، 10 mM ؛ MES ، 10 مللي متر ، درجة الحموضة 5.6).
  5. امزج معلقات بكتيرية مختلفة بنسبة 1: 1 (v / v) لعمل تركيز نهائي من OD600 = 0.1. (اختياري).
  6. احتضان التعليق البكتيري في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات مع التحريض الناعم.
  7. تسلل إلى السطح المحوري للأوراق الموسعة بالكامل من نباتات مختلفة باستخدام حقنة عديمة الإبر سعة 1 مل ، وقم بتمييز المنطقة المتسللة (لون أغمق من الأنسجة المحيطة غير المخترقة) بقلم مقاوم للماء.
  8. انتقل إلى قسم الفحص المجهري متحد البؤر من هذا البروتوكول (الخطوة 5).
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام سلالات أخرى من Agrobacterium tumefaciens مناسبة لتحويل الأنواع النباتية ذات الأهمية.

4. أنيلين بلو وصمة عار

  1. أضف قسامة 200 ميكرولتر من 1٪ أزرق أنيلين (في 50 mM فوسفات البوتاسيوم العازلة ، درجة الحموضة 8.0) إلى شريحة المجهر20.
  2. قم باستئصال المنطقة المتسللة التي تبلغ حوالي 0.5 سم × 0.5 سم ، بعيدا عن الوريد ، بشفرة ، وانقل عينات أنسجة الأوراق إلى محلول الأنيلين الأزرق (الجانب المحوري لأعلى) على شريحة المجهر ، وتأكد من غمر عينات أنسجة الأوراق في محلول الأنيلين الأزرق ، ثم قم بتغطيتها بغطاء زجاجي (22 مم × 50 مم).
  3. ضع شرائح المجهر مع العينات في مجفف متصل بمضخة تفريغ وقم بإخلائها لمدة 2 دقيقة (<0.8 باسكال) ، متبوعا بإطلاق بطيء للضغط والحضانة في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تصور إشارة الفلورسنت للأنيلين الأزرق تحت مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر باستخدام برنامج متوافق.
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام طريقة تلطيخ الأنيلين الأزرق بواسطة Huang et al.20 . في تعديل لهذه التقنية ، تم إجراء نفس التجربة بدون خطوة فراغ 2 دقيقة ، مما أدى إلى نتائج مماثلة واقتراح أن التجفيف بالفراغ ليس ضروريا لتلطيخ الأنيلين. أيضا ، قد يختلف تركيز صبغة الأنيلين الزرقاء ووقت التلوين وفقا لمصدر أنسجة الأوراق ، إلخ.

5. المجهر متحد البؤر

  1. حصاد ورقتين من نباتين في نقاط زمنية مختلفة بعد التسلل. قطع منطقة التسلل إلى حوالي 0.5 سم × 0.5 سم شرائح بعيدا عن الوريد بشفرة.
    1. ضع عينات الأنسجة في قطرة من الماء المعقم (الجانب المحوري لأعلى) في الجزء المركزي من شريحة المجهر ، وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي (22 مم × 50 مم) ، مع الحرص على تجنب الفقاعات.
  2. تأكد من أن الأطوال الموجية للإثارة للكشف عن إشارات CFP و GFP و RFP هي 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر على التوالي ، وكانت مرشحات الانبعاث للكشف 410-602 نانومتر ل CFP ، و 400-602 نانومتر ل EGFP و RFP ، مع تعيين الثقب 1 AU و Master Gain على 769 فولت.
  3. تصور إشارة الفلورسنت لعلامات الفلورسنت الذاتي في المنطقة المخترقة باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مع برنامج متوافق في 1 يوم و 2 أيام و 3 أيام و 5 أيام و 7 أيام و 10 أيام بعد التسلل.
    1. استخدم عدسة موضوعية 10x ومرشحات GFP لتحديد موقع الخلايا التي تحتوي على إشارة الفلورسنت ثم قم بالتبديل إلى عدسة موضوعية 40x لتصور التوطين تحت الخلوي وتسجيل الصور.
  4. اجمع 20 صورة لكل حالة ، باستخدام نسختين بيولوجيتين مستقلتين على الأقل.
  5. سجل توطين PD للبروتين المختبر بناء على المظهر التشخيصي للإشارة في محيط الخلية21,22.
    ملاحظة: عند اكتشاف التوطين تحت الخلوي لبروتين غير معروف ، يوصى باستخدام ثلاثة نباتات على الأقل.

6. تحليل البيانات

  1. استخدم برنامج فيجي لتقسيم القنوات وإضافة شريط المقياس إلى الصور للتصور.
  2. استخدم برنامج فيجي لتقسيم القنوات قبل قياس متوسط قيمة التدرج الرمادي لكل صورة لتقييم كثافة مضان GFP (ل MP و PDCB1 و PDLP5) أو CFP (لتلطيخ أزرق الأنيلين) في نقاط زمنية مختلفة.
  3. استخدم برنامج فيجي لتقسيم القنوات قبل تطبيع صور GFP (ل MP و PDCB1 و PDLP5) أو CFP (لتلطيخ أزرق الأنيلين). تم قياس مساحة الصورة ، وتم حساب PD puncta يدويا. تم حساب عدد نقاط PD لكل 100 ميكرومتر2 .
  4. استخدم ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة ل Tukey23 لتحديد قيم P بين العينات المختلفة والنقاط الزمنية المختلفة باستخدام برنامج إحصائي ورسوم بيانية.
    ملاحظة: بالنسبة لصورة مضان أحادية القناة، تمثل قيمة التدرج الرمادي لكل بكسل شدة التألق لتلك النقطة24. هنا ، تم استخدام متوسط قيمة التدرج الرمادي لتقييم شدة التألق لكل عينة في نقاط زمنية مختلفة.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتسهيل دراسات وظيفة PD في فسيولوجيا النبات والتفاعلات مع مسببات الأمراض ، تم تطوير ثلاثة بروتينات مرجعية بسيطة وموثوقة لتوطين PD. تم اختيار اثنين من بروتينات PD الخلوية وبروتين MP مشتق من مسببات الأمراض مشفر بواسطة فيروس توبامو TVCV النباتي. تم تصور التوطين تحت الخلوي لهذه البروتينات باستخدام مراسل ذاتي الفلورسنت EGFP مدمج في النهاية C لكل بروتين. في نهج بديل ، تم تصور PD باستخدام تلطيخ الأنيلين الأزرق لرواسب الكالوز المرتبطة ب PD. أظهرت التجارب أن كلا من PDLP5 و MP أظهرا توطينا مثقوبا ل PD ، مع ترجمة MP أيضا في نواة الخلية (الشكل 1A) ، كما لوحظ سابقا25. في المقابل ، بدا أن PDCB1 يقسم بين PD و ER (الشكل 1A). بالنسبة للباحثين الأقل خبرة في تفسير التوطين تحت الخلوي للبروتينات الموسومة ب GFP ، يوضح الشكل 1A أيضا النمط النووي المميز ل EGFP المعبر عنه في الخلايا النباتية. لتأكيد إشارة ER ل PDCB1 ، شاركنا في التعبير عن PDCB1 مع علامة ER ووجدنا أن إشارة PDCB1 تتداخل مع إشارة علامة ER (الشكل 1B). لتقييم كفاءة توطين PD للبروتينات المختبرة ، تم حساب النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن إشارة الفلورسنت التي أظهرت توطين PD لهذه الإشارة (الجدول 1).

لتحديد التوطين تحت الخلوي من خلال استخدام البروتينات المرجعية ، من المفيد فهم النطاق الزمني لتعبير البروتين المرجعي والتغيرات المحتملة لتوطينه. يوضح الشكل 2 هذه الحركية ل MP و PDLP5 و PDCB1 عندما تم تصور PD نفسها بواسطة تلطيخ أزرق الأنيلين. بدأ كل من MP و PDLP5 في التراكم عند PD بالفعل في يوم واحد بعد التسلل (dpi) ، ووصل هذا التراكم إلى الحد الأقصى الواضح عند 2 نقطة في البوصة ، وظل مستقرا لمدة 5 أيام أخرى ، وبعد ذلك انخفضت شدة الإشارة ، على الأرجح بسبب تدهور البروتين. كان المسار الزمني للفرز تحت الخلوي PDCB1 أكثر تعقيدا: بالنسبة لأول 3 نقطة في البوصة ، أظهر PDCB1 إشارة ER قوية نسبيا ، والتي حجبت تماما تقريبا توطين الإشارة الخاصة ب PD ، بينما عند 5 نقطة في البوصة ، أصبحت هذه الإشارة الأخيرة أكثر وضوحا (الشكل 2) ، وإن كان ذلك في عدد أقل من الخلايا. ومن المثير للاهتمام ، أن ظهور نمط توطين PD الواضح ل PDCB1 بعد 5 نقطة في البوصة تزامن مع عدد أقل بكثير من الخلايا التي تظهر إشارة EGFP (الشكل التكميلي 1). وبالتالي ، يمكن أن يعمل PDLP5 و MP كبروتينات مرجعية PD مع خلفية قليلة في معظم المقصورات الخلوية الأخرى ، مع نافذة زمنية مثالية للتصور من 2-5 نقطة في البوصة. PDCB1 ، من ناحية أخرى ، ليست مناسبة مثل علامة PD.

ثم تم التحقق من أن علامات PD تحتفظ بخصوصية التوطين دون الخلوي في وجود بروتينات PD الأخرى. تحقيقا لهذه الغاية ، تم التعبير عن MP-EGFP أو PDLP5-EGFP مع توطينPD 26 MP لفيروس نباتي آخر ، فيروس موزاييك التبغ (TMV) الموسوم ب CFP. يوضح الشكل 3 أنه في كلتا الحالتين ، أظهرت البروتينات المعبر عنها بشكل مشترك نمطا واضحا لتوطين PD. وبالمثل ، لم يكتشف تلطيخ الأنيلين الأزرق النسيجي الخاص ب PD للأنسجة المعبرة عن MP-EGFP- أو PDLP5-EGFP أي تداخل مع توطين PD لإشارات EGFP وإشارات الأنيلين الزرقاء (الشكل 3).

غالبا ما تستفيد دراسات توطين PD من تقدير كمي أكثر للتعبير العام للبروتين المرجعي وإشارة PD. ويوضح الشكل 4 والشكل 5 نهج القياس الكمي هذا. من أجل القياس الكمي للتعبير العام ، تم قياس شدة إشارة PDLP5 و MP. أظهر كلا البروتينين إشارات قوية في جميع النقاط الزمنية للتصور خلال فترة 10 نقطة في البوصة ، مع كثافة إشارة قصوى عند 3 نقطة في البوصة ل PDLP5 وعند 2 نقطة في البوصة ل MP (الشكل 4). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في شدة الإشارة بين PDLP5 و MP في أي من النقاط الزمنية للتصور. أظهرت شدة إشارة PDCB1 تذبذبا أكبر بين النقاط الزمنية ، مع ملاحظة أقوى إشارة عند 7 نقطة في البوصة (الشكل 4) ، على الرغم من صعوبة جمع بيانات ذات دلالة إحصائية في هذه النقطة الزمنية بسبب ندرة الخلايا المعبرة. وبالتالي ، فإن أول 3 نقاط في البوصة تمثل التوقيت الأمثل للكشف عن تعبير PDCB1. كما هو متوقع ، أظهرت عينات تلطيخ الأنيلين الأزرق إشارة أكثر استقرارا من البروتينات المعبر عنها بشكل عابر (الشكل 4).

ثم تم تحديد كمية PD puncta التي شكلتها PDLP5 و MP. أظهر PDLP5 عددا ثابتا من نقاط PD طوال فترة الملاحظة ، مع عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين أي نقطتين من النقاط الزمنية المختبرة (الشكل 5). تم الكشف عن أكبر عدد من نقاط PD التي شكلتها MP عند 2 نقطة في البوصة ، وظلت مستقرة نسبيا حتى نهاية فترة المراقبة. كشفت مقارنة أعداد PD puncta بين PDLP5 و MP عن عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في معظم أوقات أخذ العينات (الشكل 5). كما ظل عدد نقاط PD الملطخة بأزرق الأنيلين مستقرا ، على الرغم من انخفاضه قليلا عند 10 نقطة في البوصة. كانت أعداد PD puncta المزينة بأزرق الأنيلين أو PDLP5 أو MP متشابهة مع بعضها البعض ذات دلالة إحصائية (الشكل 5) ، بما يتفق مع خصوصية PD لهذه العلامات. لم يتم تحليل أعداد PD puncta ل PDCB1 لأنه في نقاط زمنية سابقة ، تم حجب إشارة PD بواسطة إشارة ER ، وفي نقاط زمنية لاحقة ، تم ملاحظتها في عدد قليل نسبيا من الخلايا (انظر الشكل 2).

figure-results-1
الشكل 1: توطين البلازموديزما (PD) ل TVCV MP و PDLP5 و PDCB1 معبرا عنه بشكل عابر في نيكوتيانا بينثاميانا وتلطيخ أزرق الأنيلين ل PD. (أ) توطين PD ل MP-EGFP و PDLP5-EGFP و PDCB1-EGFP وتلطيخ الأنيلين. إشارة EGFP باللون الأخضر ، وإشارة الأنيلين الزرقاء باللون الأزرق ، والتألق الذاتي البلاستيد باللون الأحمر. (ب) التعبير المشترك ل MP-EGFP و PDLP5-EGFP و PDCB1-EGFP مع علامة الشبكة الإندوبلازمية (ER) الموسومة ب mRFP. تم تسجيل الصور في يومين بعد التسلل (dpi) وهي أقسام متحدة البؤر تمثل تجربتين مستقلتين (N = 20 صورة من نباتينتين). إشارة EGFP باللون الأخضر ، وإشارة mRFP باللون الأرجواني ، والتألق الذاتي البلاستيد باللون الأحمر. تشير الأسهم الصفراء إلى PDCB1 المترجم في ER. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: المسار الزمني لتوطين PD ل TVCV MP و PDLP5 و PDCB1 معبرا عنه بشكل عابر في Nicotiana benthamiana وتلطيخ أزرق الأنيلين ل PD. تم تسجيل الصور بدقة 2 نقطة في البوصة وهي عبارة عن أقسام متحدة البؤر تمثل تجربتين مستقلتين (N = 20 صورة من مصنعين لجميع الأنظمة ، باستثناء 7 نقطة في البوصة و 10 نقاط في البوصة ل PDCB1-EGFP ، حيث أظهر عدد أقل من الخلايا الإشارة). إشارة EGFP باللون الأخضر ، وإشارة الأنيلين الزرقاء باللون الأزرق. قضبان المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: يحتفظ TVCV MP و PDLP5 بتوطين PD الخاص بهما بعد التعبير المشترك مع MPV لتوطين PD و costaining مع أزرق الأنيلين. تم تسجيل الصور بدقة 2 نقطة في البوصة وهي عبارة عن أقسام متحدة البؤر تمثل N ≥ 10 صور من 4-6 نباتات. إشارة EGFP باللون الأخضر ، وإشارة CFP وإشارة الأنيلين الزرقاء باللون الأزرق ، والتألق الذاتي البلاستيد باللون الأحمر. قضبان المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: المسار الزمني لشدة التألق ل TVCV MP و PDLP5 و PDCB1 معبرا عنها بشكل عابر في نيكوتيانا بينثاميانا وصبغ الأنيلين الأزرق PD. تم جمع البيانات الكمية من التجارب الموضحة في الشكل 2. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط من تجارب متعددة. يشار إلى نقاط البيانات الفردية كمتوسط لكل قياس. تعتبر الاختلافات بين القيم المتوسطة التي تم تقييمها بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة ل Tukey ذات دلالة إحصائية بالنسبة للقيم P. * P < 0.05 و ** P < 0.01 و ** P < 0.001 و **** P < 0.0001 ؛ NS ، ليست ذات دلالة إحصائية. قضبان زرقاء ، تلطيخ الأنيلين. أشرطة خضراء فاتحة ، MP-EGFP ، أشرطة خضراء داكنة ، PDLP5-EGFP ؛ أشرطة صفراء ، PDCB1-EGFP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: المسار الزمني لتشكيل PD puncta بواسطة TVCV MP و PDLP5 معبرا عنه بشكل عابر في Nicotiana benthamiana وعن طريق تلطيخ الأنيلين الأزرق ل PD. تم جمع البيانات الكمية من التجارب الموضحة في الشكل 2. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط من تجارب متعددة. يشار إلى نقاط البيانات الفردية كمتوسط لكل قياس. تعتبر الاختلافات بين القيم المتوسطة التي تم تقييمها بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة ل Tukey ذات دلالة إحصائية بالنسبة للقيم P. * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، ** P < 0.001 ، **** P < 0.0001. قضبان زرقاء ، تلطيخ الأنيلين. أشرطة خضراء فاتحة ، MP-EGFP ، أشرطة خضراء داكنة ، PDLP5-EGFP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التجربة الأولى
إجمالي الخلاياالخلايا ذات توطين PDالخلايا ذات الإشارة المختلطةالخلايا ذات توطين PD (٪)
أزرق أنيلين40404100
MP-EGFP40404100
PDCB1-EGFP403387.5
PDLP5-EGFP40400100
التجربة الثانية
إجمالي الخلاياالخلايا ذات توطين PDالخلايا ذات الإشارة المختلطةالخلايا ذات توطين PD (٪)
أزرق أنيلين40408100
MP-EGFP4039897.5
PDCB1-EGFP40123130
PDLP5-EGFP4039297.5

الجدول 1: كفاءة توطين بيانات الأداء.

الشكل التكميلي 1: توطين PD ل TVCV MP و PDLP5 و PDCB1 معبرا عنه بشكل عابر في Nicotiana benthamiana. تم تسجيل الصور بدقة 5 نقاط في البوصة (A) و 7 نقاط في البوصة (B) و 10 نقاط في البوصة (C). إشارة EGFP خضراء ، والتألق الذاتي البلاستيد أحمر. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب أي دراسات بيولوجية للخلايا للاتصال بين الخلايا النباتية والنقل من خلية إلى خلية أثناء نمو النبات الطبيعي والتشكل ، وكذلك أثناء التفاعلات بين مسببات الأمراض النباتية ، اكتشاف ومراقبة فرز البروتينات - الداخلية والممرضة المشفرة - إلى الوصلات بين الخلايا النباتية ، البلازموديزما (PD). يمكن تسهيل هذه التجارب بشكل كبير باستخدام البروتينات المرجعية ، سواء كانت داخلية المنشأ أو مشتقة من مسببات الأمراض ، والتي تتمركز بأمانة وثبات مع مرض باركنسون ، وتزيين هذه الهياكل وتصورها. تتم معالجة هذه الحاجة هنا عن طريق اختيار ثلاثة بروتينات معروفة لتوطين PD: Arabidopsis PDLP5 و PDCB1 ، و MP من مسببات الأمراض الفيروسية توبامو TVCV. تم وضع علامة على هذه البروتينات في C-termini مع مراسل الفلورسنت الذاتي EGFP ، وتم تحديد قدرة بروتينات الاندماج الناتجة على الفرز إلى PD بعد تعبيرها العابر في أوراق Nicotiana benthamiana والتحليلات المجهرية متحدة البؤر للأنسجة المعبرة. للتصور العام لمرض باركنسون في هذه الأنسجة ، تم استخدام طريقة تلطيخ الأنيلين الأزرق القياسية.

يعتقد أن النواب الفيروسيين ينقسمون إلى مجموعتين رئيسيتين فيما يتعلق بتأثيراتهم على بنية PD ونزاهتها: النواب الذين يزيدون من نفاذية PD بشكل عكسي ودون أي تعديلات هيكلية في PD والنواب الذين يدخلون PD عن طريق تعديل هيكلهم. ينتمي نواب فيروسات توبامو ، مثل TVCV ، إلى المجموعة الأولى من مجموعة MP ، مما يضعهم كعلامات جذابة ل PD لدراسات التوطين تحت الخلوي27,28.

وضعت هذه التجارب PDLP5-EGFP و MP-EGFP كعلامات بيولوجية موثوقة وقابلة للتكرار ل PD ، مع كفاءة اكتشاف PD مماثلة لتلك الموجودة في صبغة الأنيلين الزرقاء. تم الكشف عن توطين PD ل PDLP5-EGFP و MP-EGFP طوال فترة المراقبة بأكملها البالغة 10 نقطة في البوصة ، مع الوقت الأمثل لمراقبة نمط تحديد موقع PD المميز بين 2 نقطة في البوصة و 3 نقطة في البوصة. على الرغم من أن التعبير من مروج 35S قد يؤدي إلى إسكات ما بعد النسخ للجين المعبر عنه ، إلا أن هذا يحدث غالبا بعد التعبير المطول في النباتات المعدلة وراثيا المتحولة بشكل ثابت. من ناحية أخرى ، فإن استخدام هذا المروج التأسيسي القوي مهم لسهولة الكشف عن بروتين العلامة. إذا انخفض تعبير البروتين المرجعي بعد 7-10 نقطة في البوصة ، فيجب استخدام فترات أقصر ، أي 2-3 نقطة في البوصة. لم يتم الكشف هنا عن اختلافات كبيرة في نمط التوطين تحت الخلوي الكلي بين PDLP5 و MP ، باستثناء أن MP تراكمت في نواة الخلية بالإضافة إلى PD. على العكس من ذلك ، لا ينصح باستخدام PDCB1 كعلامة PD في حد ذاتها بسبب تعقيد نمط التوطين دون الخلوي ، والذي يتضمن توطينا كبيرا إلى ER.

تعتمد سهولة اكتشاف إشارة مضان EGFP أيضا على مرحلة نمو النبات ؛ على وجه التحديد ، في N. benthamiana ، لوحظ أدنى تراكم لإشارة EGFP في مرحلة الإزهار18.

هدفت هذه الدراسة إلى تطوير علامات توطين PD الحصرية إلى أقصى حد للمقصورات تحت الخلوية الأخرى. وبالتالي ، ينبغي الجمع بين استخدامها كمراجع لتوطين البروتينات ذات الأهمية مع قدرات توطين إضافية تحت الخلوية مع التعبير عن علامات تحت الخلوية الأخرى ، مثل تلك الخاصة ب ER ، الميتوكوندريا ، غشاء البلازما ، إلخ. في هذه الحالة ، يجب أن يؤخذ في الاعتبار إدراج خلايا Agrobacterium إضافية للتعبير عن هذه العلامات عند حساب التركيز النهائي لثقافات التسلل الزراعي ، أي OD600 من الثقافات السائلة. من الواضح أنه يجب تكييف تركيز الخلية وأوقات نمو النبات من أجل التعبير الأقصى واكتشاف نمط توطين PD في الأنواع النباتية الأخرى.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل في مختبر VC بمنح من NIH (R35GM144059) و NSF (MCB 1913165 و IOS 1758046) و BARD (IS-5276-20) إلى VC. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتفسيرها أو قرار النشر.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
محرك ABT AC 1 المرحلةBRANDTECH  ABF63 / 4C-7RQ
em >Agrobacterium tumefaciens < / em>EHA105
مكافحة التلوث   ؛CCI
Gateway BP Clonase II مزيج إنزيمInvitrogen# 11789020
Gateway LR Clonase II مزيج إنزيمInvitrogen# 11791020
GraphPad Prism 8.0.1.شركة GraphPad Software Inc.
الصورة Jالمعاهد الوطنية للصحة ومختبر الأجهزة البصرية والحسابية
المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزرZeissLSM 900
Nicotiana benthamiana< / em>الأنواع
pDONR207Invitrogen# 12213013
Q5 بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةNEB#M0491S
<النباتية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
  3. Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).
  4. Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  5. Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880(2011).
  6. Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128(2022).
  7. Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Aung, K., et al. Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues. The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).
  10. Cui, W., Lee, J. Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress. Nat Plants. 2 (5), 160(2016).
  11. Liu, N. J., et al. Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis. Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).
  12. Caillaud, M. C., et al. The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition. PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).
  13. Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. The Plant Cell. , (2024).
  14. Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. Sci Bull. , (2024).
  15. Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).
  17. Lim, G., et al. Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants. Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).
  18. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).
  19. Walhout, A. J. M., et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  20. Huang, C., et al. dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins. The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).
  21. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  22. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA. mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).
  23. Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice. Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).
  24. Erkkilä, M. T., et al. Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study. J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).
  25. Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection. J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).
  26. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein. mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).
  27. Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695(2021).
  28. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal MicroscopyProtein LocalizationPlasmodesmata AnalysisNicotiana BenthamianaCell To Cell MovementAniline Blue StainingAgrobacterium InfiltrationPlasmodesmata TargetingEndoplasmic Reticulum LocalizationViral Movement Protein

Related Articles